U N I DAD: IZTAPALAPA

DIVISION: CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

CARRERA: BlOLOGlA EXPERIMENTAL

MATERIA: PROYECTO TERMINAL

TITULO:

ACTIVIDAD BIOLOGICA DE LA 1,5-BENZODIAZEPINA CLORADA SOBRE

EL MUSCULO LISO INTESTINAL DE COBAYO

MATRICULA: 88338396

ASESORES:

ASESOR INTERNO: ALFONSO EFRAIN CAMPOS SEPULVEDA

ASESOR EXTERNO: DR. GIL ALFONSO MAGOS GUERRERO

m UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

ACTIVIDAD BIOLOGICA DE LA

1,5=BENZODIAZEPINA CLORADA SOBRE

EL MúSCULO LISO INTESTINAL

DE COBAYO

INDICE

1.- INTRODUCCION ..................................................................... 1

11.- OBJETIVO GENERAL ............................................................ 8

111.- OBJETIVOS PARTICULARES .............................................. 8

IV.- METODOLOGIA .................................................................... 9

V.- ACTIVIDADES REALIZADAS ................................................ 22

VI.- OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS ................................ 22

VII.- RESULTADOS ...................................................................... 23

VIII.- CONCLUSIONES .............................. ....., ............................. 26

IX.- RECOMENDACIONES ......................................................... 26

X.- BlBLlOGRAFlA ...................................................................... 27

INTRODUCCION

Desde la antigüedad se ha recurrido al uso de productos naturales para

modificar el pensamiento, los sentimientos, la conducta; asimismo para provocar un

estado de sedación y promover el sueño (7).

Los primeros agentes introducidos específicamente como sedantes y después

como hipnóticos fueron los bromuros (1853-1864). Ademis de estos, antes de 1900 se

utilizaron otros sedantes-hipnóticos, como: el hidrato de cloral, el paraldehído, el

uretano y el sutfonal. Sin embargo, los barbitúricos se han considerado como el

prototipo de la clase, debido a su amplio uso desde su introducción. Los barbitúricos

que se introdujeron con este propósito fueron el barbital en 1903 y en 1912 el

fenobarbital. Las razones para desarrollar otros sedantes-hipnóticos, a pesar de los

disponibles, ha sido para evitar algunos de los efectos indeseables de los barbitúricos,

incluyendo su potencial para causar adicción y dependencia fisica (7, 12).

Un avance significativo en el área de la neuropsicofarmacología fue el

descubrimiento de los efectos ansiolíticos y tranquilizantes de las benzodiazepinas, una

nueva clase de compuestos sintetizados a fines de la década de los ~ O ' S , cuyo

prototipo el clordiazepóxido se sintetizo en 1957 por Sternbach, y se introdujo a la

práctica clínica en 1961. Se observó que este compuesto producía un efecto

tranquilizante en modelos experimentales animales. El seguimiento de esta

observación permitió establecer que estos compuestos tenían un mecanismo de acción

hasta entonces desconocido, por lo que el éxito de las benzodiazepinas se debe a la

1

rapidez de sus efectos, a su eficacia y a su baja toxicidad (un margen de seguridad

mayor que el de los barbitúricos, los agentes sedantes e hipnóticos desarrollados hasta

ese momento) en los seres humanos (20).

El término benzodiazepina se refiere a la porción de la estructura compuesta por

un anillo de benceno (A) fusionado a un anillo de diazepina de siete miembros (B) y un

sustituyente 5 arilo (C), (Fig. 1). Se ha establecido que en el anillo A, la sustitución en la

posición 7

sustitución

de grupos como CI, CF3 y NO2 aumenta la actividad; en el anillo B una

grande en la posición 1 disminuye la actividad, la cual se incrementa por un

grupo metilo; en el anillo C la actividad se incrementa por un halógeno en la posición 2'

y disminuye por un sustituyente en la posición 4'. Para que presenten un efecto

sedante-hipnótico, se requiere de un sustituyente en la posición 7, ya sea un halógeno

o un grupo nitro (7, 14, 17, 19).

\ /- -c 2 \

.C- - N'

Fig. 1 Estructura general de las 1,4-benzodiazepinas

2

En relación a las 1,4-benzodiazepinas (1,4-BDZ), la mayoría de ellas comparten

el mismo perfil de actividad biológica, tanto a nivel de Sistema Nervioso Central (SNC)

como a nivel periférico; sin embargo una característica que las hace diferentes son sus

propiedades farmacocinéticas, así podemos identificar a las benzodiazepinas de vida

media corta, intermedia o larga; lo que hace necesario considerar este aspecto en la

elección para una situación específica (7)

Por otro lado el clobazam es la única l,5-benzodiazepina (1,5-BDZ) (Fig. 2),

que difiere estructuralmente de todas las 1,4-BDZ utilizadas en el tratamiento de la

ansiedad, y es el Único compuesto de estructura 1,5-benzodiazepínica en uso clínico.

La molécula tiene un átomo de N en la posición 1 y 5 del anillo B, con una pérdida del

grupo imino (C=N) en la posición 4 y 5. La saturación de este grupo imino en las 1,4-

BDZ muestra que está asociado con pérdida de la actividad biológica, sin embargo la

actividad del clobazam no depende de esta característica estructural. Este compuesto

ha sido estudiado ampliamente en diversos modelos experimentales como: ansiolítico,

anticonvulsivante, en modelos de estudio electroencefalográficos y en estudios

psicométricos. Se ha demostrado que el clobazam presenta una actividad ansiolítica

eficaz, sin interferir con la función psicomotora que normalmente se produce con la

administración de las 1,4-BDZ ansiolíticas (6, 10.17). Con base en estos estudios, el

clobazam se utiliza actualmente en algunas patologías del SNC como la ansiedad y la

epilepsia. (9, 14).

3

c1

N - 1

B

5

2 \

3 CH2

C . /

Fig. 2 Estructura del Clobmam

El mecanismo de acción de las benzodiazepinas8 fue dilucidado en 1974 por

Haefely y Costa ( 9 ), quienes propusieron que este tipo de compuestos facilitan la

acción de una molécula clave de la comunicación química del cerebro, el ácido gamma

aminobutírico (GABA); Krnjevic y Schratz ( 3 ) demostraron en 1967 que el GABA es

un neurotransmisor inhibitorio. AI igual que otros neurotransmisores, se sabe que éste

actúa fijándose a receptores específicos de la membrana neuronal. Se han

caracterizado tres subtipos de receptores específicos del GABA en la superficie de las

neuronas: A, B y C. El GAB& es el receptor cor] el que interaccionan las

benzodiazepinas. Este receptor es un complejo macromolecular inmerso en la

membrana de la neurona, en su parte exterior, tiene una zona de reconocimiento que

4

fija al GABA, esta zona esta acoplada a un canal que atraviesa la membrana y que

incrementa la conductancia al cloro (canal de cloro). En reposo, en ausencia de GABA,

el canal está cerrado. Cuando el GABA se fija al receptor, el complejo cambia de

conformación; el canal se abre y se incrementa la permeabilidad al cloro, quedando el

estado eléctrico de la neurona modificado, se vuelve menos excitable y por lo tanto

menos sensible a los estímulos de los demás neurotransmisores, es decir, se induce

una hiperpolarización que da lugar a un potencial posináptico inhibitorio ( 15 ).

El complejo receptor al GABA, tiene además de la zona de reconocimiento, una

proteína fijadora de benzodiazepinas y otro sitio de unión para barbitúricos. La fijación

de las benzodiazepinas a este receptor "secundario" provoca un cambio de

conformación del complejo, que se vuelve más sensible al GABA, así las

benzodiazepinas facilitan la acción del GABA sobre las neuronas, induciendo una

modulación alostérica. En este caso la modulación es positiva porque la acción es

facilitadora (3, 8).

Por otro lado y en relación a este tipo de compuestos, en el Instituto de Química

de la UNAM, se han sintetizado una serie de moléculas de estructura 1,5-

benzodiazepínica (Fig. 3) ( 5 ) que requieren ser sometidas al estudio sistematizado de

su actividad biológica para la caracterización de algún (os) efecto (S) que

eventualmente pudiesen tener importancia terapéutica, dichos estudios comprenden

incluso los aspectos de toxicidad aguda y subaguda; en este sentido se puede señalar

que los estudios realizados de toxicidad aguda en el ratón y en la rata, revelaron un alto

margen de seguridad, lo que señala un bajo índice de toxicidad, cuando el compuesto

5

se administro agudamente en estas especies. Es importante señalar que este

compuesto ha mostrado actividad anticonvulsivante en el modelo de convulsiones

inducidas químicamente por el metrazol en el ratón. También se ha informado que este

tipo de compuesto es capaz de facilitar el sueño de rnovimientos oculares rápidos

(MOR) en la ( 1,2,4). 2 2 2 4 8 1

Por lo anterior y continuando con el esl,udio de estas moléculas y

considerando que las 1,4-BDZ presentan además de la actividad biológica, a nivel de

SNC también a nivel periférico, se considero de interés estudiar si esta nueva molécula

de estructura 1,5-benzodiazepina ejerce alguna actividad sobre el músculo liso

intestinal de cobayo, con las características de la actividad descrita para las 1,4-BDZ

clásicas ( 11 ).

Por otra parte se sabe que la preparación in vitro de íleon aislado de cobayo es

un excelente modelo para el cernimiento de numerosos fiirmacos, ya que este modelo

contiene diversos receptores a la mayoría de los neulrotransmisores ( acetilcolina,

serotonina, norepinefrina, neuropéptidos, substancia P, etc) ( 13 ).

6

SCH3

Cl

Fig. 3 Estructura de la 1,5-Benzodiazepina clorada (2-Tiometil-7”[p-C1- f enil]-4,5-Benzo-3-aza-2-nonem)

7

OB JEnVO GENERAL

Estudiar en el modelo in vifro de íleon aislado de cobayo, el efecto de la 1,5-

benzodiazepina clorada (2-Tiometil-7-[p-CI-fenil-4,5-Berazo-3-~a-Z-n0nem)~ sobre la

actividad espontánea y sobre las contracciones inducidas por la acetilcolina en esta

preparación.

OBJETIVOS PARTICULARES:

1) Probar la sensibilidad del músculo liso intestinal a la aoetilcolina y realizar curvas

dosis respuesta a este neurotransmisor.

2) Estudiar la sensibilidad del músculo liso intestinal a la 1,5-BDZ y realizar curvas

dosis respuesta a este compuesto.

3) Efectuar curvas dosis respuesta a la acetilcolina en presencia de diferentes

concentraciones de la 1,5-benzodiazepina.

8

METODOLOGIA:

Se emplearon segmentos de íleon, obtenidos de cobayos de la cepa Hartley,

macho, adultos de 250-3009. Los animales fueron mantenidos a temperatura constante

(22 f 2OC) en un cuarto con un ciclo luz-obscuridad (12 X 12 h), provistos con una dieta

estandar y agua ad libifurn.

Los animales fueron sacrificados por dislocación cervical y el íleon fue removido

e inmediatamente colocado en cajas de Petri que contenían solución Krebs con la X 8 no, siguiente composición (mM): NaHC03 25, NaCl 118, KC1 4.7, NaH2P04 1.2, MgCh 5 2 1.2, CaCI2 2.5, Cloruro de colina 0.929 y Glucosa 11; el íleon fue separado de la grasa $ 5

LAJ

5 8 6 5

y tejido conectivo circundante y se dividió transversalmente en segmentos de 1.5-2.0 E FE!

1 -

cm de longitud. Los segmentos de intestino fueron montados en una cámara para 2 3 niL! q

órgano aislado de 30 ml que contenía solución nutriente de Krebs, burbujeada con una 7r SI,

mezcla de 5% de C02 y 95% de O2 (carbógeno), manteniendo una temperatura de

37OC y un pH de 7.4 (Fig. 4). Cada segmento fue sometido a una tensión inicial de 2.0 g

y se mantuvo un período de estabilización de 35 min antes de la exposición al fármaco

en estudio. La actividad basal y la respuesta contráctil se se registraron a través de un

transductor FT03 conectado a un polígrafo Grass 79 D (16). Posteriormente se

realizaron, en diferentes preparaciones, curvas dosis respuesta (CDR) a la acetilcolina

sola (lX10-7 a lXIOs M), a la 1,5-BDZ sola (1x10" a lXIOd M) y a la acetilcolina en

presencia de diferentes concentraciones de la 1,5-BDZ (1x10" a lXIOd M). La

respuesta a la 1,5-BDZ-CI se midió y se expreso en gramos de tensión, agrupándose

9

en rangos (1 a 1.9, 2 a 2.9, 3 a 3.9 y 4 a 4.9 9). De igual forma se procedió con la

respuesta inducida con la acetilcolina y con el vehículo. Para cada condición

experimental se tomaron los mismos parámetros, después de un período de lavado de

15 min. Los resultados obtenidos se tabularon y se sometieron al análisis estadístico

de la prueba f de student y se consideraron estadísticamente significativos los valores

de ps 0.05.

10

TRANSDUCTOR GRASS 7D

T

Fig. 4 Montaje de la preparación de íleon aislado de cobayo macho, perfundido con solución nutriente de Krebs buibujeada con carbógeno y mantenido a una temperatura de 37" C con pH 7.4

11

. . . . .

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2 2 2 4 8 %

ACTIVIDADES REALIZADAS

Como parte del desarrollo de este proyecto,se realizo la búsqueda, revisión,

análisis y discusión de la información bibliográfica, en los seminarios internos del

laboratorio.

También se llevo a cabo el adiestramiento técnico y metodológico a seguir. Se

desarrollo la fase experimental del proyecto, para posteriormente realizar las E... $..>*," "

,.*"a

mediciones de los registros, la tabulación y el análisis estadístico de los resultados tat . i f ,, '.

obtenidos.

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS

En el presente trabajo se cumplieron los objetivos establecidos:

0 El manejo de órgano aislado

0 se probo el efecto de la acetilcolina y de la 1,5-BDZ-CI sobre el músculo liso

intestinal.

Se efectuaron curvas dosis respuesta a la acetilcolina en presencia de diferentes

concentraciones de la 1,5-BDZ.

Por otro lado, es importante destacar que el desarrollo del presente proyecto, dio

lugar a la presentación formal en un evento académico científico nacional (22).

2 2

RESULTADOS Y CONCLUSIONES

El efecto que produce la 1,5-benzodiazepina dorada sobre el músculo liso

intestinal de cobayo, se muestra en la Fig. 5, aquí se muestran los trazos

representativos de la actividad que induce este compuesto, en la parte superior se

observan tres patrones de actividad de la 1,5-BDZ a la concentración de 3x1 O5 M. En

la parte central se muestra también una curva dosis respuesta a la 1,5-BDZ a las dosis

de 10,30,1 O0 y 300 x 1 O ” M. En la parte inferior se incluye el comportamiento que

presento el músculo liso intestinal después de un período de lavado.

Estos registros muestran que durante la exposición a la 1,5-BDZ hay un

aumento significativo en la actividad contráctil del íleon, respecto a la actividad basal.

Después del lavado, esta actividad no solo persiste, sino clue se hace más intensa.

En la fig. 6, en el rango de 1 a 1.9 g, se observa que cuando se incubo el

músculo liso intestinal en presencia de la 1,5-BDZ-CI, hay un aumento significativo en

el número de contracciones, fenómeno que es dependiente de la concentración de la

1,5-BDZ; por otro lado se aprecia que, después del lavado aumentan en frecuencia e

intensidad las contracciones musculares.

En la fig. 7 se muestra el número de contracciones, en el rango de 2 a 2.9 g. En

esta figura se aprecia que en presencia de la BDZ existe un aumento en el número de

contracciones y que aún después del lavado el número de contracciones aumenta,

2 3

fenómeno que se manifiesta como un desplazamiento hacia la izquierda de la curva

dosis respuesta.

Analizando el rango de 3 a 3.9 g, se observo que el número de contracciones

en presencia de la BDZ es menor en comparación con el rango anterior. Pero, por otro

lado se observa que siguen persistiendo aún más las contracciones después del lavado

y que es más evidente el desplazamiento de la curva dosis respuesta hacia la izquierda

(Fig. 8).

La Fig. 9 muestra el número de contracciones en presencia de la BDZ en el

rango de 4 a 4.9 g, es muy notorio como estas contracciones aumentan después del

lavado y como la CDR esta desplazada hacia la izquierda.

En la Fig. 10 se aprecian las curvas dosis respuesta en conjunto de todos los

rangos de tensión (1 a 4.9 g) durante la incubación del músculo liso intestinal en

presencia de la 1,5-BDZ. Se observa que en el primer lrango de tensión (1 a 1.9 g) el

número de contracciones es mayor en comparación con los otros rangos de tensión.

Después de la incubación con la 1,5-BDZ se procedió a lavar el tejido y se

observo (Fig. 11) que el número de contracciones es significativamente mayor en todos

los rangos. Se aprecia que el primer rango (1 a 1.9 g) priedomina sobre los otros rangos

(2 a 4.9 g) . El análisis comparativo entre los resultados graficados en la Fig 10 y la Fig

11 se observa que si hay un aumento en el número de contracciones en respuesta a la

incubación con la BDZ, no obstante, después de un lavado intenso las contracciones se

24

mantienen, son más frecuentes y de mayor intensidad. Cabe destacar que estos

hallazgos son particularmente importantes, ya que se sabe que las benzodiazepinas

clásicas (1,4-BDZ) tienen un efecto inhibitorio sobre las contracciones espontáneas y

las evocadas eléctrica y farmacológicamente sobre el músculo liso intestinal, aspecto

que se confirmo en una serie de experimentos realizados con la 1,4-benzodiazepina

prototipo, el diazepam (Fig 14).

Por otro lado también se observo el efecto de la 1,5-BDZ en el número total de

contracciones en el rango de I a 4.5 g , se muestra ( Fi!g 12) que en presencia de la

BDZ hay un aumento en el número de contracciones; em contraste con el vehículo ,

donde se observa un efecto menor

Cuando se realizo la curva dosis respuesta a la acetilcolina, se observo un

aumento en el número de contracciones del músculo liso; (en cambio en presencia de la

acetilcolina más la 1,5-BDZ aumentan significativamente has contracciones

Cuando se realizó la incubación de la preparación en presencia de la 1,5-BDZ o

de la 1,4-BDZ (Diazepam), se encontró que aún a tiempos muy prolongados de

incubación (135 min), la 1,5-BDZ es capaz de aumentar el número de contracciones y

en contraste la incubación con la 1,4-BDZ (Diazepam) por el mismo período de

tiempo, no solo no incrementa las contracciones espontáneas, sino que incluso la abate

totalmente , aspecto que como ya sabemos está relacionado con la capacidad de las

1,4-BDZ como el diazepam para inhibir las contracciones inducidas eléctrica o

farmacológicamente (Fig. 14).

25

Por lo anterior podemos concluir que la 1,5-BDZ aumenta de manera

dependiente de la concentración, la intensidad y la frecuencia de las contracciones del

músculo liso intestinal. Este incremento persiste incluso después de un período de

lavado del tejido. Por el contrario, la incubación del músculo liso intestinal de cobayo en

presencia de la 1,5-BDZ bloquea la actividad contráctil espontánea en este tejido.

Asimismo la 1,5-BDZ sinergiza las contracciones que son inducidas por la acetilcolina.

Estos resultados permiten inferir que la actividad biológica de la 1,5-BDZ es de tipo

colinérgico muscarínico en el músculo liso intestinal in vih.

Son necesarios estudios adicionales para la caracterización de la actividad

biológica de esta molécula.

RECOMENDACIONES

Con el propósito de tener más información sobre 110s efectos farmacológicos de

la 1,5-BDZ, se sugiere la realización de estudios adicionales para la caracterización de

la actividad biológica de está molécula.

También considero, se deben realizar estudios cornparativos con alguna de las

1,4-BDZ ya conocida sobre los diversos modelos experimentales.

2 6

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