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A nálisis bioquímico

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A nálisisbioquímico

María Amorós Sánchez

Laura Barrero Cuevas

Colaboradores: Andrés Macías Hernández y Universidad Europea de Madrid;

Imágenes reproducidas gracias a la colaboración de la UEM: figuras 1.4 y 1.6.

© María Amorós SánchezLaura Barrero Cuevas

© EDITORIAL SÍNTESIS, S. A.Vallehermoso, 34. 28015 Madrid

Teléfono 91 593 20 98http://www.sintesis.com

ISBN: 978-84-9077-328-4Depósito Legal: M-19.098-2016

Impreso en España - Printed in Spain

Reservados todos los derechos. Está prohibido, bajo las sancionespenales y el resarcimiento civil previstos en las leyes, reproducir,

registrar o transmitir esta publicación, íntegra o parcialmente,por cualquier sistema de recuperación y por cualquier medio,

sea mecánico, electrónico, magnético, electroóptico, por fotocopiao por cualquier otro, sin la autorización previa por escrito

de Editorial Síntesis, S. A.

Índice

Índice

PRESENTACIÓN ............................................................................................................................................................... 11

1. TÉCNICAS APLICADAS EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA CLÍNICA ........................... 13

Objetivos .................................................................................................................................................................... 13Mapa conceptual .................................................................................................................................................. 14Glosario ....................................................................................................................................................................... 14 1.1. Introducción a la espectrometría ................................................................................................ 15

1.1.1. Conceptos básicos.................................................................................................................. 15 1.1.2. Ley de Lambert-Beer ............................................................................................................... 16 1.1.3. Equipos ........................................................................................................................................ 17

1.2. Espectroscopía de absorción molecular ................................................................................ 18 1.3. Espectroscopía de absorción y emisión atómica ............................................................. 20 1.4. Espectroscopía de luminiscencia ................................................................................................ 21

1.4.1. Fluorescencia y fosforescencia ........................................................................................... 22 1.4.2. Quimioluminiscencia .............................................................................................................. 22

1.5. Espectrometría de masas .................................................................................................................. 23 1.6. Espectrometría de dispersión de la radiación .................................................................... 24

1.6.1. Turbidimetría .............................................................................................................................. 24 1.6.2. Nefelometría .............................................................................................................................. 25

1.7. Refractometría ......................................................................................................................................... 26 1.8. Fotometría de reflectancia. Química seca ............................................................................. 26 1.9. Cromatografía ........................................................................................................................................... 27

1.9.1. Cromatografía plana ................................................................................................................ 27 1.9.2. Cromatografía en columna: de gases y HPLC ................................................................ 28

1.10. Uso eficiente de los recursos ......................................................................................................... 301.10.1. Calibración .................................................................................................................................. 301.10.2. Control de calidad .................................................................................................................. 30

6 Análisis bioquímico

índice

Resumen ..................................................................................................................................................................... 31Práctica n.º 1 ............................................................................................................................................................ 32Ejercicios propuestos ......................................................................................................................................... 34Test de autoevaluación ..................................................................................................................................... 35

2. ANÁLISIS DE GLÚCIDOS .................................................................................................................................. 37

Objetivos .................................................................................................................................................................... 37Mapa conceptual .................................................................................................................................................. 38Glosario ....................................................................................................................................................................... 38 2.1. Conceptos generales del metabolismo ................................................................................... 39 2.2. Estructura de los glúcidos ................................................................................................................ 40 2.3. Metabolismo de los glúcidos ......................................................................................................... 43

2.3.1. Glucólisis ..................................................................................................................................... 44 2.3.2. Vía de las pentosas fosfato .................................................................................................. 46 2.3.3. Ciclo de Krebs ........................................................................................................................... 46 2.3.4. Gluconeogénesis...................................................................................................................... 47

2.4. Patrones de alteración del metabolismo de los glúcidos ........................................... 48 2.4.1. Determinaciones de la glucemia basal ............................................................................ 50 2.4.2. Test de tolerancia oral a la glucosa ................................................................................... 51 2.4.3. Determinación de hemoglobina glicosilada ................................................................. 52 2.4.4. Determinación de fructosamina ......................................................................................... 53

Resumen ..................................................................................................................................................................... 53Supuesto práctico ................................................................................................................................................ 54Ejercicios propuestos ......................................................................................................................................... 55Test de autoevaluación ..................................................................................................................................... 55

3. ANÁLISIS DE PROTEÍNAS ................................................................................................................................ 59

Objetivos .................................................................................................................................................................... 59Mapa conceptual .................................................................................................................................................. 60Glosario ....................................................................................................................................................................... 60 3.1. Estructura de las proteínas .............................................................................................................. 61 3.2. Metabolismo de las proteínas ....................................................................................................... 64

3.2.1. Transaminación .......................................................................................................................... 65 3.2.2. Desaminación ............................................................................................................................ 65 3.2.3. Ciclo de la urea ......................................................................................................................... 65

3.3. Patrones de alteración del metabolismo de proteínas ................................................. 66 3.3.1. Determinación de proteínas totales .................................................................................. 67 3.3.2. Proteinograma. Fracciones electroforéticas ................................................................... 69 3.3.3. Determinación de troponina, péptido natriurético y mioglobina ........................ 72

Resumen ..................................................................................................................................................................... 73Supuesto práctico ................................................................................................................................................ 74Ejercicios propuestos ......................................................................................................................................... 74Lee y debate en clase ....................................................................................................................................... 75Test de autoevaluación ..................................................................................................................................... 77

4. ANÁLISIS DE LÍPIDOS ........................................................................................................................................ 79

Objetivos .................................................................................................................................................................... 79

7Análisis bioquímico

índice

Mapa conceptual .................................................................................................................................................. 80Glosario ....................................................................................................................................................................... 81 4.1. Clasificación de los lípidos ............................................................................................................... 81

4.1.1. Estructura de los lípidos........................................................................................................ 82 4.1.2. Funciones de los lípidos ....................................................................................................... 84

4.2. Estructura de las lipoproteínas y apolipoproteínas......................................................... 84 4.2.1. Lipoproteínas ............................................................................................................................. 85 4.2.2. Apolipoproteínas .................................................................................................................... 86

4.3. Metabolismo de lípidos ..................................................................................................................... 87 4.4. Patrones de alteración del metabolismo de los lípidos ............................................... 88

4.4.1. Determinacion de colesterol total y triglicéridos ........................................................ 89 4.4.2. Determinacion de lipoproteínas y apolipoproteínas ................................................ 90

Resumen ..................................................................................................................................................................... 92Práctica n.º 2 ............................................................................................................................................................ 92Ejercicios propuestos ......................................................................................................................................... 94Test de autoevaluación ..................................................................................................................................... 95

5. ANÁLISIS DE PRODUCTOS FINALES DEL METABOLISMO ........................................................... 97

Objetivos .................................................................................................................................................................... 97Mapa conceptual .................................................................................................................................................. 98Glosario ....................................................................................................................................................................... 99 5.1. Compuestos nitrogenados no proteicos: urea y creatinina ....................................... 99

5.1.1. Urea ............................................................................................................................................... 100 5.1.2. Creatinina ..................................................................................................................................... 101

5.2. Ácido láctico y ácido pirúvico ...................................................................................................... 104 5.2.1. Ácido láctico ............................................................................................................................. 104 5.2.2. Ácido pirúvico .......................................................................................................................... 106

5.3. Cuerpos cetónicos ................................................................................................................................ 106 5.4. Bilirrubina total, directa e indirecta ........................................................................................... 108

5.4.1. Patrones de alteración ............................................................................................................ 109 5.5. Productos finales del metabolismo de las purinas. Determinación ................................ 111

5.5.1. Ácido úrico ................................................................................................................................ 112Resumen ..................................................................................................................................................................... 114Supuesto práctico ................................................................................................................................................ 114Ejercicios propuestos ......................................................................................................................................... 115Test de autoevaluación ..................................................................................................................................... 117

6. DETERMINACIÓN DE ENZIMAS.................................................................................................................... 119

Objetivos .................................................................................................................................................................... 119Mapa conceptual .................................................................................................................................................. 120Glosario ....................................................................................................................................................................... 121 6.1. Utilidad de la determinación enzimática en el diagnóstico clínico ................................ 121 6.2. Fisiología enzimática ............................................................................................................................ 123 6.3. Cinética enzimática............................................................................................................................... 126 6.4. Clasificación de las enzimas ............................................................................................................ 127 6.5. Determinación de la actividad enzimática ............................................................................ 128 6.6. Isoenzimas .................................................................................................................................................. 130 6.7. Patrones de alteración enzimática ............................................................................................. 131


índice

6.7.1. Enzimas asociadas a síndromes hepáticos .................................................................... 131 6.7.2. Enzimas asociadas a patologías pancreáticas .............................................................. 133 6.7.3. Enzimas asociadas a patologías cardiacas .................................................................... 134 6.7.4. Enzimas asociadas a patologías musculares ................................................................. 134

Resumen ..................................................................................................................................................................... 135Supuesto práctico ................................................................................................................................................ 136Ejercicios propuestos ......................................................................................................................................... 136Test de autoevaluación ..................................................................................................................................... 137

7. TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO DE MUESTRAS DE ORINA ............................................................. 139

Objetivos .................................................................................................................................................................... 139Mapa conceptual .................................................................................................................................................. 140Glosario ....................................................................................................................................................................... 140 7.1. Estudio de la orina ................................................................................................................................ 141

7.1.1. Sistema excretor ....................................................................................................................... 141 7.1.2. Formación de la orina ............................................................................................................. 142

7.2. Estudio macroscópico de la orina .............................................................................................. 144 7.2.1. Color y turbidez ....................................................................................................................... 144 7.2.2. Olor ............................................................................................................................................... 144 7.2.3. Volumen ...................................................................................................................................... 144 7.2.4. Densidad y osmolalidad ....................................................................................................... 145 7.2.5. pH .................................................................................................................................................. 145

7.3. Estudio bioquímico de la orina .................................................................................................... 146 7.3.1. Glucosa ....................................................................................................................................... 146 7.3.2. Cuerpos cetónicos .................................................................................................................. 147 7.3.3. Proteínas ...................................................................................................................................... 147 7.3.4. Leucocitos ................................................................................................................................... 148 7.3.5. Nitritos ......................................................................................................................................... 148 7.3.6. Sangre ........................................................................................................................................... 148 7.3.7. pH .................................................................................................................................................. 149 7.3.8. Bilirrubina y urobilinógeno ................................................................................................... 149

7.4. Aclaramiento de creatinina ............................................................................................................. 150 7.5. Estudio microscópico de la orina ............................................................................................... 151

7.5.1. Células .......................................................................................................................................... 151 7.5.2. Cilindros ....................................................................................................................................... 154 7.5.3. Cristales ........................................................................................................................................ 155 7.5.4. Microorganismos ...................................................................................................................... 157 7.5.5. Artefactos .................................................................................................................................... 158

7.6. Cálculos renales ...................................................................................................................................... 158Resumen ..................................................................................................................................................................... 159Práctica n.º 3 ............................................................................................................................................................ 160Ejercicios propuestos ......................................................................................................................................... 162Lee y debate en clase ....................................................................................................................................... 162Test de autoevaluación ..................................................................................................................................... 163

8. DETERMINACIONES EN HECES Y OTROS LÍQUIDOS CORPORALES ..................................... 165

Objetivos .................................................................................................................................................................... 165Mapa conceptual .................................................................................................................................................. 166

9Análisis bioquímico

índice

Glosario ....................................................................................................................................................................... 166 8.1. Estudio de la función digestiva ..................................................................................................... 167

8.1.1. Síndromes de malabsorción ............................................................................................... 167 8.1.2. Determinación de sustancias eliminadas por las heces ............................................ 168 8.1.3. Sangre oculta en heces .......................................................................................................... 169 8.1.4. Jugo gástrico .............................................................................................................................. 169

8.2. Estudio bioquímico, microscópico y macroscópico de otros líquidos corporales.......................................................................................................... 170

8.2.1. Líquido cefalorraquídeo ....................................................................................................... 170 8.2.2. Líquido sinovial ......................................................................................................................... 173

8.3. Estudio bioquímico, microscópico y macroscópico de líquidos serosos ......... 175 8.3.1. Líquido pleural .......................................................................................................................... 176 8.3.2. Líquido pericárdico ................................................................................................................ 178 8.3.3. Líquido peritoneal ................................................................................................................... 179

8.4. Estudio del semen. Seminograma ............................................................................................... 181 8.4.1. Estudio físico del semen ....................................................................................................... 181 8.4.2. Estudio bioquímico del semen .......................................................................................... 183

Resumen ..................................................................................................................................................................... 184Práctica n.º 4 ............................................................................................................................................................ 184Ejercicios propuestos ......................................................................................................................................... 186Lee y debate en clase ....................................................................................................................................... 187Test de autoevaluación ..................................................................................................................................... 188

9. DETERMINACIONES EN TRASTORNOS DE LOS EQUILIBRIOS HIDROELECTROLÍTICO Y ÁCIDO-BASE ........................................................................................................................................................ 191

Objetivos .................................................................................................................................................................... 191Mapa conceptual .................................................................................................................................................. 192Glosario ....................................................................................................................................................................... 192 9.1. Equilibrio hidroelectrolítico ............................................................................................................ 193

9.1.1. Osmolalidad .............................................................................................................................. 194 9.1.2. Electrolitos de interés diagnóstico. Determinación y alteraciones ....................... 194 9.1.3. Otros iones de interés ............................................................................................................ 196

9.2. Equilibrio ácido-base .......................................................................................................................... 197 9.2.1. Sistemas tampón ...................................................................................................................... 199 9.2.2. Patrones de alteración de gases en sangre .................................................................... 201 9.2.3. Gasometría .................................................................................................................................. 203

9.3. Determinaciones a la cabecera del paciente ...................................................................... 204Resumen ..................................................................................................................................................................... 206Supuesto práctico ................................................................................................................................................ 206Ejercicios propuestos ......................................................................................................................................... 207Test de autoevaluación ..................................................................................................................................... 208

10. DETERMINACIONES BIOQUÍMICAS INDICADAS EN ESTUDIOS ESPECIALES ................. 211

Objetivos .................................................................................................................................................................... 211Mapa conceptual .................................................................................................................................................. 212Glosario ....................................................................................................................................................................... 21210.1. Fisiopatología hormonal .................................................................................................................... 213

10.1.1. Eje hipotálamo-hipófisis........................................................................................................ 214


índice

10.1.2. Glándula tiroidea y paratiroidea......................................................................................... 21610.1.3. Páncreas endocrino ................................................................................................................. 21910.1.4. Hormonas sexuales.................................................................................................................. 22010.1.5. Glándulas adrenales ................................................................................................................ 22110.1.6. Determinación de hormonas en el laboratorio clínico .............................................. 223

10.2. Marcadores tumorales ........................................................................................................................ 22410.2.1. Tipos .............................................................................................................................................. 224

10.3. Determinación y cuantificación de drogas de abuso ..................................................... 22510.3.1. Tipos .............................................................................................................................................. 226

10.4. Monitorización de fármacos ........................................................................................................... 22610.5. Protocolo de estudio de cálculos biliares ............................................................................. 227Resumen ..................................................................................................................................................................... 228Supuesto práctico ................................................................................................................................................ 228Ejercicios propuestos ......................................................................................................................................... 229Lee y debate en clase ....................................................................................................................................... 230Test de autoevaluación ..................................................................................................................................... 231

11. DETERMINACIONES BIOQUÍMICAS INDICADAS DURANTE EL EMBARAZO .................... 233

Objetivos .................................................................................................................................................................... 233Mapa conceptual .................................................................................................................................................. 234Glosario ....................................................................................................................................................................... 23411.1. Determinaciones durante el embarazo ................................................................................... 235

11.1.1. Diagnóstico bioquímico del embarazo .......................................................................... 23511.1.2. Cribado y diagnóstico prenatal ............................................................................................. 23611.1.3. Determinación precoz de enfermedades endocrinometabólicas del recién nacido ..................................................................................................................... 238

11.2. Pruebas de fertilidad ........................................................................................................................... 239Resumen ..................................................................................................................................................................... 243Práctica n.º 5 ............................................................................................................................................................ 244Ejercicios propuestos ......................................................................................................................................... 245Lee y debate en clase ....................................................................................................................................... 245Test de autoevaluación ..................................................................................................................................... 246

BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................................................................. 249

1

Técnicas aplicadas en el laboratorio

de bioquímica clínica

3 Conocer conceptos básicos relacionados con las técnicas de espectroscopía.3 Explicar la ley de Lambert-Beer.3 Comprender el fundamento de los distintos métodos basados en la medición

de la radiación electromagnética.3 Enumerar y conocer los distintos elementos de los equipos.3 Conocer las aplicaciones más importantes de estas técnicas.3 Aprender los métodos cromatográficos y sus aplicaciones.3 Entender el concepto de control de calidad en un laboratorio.

Objetivos

14 anáLIsIs bIoQuÍmIco

caPÍTuLo 1

Mapa conceptual

Analito. Componente de interés presente en una muestra clínica.

Átomo. Unidad mínima de la materia que presenta propiedades químicas.

Calibrador. Líquido con analitos de concentración conocida utilizados para calibrar los instrumentos de medida, ajustando el resultado lo máximo posible a los valores esperados.

Control. Líquido biológico con concentraciones de analitos conocidas que se suelen procesar junto a las muestras para evaluar la validez de un resultado. Los valores del control deben estar dentro de unos límites determinados para que el resultado sea fiable.

Electrón. Partícula con carga eléctrica negativa que forman parte del átomo.

Fotón. Partícula de la luz que viaja por el vacío con masa cero.

Glosario

Radiación electromagnética

Líquidos de referencia

Materia

Resultados fiables

Técnicas de medida

Separación

Detección

Solutos/disolventesOsmometría

Control de calidad

Cromatografía

Interacción

TÉCNICAS APLICADAS EN EL LABORATORIO CLÍNICO

15Técnicas aplicadas en el laboraTorio de bioquímica clínica

capíTulo 1

1.1. Introducción a la espectrometría

En el laboratorio de bioquímica clínica se emplean numerosas, variadas y pioneras técnicas analíticas. Se ha logrado automatizar la mayor parte de las determinaciones para dar cobertura a la amplia demanda de este tipo de valoraciones. Muchas de las técnicas utilizadas están basadas en la luz como fundamento de la técnica.

La luz está formada por fotones. La energía correspondiente a cada fotón es directamente proporcional a la frecuencia (υ) e inversamente relacionada con su longitud de onda (λ). A ma-yor longitud de onda menor será la cantidad de energía. En el laboratorio clínico se trabaja en la franja lumínica desde la luz ultravioleta (180 nm) hasta el infrarrojo (800 nm).

Cuando la luz a una determinada longitud de onda incide sobre la molécula a estudio pue-den darse tres situaciones que son de interés en el laboratorio clínico (figura 1.1).

1.1.1. Conceptos básicos

Las técnicas que tienen como fundamento la luz van a proporcionar información tanto cua-litativa como cuantitativa al medir la intensidad de la luz absorbida, refractada, dispersada,

Conceptos clave

• Frecuencia (υ): número de oscilaciones completas que realiza una onda por segundo.• Longitud de onda (λ): distancia que recorre una onda en un periodo de tiempo. Se

mide en nanómetros (nm).

Toma noTa

• Parte de la luz se absorbe y parte se transmite sin pérdida de energía

Técnicas de especTromeTría1

• La luz se dispersa al contactar con la molécula, cambia de dirección sin pérdida de energía

Técnicas de TurbidimeTría y nefelomeTría2

• La luz absorbida se pierde por interacciones o por calor, por ejemplo, emisión de un fotón de menor energía

Técnicas de fluorescencia y fosforescencia3

Figura 1.1 Interacción de la radiación electromagnética con la materia


cApítulo 1

transmitida o reflejada tras la interacción del haz de luz con las sustancias de interés que se encontrarán en disolución.

l Espectro electromagnético. Se conoce así a la distribución de las ondas electromagnéticas en función de su energía. Las ondas electromagnéticas se producen por la oscilación de los campos eléctricos y magnéticos. Referido a una molécula o analito por determinar, se de-fine como espectro de emisión según la radiación electromagnética que emite o espectro de absorción en función de la que absorbe. El espectro electromagnético engloba desde la radiación de menor longitud de onda, como los rayos gamma y los rayos X, continuando con la luz ultravioleta, la luz visible y los rayos infrarrojos, hasta las ondas de radio, que son las de mayor longitud de onda. A menor longitud de onda, las radiaciones son más energéticas.

l Relación entre la absorción de luz y la concentración. Cuando un haz de luz incide con cierta intensidad (I0) sobre una solución con cierta concentración de una sustancia, la intensi-dad del haz de luz que sale (I) será inferior a la inicial, ya que parte de esa intensidad ha sido absorbida por la solución. A mayor concentración de un determinado compuesto en una solución, mayor es la absorción de luz.

– Transmitancia: relaciona la I frente a la I0 a una determinada longitud de onda. Gene-ralmente se expresa como porcentaje.

T = I / I0

% T = 100 × (I / I0)

– Absorbancia: es el logaritmo inverso de la transmitancia.

A = log (I / I0)A = log (1 / T)

Las moléculas tienen la capacidad de absorber la luz a determinadas longitudes de onda. Si se representan las distintas absorbancias de una moléculas a distintas longitudes de onda, se obtiene lo que se conoce como espectro de absorbancia.

1.1.2. Ley de Lambert-Beer

Según la ley de Lambert-Beer (figura 1.2), hay una relación directa entre la absorbancia de una so-lución y la concentración de dicha solución. Dicha relación se establece en la siguiente ecuación.

Conceptos clave

• Espectroscopía: conjunto de métodos que se basan en la interacción de la radiación electromagnética con la materia, que se traduce en absorción y emisión de energía.

• Espectrometría: conjunto de técnicas espectroscópicas que pueden medir esa inte-racción, por lo que permiten cuantificar sustancias en muestras biológicas mediante la radiación que se absorbe o se emite.

Toma noTa


capíTulo 1

El coeficiente de absortividad (ε) es característi-co para cada sustancia e indica la cantidad de luz absorbida por dicha sustancia cuando se encuen-tra en disolución; cuanto mayor es el valor de ε, mayor es la capacidad de absorber luz y más sen-sible será la determinación. Su valor está influen-ciado por la longitud de onda, el pH de la diso-lución, la temperatura y el solvente.

La proporcionalidad de la ley de Lam-bert-Beer entre la absorbancia y concentración de una disolución solo se cumple si la concen-tración de la sustancia no es muy elevada y la disolución es homogénea.

1.1.3. Equipos

Los equipos instrumentales de espectroscopía conocidos como espectrofotómetros están com-puestos por una serie de elementos comunes a todos ellos. Dichos componentes son:

l Lámpara como fuente de energía: se utilizan lámparas halógenas o de tungsteno para longi-tudes de onda a partir de 350 nm y lámparas de hidrógeno o deuterio para el espectro ultravioleta.

l Selector de longitud de onda: es necesario seleccionar la longitud de onda a la que trabaja el aparato. Los selectores pueden ser:

– Monocromadores: varían la radiación de forma continua.– Filtros de absorción: absorben solo en longitudes de onda del espectro visible. – Filtros de interferencia: consiguen un rango de radiación estrecha.

l Cubeta: es el recipiente donde se va alojar la disolución problema. Presenta 1 cm de an-cho y debe dejar pasar la luz a través de ella. Para longitudes de onda inferiores a 320 nm se utilizan cubetas de cuarzo; para mayores longitudes de onda se pueden usar cubetas de plástico, que son más baratas.

l Detector de energía: convierte la luz que recibe en una señal eléctrica. Los más utilizados son:

– Fotomultiplicadores: originan un flujo continuo de corriente eléctrica.

A = ε · c · l

c

l

Figura 1.2 Ley de Lambert-Beer

Digitalización: Andrés Macías (Adrestudio)

Para saber más

Según las unidades en las que se exprese el coeficiente de absortividad, se habla de absor-tividad molar cuando se utiliza mol/l para indicar la concentración y absortividad específica cuando la concentración se expresa en g/l.


cApítulo 1

– Diodos: detectan varias longitudes de onda simultáneamente; son útiles para obtener espectros.

– Térmicos: miden el aumento de temperatura.

l Registrador o sistema de lectura: traduce la información recibida en información interpre-table para el técnico.

1.2. Espectroscopía de absorción molecular

La espectroscopía de absorción se basa en la capacidad de las moléculas para absorber luz. Se puede realizar un análisis cualitativo, comparando el espectro de absorción de la muestra pro-blema con espectros de patrones de composición conocida e identificar las bandas comunes de absorción, o realizar un análisis cuantitativo, en este caso se utiliza la ecuación de Lambert-Beer para calcular la concentración de la sustancia a estudio.

Debe intentarse valorar la absorbancia a la longitud de onda de máxima absorción de la sustancia a determinar para evitar errores. Hay ciertos factores que pueden alterar la relación entre la absorbancia y la concentración de la sustancia problema que deben conocerse:

Actividad propuesta 1.1

Haz un esquema de los elementos comunes presentes en todos los espectrofotómetros y explica cada uno de ellos.

Fuente de luz Monocromador Cubeta Detector

Selectorde longitud

de onda

Figura 1.3 Espectrofotómetro Digitalización: Andrés Macías (Adrestudio)

Figura 1.4 Espectrofotómetro y cubetas con disoluciones problema Fuente: cortesía de la Universidad Europea de Madrid


capíTulo 1

l Parte de la energía que incide en la muestra puede ser absorbida por el solvente o la pared de la cubeta.

l La luz que incide no es totalmente monocromática.l Puede haber cierta dispersión de la energía.

Para controlar dichos factores se realiza un blanco de todos los elementos que componen la disolución además de la sustancia problema.

A) Espectroscopía ultravioleta-visible

La espectroscopía ultravioleta-visible (UV-VIS) se refiere a la espectroscopía que se realiza en el espectro del rango ultravioleta-visible (380-700 nm, aproximadamente).

l Fundamento. Se mide la absorbancia o transmitancia de la muestra tras la incidencia de un haz de luz sobre la muestra. Para determinar la concentración de la sustancia a estudio se aplica la ley de Lambert-Beer.

l Instrumentación. Actualmente los equipos cada vez están más automatizados, sin embargo, el esquema general del aparataje es el común a todos los espectrofotómetros (explicado en el apartado 1.1.3).

l Aplicaciones. Las aplicaciones más comunes para las que se utiliza esta técnica son:

– Determinación de la concentración de proteínas. Las proteínas presentan dos grupos pro-tencialmente cromóforos, es decir, capaces de absorber luz:

❍Los enlaces peptídicos, que absorben a una λmáxima= 200 nm, que corresponde a UV-lejano.

❍Las cadenas laterales de aminoácidos, los más significativos los grupos aromáticos, que absorben a una λmáxima= 280 nm, que corresponde a UV-cercano.

– Determinación de ácidos nucleicos. Las bases nitrogenadas están compuestas por gru-pos aromáticos, por tanto absorben a una λmáxima= 280 nm; UV-cercano. Cuando se desnaturaliza la doble hélice, hay una banda de máxima absorción y absorben a una λmáxima= 260 nm.

– Determinación de enzimas (ELISA), muy frecuente y utilizado. Valora la variación de la absorbancia en el tiempo en el que transcurre la reacción enzimática.

– Colorimetrías para medir la absorbancia de un grupo coloreado que, al absorber la energía lumínica de la radiación, cambiará de color.

Concepto clave

• Fotón: representa la partícula mínima que transporta energía lumínica u otro tipo de radiación. Se comporta como una onda en fenómenos como la radiación y, sin embargo, actúa como partícula cuando interactúa con la materia. Su valor viene determinado por la constante de Planck y la frecuencia de la radiación.

Toma noTa


cApítulo 1

B) Espectroscopía de infrarrojo cercano

La espectroscopía de infrarrojo cercano (IR) corresponde a la que se realiza dentro de la región del infrarrojo cercano (λ > 760 nm). Se utiliza para valorar moléculas que están en con-tinuo cambio por vibración o rotación de los enlaces. Se debe tener en cuenta que no todos los cambios pueden detectarse en el IR.

Se pueden analizar muestras en disolución y también en estado sólido o gaseoso, es menos sensible que la espectroscopía UV-VIS y también menos utilizada.

1.3. Espectroscopía de absorción y emisión atómica

Es una técnica ampliamente usada en el laboratorio clínico, principalmente para la determina-ción de elementos químicos como zinc, litio, aluminio, hierro... y otros metales pesados. Es una técnica como las descritas anteriormente, basada en la capacidad de los átomos de absorber o emitir energía, y se caracteriza por ser una técnica sensible, específica y precisa.

A) Espectroscopía de absorción atómica

A continuación se detalla el fundamento, la instrumentación y las aplicaciones de esta técnica:

l Fundamento. Esta técnica se basa en la capacidad que tienen los electrones de un ele-mento químico en el estado fundamental para saltar a orbitales más excitados gracias a la energía lumínica que absorben. Los electrones de cada sustancia realizan saltos característicos y a una longitud de onda concreta, por ello cada elemento forma un espectro concreto.

Para realizar esta técnica la muestra debe estar en estado gaseoso, ya que es en este estado en el que los átomos de la molécula están capacitados para absorber energía en su banda espectral, es decir, a una longitud de onda determinada. Se parte de una mues tra en solución que se calienta gracias a una fuente de energía calórica (llama): así la mues-tra pasa al estado gaseoso; posteriormente se irradia a una determinada longitud de onda según el analito a determinar y se valora la energía transmitida por la molécula después de absorber la energía.

l Instrumentación. Además de los elementos propios de los espectrofotómetros explicados anteriormente, en esta técnica los analizadores presentan un elemento nuevo, los atomi-zadores o sistemas de atomización que se localizan entre la fuente y el selector de onda y se encargan de proporcionar la temperatura suficiente para que la muestra pase de estado líquido a gaseoso. Existen distintos tipos de atomizadores: unos utilizan una llama y una mezcla de gases, llegando a alcanzar hasta 2.300 °C; otros sistemas no utilizan llama, como el horno de grafito.

l Aplicaciones. Principalmente se utiliza para determinar elementos químicos y metales pe-sados. Esta técnica tiene numerosas ventajas por ser muy sensible, específica y precisa, sin embargo, la mayoría de las veces no cumple la ley de Lambert-Beer porque hay muchas interferencias.


capíTulo 1

B) Espectroscopía de emisión atómica


l Fundamento. Consiste en la excitación térmica de los átomos utilizando una llama o chispa en una longitud de onda determinada según la sustancia. De esta manera, cuan-do los electrones vuelven a su estado basal de energía, liberan energía en una longitud de onda característica de cada elemento, que se puede cuantificar. La intensidad de la energía que emiten los átomos es directamente proporcional a la cantidad de átomos excitados y, por tanto, a la concentración del elemento a valorar en la muestra.

l Instrumentación. Los aparatos utilizados para la realización de la técnica son del mismo estilo que los utilizados para la técnica de absorción atómica.

l Aplicaciones. Se utiliza para determinar elementos químicos abundantes, como sodio, potasio, litio… en líquidos biológicos. Es una técnica que apenas se utiliza actualmente en el laboratorio clínico.

1.4. Espectroscopía de luminiscencia

También conocida como técnica espectroscópica de emisión molecular, es mucho más sensible que las técnicas de absorción, sin embargo, tiene menos aplicación en el laboratorio clínico. Se puede distinguir entre técnicas de fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia molecu-lar; todas ellas se basan en la propiedad de emitir luz que tienen algunas moléculas y la cantidad de luz emitida es proporcional a la concentración de las moléculas luminiscentes, es decir, ca-paces de emitir luz. A continuación se explica cada una de las técnicas.

Para que los electrones de la molécula se exciten y pasen de un orbital a otro es ne-cesaria una radiación a una longitud de onda específica para cada molécula, para ello se utilizan lámparas de cátodo hueco

que deben estar hechas del mismo mate-rial que la molécula que se va a determi-nar, es decir, una lámpara de cátodo hueco de hierro solo puede usarse para determi-nar el hierro.

InTeresanTe

Actividades propuestas

1.2. ¿Por qué en el caso de la espectroscopía de absorción atómica la muestra debe estar en estado gaseoso?

1.3. Indica las principales diferencias entre la espectroscopía de absorción en el UV-VIS y la de absorción atómica.


cApítulo 1

1.4.1. Fluorescencia y fosforescencia


l Fundamento. La molécula absorbe fotones procedentes de la fuente de energía y pasa a un estado más excitado; cuando vuelve a su estado inicial o estado fundamental, emite esa energía en forma de luz, que puede ser cuantificada. La energía que se emite es algo menor a la absorbida, ya que se pierde una pequeña cantidad, por tanto, la longitud de onda emitida es mayor a la longitud de onda incidente.

l Instrumentación. Los aparatos que se utilizan para estas técnicas se denominan fluoríme-tros. Su composición es similar a la de los espectrofotómetros, a excepción de los mono-cromadores, que en este caso se colocan antes y después de la cubeta de la muestra para captar la fluorescencia emitida. Y generalmente el detector de la emisión está colocado en un ángulo de 90° respecto a la luz incidente, proporcionando mayor sensibilidad a la técnica.

l Aplicaciones. Es una técnica muy sensible, por ello es utilizada para detectar moléculas que se encuentran en concentraciones muy bajas o en muestras muy diluidas. También es utilizada para determinar fármacos, algunos marcadores de enfermedades y proteínas a partir de la determinación de los aminoácidos aromáticos que contengan, ya que estos presentan fluorescencia. Los aminoácidos aromáticos son la fenilalanina, la tirosina y el triptófano.

1.4.2. Quimioluminiscencia

Se habla de quimioluminiscencia cuando la excitación de los electrones de una molécula se produce por una reacción química y las moléculas excitadas emiten luz al volver a su estado fundamental. Esta técnica es muy utilizada en técnicas de inmunodetección y es conocida como inmunoquimioluminiscencia.

l Aplicaciones. En el laboratorio clínico existen sistemas automatizados que utilizan la tec-nología de inmunoanálisis quimioluminiscente (o inmunoquimioluminiscencia) para la detección de compuestos presentes en muestras biológicas. A continuación se describe

Actividad resuelta

1.1. ¿Cuál de los tres aminoácidos aromáticos es el que presenta menor fluorescencia y por qué?

Solución:

De los tres aminoácidos aromáticos, el que menor capacidad fluorescente presenta es la fenilalanina. La fenilalanina presenta menor coeficiente de absortividad que el trip-tófano y la tirosina, lo que se traduce en una menor capacidad de absorber energía y consecuentemente de emitirla.

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