Procedimientos en Microbiología Clínica

Recomendaciones de la Sociedad Española de EnfermedadesInfecciosas y Microbiología Clínica

Editor: Juan J. Picazo

Coordinador: Manuel Casal

Antonio GuerreroNuria MartínSantiago MorenoMª Carmen Nogales

INDICE

Introducción.

Micobacterias de interés clínico

Características del género Mycobacterium

Cuadros clínicos.

Obtención de muestras clínicas.

Diagnóstico de muestras clínicas. Visualización. Descontaminación. Cultivo. Técnicas genéticas

Proceso de identificación. Métodos bacteriológicos. Métodos bioquímicos. Métodos genéticos. Otros métodos.

Estudios de sensibilidad a antimicrobianos. Detección de resistencias de M. Tuberculosis. Detección de resistencias de otras micobacterias.

Marcadores Epidemiológicos. Técnicas genéticas. Otros marcadores.

Controles microbiológicos del tratamiento antimicrobiano.

Niveles de laboratorios de micobacteriología.

Medidas de seguridad de los laboratorios de micobacteriología.

Controles de calidad.

Bibliografía.

9. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LAS INFECCIONES POR MICOBACTERIAS1999

1.- INTRODUCCIÓNLas enfermedades ocasionadas por micobacteriasconstituyen sin duda un capítulo importante de lapatología infecciosa humana encuadrandoenfermedades tan antiguas como la tuberculosis yla lepra y otras como las micobacteriosis.La lepra, con un millón de casos estimados en elmundo, para la que no existen ni métodos decultivo ni vacunas adecuadas.La tuberculosis con 8 millones de casos en elmundo, largos períodos de tratamiento queocasionan abandonos y resistencia a las drogas.La coinfección tuberculosis y SIDA puedeaparecer en el 30-50% de casos de SIDA.Igualmente, las micobacteriosis ocasionadas pormicobacterias diferentes al Mycobacteriumtuberculosis y Mycobacterium leprae aumentan suincidencia debido a la inmunodepresión y demanera especial con el SIDA en cuyos enfermosMycobacterium avium intracellulare se haconvertido en países como USA en un patógenooportunista frecuente y de difícil tratamiento.En la actualidad, el retraso diagnóstico yterapéutico y el no cumplimiento correcto de lostratamientos ha complicado el panorama de estasenfermedades, con la aparicición de cepas conresistencia multiple a fármacos.Por todo ello pensamos que hoy la MicrobiologíaClínica de las micobacterias es fundamental parael diagnóstico precoz y para el control de lacuración de estas enfermedades.El objetivo de estas recomendaciones no es hacerun exhaustiva exposición o revisión de técnicasdiagnósticas, que puedan encontrarse enmanuales o artículos de la bibliografía existente,sino que ha sido el poner de manifiesto, a la luz delos conocimientos actuales y de la experienciapropia de los autores, los aspectos másimportantes a tener en cuenta por clínicos ymicrobiólos para poder realizar un diagnóstico delas enfermedades por micobacterias, lo másrápida y eficazmente posible.

2.- MICOBACTERIAS DE INTERÉS CLÍNICOEl género Mycobacterium incluye más de 100especies que pueden clasificarse en seis gruposdesde el punto de vista bacteriológico, pero confines didácticos se dividen en tres apartados:Complejo tuberculosis. Incluye las especies M.tuberculosis, Mycobacterium bovis (incluida lacepa BCG) y Mycobacterium africanum,productoras todas ellas de tuberculosis. Se incluyetambién Mycobacterium microti, productor detuberculosis en rata.

Complejo lepra. En el que se incluyen lasespecies M. leprae, productor de la lepra humana,y Mycobacterium lepraemurium, que produce lepraen roedores.Otras Micobacterias. Micobacterias nocomprendidas en los dos grupos anteriores. Sóloalgunas de ellas suelen ser patógenas, otraspueden ser patógenas oportunistas y finalmenteotras suelen ser saprofitas. Producen lasdenominadas micobacteriosis.

3.- CARACTERÍSTICAS GENERALES DELGÉNERO MYCOBACTERIUM. M.TUBERCULOSISSi bien las micobacterias en general pueden variarmucho en su morfología, desde formas cocoidespequeñas a largos filamentos, M. tuberculosissuele tener una morfología característica, bacilodelgado de forma recta o ligeramente curvada enfrotis teñidos, y su tamaño suele ser de 1-4 micrasde largo por 0,3-0,5 micras de ancho.Ocasionalmente, forma ramificaciones verdaderasque se observan en cultivos enriquecidos y enfrotis de ganglios linfáticos caseosos.Son bacilos ácido-alcohol resistentes por lo que latinción de Zieh1Neelsen es útil para la coloraciónde estos microorganismos obtenidos de muestrasclínicas o de cultivo. Con esta tinción, los bacilosaparecen de color rojo brillante sobre un fondoazul. Los bacilos tuberculosos son difíciles de teñircon la tinción de Gram, y se observan comobacilos gram positivos con tinción irregular.Son bacilos no formadores de esporas, sinflagelos ni cápsula. La estructura celular de M.tuberculosis consta de un gruesa pared, separadade la membrana celular por el espacioperiplasmico, con cuatro capas. La mas interna esel glicopéptido o peptidoglicano con moléculas deN-acetilglucosamina y ácido-N-glucolilmurámico(en lugar del habitual N-acetilmurámico) con cortascadenas de alanina, a diferencia de M. leprae queposee glicina. Esta capa es el esqueleto de labacteria que le da forma y rigidez. Externamente,hay otras 3 capas compuestas una por polímerosde arabinosa y galactosa, otra formada por ácidosmicólicos (que son ácidos grasos derivados, degran importancia taxonómica en micobacterias yotros generos relacionados como Nocardia) y otrasuperficial formada por lípidos como lossulfolípidos, el cord factor, llamado así por suaparente asociación con la forma acordonada conque se agrupan las micobacterias virulentas, y losmicósidos que son al igual que el anteriorglicolípidos. No difiere del resto de las bacterias encuanto al citoplasma y el ADN nuclear. Las

micobacterias son aerobios estrictos y no crecenen ausencia de oxígeno.La mayoría de la micobacterias, y entre ellas M.tuberculosis, se desarrollan de forma adecuada enmedios simples que contienen una fuente decarbono, una de nitrógeno e iones de metalesesenciales entre ellos hierro y magnesio. Para elaislamiento primario de muestras clínicas, serequiere un medio mas complejo que contengauna base de patata-huevo o una base de agar-suero. Los bacilos tuberculosos tienen uncrecimiento muy lento incluso en condicionesóptimas y requiere de 10 a 20 días de incubacióna 37ºC. Aunque la proliferación puede tener lugara un pH que oscila entre 6 a 7.6, el pH óptimo decrecimiento es de 7.El tiempo de duplicación de M. tubercusosis encondiciones óptimas de cultivo es de 15 a 18horas, tardando varias semanas (1 a 3) enaparecer colonias visibles en medios de cultivo.Las micobacterias son muy resistentes a ladesecación. El medio ambiente en el que seencuentran constituye un factor muy importantepara su viabilidad. Por ejemplo, cuando seexponen a la luz solar directa, los bacilostuberculosos de los cultivos son destruidos en 2horas, pero si estos están presentes en el esputo,pueden permanecer viables durante periodos máslargos.Las micobacterias son más resistentes a ladesinfección con productos químicos que otrosmicroorganismos no formadores de esporas,probablemente como consecuencia de sucontenido en lípidos. Son sensibles al calorhúmedo y destruidas por las temperaturas depasteurización.Las mutaciones de M. tuberculosis se producencon muy baja frecuencia en comparación con otrasbacterias, y son la base de la resistencia a losfármacos.Se han podido aislar numerosos fagos conactividad sobre muchas especies de micobacteriasincluido M. tuberculsisSe están intentando purificar antígenos con el finde obtener una prueba serológica útil para eldiagnóstico clínico de la tuberculosis, lepra y lasmicobacteriosis humanas.Los principales antígenos de las micobacteriaspueden dividirse en dos grandes grupos:

• los solubles o citoplasmáticos.• los insolubles ligados a la pared celular.

a) En relación a la naturaleza de los antígenossolubles, se sabe que hay:

b) De naturaleza polisacárida, comunes a todaslas micobacterias y constituidos porarabinomananos, arabinogalactanos,glucanos.

c) Proteínas, algunas están bastante estudiadas.Entre ellas la denominada tuberculina vieja

(OT) o el Derívado Proteíco Purificado (PPD).También el antígeno 5 o el de 65 Kda.

d) Lipídica, los monósidos de fosfatidil inositol(PIM) constituyen una familia de lípidospolares que se encuentran presentes en lamembrana plasmática de las micobacterias.Entre ellos podemos citar los glicolípidosfenólicos, bastante específicos para M. leprae(PGL-1), para M. kansaii (PGL-kl) y para M.tuberculosis (PGL-Tbl).

e) El denominado antígeno 60 (Ag 60) es uncomplejo proteíco-lipopolisacárido procedentedel citoplasma y de la membrana celular de M.bovis BCG y es común a M. tuberculosis. M.bovis y otras micobacterias.

Estudiando los antígenos en doble difusión en gelse han establecido 4 grandes grupos con mayor omenor especificidad:• Grupo I: compuesto de antígenos comunescompartidos por todas las micobacterias e inclusoalgún otro género bacteriano como Nocardia yCorynebacterium.• Grupo II: serían antígenos propios de lasmicobacterias de crecimiento lento.• Grupo III: lo formarían antígenos demicobacterias de crecimiento rápido y nocardias.• Grupo IV: constituido por antígenos propios decada especie.Los antígenos insolubles ligados a la pared se hanusado con fines taxonómicos medianteaglutinación por especies no rugosas como M.avium, estableciéndose serotipos, pero no sonútiles en M. tuberculosis por producirautoaglutinación.

M. LEPRAEM. leprae se presenta como un bacilohabitualmente recto o ligeramente incurvado, conextremos redondeados con un tamaño de 1-8micras de longitud por 0,3 0,5 micras de anchura.Se agrupan dentro de células, denominándose aestas formaciones "globis". Es no esporulado,inmóvil y no capsulado.Aunque es grampositivo es difícil, al igual que M.buerculosis, ponerlo de manifiesto por estemétodo. Cuando se tiñe con método de Ziehl-Neelsen, se visualiza como un bacilo rojo sobrefondo azul, ácido-alcohol-resistente, pudiéndolohacer de forma uniforme o presentar gránulos conmayor tamaño que el diámetro promedio de lacélula. Los bacilos que toman la coloración ácido-alcohol-resistente de manera uniforme son célulasviables y sanas mientras que es probable que losque presentan granulaciones en rosario no seanviables. La ácido-alcohol-resistencia de M. lepraepuede ser eliminada por medio de la extracciónprelimiar con piridina, una propiedad útil para

diferenciar a este microorganismo de la mayorparte de las otras micobacterias.Puede emplearse también para visualizarlo lafluorescencia con auramina o naranja de acridina.Sin embargo a diferencia de otras micobacteriasno se colorea en negro Sudán III y posee actividadfenolásica M. leprae presenta una triple cubiertarica en polisacáridos externos y en peptidoglicanobasal que forma la pared que rodea al citoplasma.Peptidoglicano arabinogalactanos y micolatoscontribuyen significativamente a la integridadestructural de la pared. En cambio otros,glicolípidos, glicopeptidolípidos y trehalosa quecontienen lipooligosacáridos se han encontradoque son componentes activos de lasmicobacterias.La más notable de las moléculas de glicolípidosasociados a la pared celular de M. leprae es elglicolípido fenólico I (PGL-I), con un trisacaridoespecial que ha demostrado ser especieespecífico e inmunogénico durante la infección deM. leprae. La presencia de glicina en vez dealanina en la pared le dota de fragilidad ycrecimiento aberrante. El citoplasma posee unaestructura central con ácidos nucleicos yribosomas.M. leprae se desarrolla lentamente y tiene untiempo de generación de 1 día. Se comporta comoun parásito intracelular obligado. Hasta el presenteno se ha conseguido su cultivo en medios delaboratorios.M. leprae posee varios antígenos de superficie ycitoplasmáticos, algunos de los cuales soncomunes a otras micobacterias y nocardias.Ciertos polisacáridos estimulan títulos elevados deanticuerpos que presentan reacciones cruzadas

con antígenos de otras micobacterias. Lasproteinas desencadenan una reacción desensibilidad tardía que se manifiesta por lacutireacción de Fernández a las 48 horas similar ala reacción de la tuberculina.

OTRAS MICOBACTERIASTodas las micobacterias no comprendidas dentrodel "complejo tuberculosis" (M. tuberculosis, M.bovis, M. africanum y M. microti) ni del complejoM. leprae han recibido a través de los tiempos muydiferentes nombres en un intento de agruparlas atodas. Hoy deben de individualizarse ydenominarse cada una según su nombre binomialaceptado científicamente. A la visión microscópicaen una baciloscopia pueden parecer idénticas alya citado Mycobacterium tuberculosis yconfundirse con él, pero si se estudian desde elpunto de vista bacteriológico de manera másdetallada, muestran una serie de diferencias quehacen que actualmente se hayan descrito unascien especies diferentes a M. tuberculosis, de lasque se aceptan internacionalmente más de 50.Éstas se clasifican en seis grupos desde el puntode vista bacteriológico, basados en su velocidadde crecimiento (rápido o lento, según sea inferior osuperior a una semana en medio sólido) yproducción de pigmento en presencia o ausenciade luz (fotocromógeno o escotocromógeno)(Tabla1). Algunas de estas micobacterias se handescrito como patógenas, otras pueden serpatógenas oportunistas y finalmente otras que,aunque pueden encontrarse en productospatológicos humanos, hasta el momento presentesuelen ser saprofitas.

TABLA 1.- CLASIFICACIÓN DE LAS MICOBACTERIAS

Grupos de crecimientolento

Crupo IFotocromógenas

Grupo IIEscotocromógenas

Grupo III Nocromógenas

M. Kansaii a)Pigmento rosa-rojo: M. aviumM. asiaticum M. lactis M. intracellulare

M. intermedium b) Pigmento amarillo-naranja: M. gastri

M. gordonae M. terraeM. scrofulaceum M. trivialeM. flavescens M. nonchromogenicumM. szulgai M. malmoensec) Pigmento irregular M. haemophilumM. xenopi M. shimoideíM. simiae M. celatumM. ulcerans M. interjectum

M. branderiM. genavense

Grupos de crecimientorápido

Grupo IVFotocromógenas

Grupo VEscotocrómogenas

Grupo VI Nocromógenas

M. marinum a)Pigmento rosa-rojo: M. fallaxM. engbaecki M. fortultumb)Pigmento amarillo-naranja: M. chelonae

M. acapulcense M. abscessusM. aurum M. agriM. duvalii M. chitaeM. gadium M. moriokaienseM. neoaurum M. confluentisM. gilvum M. mucogenicumM. obuenseM. rhodesiaeM. aichienseM. chubuenseM. tokaiensec) Pigmento irregularM. phleíM. vaccaeM. thermoresistibileM. parafortuitumM. diernhoferiM. smegmatisM. austroafricanum

No se incluyen en esta clasificación especies que no suelen aislarse de productos patológicos humanos,sino ambientales como: M. alvei, M. brumae, M. chlorophenolicum, M. farcinogenes, M. hiberniaie, M.holderi, M. komosense, M. lepraemurium, M. madagascariense, M. mageritense, M. microti, M. porcium, M.poriferae, M. pulveris, M. senegalense, M. sphagni.

MICOBACTERIAS DE CRECIMIENTO LENTOMycobacterium avium-MycobacteriumintracellulareExiste una considerable superposición entre laspropiedades de los dos patógenos nofotocromógenos principales. M. avium y M.intracellulare, lo que dificulta mucho la

determinación de la especie de las cepas. Dadoque la diferenciación entre las dos especies esdifícil, se emplea el término complejo M. avium-M.intracellulare (MAC) para referirse a estasmicobacterias, M. avium está constituido por tresserotipos diferentes por aglutinación, mientras M.intracellulare contiene unos 25 serotipos.

Actualmente, con sondas de ADN se intenta sudiferenciación.En las muestras clínicas, los microorganismos sonpleomórficos, pero en los medios de cultivohabitualmente se presentan como bacilos cortoscon gránulos ácido-alcohol resistentes bipolares.Casi todas las cepas de M. avium virulentas,crecen mejor a 44ºC que a 37ºC, en tanto que lamayor parte de las cepas de M. intracellulareprefieren la temperatura inferior. Sin embargo, porsubcultivos repetidos en el laboratorio, lasvariantes virulentas de las cepas aviarias sepueden adaptar a un buen desarrollo a 37ºC yentonces son indistinguibles de las cepasavirulentas de M. intracellulare por las pruebashabituales. Las colonias de los aislamientosprimarios son predominantemente delgadas,traslúcidas y lisas, pero con frecuencia seproducen unas pocas colonias rugosas. En lossubcultivos, las colonias se vuelven más opacas ycon forma de cúpula. Junto con este tipo devariaciones en las colonias se presentan cambiosen la virulencia y en otras propiedades. Conanterioridad a 1982 y al comienzo de la era delSIDA el compromiso extrapulmonar era raro. En laactualidad la infección por M. avium M.intracellulare se reconoce como a una de lascomplicaciones del SIDA.

Mycobacterium KansaiiLos bacilos de M. Kansaii habitualmente son máslargos y más anchos que los de M. tuberculosis ycon la coloración para ácido-alcohol resistencia,de manera característica se tiñen de formadesigual para dar un aspecto en bandas o enrosario. Lo habitual es que los microorganismos sedispongan en cordones curvos.M. Kansaii es fotocromógeno. Las colonias, queson visibles después de 1 a 2 semanas deincubación en la oscuridad, en medios de glicerol-huevo, en general son lisas de y de color marfil. Sise desarrollan en la luz son de color amarillolimón.

Mycobacterium malmoense y Mycobacteriumhaemophilum.Son especies no fotocromógenas con propiedadesbioquímicas similares a M. avium, M. malmoenseparece inducir un serotipo aglutinante diferente yse asocia con enfermedad pulmonar. M.haemophilum es la única micobacteria decrecimiento lento, incapaz de multiplicarse enausencia de hemina. También requiere unatemperatura de 30 a 32ºC y no crece a 37ºC. Esprobable que este microorganismo en ocasionesno sea aislado de muestras clínicas debido a queno se emplean los medios y las condiciones decultivo adecuadas.

Mycobacterium scrofulaceumM. scrofulaceum es un microorganismo más largo,más grueso y con una disposición en rosario másgrosera que M. tuberculosis. En medios líquidos,los microorganismos se distribuyen al azar y nopresentan evidencias de formación de cordones.M. scrofulaceum es escotocromógeno, y producecolonias compactas en forma de cúpula, las cualesson amarillas a anaranjadas cuando se proliferanen la oscuridad pero desarrollan una pigmentaciónanaranjada rojiza con una exposición continua a laluz.

Mycobacterium simiaeM. simiae se aisló por primera vez en 1965 a partirde monos enfermos. Desde entonces estemicroorganismo ha sido encontrado en asociacióncon enfermedad humana. También se lo haaislado del medio ambiente de suministros deagua.El microorganismo es fotocromógeno y producecolonias pequeñas disgónicas, que al comienzopresentan un color ante pero que gradualmente sevuelven amarillas por exposición a la luz. Supropiedad más característica es la producción deniacina, un rasgo que no se observa en las otrasmicobacterias atípicas. M. simiae es muyresistente a los fármacos antituberculosos.

Mycobacterium szulgaiM. szulgai se parece a M. scrofulaceum y al nopatógeno M. gordonae, pero se diferencia de ellostanto bioquímica como serológicamente.El microorganismo debe ser diferenciado de M.gordonae, un escotocromógeno de crecimientolento que se aísla con frecuencia del esputo depacientes que no presentan infeccionesmicobacterianas.Se comporta como escotocromógeno cuando seincuba a 37ºC y fotocromógeno si es incubado a27ºC.

Mycobacterium ulceransM. ulcerans produce una enfermedad cutáneadestructiva principalmente tropical, sobre todo enciertas áreas de África, Nueva Guinea, Américadel Sur y Norte de Australia, aunque también sehan descrito de modo esporádico en otros lugares.Si no se trata en una etapa temprana, provocaulceras crónicas con centros necróticos.En los cultivos, los bacilos miden 0,5 micras deancho y 1,5 a 3µ de largo, pero en corteshistológicos habitualmente son más grandes y conaspecto en rosario. La temperatura óptima para eldesarrollo es de 30 a 33ºC y no proliferan a 25ºCni a 37ºC. Su multiplicación es muy lenta, y serequieren de 6 a 12 semanas para el aislamientoprimario. En el medio de Lowenstein-Jensen, sedesarrollan colonias rugosas y cupuladas de coloramarillo limón.

Mycobacterium xenopiAunque el primer aislamiento ser realizó en unanimal de sangre fria, el sapo Xenopus laevis, estemicroorganismo crece mal a 37ºC, y prefieretemperaturas de 42-45ºC. Para el aislamientoprimario, se necesitan de 3 a 4 semanas o más.Las colonias características son muy pequeñas ygranulares y cuando se las observa con elmicroscopio presentan una red periférica de hifas.En la incubación prolongada, se desarrolla deforma gradual una pigmentación amarilla. En lastinciones, los bacilos son más largos y delgadosque lo habitual y con frecuencia se disponenformas arqueadas típicas en nidos de pájaros. M.xenopi ha sido aislado del agua, tanto de aguacorriente fría como caliente.

MICOBACTERIAS DE CRECIMIENTO RAPIDOMycobacterium marinumM. marinum es una especie fotocromógenaimplicada en una enfermedad cutáneagranulomatosa conocida habitualmente como"granuloma de las piscinas". M. marinum crececon rapidez a 30-32ºC en cualquiera de los mediosque a menudo se emplean para micobacteriaspero no lo hace si se le incuba a 37ºC. En el mediode Lowentein-Jensen las colonias sonblancogrisáceas con estrías de color amarillopálido pero expuestas a la luz temperaturaambiente, desarrolla una intensa pigmentaciónamarillo-anaranjada.Las lesiones se presentan en el sitio deabrasiones menores, en especial en los codos yen las rodillas. La infección habitualmentecomienza 2 a 3 semanas después de la exposicióncomo una pequeña pápula, que poco a pocoaumenta de tamaño, se ulcera y segrega pus quecontiene microorganismos ácido-alcoholresistentes.Se encuentra presente en el agua dulce y salada yen los peces de estas aguas.

Mycobacterium fortuitum y MycobacteriumchelonaeEn la actualidad, M. fortuitum y M. chelonae sonespecies bien definidas, pero debido a quecomparten una serie de características similares ya que con frecuencia se las encuentra en losmismos tipos de infección, antes han recibido elnombre de complejo M. fortuitum-M. chelonae. Losmicroorganismos de este grupo son pleomórficos ypresentan diferentes grados de ácido-alcoholresistencia. En pus se observan formas largas yfilamentosas. Las colonias que se desarrollandespués de 72 horas de incubación a 37ºC en elmedio 7H 10 son no pigmentadas y habitualmentegrandes y rugosas, pero en algunos mediostambién se desarrollan colonias céreas y lisas.Algunas cepas de M. fortuitum pueden teneraspecto similar y ser identificadas de forma

incorrecta como M. tuberculosis si los cultivos noson inspeccionados durante las 3 a 4 semanassiguientes a la incubación.Una manifestación clínica frecuente es un abscesoque se presenta en el sitio del traumatismo, engeneral en el sitio de la inyección de productossupuestamente estériles. Con menor frecuencia setrata de úlceras corneanas posteriores a algún tipode lesión penetrante e infección pulmonar. Lainfección pulmonar por M. fortuitum no se puedediferenciar radiológicamente de la tubercusis.

4.- CUADROS CLÍNICOS.Las micobacterias incluyen microorganismos queen relación con el hombre se comportan comopatógenos obligados (es el caso del complejo M.tuberculosis y M. leprae), patógenos oportunistas ysaprofitos. Muchas de ellas pueden aislarse demuestras ambientales, como la tierra o el agua.Aunque los cuadros clínicos en los que puedenverse implicadaslas micobacterias son muyvariados, deben conocerse cuáles son aquéllosque con mayor frecuencia producen cada una delas especies.

Mycobacterium tuberculosis complexLa tuberculosis constituye una de lasenfermedades infecciosas de mayor prevalencia yes la primera causa de muerte por enfermedadprevenible a nivel mundial. Asi hoy, la tuberculosissupone un importante problema de salud públicacon una incidencia que se ha elevado en muchospaises en los últimos años. La epidemia de lainfección por el virus de la inmunodeficienciahumana, el aumento de la indigencia en losgrandes centros urbanos y la inmigración dehabitantes de áreas geográficas con altaprevalencia de tuberculosis se han señalado comocausas más importantes que han contribuido arevertir la curva decreciente de nuevos casos detuberculosis que se venia observando en lospaises occidentales.El riesgo de padecer tuberculosis es variable,dependiendo de la presencia de determinadosfactores de riesgo. La adquisición de la infeccióntiene lugar por vía aérea, con un riesgo que essimilar para todos los sujetos, variandoexclusivamente con la capacidad infectiva de lapersona enferma y la proximidad del contacto.Tras la infección primaria, la progresión aenfermedad sí que es variable de unas personas aotras. En los niños menores de 5 años y enpersonas inmunodeprimidas (por efecto del VIH opor otra causa) existe un riesgo elevado de unarápida progresión (en semanas o meses) aenfermedad activa, con frecuencia diseminada. Enlos adultos, no inmunodeprimidos, existe mayorposibilidad de que la infección entre en un estadode latencia, con riesgo de reactivación en los años

siguientes. Glogalmente, aproximadamente un10% de las personas infectadas desarrollarántuberculosis activa a lo largo de su vida, con elmayor riesgo en los dos años siguientes a lainfección. Entre los factores que aumentan demodo significativo el riesgo de desarrollartuberculosis a partir de una infección latente seincluyen la infección por el VIH, lainmunodepresión de cualquier origen,gastrectomía, malnutrición o la insuficiencia renalcrónica. Las personas con infección latentepueden ser identificadas mediante la prueba de latuberculina (PPD), que permite identificar a laspersonas infectadas que se pueden beneficiar derecibir quimioprofilaxis para evitar el desarrollo dela enfermedad.La localización más frecuente de tuberculosis en eladulto inmunocompetente es la pulmonar.Habitualmente, se presenta como una enfermedadde curso subagudo caracterizada por fiebre debajo grado de predominio vespertino, tospersistente, sudoración nocturna, expectoración y,más raramente, hemoptisis. Radiológicamente,suele presentarse como un infiltrado en lóbulossuperiores , con frecuencia cavitado, y no siendoraro el derrame pleural como única manifestaciónradiológica. Ocasionalmente, en las personasinmunocompetentes, la tuberculosis puedepresentarse con afectación extrapulmonar odiseminada. Estas son, sin embargo, las formasclínicas más frecuentes en las personas con SIDAo inumunocomprometidas por otras causas. Entrelos órganos que con mayor frecuencia se afectanse incluyen los ganglios linfáticos, el hígado, elbazo, el riñon, el sistema nervioso central y elpericardio. No es raro el aislamiento de M.tubercusosis a partir de la sangre en personasinmunocomprometidas.Las otras especies del complejo M. tuberculosis,que producen enfermedad humana son M. bovis yM. africanum. M. bovis produce fundamentalmenteenfermedad en los animales, aunque puede seradquirido por el hombre, constituyendo en lamayoría de los casos una enfermedad profesional.La enfermedad que produce en el hombre esindistinguible de la que produce M. tuberculosis.M. africanum causa tuberculosis humana enpaises del Africa tropical.

Mycobacterium avium complex.Las especies del complejo M. avium (MAC sonmicroorganismos ubicuos, que pueden aislarsecon frecuencia de múltiples fuentes ambientales.Hasta la aparición del SIDA, MAC había sidodescrito como raro productor de enfermedad en elhumano. Se había implicado como causa deadenitis en niños, en los que constituía la causamás frecuente en paises con baja prevalencia detuberculosis, y, sobre todo, como causa deenfermedad pulmonar en personas como

afectación crónica de las vías respiratorias o delparénquima pulmonar. MAC se ha descritoproduciendo nódulos pulmonares solitarios,sobreinfección de bronquiectasias, cuadrosdiseminados en el pulmón, sobre todos eninmunocomprometidos. Fuera de los cuadrosmencionados, MAC había sido muy raramentecausante de cuadros de infección diseminada.En los pacientes con SIDA, la enfermedaddiseminada por MAC constituye una de lascomplicaciones frecuentes en algunos paises(Estados Unidos, Australia), sobre todo enpacientes con enfermedad avanzada (menos de50 linfocitos CD4/mm³). Se han registrado, sinembargo, diferencias notables en su incidencia deunos paises a otros, constituyendo unacomplicación relativamente rara en algunas áreas.Se ha especulado con que el padecimiento detuberculosis previa pudiera proteger, porinmunidad cruzada, del desarrollo posterior deenfermedad por MAC. La presentación habitual esde enfermedad diseminada con afectación demúltiples órganos y aislamiento a partir de sangre,y también de médula ósea, hígado y otros órganosdonde puede causar enfermedad focal.

Otras micobacteriasLa mayoría de micobacterias diferentes a M.tuberculosis y M. leprae se aislan a partir del aguay del suelo, pero pueden también aislarse de otrasmúltiples fuentes, como el polvo de casa o inclusoinstrumental o soluciones para uso médico o delaboratorio. Ello explica que las micobacteriaspueden ser colonizadoras habituales desuperficies mucosas corporales o sercontaminantes en el laboratorio y, por este motivo,para evitar atribuir a una micobacteria la causa deuna enfermedad se han elaborado criteriosestrictos que la diferencien de la colonización ocontaminación. Estos criterios deben ser másestrictamente aplicados en circunstancias en lasque la colonización/contaminación es másprobable, como en las enfermedades pulmonarescrónicas.Estos criterios de patogenicidad que debentenerse en cuenta para aceptar el papel patógenode una micobacteria son los que exponemos acontinuación de una manera exhaustiva. Ello noquiere decir que deban coexistir todos, sino quesegún se cumplan más o menos algunos de ellostendremos menor o mayor certeza de que se tratade una micobacteriosis.

1.- Evidencia de afección clínica que puedadeberse a esa micobacteria.

2.- Ausencia de M. tuberculosis, M. africanumy M. bovis en todas las muestras tomadas delpaciente para comprobar la etiología delproceso.

3.- Aislamiento repetido en el paciente envarias muestras tomadas en distintosmomentos de la misma especie demicobacteria.

4.- Aislamiento abundante de la micobacteria aser posible.

5.- Aislamiento, si es posible, del mismo tipode micobacteria hallado en la muestra (p. ej.,esputo) de la zona de tejido del enfermoafectado por el proceso en estudio medianteexéresis quirúrgica, biopsia, etc. (p. ej.,pulmón).

6.- Comprobación, si es posible, de laslesiones histopatológicas específicas típicasde los órganos afectados.

7.- Reacción inmunológica positiva en elpaciente a la "sensitina" específica preparadacon dicha micobacteria, significativamentemás intensa que la ocasionada en el enfermocon la "tuberculina".

8.- Repercusión favorable en lasmanifestaciones por la terapéutica instauradasegún el antibiograma previamente realizado ala micobacteria considerada responsable.

La tabla 2 incluye las micobacterias que conmayor frecuencia se han comportado comopatógenas en el hombre y las enfermedades enlas que se ha implicado. El resto de micobacteriasno se han asociado con enfermedad en el hombreo se ha hecho sólo muy raramente.

Tabla 2. Especies de micobacterias que pueden producir enfermedades en el hombre.

Especie de Micobacteria Enfermedad más frecuente

M. avium-intracellulare Enfermedad pulmonar, linfadenitis cervical en niños, enfermedaddiseminada (SIDA)

M. celatum Enfermedad pulmonar similar a tuberculosis Enfermedaddiseminada (SIDA)

M. genavense Enfermedad diseminada similar a MAC (SIDA)M. haemophilum Nódulos cutáneos, inf. diseminada (SIDA)M. kansaii Enfermedad pulmonar similar a tuberculosis.

Enfermedad diseminada (SIDA)M. malmoense Enfermedad pulmonar crónicaM. marinum Infección cutáneaRápidos crecedores(M. fortuitum, M. chelonae, M.abscessus)

Infecciones de partes blandas, osteomielitis, enfermedaddiseminada, infección de herida quirúrgica

M. scrofulaceum Linfadenitis cervical en niñosM. simiae Enfermedad pulmonar crónicaM. szulgai Enfermedad pulmonar similar a tuberculosis

M. ulcerans Ulceras cutáneas (úlcera de Buruli en Africa, úlcera de Baimsdaleen Australia)

M. xenopi Enfermedad pulmonar crónica

5.- OBTENCIÓN Y TRANSPORTE DEMUESTRAS CLÍNICASLas normas generales de obtención de muestraspara el diagnóstico microbiológico deben serobservadas igualmente para el estudio de lasmicobacterias. Resaltamos aquellos puntos quepueden ser más específicos:

5.1.- OBTENCIÓN DE MUESTRAS CLÍNICAS

5.1.1.- ESPUTO Y OTRAS MUESTRASRESPIRATORIASEl enfermo ha de ser instruido sobre la forma másadecuada de recoger el esputo, informarle de laimportancia que tiene la muestra y que conozca la

diferencia entre esputo, saliva y secrecionesrinofaríngeas.- El paciente debe de realizar la recogida demuestra en áreas bien ventiladas y tomar todas lasprecauciones posibles par proteger al personalque le rodea del contagio.- El esputo recogido por expectoración deberealizarse a primera hora de la mañana, encantidad entre 5 a 10 ml. Pequeños volúmenes,especialmente, menos de 2ml, puede bajar laprobabilidad de detección de micobacterias.- Los esputos obtenidos 1 ó 2 después de labroncofibroscopia son con frecuencia másproductivos que los obtenidos antes de la misma.- Los laboratorios deberían de ser informados deltipo de esputo que se envía. Asi un esputo

inducido puede ser tomado por saliva debido a suacuosidad.- Los laboratorios deben de informar al médicoclínico sobre el volume y calidad de la muestraenviada, lo cual es sumamente importante enrelación con los resultados.- Cuando la muestra enviada no parece unverdadero esputo o el volumen es pequeño, ellaboratorio debe requerir otra muestra que sea devías bajas.- En aconsejable un estudio seriado de tresmuestras de días consecutivos para obtenermayor rentabilidad.- Cuando el enfermo no expectora, labroncofibroscopia es la técnica de elección, ya quepermite realizar boncoaspirados selectivos, lavadobroncoalveolar y biopsia de las lesionesbronquiales, siendo su rentabilidad superiornormalmente a la del aspirado gástrico en ayunas.Si bien en algunos casos se han comunicadoresultados del aspirado gástrico con buenarentabilidad.5.1.2.- JUGO GÁSTRICO- Las muestras de jugo gástrico deben procesarseantes de 4 horas después de su obtención, si estono es posible debe neutralizarse con carbonatosódico, ya que el ácido destruye a lasmicobacterias.5.1.3.- ORINAS- Es la muestra habitual para llegar al diagnósticode tuberculosis renal. No es necesario norecomendable el sondaje, ni la orina obtenidadurante 24 horas. Para la obtención de la muestra,lo usual y más adecuado es recoger la primeraorina de la mañana.La eliminación de BAAR por la orina es en generaldiscontinua por lo que se deben procesar tresmuestras en días sucesivos.5.1.4.- HECES- Las muestras de heces normalmente, sólo sonútiles en casos de SIDA para el diagnóstico depresencia de M. avium, si bien de ellas puedenaislarese otras micobacterias.5.1.5.- LÍQUIDOS ORGÁNICOSEn los líquidos orgánicos como LCR, L. pleural, L.peritoneal o L. pericárdiaco, es importante lasiembra de la mayor cantidad posible de muestra,ya que en la mayoría de las ocasiones el númerode bacilos en las mismas es muy bajo.5.1.6.- HEMOCULTIVOS- El incremento de las infecciones diseminadas porM. avium intracellulare u otras micobacterias dereciente descripción, y M. tuberculosis, enpacientes con SIDA ha generado la introducciónde nuevas técnicas para la detección demicobacterias en sangre.La lisis centrifugación y el sistema radiométricoBACTEC 460 son los más usuales. También sehan comunicado buenos resultados con el sistemaESP.

El envío de hemocultivo para el estudio demicobacterias debe ser utilizado normalmentepara pacientes con SIDA que posean linfocitosnormalmente CD4 por debajo de 50 y fiebre deorigen desconocido.5.1.7.- BIOPSIAS- Siempre que se practique una biopsia decualquier órgano por sospecha de tuberculosis,deberá remitirse un fragmento al laboratorio deMicrobiología y otro al de Anatomía Patológica. Lamuestra destinada a estudios microbiológicosdebe enviarse sin fijar, con unas gotas de aguadestilada para evitar la desecación.5.1.8.- MUESTRAS DE TEJIDO Y OTRASVARIASLas muestras de tejido, que reciben unprocesamiento similar a los líquidos orgánicos, nosiempre son rentables en el aislamiento demicobacterias. Si bien a veces son la únicamuestra que nos puede dar el diagnóstico.CONSIDERACIONES A LA TOMA DEMUESTRAS- Las torundas son recomendadas para elaislamiento de micobacterias, por la cantidadlimitada de muestra. Estas sólo son aceptablescuando no pueden tomarse de otra manera. Porello, el resultado negativo de estas muestrasenviadas en torundas no son fiables.- La cantidad insuficiente de muestra podríasuponer un resultad de cultivo falso negativo.- Es importante notificar al clínico lo antes posibleque la muestra es inadecuada y el porqué.También debe explicarse qué muestras son lasaceptadas en esa situación clínica.- En el agua y otros fluidos, puede existirmicobacterias viables que forman parte de la floranormal microbiota. Las contaminaciones por estasmicobacterias saprófitas pueden producir cultivosy/o microscopias falsamente positivas.Micobacterias saprófitas pueden aislarse tambiénde los lavados gástricos u otros orígeneshumanos.- Las muestras obtenidas inicialmente después dela implantación de una terapia antimicrobianapuede producir resultados falsamente negativos.

5.2.- CONSERVACIÓN Y TRANSPORTE DEMUESTRAS1.- El transporte rápido de las muestras allaboratorio es fundamental.2.- La conservación deberá hacerse a 4ºC siempreque sea posible.3.- Algunas muestras como esputos, sangre oheces pueden en caso necesario ser enviadas sinrefrigeración. Los esputos consecutivos de tresdías pueden por necesidades operativasalmacenarse en frigorífico a 4ºC y llevarse allaboratorio los tres juntos el último día

6.- DIAGNÓSTICO DE MUESTRASCLÍNICAS

6.1.- VISUALIZACIÓN. MICROSCOPIAEl hallazgo de bacilos ácido alcohol resistentes(BAAR) en extensiones teñidas y examinadas almicroscopio es la primera evidencia de lapresencia de micobacterias en una muestraclínica. Es el procedimiento más facil y rápido quese puede efectuar y que aporta al clínico unaorientación preliminar del diagnóstico.La visualización de BAAR en esputo no esafirmativa de M. tuberculosis porque otrasmicobacterias pueden también causar enfermedadpulmonar. Sin embargo, una baciloscopia positivaen conjunción con la clínica y hallazgosradiológicos puede utilizarse para un diagnósticopresuntivo de micobacteriosis.Algunas micobacterias pueden aparecer comoGram positivas en forma de bacilos difterimorfosen la tinción de Gram. Algunos otros grupos demicroorganismos comparten la característica deácido alcohol resistencia parcial como especies deNocardia, Legionella, Rhodococcus, Tsukamurellay algunos parásitos como Cryiptosporidium,Isopora belli y Cyclospora. Estos microorganismoscon propiedad de ácido resistencia songeneralmente menos estables que lasmicobacterias y requieren de una decoloraciónmás ligera para ser positivos.Las baciloscopias pueden preparse directamentede la muestra clínica o después de que ésta hayasido descontaminada y concentrada para larealización del cultivo. Esto aumenta ligeramentela sensibilidad de la técnica.La técnica clásica de Ziehl-Neelsen o susvariantes y la tinción con fluorocromos (auramina)son igualmente eficaces y se basan en el mismoprincipio. La mayor rápidez dde la fluorescencia esla razón por lo que ésta justificada en aquelloslaboratorios que realizan más de diez examenesmicroscópicos al día.Algunos laboratorios confirman la tinción positivade fluorescencia con el Ziehl-Neelsen. Alrededordel 30% de la micobacterias de crecimiento rápidopueden ser fluorescencia negativa y requieren dela tinción de Ziehl-Neelsen para su detección. Antela sospecha de una infección conocida o enpotencia de enfermedad por micobacterias decrecimiento rápido debe realizarse en esasmuestras directamente una tinción de Ziehl-Neelsem.En los casos en que la morfología de los bacilosencontrados por la técnica de fluorocromo escuestionable, la tinción debe ser repetida por elmetodo de Ziehl-Neelsen. Esta medida esimportante para disminuir la probabilidad deresultados falsos positivos.Todas las caracterísiticas morfológicas porvisualización pueden ser consideradas, pero no se

pueden establecer diferencias entre las distintasespecies con un alto grado de certeza hasta queno sea probado mediante cultivo, e identificación.- La no observación de BAAR en una muestraclínica no descarta el diagnóstico de tuberculosis,ya que es una técnica de sensibilidad limitada.Se ha demostrado que son necesarios de 5.000 a10.000 bacilos por ml de esputo para elreconocimiento en la microscopio directa, en estoscasos el cultivo detecta de 10 a 100 colonias demicobacterias viables.Todas las muestras, deberían ser procesadasrutinariamente para microscopia y cultivo.La interpretación de baciloscopia de heces, sangrey médula ósea es problemática. Estas muestrascon frecuencia son dificiles de interpretar por lagran cantidad de material celular presente.- Los resultados del examen microscópico debenexpresarse en número aproximado de bacilosvisualizados. Existen diversas formas deexpresarlos. La reducción del número de bacilosemitidos por el enfermo orienta sobre la eficaciadel tratamiento siempre que se acompañe de unamejoría de sus síntomas clínicos.- La sensibilidad de la baciloscopia depende, engran parte, de una buena preparación de la tincióny de la lectura, se han documentadosensibilidades desde un 20 a un 80%,dependiendo de donde se haya hecho el estudio ydel tipo de muestras estudiadas.- Los estudios muestran que el factor crítico paraevaluar la validez de la tinción está en función delnúmero de colonias que crece en el cultivo.- Existen una serie de puntos que hay que teneren cuenta ante una baciloscopia.Los falsos positivos en el laboratorio se puedenprovocar:- Por contaminación de la preparación conmicobacterias saprófitas como M. gordonaepresentes en el grifo o en el agua destiladautilizada durante el procesamiento o manipulaciónde la tinción.- Por contaminación cruzada de una baciloscopiapositiva a negativa debido a la unión o proximidadentre las preparaciones. El uso apropiado decontroles de baciloscopia en cada tanda detinciones podría reducir considerablemente losfalsos positivos.Cuando los pacientes bacilíferos son tratados conregímenes de primera elección suelen negativizarsus esputos a partir de las 2-3 semanas detratamiento. No obstante, en algunos pacientes senegativiza antes el cultivo que la baciloscopia, estoes debido a que los bacilos que se sigueneliminado están lo suficientemente lesionados porel tratamiento que nos capaces de desarrollarseen los cultivos . Esto da lugar a lo que se llaman"falsos positivos" con cultivo negativo o "bacilosinviables". A pesar de la baciloscopia positiva

estos pacientes no suelen tener capacidadcontagiante.Los falsos negativos suelen ser el resultado deextensiones demasiado finas o rápidez en lavisualización.Control de calidadLas suspensiones utilizadas para el control decalidad deben prepararse en aproximadamente 1ml de suero salino o agua destilada con unaturbidez nº 1 de McFarland de Nocardia asteroides(control negativo) y Mycobacterium tuberculosis,H37Ra ATCC 25177 (control positivo). Tambiénpueden utilizarse como controles otrosmicroorganismos como E. coli o M. kansasii.No deben utilizarse micobacterias de crecimientorápido, puesto que muestran una capacidadinconstante para retener las tinciones ácidoalcohol resistentes.

6.2.- DIGESTIÓN Y DESCONTAMINACIÓNEs necesario eliminar de las muestras losmicroorganismos contaminantes que interfieren enel desarrollo de las micobacterias. También esimportante conseguir la licuefacción de los restosorgánicos (tejidos, moco y otros materiales) querodean a los microorganismos, para que losagentes descontaminantes puedan destruir lasbacterias no deseadas. Las micobacterias sonmás resistentes a los ácidos y bases fuertes queotros microorganismos, lo que permite utilizar conéxito estas técnicas de digestión-descontaminación. Pero si éstas no se utilizanadecuadamente pueden afectar, también laviabilidad de las micobacterias presentes en lamuestra y dar lugar a falsos cultivos negativos (porexceso de descontaminación) o a un númeroelevado de contaminaciones (por defecto dedescontaminación).Para muestras de lugares estériles (LCR, L.peritoneal, tejidos, etc.), puede no ser necesaria ladescontaminación previa. Sin embargo estasmuestras deben ser concentradas para optimizarel aislamiento del microorganismo.Los métodos de digestión - descontaminación másutilizados en la actualidad son los de Petroff.Tacquet y Ticcson, Kubica modificado porKrasnow y N-acetil-L cisteína-Hidróxido Sódico(NALC-NaOH). La elección de cualquiera de estosmétodos dependerá del tipo de muestras que sedescontamine y, sobre todo, de la utilización dedeterminados medios de cultivo líquidos yrealización de técnicas moleculares a partir delsedimento de las muestras descontaminadas, yaque algunos reactivos utilizados en estos métodospueden retrasar el crecimiento de lasmicobacterias o interferir en las reacciones deamplificación.- La mayoría de los métodos de descontaminaciónrequieren de una extrema atención al tiempodurante el cual la muestra está expuesta a la

descontaminación para evitar la muerte de lasmicobacterias.- Usar siempre agua destilada estéril para todoslos pasos del proceso con el fin de evitarcontaminación con micobacterias.- Evitar un exceso de agitación de la solución deNAOH-NALC, ya que la NALC es inestable enpresencia de oxígeno.- Si existe una población amplia de enfermos confibrosis quística, debe considerarse el añadir ácidooxálico en el tratamiento de descontaminaciónpara eliminar P. aeruginosa que pueden resistir alprocesamiento de rutina.- Un porcentaje de contaminación aceptado, paralos medios sólidos está establecido entre el 3% yel 5%. Un índice de contaminaciónsignificativamente menor del 3% indica que ladescontaminación es demasiado fuerte. Un rangosignificativamente mayor del 5% sugiere unproceso de descontaminación demasiado suave ode digestión incompleta .En el índice de contaminación en los medioslíquidos existe un margen variable de resultadosdependiendo del sistema utilizado y de losautores.

6.3.- CULTIVOSTodas las muestras clínicas sospechosas decontener micobacterias se deben sembrar enmedios de cultivo adecuados por las siguientesrazones:

1.- Los cultivos son mucho más sensibles quelos examenes microscópicos, pudiendodetectar una cantidad tan pequeña como 10bacterias por ml. de muestra clínica digerida yconcentrada.

2.- Los aislamientos en cultivo puro sonnecesarios normalmente para poder identificarlas especies de las cepas aisladas.

3.- Si la baciloscopia es un índice de laeficacia del tratamiento, el cultivo permiteasegurar la negativización y curación delpaciente.

6.3.1.- MEDIOS SÓLIDOSEl método tradicional de cultivo para micobacteriasincluye la inoculación de varios medios sólidos olíquidos con y sin antibióticos. Un medio con basede huevo como el LowensteinJensen es el másconocido. También los medios sin base de huevocomo el Middlebrook 7HlO y 7Hll.6.3.2.- MEDIOS LÍQUIDOSLos medios líquidos suponen un mejor crecimientode las micobacterias , y en la actualidad serecomienda el cultivo primario de todas lasmuestras en medios líquidos.

6.3.2.1.- METODOS LÍQUIDOS DE LECTURAMANUAL

El sistema Septi-Chek MB (Becton Dickinson)consiste en un medio bifásico de 20 ml. de caldoMiddlebrook 7H9, enriquecido con CO2,suplementando con factores de crecimiento yantibióticos, al que se le acopla en el partesuperior después de la inoculación de la muestraun dispositivo. Este dispositivo tiene tres mediosde cultivo, por un lado un agar Middlebrock 7H11no selectivo, que permite el crecimiento de lamayoría de las micobacterias y, por otro lado, dossecciones, una con un medio modificado deLowenstein-Jensen, y otra con agar chocolatepara detectar contaminaciones. El medio líquidoes invertido sobre la fase sólida inicialmente y aintervalos durante la incubación. El sistema serevisa visualmente. El crecimiento se detecta tantoen el medio líquido como en la fase sólida.

Ofrece la posibilidad de disponer un crecimientosobre la fase sólida que puede utilizarse parapracticar pruebas de identificación sin necesidadde realizar resiembras adicionales, y ademásfacilita la detección de cultivos mixtos.

Los principales inconvenientes del MBSepti-Checkson la lentitud en la detección del crecimiento conrespecto al sistema BACTEC 460 TB, no permiterealizar estudios de sensibildad in vitro y falla confrecuencia el sistema de identificación presuntivade tuberculosis que lleva incorporado en su fasesólida.

El medio de cultivo Mycobacterial GrowthIndicador Tube (MGIT) (Becton Dickinson), utilizatambién un caldo de Middlebrook 7H9 al que seincorpora un sensor fluorescente sensible al O2formado por un compuesto de ruteniopentahidratado sobre una base de silicona. Amedida que se produce crecimiento bacteriano seconsume O2 y esto permite observar fluorescenciaen el tubo mediante el uso de un transiluminadorde luz ultravioleta de 362 nm. Este medio en laactualidad está automatizado.

Este medio MGIT, presenta falsos positivos. Tubosen los cuales existe fluorescencia pero en los quela baciloscopia y el cultivo son negativos paraMycobacterium sp. El número de estos falsospositivos podría disminuir con la experiencia.Actualmente, existen limitaciones en la realizacióndirecta de sondas de identificación yantibiogramas, que, en un futuro, podríansolucionarse.

6.3.2.2.- MEDIOS LÍQUIDOS DE LECTURASEMIAUTOMÁTICA

El sistema BACTEC 460TB, es el másampliamente evaluado, utiliza el medio de cultivolíquido Middlebrook 7H12 y como sustrato ácidopalmítico marcado con C14. Durante el crecimientobacteriano se produce 14CO2, que es detectadopor el sistema y lo traduce en índice decrecimiento. Este sistema utiliza reactivosradiactivos, es semiautomatizado y requiere deuna amplia manipulación de los viales a lo largo detodo el período de incubación.

En la actualidad, se están evaluando variosmétodos automatizados para el cultivo deMycobacterium sp. en medio líquido, todos ellosadaptados de los sistemas automáticos dehemocultivos, utilizando medios de cultivosapropiados y sistemas capaces de detectarmicobacterias de muestras clínicas.

6.3.2.3.- MEDIOS LÍQUIDOS DE LECTURAAUTOMÁTICA

Sistema ESP, utiliza un vial conteniendo el mediolíquido 7H9 modificado suplementado con OADCpara el enriquecimiento. Cada vial llevaincorporado una esponja de celulosa que permiteuna mayor área de superficie para el crecimientode la micobacteria. El sistema puede detectarmicobacterias de esputos, sangre, heces, jugogástrico... etc, basándose en una medidamonométrica de consumo de oxigeno.

El sistema MB/Bact, utiliza el medio líquidoMiddlebrook 7H9 modificado. Cada botella llevaincorporada en la base un sensor colorimétricoque detecta la presencia de C02 como indicador decrecimiento bacteriano. El cambio de color deverde a amarillo es monitorizado continuamentepor un reflectómetro que se halla en la unidad dedetección. Estos valores medidos cada 10 minutosson transmitidos a un ordenador, que basándoseen un sofisticado algoritmo, indica que en el medioexiste crecimiento bacteriano.

En estos sistemas se realiza la incubación y lalectura automáticamente. El sistema lo detectacomo positivo o lo descarta como negativo, sinque se produzca ninguna manipulación desde quela botella es introducida en el sistema.

También se encuentra actualmente en desarrollootro sistema MGIT 960, que automatiza el antiguosistema manual.

6.3.2.4.- AISLAMIENTO DE ESPECIES CONCARACTERÍSTICAS ESPECIALES

El aislamiento de M. haemophilum de pacientesnecesita medios que contengan hemina. Cuandoexista sospecha estas muestras pueden serinoculadas en medios con un 1% de citrato féricoamónico . Mycobacterium haemophilum crecemejor a 30 32ºC.

Se recomienda que los cultivos de sangre paramicobacterias sean inoculados en BACTEC 1.3A eincubados al menos durante 8 semanas, para elaislamiento de M. genavense en pacientes conSIDA.

Hay que tener en cuenta las especies quenecesitan temperaturas de crecimiento inferiores osuperiores a 37º como M. marinum y M.thermorresistibile.CONTROL DE CALIDADEl control de calidad para los medios de cultivo esnecesario para distinguir entre la contaminacióndel medio o de sus ingredientes y elcorrespondiente a la muestra de enfermo.Los microorganismos utilizados para el control decalidad de los medios de cultivo son M.tuberculosis H37Ra, M. kansaii ATCC 12478, M.scrofulaceum ATCC 19981, M. intracelulare ATCC13950 y M. fortiutum ATCC 6841. Todas estascepas deben crecer en los medios paramicobacterias, debiendo ser la incubación lamisma que para las muestras de los pacientes,durante mas de 21 días a 35-37º C, en unaatmosfera de CO2 de 5 a10%. La cepa control E.coli ATCC 25922 debe mostrar inhibicción total oparcial en los medios selectivos de micobacterias.

6.4. TÉCNICAS GENÉTICASTécnicas de detección e identificación. En losúltimos años se han desarrollado técnicasbasadas en la amplificación de ácidos nucléicoscon las que se intenta conseguir la detección a lavez que la identificación de M. tuberculosisdirectamente de muestras clínicas. Algunas seencuentran ya comercializadas, siendo las másutilizadas TB Amplicor-Amplicor Mycobacteriumtuberculosis PCR test (Roche), M. Mycobecteriumtuberculosis Direct test (MTDT) (GenProbe) y LCXMycobacterium tuberculosis assay (Abbot).

7. PROCESOS DE IDENTIFICACIÓN.Actualmente se recomienda que todos losaislamientos de micobacterias sean identificados anivel de especie, debido a la posibilidad de quemúltiples especies de micobacterias notuberculosas se comporten como patógenos parael hombre.

Durante muchos años la identificación de lasmicobacterias se ha llevado a cabo en base a lascaracterísticas fenotípicas (velocidad decrecimiento, morfología de las colonias, etc) y apruebas bioquímicas. En la actualidad, lanecesidad de identificar cada vez mayor númerode aislados diferentes a M. tuberculosis y laimportancia de un diagnóstico precoz hanmotivado el desarrollo de nuevas técnicas en laidentificación de las micobacterias. En laactualidad, las técnicas disponibles para laidentificación de micobacterias pueden resumirseen bacteriológicas (características fenotípicas),bioquímicas, técnicas genéticas o de microbiologíamolecular y otras, que incluyen la cromatografia delípidos.

7.1.- MÉTODOS BACTERIOLÓGICOSSe trata de métodos que permiten la mayoría delas veces asignar las micobacterias a unsubgrupo. Esto permite seleccionar las pruebasbioquímicas u otros métodos para su ulterioridentificación a nivel de especies.7.1.1.- TINCIÓN DE ÁCIDO-ALCOHOLRESISTENCIAEl primer paso en la identificación de unamicobacteria es confirmar que el aislado perteneceal género Mycobacterium.7.1.2.- VELOCIDAD DE CRECIMIENTOSe refiere al número de días necesarios para lapresencia de colonias visibles en subcultivo. Enfunción de la velocidad de crecimiento se dividen alas micobacterias en dos grandes grupos:

- Micobacterias de crecimiento rápido: lascolonias aparecen en menos de 7 días enmedio sólido.

- Micobacterias de crecimiento lento: lascolonias tardan más de 7 días en aparecer, enmedio sólido.

El número de días en los que han aparecido lascolonias del cultivo primario es sólo orientativo.En aquellos casos en los que existan dudasacerca de si un aislado es rápido o lento crecedor,se pueden realizar varias diluciones seriadas de lacepa aislada (la velocidad de crecimiento puedeestar influida por el efecto inóculo) y subcultivarlasa distintas temperaturas (la velocidad decrecimiento puede estar también influida por latemperatura de incubación).7.1.3.- TEMPERATURA DE CRECIMIENTO.La mayoría de las micobacterias crecen bien a37ºC. Sin embargo, hay micobacterias querequieren temperaturas inferiores de crecimiento,(M. marinum, M. ulcerans y M. haemophilumcrecen a 30ºC) y otras que pueden crecer adistintas temperaturas lo cual orienta en suidentificación (M. thermoresistibile es capaz decrecer a 52ºC y M. xenopi a 42ºC).

7.1.4.- MORFOLOGÍA DE LAS COLONIAS.La morfologia de las colonias puede ser tambiénbastante orientativa. Puede observarse lamorfología de las colonias crecidas directamenteen Lowestein-Jensen y distinguirse si son coloniaslisas, rugosas o mucosas. Pueden tambiénobservarse morfológicamente las microcolonias,según el método de Runyon (observaciónmicroscópia de las colonias a los 15 días delsubcultivo en un medio transparente, Middiebrook7H10).7.1.5.- PIGMENTACIÓN Y FOTOREACTIVIDAD.La pigmentación que presentan las colonias dealgunas especies de micobacterias, se debe a laproducción de pigementos carotenos. Atendiendoa la pigmentación de micobacterias se dividen entres grandes grupos:- Fotocromógenas.- Producen colonias nopigmentadas cuando crecen en la oscuridad ydichas colonias se pigmentación con la luz. Laforma de inducir esta propiedad se llamafotoinducción y se consigue exponiendo lascolonias a la luz de una lámpara de 40W durante60 minutos, tras lo cual se vuelve a incubarnormalmente. Si las colonias se pigmentan, lacepa presenta fotoinducción y es fotocromógena.

- Escotocromógenas: Producen coloniaspigmentadas cuando crecen, tanto expuestas a laluz como en la oscuridad. Para comprobar que lacepa es realmente escotocromógena es necesariohacer un subcultivo cubriendo el tubo con papelnegro. La pigmentación puede ser de tres tipos ypermite distinguir las especies: pigmento rosa orojo (M. lactis), pigmento amarillo-naranja (M.gordonae) y pigmento irregular M. xenopi)

- No cromógenas: las colonias no se pigmentan enla oscuridad ni en la luz.Los patrones de pigmentación deben evaluarsemuy cuidadosamente, teniendo en cuenta quepueden presentarse variaciones dentro de lasespecies (algunas cepas de M. avium,generalmente no cromogeno, con el tiempopueden dar pigmentación irregular) y en función dela temperatura de incubación (M. szulgai esfotocromógeno a 25ºC y no cromógeno a 35ºC).Por este motivo, todas las micobacteriasescomógenas y no escotocromógenas debensometerse siempre a la prueba de la fotoiriduccióny hacerlo a distintas temperaturas.Con estos métodos bacteriológicos simplespueden clasificarse las micobacterias más

frecuentemente aisladas en las muestras clínicasen subgrupos, a los que luego podrán aplicarseotros métodos para su definitiva identificación anivel de especies. Las tablas 3 y 4 agrupan lasespecies en función de las característicasmencionadas anteriormente.En el grupo de micobacterias de crecimiento lentono cromógenas se han incluido recientemente dosnuevas especies como causantes de infeccionesdiseminadas en pacientes con depresión de lainmunidad celular M. celatum y M. conspicuum, M.celatum tiene las mismas característicasmorfológicas que M. avium complex, con el quepuede confundirse. Otra especie de micobacteriadescrita en los últimos años causante de infeccióndiseminada esM. genavense, que no suele creceren los medios sólidos habituales por lo que sedesconoce sus características fenotípicas.

7.2.- MÉTODOS BIOQUÍMICOSEstos métodos son los que tradicionalmente sehan venido usando para identificar a lasmicobacterias. La descripción detallada de cadauna de las pruebas, materiales y reactivosnecesarios para su realización puedenencontrarse en distintos manuales.Dentro de las pruebas bioquímicas las másusuales son:7.2.1.- PRUEBA DE LA NIACINA.Pone de manifiesto la capacidad para producirácido nicotínico. Es una prueba fundamental en laidentificación de M. tuberculosis, aunque laidentificación no debe basarse nuncaexclusivamente en esta prueba, ya que hay cepasde M. simiae y M. bovis BCG que también puedenser niacina positivo. La prueba de la niacina debeacompañarse siempre de la reducción de losnitratos y la actividad catalasa a 68ºC.Es muy importante en la realización de la pruebaque el cultivo sea abundante y puro. Existen tirasde papel comercializadas que facilitan larealización de la técnica.7.2.2.- PRUEBA DE LA REDUCCIÓN DE LOSNITRATOS.Al igual que la prueba de la niacina, es una pruebabásica.7.2.3.- PRUEBA DE LA HIDROLISIS DEL TWEEN80.Pone de manifiesto la capacidad de lasmicobacterias para liberar acido oleico contenidoen el Tween 80.

Tabla 3. Identificación de micobacterias de crecimiento rápido

Prueba M. fortuitum M. chelonae M. smegmatis M. neoaureum M. marinum M. thermoresistible

Arilsulfatasa (3dlas) + + - - +/- -Crecimiento en MCK + + + - - -Catalasa>45 mm + + - + +/- +Citrato Férrico amoniacal + -

Tabla 4. Identificación de lentos crecedores fotocromógenos

Prueba M.kansasii M. marinum M.asiaticum

Crecimiento 28ºC >7días <7días >7díasCrecimiento 45ºC - - +Reducción Nitratos + - -

7.2.4.- PRUEBA DE LA ARILSULFATASA.Pone de manifiesto si la micobacteria posee estaenzima. La prueba tiene dos variantes según lalectura se haga a los 3 días (para rápidoscrecedores) o a las dos semanas (para lentoscrecedores).7.2.5.- PRUEBA DE LA CATALASA.Todas las micobacterias, excepto M. gastri,algunas de M. tuberculosis y M. bovis resistentes ala isoniacida y cepas de M. kansasii resistentes ala isoniacida, poseen actividad catalasa. La pruebatiene dos variantes:- Catalasa semicuantitativa: se mide el tamaño dela columna de burbujas.-Estabilidad de la actividad catalasa a 68ºCalgunas micobacterias pierden la actividadcatalasa tras el calentamiento a 68ºC. En este

grupo se incluyen M. tuberculosis, M. bovis, M.gastri y M. haemophilum.7.2.6.- PRUEBA DE LA RESISTENCIA A LA TCH(HIDRACÍDA DEL ÁCIDO 2-TIOFENOCARBOXÍLICO).Consiste en observar crecimiento o inhibición delas micobacterias frente a este compuesto.Permite diferenciar M. bovis, cuyo crecimiento seinhibe, de M. tuberculosis, resistente a dichocompuesto.7.2.7.- CRECIMIENTO EN AGAR MAcCONKEYSIN CRISTAL VIOLETA.Es una prueba útil en la identificación de rápidoscrecedores. Las especies patógenas, M. fotuitum yM. chelonae, crecen en este medio, el resto de lasespecies de rápidos crecedores no lo hacenexcepto algunas cepas de M. smegmatis quepueden crecer.

Tabla 5. Identificación de lentos crecedores escotocromógenos

Prueba M.scrofulaceum

M.gordonae

M.xenopi

M.simiae

M.ulcerans

M.szulgai

M.flavescens

Reducción nitratos - - - -/+ -- + +Tween 80 (5dIas) - + - - - - +Tween 80 (10dIas) - + - - - + +Arilsulfatasa (3dIas) - - +(42ºC) - - - +/-Crecimiento 30ºC + + -/+ + + + +Crecimiento 45ºC - - + - - - -Catalasa>45mm + + - + + +

7.2.8.- PRUEBA DE LA REDUCCIÓN DELTELURITO POTÁSICO.Es útil para la identificación de las cepas delcomplejo MAC.Otras pruebas bioquímicas que pueden ayudar ala identificación de los aislados de micobacteriasson,.

- La transformación del citrato férricoamoniacal, diferencia M. fortuitum de M.chelonae.

- Tolerancia al cloruro sódico solo M. trivialecrece en medios conteniendo 5% de NaCI.

- Ureasa: diferencia cepas pigmentadas deMAC, ureasa negativa.

- NAP: compuesto que inhibe a lasmicobacterias del complejo tuberculosis y quese utiliza en el sistema BACTEC radiométricoy en el Septi-chek.

El principal inconveniente de las pruebasbioquímicas es que además de ser muylaboriosas, son muy lentas. A estosinconvenientes se suma además la variabilidadde las reacciones incluso entre cepas de unamisma especie. Las tablas 5 a 8 expresan laidentificación bioquímica de los diferentes gruposde micobacterias.

7.3.- MÉTODOS GENÉTICOS DEMICROBIOLOGÍA MOLECULAR.La principal ventaja que aportan estos métodoses la rapidez en la identificación, ya que sontécnicas para las que no se requieren subcultivosla mayoría de las veces pueden llevarse a cabodirectamente en el cultivo primario. Como ventajaadicional, los métodos genéticos puedenaplicarse también directamente a los cultivos enmedios líquidos (BACTEC radiométrico y nuevosmedios), lo que acelera aun más los resultados.Las técnicas disponibles mas usadas actualmenteson:

Tabla 6. Identificación de no cromógenos de crecimiento lento

Especie Niacina Reducciónde nitratos

HidrolisisTween 80

Catalasa68ºC THC Ureasa Crecimiento

en PZA

M. tuberculosis + + +/- - + +/- -M. bovis² - - - - - + +M. bovis BCG² - + +/- - - + +M. africanun - - - - v + -M.avium complex¹ - - - + + - +M.malmoense - - + - + +/- +M. gastri - - + - + v +M.triviale¹ - + + + + +/- +M. haemophilum³ - - - - nd - ndM. xenopi - - - + + - +M. shimoidei - - + + - +M. celatum - - - + + - ndM. conspicuum - - + >1cm + - -

nd: no disponible1. M. terrae y M.triviale pueden diferenciarse por la tolerancia a 5% de NaCI2. M. bovis puede diferenciarse de M. bovis BCG por ser resistente a 30 µg de cicloserinay M. bovis es sensible3. M. haemophilum necesita hemina o citrato amónico férrico para su crecimiento.

7.3.1.- SONDAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS.Se basan en el uso de sondas de ADN marcadascon ésteres de acridina (químioluminiscencia) ycomplementarias a fragmentos de rARNespecíficos de especie. Actualmente seencuentran disponibles sondas comerciales(AccuProbe) para la identificación de lassiguientes especies M. tuberculosis complex: Elprincipal inconveniente es que no diferenciaentre las especies de este complejo. Se handescrito casos de falsos positivos con M. terrae yM. celatum.- M. avium complex: Puede dar falsos negativoscon algunas cepas, que presumiblementepueden obviarse cuando se utilizan las sondasespecíficas de M. avium- M. intracellulare- M. gordonae- M. kansasiiLas sondas de ácidos nucleicos son muysensibles cuando se utilizan a partir de cultivosen medios sólidos. En cultivos en BACTEC, losmejores resultados en este caso se obtienencuando el indice de crecimiento es muy alto(500-900), por lo que se recomienda su usocuando se comprueba que el índice haalcanzado valores altos que se estabilizan. En elcaso de los hemocultivos inoculados en elsistema BACTEC radiométrico la presencia desangre en la muestra puede causar problemasde falsos positivos. Pueden solucionarsediluyendo la muestra con líquido del mismo vial ytratarla con SDS o bien esperando al subcultivoen medio sólido.No existen todavía demasiados datos acerca deluso de las sondas con los medios líquidosactuales no radiométricos para el cultivo demicobacterias, aunque ya se han comunicadoalgunos resultados válidos.7.3.2.- SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOSNUCLEICOS.Se basa en la amplificación y posteriorsecuenciación de un fragmento del gen 16srARN, de secuencia conocida en las distintasespecies de micobacterias. Este gen estábastante conservado, pero tiene zonas variablescon secuencias de nucleótidos que sonespecíficas de género y de especie y que son lasque se amplifican. Actualmente ésta esconsiderada por muchos autores como la técnicaque permite la mejor identificación de losaislados de micobacterias. Sin embargo, no esaplicable como rutina asistencial en loslaboratorios de microbiología diagnóstica dada lanecesidad de una tecnología no disponible en lamayoría de ellos. Su uso se limita por elmomento a laboratorios con experiencia.

7.3.3.- POLIMORFISMO DE FRAGMENTOS DERESTRICCIÓN (PRA).Consiste en la amplificación de un framento delgen que codifica la proteina 65K de lasmicobacterias y en la posterior digestión delfragmento por dos enzimas de restricción, HaeIIIy BstEII. Los patrones de restricción sonespecíficos en las distintas especies demicobacterias. La tecnica tiene muchas ventajas:necesidad de poco inóculo, rapidez y capacidadde identificar la mayoría de las especiesdescritas. Entre los inconvenientes se encuentrala necesidad de disponer de los materialesnecesarios para amplificación y electroforesis degeles de agarosa, así como el adiestramiento degeles de agarosa, así como el adiestramiento enla lectura e interpretación de los patrones.7.3.4.- TÉCNICAS DE DETECCIÓN EIDENTIFICACIÓN.Se han comentado en el apartado 6.4.

7.4.- OTROS METODOS.7.4.1.- CROMATOGRAFÍASe trata de técnicas con las que se estudian lacomposición de lípidos de la pared celular de lasmicobacterias. Existen tres tipos de cromatofrafíaque se han aplicado a la identificación de lasmicobacterias- la cromatografía de capa fina, lacromatofrafía de gases y la cromatografia líquidade alta resolución (HPLC). De ellas, lacromatografía de gases y la HPLC son las quemejores resultados han dado. Se trata detécnicas muy rápidas (aportan resultados enmenos de 2 horas) y que dan muy buenosresultados en la identificación. Tienen comoinconveniente que el equipo que requieren escaro, por lo que actualmente están siendoutilizadas en laboratorios de Referencia.En la cromatografía de gases, la identificación sebasa en el perfil de ácidos grasos de lasmicobacterias. Permite la identificación deprácticamente todas las especies demicobacterias descritas y se realiza en unaspocas horas. Existe comercializado un sistemaque incluye además del cromatógrafo, el equipoinformático además del cromatógrafo, el equipoinformático necesario para la interpretación delos patrones.Por su parte, la HPC se basa en el perfil deácidos micólicos. Require muy poco inóculo y laidentificación puede llevarse a cabo tan prontocomo las colonias son visibles.Técnicamente es sencilla y rápida. Lainterpretación de los patrones obtenidos se hafacilitado por la existencia de programasinformáticos que permitan la comparación de lospatrones de ácidos micólicos con los de unacolección de 45 especies de micobacterias que

comprenden las mas habituales en clínichumana.

8.- ESTUDIOS DE SENSIBILIDAD AANTIMICROBIANOS8.1.- DETECCIÓN DE RESISTENCIAS DE M.TUBERCULOSIS.8.1.1.- INTRODUCCIÓNEn el genoma de Mycobacterium tuberculosis seproducen mutaciones espontáneas, que danlugar a resistencias a los antibióticos, este tipode resistencias suelen ser a un solo farmaco y sufrecuencia es baja. En la población bacilar de unenfermo tuberculoso, pueden existir bacilos coneste tipo de mutaciones junto a bacilos sensibles.La quimioterapia elimina los bacilos sensibles ypermite el desarrollo de los bacilos resistentes,por lo que el tratamiento de la tuberculosis sebasa en la asociación de fármacos para evitar laaparición de este tipo de resistencias. Laexistencia de tuberculosis resistente y sobre todode tuberculosis multirresistente en un productode la actuación humana. Las pruebas desensibildad en el laboratorio detectan, de formaaislada para cada fármaco, el porcentaje elevadode bacilos resistentes en la poblacióntuberculosa del enfermo.8.1.2.- FINALIDAD DE LA DETECCIÓN DERESISTENCIALa realización de pruebas de sensibilidad tienedos vertientes, un aspecto individualizado en unpaciente tuberculoso y un segundo aspectoepidemiológico para conocer el porcentaje decepas resistentes circulantes en una población.La implicaciones epidemiológicas van desde eltratamiento sistemático con 3 ó 4 fármacos, alconocimiento de grupos de riesgo por malcumplimiento del tratamiento o la evaluación dela eficacia de los programas contra latuberculosis.8.1.2.1.-Criterios para realizar las pruebas desensibilidad en un paciente.En la literatura existen diferentes indicacionesque son susceptibles de modificación atendiendoa circunstancias del mismo paciente o del áreageográfica en que se trabaje, inicialmente elantibiograma sistemático no estaría indicado ydebe realizarse básicamente en los siguientescasos: 1)sospecha de que se trata de unpaciente con resistencias, 2)persistencia debaciloscopias positivas con posterioridad a losdos meses de la primera muestra, 3) persistencia

de cultivo positivo a los seis meses del primercultivo. Estos criterios se han ampliado para : 4)todos los pacientes con VIH en zonas donde laincidencia de VIH es elevada, para realizar unavigilancia activa sobre este grupo y 5) todos lospacientes menores de 15 años.8.1.2.2.- Realización de pruebas de sensibilidadcon fines epidemiológicos.La vigilancia y control de cepas resistentes es unproceso que requiere planificación previa y lacolaboración de clínicos, epidemiológicos ymicrobiológicos.Los datos publicados sobre resistencias de M.tuberculosis pueden no ser comparables porquelas definiciones de los tipos de resistencia, loscálculos de las mismas o las poblacionesincluidas son distintas. Asimismo, la metodologíautilizada para las pruebas de sensibilidad puedeser también causa de diferencias.8.1.3.- DEFINICIÓN DE RESISTENCIAS

Resitencia primaria. Se define como resistenciaprimaria (RP) la presencia de resitencia a uno omás fármacos antituberculosos en un nuevopaciente tuberculoso. Incluye los pacientes quenunca han recibido tratamiento y aquellos en losque por diversos motivos se ignora si hanrecibido tratamiento anterior. Esta definiciónincluye las resistencias adquiridas encubiertas(iniciales).

Resistencia adquirida. Se define comoresistencia adquirida (RA) la resistencia a uno omás farmacos antituberculosos en pacientes quehan recibido tratamiento previo durante un mes omás.La definición de resistencia múltiple omulterresistencia (MR) incluye las cepas conresistencia al menos a isoniacida (H) yrifampicina ya sea inicial o adquirida.

Cálculo de la resistencia inicial y adquirida.La RP se calcula con un cociente en cuyonumerador esta el número de pacientes conresistencia que no han recibido tratamientoanterior dividido por el número de pacientes queinician tratamiento. La RA se calcula con elnúmero de pacientes con resistencia y que hanrealizado anteriormente tratamiento dividido porlos pacientes que inician tratamiento perorefieren tratamientos previos.

8.1.4.- MÉTODOS DE SENSIBILIDAD PARA M.TUBERCULOSIS.Los diversos métodos descritos para realizarpruebas de sensibilidad de M. tuberculosis, sepueden agrupar de la siguiente forma:

1.- Métodos de referencia (dependen de laobservación de colonias crecidas).2.- Métodos que detectan el crecimientobacteriano por sistemas automatizados osemiautomatizados.3.- Detección de alteracciones genómicas.4.- Otros métodos en desarrollo.8.1.4.1.- Métodos de referencia.Como en cualquier otra técnica los resultadosdeben ser reproducibles, comparables entrelaboratorios y correlacionar con la clínica. Endiversas reuniones de la OMS entre 1961 y 1969se aceptaron tres métodos para realizar estudiosde sensibilidad de M. tuberculosis, queactualmente siguen siendo los métodos dereferencia.El primero descrito por Michison en 1953 seconoce como método del cociente deresistencias, compara la concentración mínimainhibitorio de una cepa, con una cepa salvaje dereferencia. El segundo es el método deconcentraciones absolutas de Meisser descritoen 1961, donde se compara el número decolonias que crecen en el medio con el fármacorespecto al crecimiento obtenido en un medio sinfármacos. El tercero fue elaborado por Canetti ycols. en 1963 es el método de proporciones ydiluciones múltiples que ha sido finalmente elmás utilizado. La característica común a los treses que incorporan el fármaco en medio solido deLówenstein-Jensen y que para su lectura esnecesaria la visualización de colonias, por lo quedado el metabolismo lento de M. tuberculosis losresultados tardan de 21 a 28 días.El principal problema radica en la escasasolubilidad del bacilo en medio acuoso, lo quehace dificil obtener una suspensión homogéneaque permita un inóculo uniforme por esa razón,para la lectura se establece siempre unaproporción o relación entre el crecimiento de lacepa problema en medio de cultivo sin antibióticoy el número de colonias obtenidas en el mediode cultivo con el fármaco investigado.Al método de proporciones se han realizadovarias modificaciones, como la utilización delmedio liofilizado de Middlebrook 7H10 según elsistema del CDC, la versión del disco y lamodificación de Heiffets utilizando Middlebrook7H11 para las cepas que no crecen bien enMiddlebrook 7H10. Estos métodos facilitan lalabor en el laboratorio y la lectura. Los resultadospueden obtenerse en 15 a 21 días.La dificultad al describir un nuevo método osistema de antibiograma consiste en que debenredefinirse todos los parámetros del método,como son: el inoculo de bacilos, la concetraciónfinal de fármaco en función del medio que sevaya a usar y el tiempo idoneo de lectura, para

que los resultados puedan ser comparables a losmétodos de referencia clásicos.

8.1.4.2.- Sistemas semí o automatizados paradetectar el crecimiento bacteriano.

Sistemas radiométricos (BACTEC 460 TB) Ladependencia de esperar un crecimiento visible alojo humano, se superó con la incorporación deestos métodos en el aislamiento demicobacterias, y su aplicación a la detección deresistencias. Este sistema detecta el crecimientobacteriano mediante la utilización de un isótoporadiactivo incorporado a un medio líquido. En suinicio, al comparar los resultados obtenidos conlas técnicas estandar se conseguía mayorcoincidencia en las cepas sensibles que en lasresistentes. Con posterioridad se fueronajustando las concentraciones de los fármacosque se debía incorporar al medio y actualmentese considera que las pruebas de sensibilidadpara M. tuberculosis son reproducibles y susresultados coincidentes con las técnicas enmedios sólidos. El resultado puede darse entrelos 5 a 10 días.

Sistemas no radiométricos. (ESP II, MB/Bact,MGIT) Con el fin de evitar la utilización decompuestos radiactivos se han desarrolladootros sistemas que en algunos casos incorporanla lectura automatizada. En el momento actualestos métodos están en fase avanzada decomprobación respecto a métodos de referencia.Los tiempos de lectura son similares al sistemaradiométrico.

8.1.4.3.- Detección de genes de resitencia.

Estas técnicas son independientes delcrecimiento bacteriano necesario en los métodosanteriormente citados. La utilización de técnicasde biología molecular al estudio de resistenciasen micobacterias se iniciaron a principio de losaños 90. La delección del gen kanG, que codificala catalasa y peroxidasa se asocia a resistenciasfrente a isoniacida (H), al igual que el gen inhAque interviene en la síntesis de ácidos micólicosy el gen aphC. Mutaciones en el gen rpoB quecodifica la subunidad beta de la ARN polimerasa,confiere la resistencia a rifampicina. Laresistencia a estreptomicina se asocia amutaciones en los genes rpsL y rrs que codificanla proteínas ribosómicas 12S y 16S rRNA. Paralas resistencias a etambutol las alteraciones sehan encontrado en el gen embB y el incrementode resistencia a fluoquinolonas se ha

correlacionado con alteraciones en los genesgyrA y gyrBde la ADN girasa. Las alteraciones endeterminados genes no se detectan en todas lascepas consideradas como resistentes con losmétodos convencionales, por lo que es desuponer que debe haber mutaciones noconocidas en el genoma micobacteriano.

Para la detección de estas resistenciasTelenti describió la técnica de PCR-singlestrand conformatión polymorphism analysis(PCR-SSCP) y en su experiencia lasensibilidad de este método es del 87% parala resistencia a H y superior al 96% para laresistencia a R.

Se ha comercializado un sistema para ladetección de algunas mutaciones deresistencia a R (InnoLipa) de facil realizacióny buena sensibilidad y especificidad aunquerequiere la infraestructura básica de unlaboratorio de biología molecular. Lasalteraciones genéticas también puedendetectarse por secuenciación o PCRheteroduplex. Estas determinaciones sonlaboriosas, deben ser realizadas enlaboratorios de referencia y principalmenteestan enfocadas a estudios epidemiológicos.

8.1.4.4.- Otros métodos en desarrollo.

Con el fin de reducir el tiempo de detecciónde las resistencias se han descrito otrosmétodos que están en fase de evaluación ypor el momento no aplicables a la utilizaciónclínica: Estos métodos son:

Detección de adenosin-trifosfato (ATP)producido por los bacilos crecidos en medioliquido mediante bioluminiscencia.

Expresión de genes de luciferasa descritopor Jacobs, se basa en la utilización de unmicobacteriofago portador de un gen deluciferasa que se incluye en el genoma de M.tuberculosis produciendo luz si hay unmetabolismo activo, el desarrollo de estatécnica se basa en la mejora de vectorestransportadores de los genes y de lasproteínas productoras de luz.

Detección del ARN ribosómicomicobacteriano mediante la utilización desondas de hibridacción de ADN marcado,este método, iniciado por Kawa con ADN-I125, se ha continuado por Miyamoto yMartín Casabona utilizando DNA marcado

con compuestos quimioluminiscentes.Citometría de flujo, basada en la hidrolisisdel diacetato de fluoresceina por el bacilo. Sudetección por este método permiteresultados a las 24 horas. En la actualidadsupone un elevado costo.

Cromatografía. La cromatofrafía en mediolíquido (HPLC), utilizada para identificación,también ha sido aplicada para pruebas desensibilidad determinando las variaciones delos picos de acidos micólicos producidos porun cultivo de M. tuberculosis, y estudiados endiferentes tiempos de incubación.

CMI en microplaca. Esta técnica se hamejorado recientemente con la adición dedeterminados reactivos, indicadores de laoxidoreducción, como el azul alamar, oderivados del difeniltetrazolio.

8.2. DETECCIÓN DE RESISTENCIAS DEOTRAS MICOBACTERIAS.8.2.1.- INTRODUCCIÓNM. tuberculosis es una especie de sensibilidadconstante, en la que las pruebas desensibilidadhan sido estandarizadas y correlacionadas con laeficacia terapéutica. En el caso de otrasmicobacterias las diferentes especies muestranamplia variabilidad en su sensibilidad a losantibioticos, además, no se ha conseguido laestandararización de los métodos y los estudiosrealizados no demuestran claramente unacorrelación clínica. En definitiva, no hay métodosestandarizados para estudios de sensibilidades,por lo que la única vía posible es utilizar métodosconocidos y establecidos en otros campos de lamicrobiología, como la concentración mínimainhibitoria (CMI) y comparar los resultados conlas concentraciones alcanzables en sangre.8.2.2.- MÉTODOS UTILIZADOS

8.2.2.1.- Micobacterias de crecimientolento. Concentración mínima inhibitoria(CMI).

Pueden realizarse en medio sólido o líquido,Heiffets indica, entre otras las siguientesventajas del medio líquido:a. los resultados se obtienen en una

semana en vez de las dos semanas quenecesita el medio sólido:

b. la absorción y degradación de la drogadurante el tiempo de incubación esmenor.

c. los resultados obtenidos en medio líquidopueden ser comparados con parámetrosfarmacocinéticos.

Para realizar las MICs correctamente enmedio líquido, es necesario: estandarizar elinoculo, el tiempo de lectura, laconcentración de la droga en función delmedio utilizado y realizar

contajes de colonias para conocer las ufc/mlen las diferentes concentracionesantibióticas. Toda esta metodología es cara,lenta, laboriosa y poco ágil en la práctica.

Sistemas simplificados para determinar laCMI.

Sistema radiactivo. El método ha sidoutilizado frecuentemente en especies M.avium complex o M. kansasii, peroescasamente en otro tipo de micobacterias.

Microdilución en placa. Es más económicoy de más fácil manipulación.

Gradiente de antibiótico en tira (Etest). Esun sistema comercializado. Su principalventaja es su facil realización.

8.2.2.2.- Micobacterias de crecimientorápido.

M. fortuitum y M. chelonae son las especiesmas estudiadas, la información es escasapara otras especies de crecimiento rápido. Aligual que en las micobacterias decrecimiento lento se utilizan tecnicas quedetermines la CMI a los distintos antibióticos,la diferencia es que, en este caso, el mediode cultivo puede ser Mueller-Hintonsuplementado.

Otros métodos: Dilución en agar y difusióndisco con ambos métodos se ha obtenidouna buena correlación con la CMI en el casode M. fortuitum, pero la correlación es menorpara M. chelonae.

Algunas técnicas como bioluminiscencia ycitrometría de flujo y sus variantes, referidasantes también han sido aplicadas al estudiode la sensibilidad de estas micobacterias.

9.- MARCADORES EPIDEMIOLÓGICOSLa identificación de subgrupos de micobacteriasbasados en la rapidez de crecimiento, morfologíade la colonia, pigmentación y diversas pruebasbioquímicas permiten clasificarlas pero desde elpunto de vista epidemiológico se han empleadootros marcadores como el tipado de fagos, lasensibilidad a los antimicrobianos y la genéticamolecular.

9.1.- MARCADORES GENÉTICOSLa genética molecular es la herramienta actualmás útil como marcador epidemiológico. Laidentificación de la secuencia repetitiva del DNA,que está presente en el genoma en númerovariables y localización, permite detectardiferencias entre cepas al dar un patrónaltamente polimórfico usando enzimas derestricción. La mayoría de las aplicacionesepidemiológicas del análisis con enzimas derestricción (RFLP analysis) han usado unasecuencia de insersión conocida como IS6110.En general, de 1 a 20 copias de la 1S6110 seencuentran en el genoma de M. tuberculosis . Lavalidez y utilidad de los marcadores genéticos,como el 1S16110, depende de la estabilidad delpatrón producido y de sus evolución durante eltiempo. La huella genética del DNA necesita, porotro lado, para ser específica se cepaevolucionar con el tiempo. En caso contrariotodos los microorganismos tendrían el mismopatrón . El polimorfismo en la población de cepasde M. tuberculosis es esencial para que unsistema de huella genética sea válido. Laclonalidad o identidad de cepa se demuestra deforma más convincente cuando hay unaconsiderable diversidad de patrones. Unalimitación del estudio de la huella genética(aparte del tiempo que consume y el coste) se dacuando hay pocas copias de 1S6110. Esascepas deben ser tipadas usando otro sistema deestudio como el spoligotyping (spaceroligonueleotyde typing), este método detecta lapresencia o ausencia de secuencias de uniónvariables dentro de la región DR (direct repeatregion) y permite detectar patrones dehibridación dependiendo de la cepa de unamplificado in vitro del DNA. Sirve también paradiferenciar M. bobis de M. tuberculosis.Algunas aplicaciones sobre las que se haaplicado la huella genética con 1S6110 han sido:a) examen epidemiológico de la tuberculosiscomunitaria, b) detección de la transmisión nosospechada de M. tuberculosis, c) confirmaciónde la transmisión sospechadaepidemiológicamente, d) investigación de latransmisión nosocomial, e) estudios sobrepatógenesis de tuberculosis (diferenciación entrereinfección y reactivación), f) identificación decontaminación cruzada en el laboratorio.

9.2.- OTROS MARCADORES9.2..1.- MICOBACTERIÓFAGOSEl tipado con fagos que se basa en lasensibilidad de M. tuberculosis a diversosbacteriofagos, se ha empleado durante años

pero es muy laborioso y puede identificar sólo unlimitado número de cepas.9.2.2.- MYCOBACTERIOCINASTakeya y Tokiwa y de Shimamoto y Mizuguchi,describieron sus características y modo deacción junto con su posible utilidad en taxomía.Con estas micobacterocinas se han tipificadoepidemiológicamente 11 grupos de M.tuberculosis, y tambien se han utilizado para latipificación de micobacterias de crecimientorápido.9.2.3.- BIOVARIEDADES ENZIMÁTICAS DEMICOBACTERIASEn 1984 Casal y Linares detectan la diferenteactividad enzimática, de Mycobacteriumtuberculosis, proponiendo su utilidad, comoposible marcador epidemiológico.9.2.4.- PATRONES ANTIMICROBIANOSEl patrón antimicrobiano de resistencia se hausado para inferir la relación de las cepas. Solocuando el patrón es inusual puede inferirse larelación de los casos de una manera importante.

10.- CONTROLES MICROBIOLÓGICOSDEL TRATAMIENTO ANTIMICROBIANO.La defervescencia del proceso, como unmarcador de la mejoría clínica, se detecta dentrode las primeras 2 a 3 semanas. La mejoríaclínica y radiológica debe de ocurrir dentro de los3 meses del tratamiento. Si la fiebre continuamás de tres semanas, acompañada de deterioroclínico o radiológico, hay que contemplar eldiagnóstico de tuberculosis multirresistente.Los pacientes con un microorganismo sensibleque realizan un tratamiento correcto presentanuna rápida disminución, respuestasemilogaritmica, en el número de bacilos ácidoalcohol resistentes durante las primeras dossemanas. Se produce una reducción de hasta 2logs por mililitro de esputo durante los dosprimeros días de poliquimioterapia efectiva.En los pacientes con un esputo positivopreterapia, la repetición de la muestra de esputose puede obtener dentro del primer mes detratamiento (a las 2-4 semanas) y mensualmentehasta que dos exámenes seguidos seannegativos. El cultivo del esputo debe practicarsehasta que se produzca la conversión negativabacteriológica. Se recomienda la realización delos controles bacteriológicos mensuales hasta elsexto mes o miestras el paciente tengaexpectoración y después trimestralmente en laspautas de 9 y 12 meses.Se transforma el cultivo en negativo en los quereciben un mes de tratamiento con isoniacida yrifampicina, en la mitad pacientes y al cabo delos 3 meses, en el 90%. Los pacientes cuyos

esputos no se han negativizado después de 3meses de tratamiento deben ser analizados paraexcluir resistencia a fármacos o inadecuadaadhesión al tratamiento.Los denominados "escapes bacilares" odetección esporádica de cultivos positivospueden tener su origen en el paciente o resultarde una contaminación de una muestra vecina enel laboratorio. En ocasiones, se detectanbaciloscoplia positivas durante el final deltratamiento sin que se logre el crecimiento de lamicobacteria; son los denominados bacilosinviables.

11.- NIVELES DE LABORATORIOS DEMICOBACTERIOLOGÍAClásicamente, los laboratorios de micobacteriashan sido clasificados por la OMS, la PAO y lasATS en tres niveles que básicamente son lossiguientes:- Nivel periférico o nivel I. Realiza baciloscopias.- Nivel intermedio o nivel II. Realizabaciloscopias, cultivo e identificación de M.tuberculosis.- Nivel central o nivel III. Realiza baciloscopias,cultivo identificación de todas las especies,antibiograma, supervisión de otros laboratorios einvestigación.Esta clasificación es una orientación generalpara paises que tienen un programa nacional delucha contra la tuberculosis.En nuestro pais actualmente los laboratorios,suelen corresponder a los cuatro tipos referidos acontinuación:1. No realización de ningún procedimientoespecífico (sólo recolección de muestras ytrasporte a otros laboratorios).2. Realización de tinción para detección debacilos acido alcohol resistentes.3. Aislamiento de cultivo con identificación de M.tuberculosis complex.4. Identificación definitiva de todas lasmicobacterias.

12. MEDIDAS DE SEGURIDAD DE LOSLABORATORIOS DEMICOBACTERIOLOGÍALegislación sobre protección frente a losriesgos biológicos:Directiva del Consejo:de 26 de noviembre de1990 sobre la protección de los trabajadorescontra los riesgos relacionados con la exposicióna agentes biológicos durante el trabajo(90/679/CEE, DOCE L 374, de 1, 3-12). En lamás reciente directiva 193/88/CEE y en su anexoI, figuran la clasificación grupal en la que cada

microorganismo queda incluido o Real decretoespañol 664/1997, de 12 de mayo sobre laprotección de los trabajadores contra los riesgosrelacionados con la exposición a agentesbiológicos durante el trabajo.Las medidas de seguridad incluirán la puesta enpráctica de las recomendaciones de todolaboratorio microbiológico como son lassiguientes:

12.1.- RECOMENDACIONES GENERALESEducación para realizar el trabajo seguro,prohibición de comer, beber, fumar y aplicarsecosméticos o crema de manos, lavado de manosal abandonar el laboratorio, uso de bata (opijama), dispositivo de protección facial ante elriesgo de salpicaduras o formación de aerosolesy uso de guantes cuando se trabaje conmuestras clínicas o medios de cultivo concrecimiento.

12.2.- MEDIDAS PARA REDUCIR LAFORMACIÓN DE ACROSOLESManejo adecuado de centrifugas (no frenar paraterminar antes, motores con tapa, no llenar enexceso los tubos, preferencia de tubos conrosca, no verter líquidos bruscamente,precauciones al abrir las ampollas y agitar loscultivos, uso de asas de plástico desechable oincineradores de asas biológicas y trabajar encabinas biológicas de seguridad.

12.3.- MEDIDAS PARA EVITAREXPOSICIONES ACCIDENTALESNo pipetear con la boca, no encapuchar agujas,protegerse heridas o erosiones o las medidas debarrera ya comentadas.

12.4.- LIMPIEZA O ELIMINACIÓN DERESIDUOS ADECUADASLimpieza de la superficie de trabajo al menosuna vez al día y desinfección si existesalpicadura en la superficie. Esterilización odesinfección antes de la eliminación del materialpotencialmente infeccioso.

Para los laboratorios o zonas de trabajo denivel 2 se requiere el denominado nivel 2 deseguridad: llevar guantes para hacer lasextensiones, lavarse las manos, evitar lageneración de aerosoles, prohibición demanipular fuera de las campanas de seguridadmuestras clínicas, manejo adecuado de agujas yeliminación en contenedores resistentes.

Para laboratorios de nivel 3 y 4 se precisaríaun nivel de seguridad 3: cabina con filtrosHEPA (high-efficiency particulate air) que si el

aire recircula dentro del laboratorio deben derevisarse anualmente. Si se utilizan grandesinóculos de micobacterias, como en loslaboratorios de nivel 4, se aconseja disponer deuna habitación con presión negativa. No estarápermitido manipular fuera de las campanas deseguridad medios de cultivo con crecimiento demicroorganismos.Sería aconsejable que el personal al ingreso (yfinalizar) en el área de micobacterias se haga unestudio de infección tuberculoso (Prueba detuberculina en el caso de ser previamentenegativo, con o sin radiografía de tórax, yvaloración clínico-terapéutica si es positiva).

13. CONTROLES DE CALIDADLos controles de la calidad del laboratorio debenhacer referencia no solamente al resultadoobtenido y a testificar que un medio de cultivo osistema son adecuados al objetivo propuestosino también al tiempo requerido hasta que elsolicitante del estudio conoce el resultado.Todos los medios, reactivos y colorantes debende estar etiquetadas con su nombre, fecha derecepción, calidad, apertura y uso.Todo elequipamiento del laboratorio (incubadoras,neveras, centrifugas, microscopios, contadoras,neveras, centrífugas, microscopios,congeladores, lámparas de fluorescencia yultravioletas, filtros,...etc,) debe ser mantenido ycontrolado exhaustivamente. Debe constar lafecha de revisión de la-campana y la fecha de lapróxima revisión necesaria.Se aconseja que exista un manual deprocemientos. Los cambios en el procedimientodeben de ser aprobados por el responsable dellaboratorio.El personal asignado al laboratorio debe serpermanente y si la rotación es necesaria debepermanecer en el laboratorio al menos de 3 a 6meses.El laboratorio debe de participar en programasde control de calidad al que se envíen muestraspara que entren en la rutina habitual dellaboratorio. Cada laboratorio debe analizar susrutinas y resultados respecto a muestras ymétodos de transportes, procedimientosmicroscópicos, procedimiento de muestras ycultivos y establecer sus criterios de evaluación.

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