6437940 bacterias degradadoras de petroleo

5/11/2018 6437940 Bacterias Degradadoras de Petroleo - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/6437940-bacterias-degradadoras-de-petroleo-55a2344045970

1

“Biodegradación de

Petróleo Diesel”

Autor: Rómulo Aycachi Inga

Docente: MSc. Carmen Rosa Carreño Farfán

Facultad de Ciencias BiológicasDepartamento de Microbiología y Parasitología

Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallos

Lambayeque, 04 de abril del 2008.



2

I. Introducción:

La industria petroquímica es importante en una sociedad moderna, no obstante lafalta de un programa de protección ambiental, hace que el medio ambiente se contamineal producirse derrames de petróleo, principalmente de crudo, por un deterioro de los

oleoductos, descargas de efluentes contaminados, afloramientos naturales a través defisuras de la corteza terrestre y debido a la producción, transporte y almacenamiento deeste recurso natural.

A nivel mundial, el volumen de derrame de petróleo es de 1.7 a 8.8 millones detoneladas métricas por año y en nuestra región (Pacífico Sudeste) es de 6000 toneladasmétricas al año. En el Perú se registran derrames de petróleo desde 1978, uno de ellosfue el producido en el oleoducto marino de Talara, estando entre los últimos el ocurridoel año 2000 en el río Marañón que afectó la Reserva Pacaya-Samiria y el producido el30 de enero del 2008 en el que, debido a una explosión producida en un barco carguero,se derramaron frente al mar de Tumbes 1300 barriles de crudo de petróleo. Pero no sóloderrames mayores causan contaminación sino también los constantes derrames

accidentales en suelos de nuestra selva, los que se producen por el rompimiento delOleoducto Nor-Peruano, debido a accidentes naturales y por la actividad extractiva. Losmares del planeta sufren cada año millones de pequeños derrames contaminantesprocedentes de barcos, refinerías costeras y plataformas petrolíferas. Un estudio de laUniversidad Politécnica de Cataluña advierte de que el impacto ambiental de lospequeños vertidos diarios es mucho mayor que el ocasionado por un gran accidente yhan lanzado una seria advertencia sobre el enorme impacto ambiental que provocan lospequeños vertidos de petróleo -desde un litro a unas 80 toneladas- por su excesivafrecuencia.

Los dispersantes químicos utilizados para favorecer la remediación de los ambientescontaminados pueden causar un mayor impacto ecológico que el mismo derrame, por sutoxicidad y recalcitrancia a la biodegradación. Por tanto, una mejor alternativa desolución es el proceso de biorremediación, que es el tratamiento biológico del suelo,aire y agua, mediante la biodegradación de compuestos tóxicos para transformarlos encompuestos de menor o ningún impacto ambiental. Así en la biodegradación dehidrocarburos, se utilizan bacterias con alta capacidad degradativa, entre estas:

Brevibacterium, Spirillum, Xanthomonas, Alcaligenes, Arthrobacter , Nocardia,Flavobacterium, Vibrio, Achromobacter , Acinetobacter , Micrococcus, Pseudomonas

aeruginosa, Serratia rubidae, Bacillus sp., Pseudomonas mendocina, Pseudomonas

aureofasciens, etc., las cuales disminuyen la concentración de hidrocarburos presentesen el ambiente y al mismo tiempo son inocuas para la salud y el medio ambiente. Estas

bacterias producen bioemulsificantes y biosurfactantes que disminuyen la tensiónsuperficial entre el petróleo y el medio acuoso facilitando el acceso microbiano a lafuente de carbono insoluble para su degradación.



3

II. Generalidades:

a. El crudo de petróleo:

El crudo de petróleo se caracteriza por ser un líquido negro, viscoso y con una

composición química sumamente compleja, pudiendo contener miles de compuestos,básicamente de la familia de los hidrocarburos. Los hidrocarburos componen la familiapredominante de compuestos (un 50-98% de la composición), por lo que constituyenuno de los grupos de contaminantes ambientales más importantes, tanto por suabundancia, como por su persistencia en distintos compartimentos ambientales.Mayoritariamente son alcanos de cadena lineal (n-alcanos o nparafinas), alcanosramificados (en menor cantidad), cicloalcanos (o naftenos) y cantidades variables dehidrocarburos aromáticos. La composición elemental de un crudo está condicionada porla predominancia de los compuestos tipo hidrocarburo: 84-87% de C, 11-14% de H, de0-8% de S, y de 0-4% de O y N y metales como el níquel y el vanadio. Los principalescomponentes se subdividen y purifican en distintas fracciones: i) fracción saturada (n-

alcanos, alcanos ramificados con cadenas alquílicas y las cicloparafinas), ii) fracciónaromática (monoaromáticos, diaromáticos y hidrocarburos aromáticos policíclicos(HAPs), iii) fracción de resinas y iv) fracción de asfaltenos que son menos abundantes yconsisten en compuestos más polares, pudiéndose encontrar hidrocarburosheterocíclicos, hidrocarburos oxigenados y agregados de alto peso molecular .



4

b. Refinado del crudo de petróleo:

Para comprender la naturaleza química de los diferentes derivados del petróleoque potencialmente pueden ser contaminantes en el medio ambiente, hay que entenderel proceso de refinado del crudo utilizado para la obtención de estos productospetrolíferos.

El refinado pasa por un proceso de destilación, con la finalidad de eliminar elcolor y olor, así como también, los compuestos del azufre. Se destila a emperaturascrecientes obteniendo 4 fracciones principales: gasolina, queroseno, destilados medios(querosenos, gasoil, aceites lubricantes) y un residuo. Este residuo se destila al vacíoobteniéndose otros aceites lubricantes (más pesados), ceras y parafinas y betumesasfálticos (alquitranes).

Durante el proceso de refinado, se eliminan componentes de la fracciónasfalténica (altamente recalcitrante) lo que implica que los refinados intermedios(gasoil, fueles, querosenos y también las gasolinas) sean productos relativamente másbiodegradables que los coques o alquitranes residuales. Así pues, la composiciónquímica de la gasolina es diferente a la del gasoil debido a que se han obtenido comoproductos de destilación del petróleo a partir de diferentes intérvalos de temperatura(tabla 1.4). La obtención de gasolina es menos directa que la de los fueles y gasóleos, yaque en una primera fase se obtiene por destilación del crudo entre 20-180ºC. Estoimplica una composición de n-alcanos más ligera (C6-C11) que los fueles y gasóleos(C10-C25). En la gasolina encontramos como componentes más abundantes: nbutano,isopentano, pentano, mono y dimetilpentanos, hexano, BTEX, mono y dimetil hexanos,

trimetilbencenos, metiletilbencenos, y en menor cantidad los naftalenos, sus mono ydimetilados y heptano (de menor índice de octanaje).



5

Los fueles ligeros y el gasoil forman parte de la fracción intermedia dedestilación en el proceso de refinado, lo que implica un rango de puntos de ebulliciónentre 185-345ºC, encontrando compuestos de 10 a 25 átomos de carbono, siendo losmás abundantes los C15-C17. (fig. 1.2). Su composición es de un 30% en parafinas (n-alcanos e isoprenoides), 45% de naftenos (cicloalcanos) y un 25% de aromáticos. En

concreto a nivel de compuestos aromáticos encontramos alquilbencenos, y másabundantemente, el naftaleno y sus alquilados. También se ha encontrado, en cantidadesmenores, el fenantreno y el fluoreno. No contienen pireno ni fluoranteno (compuestosde 4 anillos aromáticos), cuyos puntos de ebullición son más elevados que el intervaloutilizado en la destilación de fracciones intermedias.

c. Biorredediación del petróleo Diesel usando diversos microorganismos:

La biorremediación es la adición de materiales a ambientes contaminados paraproducir una aceleración del proceso natural de biodegradación1.

1 Biodegradación: se refiere al proceso natural mediante el cual bacterias u otros microorganismos alterany convierten moléculas orgánicas en otras sustancias, como ácidos grasos y CO 2.



6

La elevada complejidad de la composición del crudo de petróleo y derivados,implica la existencia de una amplia capacidad enzimática si se quiere conseguir unadegradación significativa del crudo. La mayor parte de los estudios realizados se hanllevado a cabo con cepas bacterianas individuales o con la combinación de diferentescepas aisladas.

En la mayoría de los casos, son degradadoras de alcanos, debido a que losalcanos son los componentes más abundantes del crudo de petróleo. No obstante enalgunos casos, estas cepas tienen la capacidad de oxidar selectivamente las cadenasalquílicas de ciertos HAPs alquilados, compuestos abundantes en el crudo.Recientemente, se han descrito algunas cepas con la capacidad de degradar tanto HAPsde elevado peso molecular como alcanos pero ésta, no parece que sea una normageneral. De hecho los degradadores de alcanos citados habitualmente en la bibliografíageneralmente no son capaces de romper el anillo aromático de los HAPs, mientras quelos degradadores de HAPs generalmente no crecen con alcanos.

La alternativa a la utilización de cepas individuales es la obtención y utilizaciónde cultivos mixtos, los cuales pueden ser consorcios definidos y consorcios no

definidos. Los consorcios definidos se caracterizan por ser una combinación de cepasaisladas con capacidades degradativas conocidas que son complementarias entre sí. Losconsorcios no definidos se caracterizan por ser el resultado de procesos directos deenriquecimiento a partir de muestras ambientales con historia previa de contaminación ypor lo tanto no son el resultado de una combinación de cepas previamente aisladas.

d. Biosurfactantes

Se dice que un soluto es un agente tensoactivo o surfactante cuando da lugar aun descenso significativo de la tensión superficial. El descenso de la tensión facilita laeliminación de las partículas de la suciedad de las superficies sólidas. Son moléculasque contienen un segmento liposoluble (soluble en aceite) y otro hidrosoluble (solubleen agua o disolventes polares). La solubilidad parcial tanto en agua como en aceitepermite al surfactante ocupar la interfase. Así pues, reducen la tensión superficial y lastensiones interfaciales entre moléculas individuales en la superficie y la interfase,respectivamente. Tienen propiedades emulsionantes.

Atendiendo a estos criterios un biosurfactante sería una molécula biológica(orgánica) con propiedades surfactantes o tensoactivas producidas sobre superficiesvivas, mayormente superficies de células microbianas, o excretados al medioextracelular.

Con excepción del poder bactericida de ciertos surfactantes, fenómeno del cual

no hay una explicación absolutamente segura, se puede decir que todas las propiedadesy usos de los surfactantes provienen de dos propiedades fundamentales de estassustancias: su capacidad de adsorberse a las interfases y de otra parte su tendencia aasociarse para formar estructuras organizadas.



7

Clasificación de los biosurfactantes

Los surfactantes microbianos son moléculas complejas que cubren un ampliorango de estructuras químicas incluyendo péptidos, ácidos grasos, fosfolípidos,glicolípidos, antibióticos, lipopéptidos, etc. Los microorganismos también producen enalgunos casos, surfactantes que son combinaciones de muchas estructuras químicascomo los surfactantes microbianos poliméricos. Muchos surfactantes microbianos hansido purificados y sus estructuras químicas son conocidas. Mientras que los de alto pesomolecular son generalmente heteropolisacáridos polianiónicos que contienen tantopolisacáridos como proteínas, los de bajo peso molecular suelen ser glicolípidos.

Podemos clasificar los biosurfactantes atendiendo a tres criterios: naturalezaquímica, peso molecular y carga iónica de la parte superficialmente activa de lamolécula.

1. Naturaleza química

a) Lípidosb) Hidrtos de carbonoc) Aminoácidos

d) Glucolípidose) Lipopéptidos

2. Peso molecular

a) Bajo peso molecular: Suelen ser glicolípidos. El más estudiado es el rhamnolípido,producido por diversas especies como Pseudomonas. La función principal de estosbiosurfactantes es reducir la tensión superficial entre fases (agua-roca por ejemplo).

b) Alto peso molecular: Suelen ser polisacáridos, proteínas, lipoproteínas,lipopolisacáridos o mezclas de estos polímeros. Estos biosurfactantes no son taneficaces en cuanto a la reducción de la tensión superficial entre fases, pero si son buenoemulsionantes. Además se ha demostrado que son muy eficaces a bajas concentraciones

y poseen una considerable afinidad por el sustrato. Un ejemplo sería Alasan producidopor Acinetobacter radioresistens.



8

3. Carga iónica

a) Agentes aniónicos: Contiene generalmente uno de cuatro grupos polares solubles-carboxilato, sulfonato, sulfato o fosfato- combinado con una cadena hidrocarbonadahidrófoba. Si esa cadena es corta son muy hidrosolubles y en el caso contrario tendrán

baja hidrosolubilidad y actuaran en sistemas no acuosos como aceites lubricantes. Seusan principalmente en la industria de jabones y detergentes.

b) Agentes catiónicos: Están compuestos por una molécula lipofílica y otra hidrofílica,consistente de uno o varios grupos amonio terciarios o cuaternarios. Son utilizadoscomúnmente en detergentes, agentes limpiadores, líquido de lavaplatos, tratamiento detextiles, como sustancias activas antimicrobianas y en cosmética.

c) Agentes no iónicos: No se disocian en iones hidratados en medio acuoso. Laspropiedades hidrofílicas son provistas por hidratación de grupos amido, amino, éter ohidroxilo.

d) Otros tipos de surfactantes: La combinación en la misma molécula de un grupo contendencia aniónica y de un grupo con tendencia catiónica produce un surfactanteanfotérico, como por ejemplo los aminoácidos, las betainas o los fosfolípidos. Según elpH del medio una de las dos disociaciones prevalece. Este tipo de surfactante se usasólo en casos particulares debido a su alto costo.

Utilización de los Biosurfactantes

Los contaminantes hidrofóbicos presentes en los hidrocarburos del petróleo,suelos y aguas del medio ambiente requieren su solubilización antes de ser degradadospor la célula microbiana.

La mineralización está gobernada por la desorción de los hidrocarburos delsuelo. Los surfactantes pueden aumentar el área de los materiales hidrofóbicos, comopesticidas en suelos y agua del medio, aumentándose así su solubilidad en agua. Portanto, la presencia de biosurfactantes puede aumentar la degradación microbiana de loscontaminantes.

Se le ha dado una atención considerable a la producción de moléculas

tensoactivas de origen biológico por sus aplicaciones en el procesado de alimentos,aromatización de bebidas alcohólicas, reciclaje de papel, fabricación de pulpa de papel,



9

en farmacología, y la industria del aceite. En relación a esa última aplicación, losaccidentes que llevan a vertidos de aceite han llegado a ser numerosos y han causadocatástrofes tanto sociales como ecológicas. La habilidad de los biosurfactantes paraemulsionar hidrocarburos mezclados con agua ha sido ampliamente divulgada. Estaspropiedades emulsionantes también se ha demostrado que favorecen la degradación de

los hidrocarburos en el medio ambiente, por tanto los hacen muy útiles para el controlde la contaminación por vertidos de aceites.En la biorremediación en vertidos de petróleo, estudios recientes han mostrado

que se puede utilizar el poder solubilizante de las micelas para extraer ciertas sustanciascontaminantes aún cuando su concentración sea extremadamente baja.

Las funciones que harían estos biosurfactantes a la hora de aumentar labiodisponibilidad serían:

- Dispersar el petróleo aumentando la superficie de contacto.- Aumenta la biodisponibilidad de compuestos hidrofóbicos. Serían en este caso sobretodo los de bajo peso molecular.

- Poseen también funciones evolutivas para los propios microorganismos. Puedenayudar a los microorganismos productores a desprenderse de las gotas de petróleo unavez se ha agotado la fuente de hidrocarburo que utilizaba. Hay que tener en cuenta queun microorganismos suele utilizar un solo tipo de hidrocarburo entre la mezcla queexiste. Por eso les sería útil poderse desprender de estas interacciones hidrofóbicas quemantiene la membrana con la gota de petróleo, para así ir en busca de nuevas fuentes decarbono. Además deja una microcápsula alrededor de la gota para marcarla como usada,favoreciendo así a toda la población.

Una propiedad de los biosurfactantes curiosa es su actividad bactericida. Dichaactividad se debe a su capacidad detergente.



10

Surfactantes Microbianos

El interés por los surfactantes microbianos ha estado en aumento en los últimosaños debido a sus diversas características deseables tales como una efectivaselectividad, respetuosos para la naturaleza, su estabilidad a elevadas temperaturas, a pH

y concentración de sales. Hay que añadir que los biosurfactantes han aumentado laversatilidad en comparación a muchos surfactantes sintéticos y tienen la ventaja depoder producirse por fermentación.

Hay células microbianas intactas con una superficie celular altamentehidrofóbica que son ellas mismas surfactantes. En algunos casos, los propiossurfactantes juegan un papel natural en el crecimiento de las células microbianas sobresustratos insolubles en agua. Los surfactantes extracelulares están implicados en laadhesión celular, emulsión, dispersión, floculación, agregación celular y fenómenos dedesorción. Aunque el tipo y cantidad de surfactante microbiana producido dependeprimeramente del organismo productor, factores como el carbono y el nitrógeno,elementos traza, temperatura, y aireación, también afectan a su producción por el

organismo.Existen varios biosurfactantes producidos por bacterias, entre ellos tenemos:



11

Algunos ejemplos de bacterias y la producción de biosurfactantes:

1. Bacillus pumilus (estirpe 28-11) produce biosurfactantes con una gran capacidad deemulsionar y eliminar compuestos hidrocarbonatos. Esto hace que se considere estaestirpe como prometedora en el campo de la tecnología medio ambiental.

2. Candida ishiwade (Tailandia) es una levadura termotolerante que producemonoacilgliceroles y glicolípidos.

3. Pseudomonas sp. Pueden reducir la tensión superficial, estabilizar emulsiones, ypromover la formación de espumas y generalmente son no tóxicos, no peligrosos y



12

biodegradables. Debido a su diversidad, inocuidad para el medio ambiente, posibilidadde producción a gran escala, selectividad, efectividad bajo condiciones extremas enpequeñas cantidades, producción sobre recursos renovables, y sus aplicacionespotenciales para la protección del medio ambiente, los biosurfactantes han ganadoimportancia frente a los surfactantes químicos. Hay que añadir el valor del carbohidrato

presente, la ramnosa de los ramnolípidos biosurfactantes, es usada para el transporte dedrogas insolubles en humanos y actúa como precursor de componentes de saborizantesde alta calidad. Los biosurfactantes potencian la emulsión de hidrocarburos y por esotienen el poder de solubilizar contaminantes hidrocarbonados y aumentar sudisponibilidad para la degradación microbiológica.

Así los microorganismos productores de biosurfactantes pueden jugar unimportante papel en la biorremediación acelerada de lugares contaminados conhidrocarburos. Debido al alto costo de los procesos de remediación y otras aplicacionespotenciales, la necesidad de aumentar la producción de biosurfactantes es determinadapor la genética del microorganismo, otros factores tales como las condiciones

ambientales y la naturaleza del sustrato también influyen en el nivel de expresión. Así,la optimización de esas condiciones puede llevar a una producción elevada y segura debiosurfactantes. Existen estudios para el desarrollo de métodos económicos paraaumentar la producción usando materias primas de bajo costo.

4. Pseudomonas aeruginosa LBI es un ejemplo claro de estructura química, propiedadessuperficiales y actividad biológica en la producción de biosurfactantes. La naturalezaquímica de los biosurfactantes producidos sería en este caso ramnolípidica, cuyaestructura de ramnosa contiene propiedades biosurfactantes.

5. Pseudomona putida PCL1445 produce biosurfactantes interesantes a nivel industrial.En este caso se caracterizo dos lipopéptidos con actividad biosurfactante: putisolvin I yputisolvin II; los cuales inhiben la formación de biopelículas o provoca la destrucciónde las mismas. Esta estirpe PCL1445 fue aislada de la raíz de una planta, crecida en unazona contaminada con PAHs (hidrocarburos aromáticos policíclicos). Se vió que laestirpe PCL1445 produce actividad biosurfactante hasta el final de la fase decrecimiento.

Teniendo en cuenta el uso potencial de los tensioactivos en las tecnologías debiorremediación, la utilización de los biotensioactivos parece tener más potencial quelos tensioactivos de síntesis (químicos), debido a la mayor diversidad estructural,

biodegradabilidad y biocompatibilidad de los biotensioactivos. Los biotensioactivosmás estudiados han sido los emulsanos de Acinetobacter sp. y el grupo deramnolípidos producidos por Pseudomonas aeruginosa.

e. Ventajas y limitaciones de los procesos de biorremediación de sueloscontaminados.

Entre las distintas tecnologías disponibles para la descontaminación de un suelo,es importante diferenciar aquéllas que suponen una solución temporal o el posibletraslado del contaminante a otros compartimentos ambientales de aquéllas que

potencialmente pueden transformar los contaminantes en productos inocuos. Latecnología de la biorremediación, basada en la utilización de los microorganismos y su



13

potencial metabólico biodegradador para eliminar o transformar los contaminantes delmedio en productos inocuos, tiene ciertas ventajas respecto a los métodosfisicoquímicos (excavación, extracción química y incineración) tanto por su menorcoste económico, como por la no afectación de otros compartimentos ambientales y laoptimización de los recursos.

Los costes de las técnicas biológicas (bioventing, biopila, landfarming y plantasde tratamiento biológico) son mucho más rentables económicamente que las técnicasfisicoquímicas. Una consecuencia de ello es que en Alemania, por ejemplo, en 1998,aproximadamente de las 2,2 MTm de suelo que fueron tratadas en las 109 plantas detratamiento que dispone, un 60% fueron tratadas de forma biológica. Si tenemos enconsideración que cada planta de tratamiento de suelos, tiene una capacidad de 4 x 10 5

Tm x año-1, se podría llegar a tratar una cantidad de suelo 10 veces superior que laprocesada en 1998.

Una de las limitaciones que presentan las técnicas biológicas respecto a lastécnicas fisicoquímicas es el tiempo necesario para alcanzar una biodegradaciónaceptable según las normativas. Durante un proceso de biorremediación se produce una

ralentización del proceso de biodegradación ya sea por un enriquecimiento decomponentes más recalcitrantes o por una disminución de la biodisponibilidad de loscontaminantes. Sin embargo, las técnicas fisicoquímicas, aún pudiendo ser más rápidasy efectivas en la disminución de la concentración de contaminantes, alteran o eliminanpor completo la microbiota autóctona del suelo, modifican las característicasfisicoquímicas del suelo, y además, no eliminan los contaminantes, si no que lostrasladan a otro compartimento ambiental. Por lo tanto no cumplen con los criterios desostenibilidad en los que se debería basar la ley de protección de suelos.

Factores que condicionan la biorremediación de un suelo.

La biodegradabilidad de una mezcla de hidrocarburos presente en un suelocontaminado depende de diversos factores como son: la presencia de una poblaciónmicrobiana degradadora potencialmente activa, la estructura molecular delcontaminante, su concentración y biodisponibilidad, y factores ambientales como el pH,temperatura, humedad del suelo, presencia de aceptores de electrones disponibles, y laexistencia de nutrientes inorgánicos (fuente de N y P) disponibles.

El pH, temperatura y la humedad

Cada cepa microbiana tiene un determinado rango de tolerancia a factores

ambientales como son: la temperatura, el pH y la salinidad, los cuales pueden afectar alcrecimiento y actividad de las poblaciones microbianas. En consecuencia, cuanto mayorsea la diversidad de microorganismos existentes, potencialmente mayor será el rango detolerancia. No existen unas condiciones preestablecidas que sean óptimas en todos loscasos, pero en términos generales a pH y temperaturas extremas y en suelos salinos labiodegradación se ralentiza, siendo los rangos óptimos para la biodegradación: pH entre6- 8 y temperaturas entre 20-30ºC.

La variación del pH del suelo afecta a la actividad microbiana y también a lasolubilización y adsorción/absorción de los contaminantes y de los iones. Las formascatiónicas (NH4+, Mg2+, Ca2+) son más solubles a pH ácido mientras que las formasaniónicas (NO3-, NO2-, PO4

3- Cl-) son más solubles a pH alcalino. En general, el pH

óptimo para las bacterias heterótrofas es neutro (pH 6-8), mientras que es más ácido



14

para los hongos (pH 4-5). El pH óptimo establecido para procesos de biodegradación esneutro (pH 7,4-7,8).

La temperatura es uno de los factores ambientales más importantes que afecta laactividad metabólica de los microorganismos y la tasa de biodegradación. La mayorparte de estudios realizados indican que las condiciones mesofílicas (20-30ºC) son las

óptimas para la biorremediación de suelos contaminados. No obstante, también se hadescrito biodegradación de hidrocarburos temperaturas extremas: a 10ºC en suelossubárticos y subalpinos, 5ºC en suelos árticos y hasta 60ºC por una cepa termófila de

Bacillus stearothermophilus aislada de un suelo contaminado con crudo de petróleo deldesierto kuwaití.

La humedad del suelo puede limitar de forma severa la biodegradación,fundamentalmente en suelos superficiales afectados por oscilaciones importantes en elcontenido de agua. No obstante el nivel óptimo de humedad depende de las propiedadesde cada suelo, el tipo de contaminación y si la biodegradación es aeróbica o anaeróbica.Un déficit de agua puede disminuir el transporte de nutrientes y de contaminantes, así como también la migración bacteriana a través del suelo. El exceso de agua en un suelo

desplaza el aire residente en los poros del suelo, generándose con mayor facilidadcondiciones anaeróbicas, al agotarse el oxígeno disuelto en agua.

Estructura química

De las distintas familias de hidrocarburos del petróleo, los n-alcanos y losalcanos ramificados (isoprenoides) de cadena intermedia (C10-C20) son los sustratos másfácilmente degradables por los microorganismos del suelo, y que por lo tanto tienden aser eficazmente biodegradados. Sin embargo, los alcanos de cadena larga (>C20) sonmás difíciles de degradar debido a su (elevado peso molecular) y su baja solubilidad enagua. Los cicloalcanos, por norma general, se degradan más lentamente que los n-alcanos y alcanos ramificados. Asimismo, los HAPs que contienen de 2 a 3 anillosaromáticos pueden ser biodegradados eficazmente en el suelo en condicionesambientales óptimas, mientras que los HAP de 4 anillos, y especialmente, los de 5 omás anillos bencénicos presentan una mayor recalcitrancia inherente y una bajasolubilidad. Las fracciones de resinas y asfaltenos son las que presentan una menordegradabilidad debido a las complejas estructuras químicas y al elevado peso molecularde sus moléculas.

Biodisponibilidad

La tasa de degradación depende tanto de la capacidad de transporte y delmetabolismo microbiano, como de la transferencia de masas del compuesto. La relaciónentre estos factores se conoce como biodisponibilidad. En los suelos uno de los factoreslimitantes para la biodegradación es la transferencia de masas, ya que losmicroorganismos de los suelos contaminados, suelen tener amplias capacidadesbiodegradativas al estar expuestos a una gran variedad de compuestos orgánicosdiferentes. Por lo tanto la adsorción, la absorción, desadsorción, disolución y la difusiónson fenomenos, propios de la transferencia de masas, que condicionan labiodisponibilidad de los contaminantes. Un fenómeno que afecta de forma negativa a labiodisponibilidad de los contaminantes es el envejecimiento o ageing que se definecomo la pérdida de la biodegradabilidad de los compuestos a lo largo del tiempo en el

suelo (aunque la población microbiana mantenga intacto su potencial catabólico), elcual es más importante en suelos con elevado contenido en materia orgánica. Este efecto



15

se produce por una serie de fenómenos como son: la adsorción con la materiaparticulada del suelo, absorción a la materia orgánica del suelo, a la baja difusividad delos compuestos, principalmente desde los microporos; a la disolución en fases líquidasno acuosas (FLNAs), o a la formación de uniones covalentes con la materia orgánica einorgánica del suelo. Con la finalidad de aumentar la biodisponibilidad de los

contaminantes existen numerosos ejemplos en la bibliografía de la utilización detensioactivos sintéticos y biotensioactivos en la biorremediación de sueloscontaminados por hidrocarburos.

Presencia de aceptores de electrones

La mayor parte de hidrocarburos presentes en los productos petrolíferos sondegradados con mayor extensión y rapidez de forma aeróbica (O2 como aceptor final deelectrones), ya que en ausencia de O2, y en presencia de aceptores de electronesalternativos (NO3

-, SO42-, CO2, Mn4+

y Fe3+) los hidrocarburos pueden ser degradados,pero con unas tasas de biodegradación muy inferiores a las aeróbicas.

Nutrientes inorgánicos

Las concentraciones de nitrógeno y fósforo asimilables presentes en el suelo,suelen ser limitantes para un incremento y activación de la población microbiana,mientras que otros nutrientes esenciales como el Ca2+

, Na+, Fe2+ y SO4

2- ya están

presentes en cantidades suficientes en el suelo.La adición de fuentes de N y P inorgánicas, generalmente tiene un efecto

positivo incrementando las poblaciones microbianas y las tasas de biodegradación dehidrocarburos en suelos contaminados. Las proporciones molares de C:N:P, descritas enla bibliografía, respecto al contenido de carbono a degradar son muy distintas. LaAgencia de Proteccion Ambiental de USA recomienda utilizar proporciones C:N de100:10 a 1000:10 para la biodegradación de suelos contaminados por hidrocarburos, ydentro de este intervalo se han descrito proporciones C:N de 600:10, 500:10 y de100:10:1 a 300:10:1 respecto al Carbono Orgánico Total a degradar. Aunque en generalla adición de fuentes inorgánicas de N y P al suelo es beneficiosa para los procesos debiodegradación, existen estudios que han descrito efectos inhibitorios en la adición denutrientes inorgánicos.

Además es importante destacar que la acción de los nutrientes inorgánicos puedeestar limitada debido a la interacción química con los minerales del suelo (el amonio sepuede unir a las arcillas por intercambio catiónico y el fosfato puede unirse y precipitar

con iones calcio, hierro y aluminio).

f. Microorganismos reportados como degradadores de Petróleo:

- Todos los ecosistemas acuáticos y marinos contienen algún tipo demicroorganismos degradadores de petróleo, entre los géneros reportados están:

- Bacterias:o Achrornobactero Acinetobactero Actinomyceso Alcaligeneso Arthrobacter

o Bacilluso Beneckeao Brevebacteriumo Coryneformeso Erwinia



16

o Flavobacteriumo Klebsiellao Lactobacilluso Leumthrixo Moraxella

o Nocardiao Peptococcus

o Pseudomonaso Sarcinao Spherotiluso Spirillumo Streptomyces

o Vibrioo Xanthomyces

- Hongos:o Allescheriao Aspergilluso Aureobasidiumo Botrytiso Candidao Cephalosporiumo Cladosporiumo Cunninghamellao Debaromyceso Fusariumo Gonytrichumo Hansenulao Helmintrosporiumo Mucor

o Oidiodendrumo Paecylomyseso Phialophorao Penicilliumo Rhodosporidiumo Rhodotorulao Saccharomyceso Saccharomycopisiso Scopulariopsiso Sporobolomyceso Torulopsiso Trichodermao Trichosporon

- También se ha reportado la utilización de dos especies de camarones en labiodegradación del petróleo, siendo estos Peanus duorarum y Peanus aztecuz cuya capacidad de degradar los hidrocarburos casi en su totalidad van desde loscompuestos de 12 carbonos hasta los compuestos de 22 carbonos.

- La cantidad y diversidad de los microorganismos degradadores de petróleodepende de la exposición de las aguas a estos hidrocarburos.

- La velocidad de degradación de los compuestos presentes en el petróleo es comosigue:

HC saturados > aromáticos ligeros > aromáticos de alto PM > asfaltenos, resinas

III. Objetivos:

- Aislar bacterias degradadoras de de Petróleo Diesel.- Cuantificar la actividad degradativa del Petróleo Diesel de cada una de las

bacterias aisladas.

IV. Materiales y métodos:

Materiales:o Muestra: 100 g de suelo de servicentro contaminado con Petróleo Diesel.o Medios: Agar Bushnell Hass, Agar Tripticasa Soya, Petróleo Diesel.o Frascos estériles.o Tubos de dilucióno Tubos medianos



17

o Placas de Petrio Gradillaso Mechero Bunseno Asas bacteriológicaso Viales

o Pipetaso Jeringaso Biorreactores tipo tanque Bacht Air Lift

Método:

o Enriquecimiento de las muestras de suelo y adaptación de losmicroorganismos a concentraciones crecientes de petróleo.

- Diseñar y acondicionar dos biorreactores tipo tanque Bacht Air Lift con flujodescendente de 1 L de capacidad.

- Pesar 50 g de muestra de suelo previamente tamizada y llevarla hacia unbiorreactor conteniendo 100 mL de caldo Bushnell Hass (BH) con 1% dePetróleo Diesel.

- Incubar a 30 ºC durante 72 h.- Tomar 10 mL de la muestra enriquecida y llevarla hacia el segundo biorreactor

conteniendo 100 mL de caldo BH con 2% de Petróleo Diesel. Lavar y esterilizarel primer biorreactor.

- Incubar a 30 ºC durante 72 h.- Tomar 10 mL de la muestra enriquecida y llevarla hacia el primer biorreactor

conteniendo 100 mL de caldo BH con 4% de Petróleo Diesel.- Incubar a 30 ºC durante 72 h.

o Aislamiento de las bacterias degradadoras de Petróleo Diesel.

- A partir de la muestra enriquecida en caldo BH con 4% de Petróleo Diesel (PD)tomar una alícuota y sembrarla mediante la técnica de agotamiento y estríasobre la suèrficie de placas de Petri conteniendo Agar BH con 4% de PD.

- Incubar a 30 ºC durante 48 h.- Seleccionar y repicar las cinco colonias que presenten la mayor biomasa y

mayor rapidez en el crecimiento hacia viales conteniendo agar BH con 4% dePD y agar Tripticasa Soya (TSA).

- Incubar a 30 ºC durante 48 h.- Conservar las cepas de bacterias biodegradadoras de PD en refrigeración

o Cuantificacion de la actividad degradativa sobre el PD de cada una de lascepas de bacterias aisladas.

La actividad degradativa sobre el PD de cada una de las cepas bacterianas aisladas serácuantificada a través del tiempo requerido para la utilización del PD como fuente decarbono y energía y del número de Unidades de Actividad Emulsificante (UAE) de cadauna de ellas.

- Preparación del inóculo:



18

o Reactivar cada una de las cepas bacterianas degradadoras del PD en 5mL de caldo nutritivo a 30 ºC durante 24 h.

o Cantrifugar el caldo nutritivo a 3500 RPM durante 15 min; eliminar elsobrenadante y lavar el sedimento con SSFE por dos veces.

o Con el paquete celular obtenido preparar una suspensión de celulas en

SSFE y estandarizarla con el tubo Nº 3 del Nefelómetro de McFarland(9x108 celulas/mL).

- Tiempo requerido para la utilización del PD como fuente de carbono y energía:o De cada inóculo bacteriano previamente estandarizado tomar 1 mL e

inocular por triplicado en tubos de prueba de 16 x 150 mm conteniendo10 mL de caldo BH con 0,2 mL de resarzurina y 0,1 mL de PD (dejar untubo con medio de cultivo no inoculado como testigo).

o Incubar a 30 ºC hasta por 5 días en agitación constante (150 RPM).o Observar diariamente en busca del cambio de coloración del indicador

resarzurina (azul a rosado brillante) que será interpretado como positivo

para la utilización del PD como fuente de carbono y energía.

- Cuantificación de las Unidades de Actividad Emulsificante:o De cada inóculo bacteriano previamente estandarizado tomar 1 mL e

inocular por triplicado con tubos de prueba de 16 x 150 mm conteniendo10 mL de caldo extracto de levadura más 0,2 mL de etanol. Dejar untubo con medio de cultivo no inoculado como testigo.

o Incubar a 30 ºC durante 3 días en agitación constante (150 RPM).o Diariamente observar en busca de la información de burbujas y turbidez

del medio de cultivo.o Centrifugar el contenido de cada uno de los tubos, a 2000 RPM durante

30 min.o Tomar 1 mL de cada uno de los sobrenadantes y colocarlos en tubos de

prueba conteniendo 9 mL de caldo levadura etanol más de 0,2 de PD.Tapar herméticamente los tubos y agitarlos durante un min. Hasta lograrla emulsión.

o Calibrar a cero el espectrofotómetro con tubo “blanco” conteniendo

caldo extracto de levadura con etanol no inoculado (testigo) y leer laabsorvancia de cada una de las muestras a 540 nm.

o Realizar la conversión de la absorvancia de cada una de las muestras aUAE considerando 0.816 de absorvancia como una Unidad de Actividad

Emulsificante por mL (1 UAE/mL).

V. Resultados:

- Tiempo requerido para la utilización del PD como fuente de carbono y energía:

CEPA DÍAS DE VIRAJE COLOR DE VIRAJE pHCepa 01 ---- ---- ----Cepa 02 5 días Violeta ≥ 6.8 Cepa 03 12 días Amarillo ≤ 5.2



19

- El indicador utilizado en este proceso de cuantificación fue el “púrpura de

bromocresol”. Este indicador se caracteriza por virar de acuerdo al pH, siendo

amarillo a un pH menor o igual a 5.2 y violeta a un pH mayor o igual a 6.8.

Inóculos al 1º día Inóculos al 5º día

Inóculos a 15 días

- Cuantificación de las Unidades de Actividad Emulsificante:

CEPA UAECepa 01 1.281Cepa 02 1.353Cepa 03 1.561

- Con el tubo blanco se lee la absorvancia a 540 nm. Luego los resultadosobtenidos se los divide entre 0.816 (1 UAE = 0.816).



20

- Identificación de las cepas aisladas:

CARACTERISTICAS CEPA 01 CEPA 02 CEPA 03

MorfologíaBacilos cortos,espora centralno deformante

Bacilos largos,delgados,

espora terminalno deformante

Bacilos medianos

no esporulados

DisposiciónDe a dos o encadenas cortas

De a dosAislados y de a

dosTinción Gram Positivo Positivo Negativo

Catalasa Positivo Positivo Positivo

Crecimiento en caldoPelícula,

turbidez ysedimento

Película,turbidez ysedimento

Película, turbidezy sedimento

Reducción de NO3-

O – F glucosaRojo de Metilo -

Voges Proskawer + + -Hidrólisis de almidón + + +

Indol - -Caldo glucosa + +Caldo maltosa + +

Hidrólisis de gelatina + +Género Bacillus sp. Bacillus sp. Pseudomonas sp.

VI. Referencias:

- LU CHAU, T. (2006). Biorremediación. Dpto. de Ingeniería Química.Universidad de Santiago de Compostela. Obtenido el 24 de marzo de 2008 enhttp://www.usc.es/uscmn/investigacion/documento/Prestige-Biorremediaci%F3n.pdf

- VIÑAS C., M. Biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos:caracterización microbiológica, química y ecotoxicológica. Facultad deBiología. Universidad de Barcelona. Obtenido el 24 de marzo de 2008 enhttp://www.tesisenxarxa.net/TESIS_UB/AVAILABLE/TDX-0920105-085623//TESIS_MVI%D1AS_CANALS.pdf

- ALTAMIRANO, M. G. (2005). Aislamiento e identificación de bacteriashidrocarburolíticas provenientes de un suelo sometido a biorremediación.

- ORTIZ, J. y J. RODRIGUEZ (2007). Biomarcadores y su utilidad en laevaluación de la biodegradación del petróleo. Obtenido el 24 de marzo de 2008en http://ingenierosdeminas.org/docu/documentos/biomarcadores_petroleo.pdf

- V. BOTELLO, A. (1974) Utilización y degradación del petróleo crudo por dosespecies de camarón: Penaeus duorarum y Peneaus aztecas. UniversidadNacional Autónoma de México. Centro de Ciencias del Mar y Limnología.Obtenido el 24 de marzo del 2008 enhttp://biblioweb.dgsca.unam.mx/cienciasdelmar/centro/1975-1/articulo11.html

- SULBARAN MORA, Miguel, BAHSAS, Ali, VELASQUEZ, William et al.Caracterización de Biosurfactantes producidos por Pseudomonas Fluorescentes

http://www.usc.es/uscmn/investigacion/documento/Prestige-Biorremediaci%F3n.pdf



http://www.tesisenxarxa.net/TESIS_UB/AVAILABLE/TDX-0920105-085623/TESIS_MVI%D1AS_CANALS.pdf



http://ingenierosdeminas.org/docu/documentos/biomarcadores_petroleo.pdf



http://biblioweb.dgsca.unam.mx/cienciasdelmar/centro/1975-1/articulo11.html










21

aisladas de emulsiones de petróleo pesado. CIEN , jun. 2005, vol.13, no.2, p.228-239. ISSN 1315-2076.

- PINEDO R., T. (2005) Biosurfactantes. Obtenido el 24 de marzo del 2008 enhttp://www.personal.us.es/evpolo/pdf/trab_dirig/pinedorevilla_trigochorda.pdf

VII. Anexos:

Fluxograma de trabajo:

Muestra: 100 g desuelo contaminado

con PD

Tamizar

50g detamizado

100 mL de caldoBH + 1% PD

10 mL dela muestraenriquecida

A

100 mL de caldo

BH + 2% PD

30 ºC x 72 hB

30 ºC x 72 h

10 mL dela muestraenriquecida

A

100 mL de caldoBH + 4% PD

30 ºC x 72 h

C

http://www.personal.us.es/evpolo/pdf/trab_dirig/pinedorevilla_trigochorda.pdf





22

Cuantificación de la actividad degradativa de las cepas aisladas sobre PD.

Tomar unaalícuota de la

muestraenriquecida C

Agar BH+ 4% PD

Sembrar

30 ºC x 48 h

Seleccionar yrepicar 3colonias

Incubar

> biomasa, > rapidezde crecimiento

Repicar

Agar BH + 4% dePD + TSA 30 ºC x 48 h

Conservar las cepasen refrigeración

Tiempo requerido para su utilización

Reactivar

5 mL caldonutritivo

Incubar

30 ºC x 24 hCentrifugar

3500 rpm x 15 min.



23

Eliminarsobrenadante

Lavar sedimento conSSFE x 2 veces

consecutivas

Preparar suspensiónal Tubo Nº 3 del

NMF (9x108 cel/mL)

1 mL

Inocular de cadacepa en botellas

Realizar esto porcada cepa

10 mL caldo BH con0.2 mL de

resarzurina y 0.1 mLde PD

Dejamos un tubo conmedio no inoculado

como testigo

Incubar a 30 ºC x5 d. a agitacióncte. (150 rpm)

Observardiariamente si

cambia de azul arosado brillante

Como se usó púrpura de bromocresol veremosel cambio de color de lila a amarillo



24

Cuantificación de las unidades de actividad emulsificante (UAE).

Del inóculopreparado al Tubo

Nº 3 del NMF(9x108 cel/mL) 1 mL

Inocular en tubos dedilución con 10 mLde caldo Extracto deLevadura + 0.2 mL

de etanol

30 ºC x 3 d. enagitación constante

(150 rpm)

Incubar

Observar y diariamenteformación de burbujas y

turbidez del medio

Centrifugar cada uno delos tubos (2000 rpm)

Tomar elsobrenadante

(1mL)

9 mL caldolevadura

etanol + 0.2mL de PD

Tapamosherméticamente

Agitamos 1 min.hasta lograr una

emulsión

Calibramos a cero el

espectrofotómetro conel tubo blanco

Leer absorvanciaa 540 nm

Realizar la conversiónde la absorvancia de

cada una de lasmuestras a UAE

Considerar 0.816 deabsorvancia como 1 UAE/mL



25

ÍNDICE

I. Introducción: ......................................................................................................... 2

II. Generalidades:....................................................................................................... 3

a. El crudo de petróleo: ......................................................................................... 3

b. Refinado del crudo de petróleo: ......................................................................... 4

c. Biorredediación del petróleo Diesel usando diversos microorganismos: ............. 5

d. Biosurfactantes .................................................................................................. 6

Clasificación de los biosurfactantes ....................................................................... 7

Utilización de los Biosurfactantes .......................................................................... 8

Surfactantes Microbianos .................................................................................... 10

Algunos ejemplos de bacterias y la producción de biosurfactantes: ...................... 11

e. Ventajas y limitaciones de los procesos de biorremediación de suelos

contaminados. ......................................................................................................... 12

Factores que condicionan la biorremediación de un suelo. ................................... 13

El pH, temperatura y la humedad ..................................................................... 13

Estructura química ........................................................................................... 14

Biodisponibilidad ............................................................................................ 14Presencia de aceptores de electrones ................................................................ 15

Nutrientes inorgánicos ..................................................................................... 15

f. Microorganismos reportados como degradadores de Petróleo: ......................... 15

- Bacterias:..................................................................................................... 15

- Hongos: ....................................................................................................... 16

III. Objetivos: ........................................................................................................ 16

IV. Materiales y métodos: ...................................................................................... 16 Materiales: ...................................................................................................... 16

Método: ........................................................................................................... 17

o Enriquecimiento de las muestras de suelo y adaptación de los

microorganismos a concentraciones crecientes de petróleo. ................................. 17

o Aislamiento de las bacterias degradadoras de Petróleo Diesel. ..................... 17

o Cuantificacion de la actividad degradativa sobre el PD de cada una de las

cepas de bacterias aisladas. .................................................................................. 17- Preparación del inóculo: .......................................................................... 17



26

- Tiempo requerido para la utilización del PD como fuente de carbono y

energía: ........................................................................................................... 18

- Cuantificación de las Unidades de Actividad Emulsificante: .................... 18

V. Resultados: .......................................................................................................... 18

- Tiempo requerido para la utilización del PD como fuente de carbono y energía:

18

- Cuantificación de las Unidades de Actividad Emulsificante: ............................ 19

VI. Referencias:..................................................................................................... 20

VII. Anexos: ........................................................................................................... 21

6437940 bacterias degradadoras de petroleo

Documents