Trabajo Práctico Nº 9

Cinética de Crecimiento

Unidad 6: Crecimiento microbiano

Profesora: Dra. Graciela Pose.

Auxiliares: Ing. Luisa Franchi Lic. Marcela Pellegrini

Año calendario: 2010

Objetivos:1. Que los alumnos se familiaricen con la dinámica de crecimiento de una

población bacteriana.2. Que el alumno sea capaz de graficar una curva de crecimiento, así como de

determinar el tiempo de generación de un cultivo bacteriano.

Ingeniería en Alimentos

Ingeniería en Biotecnología

Microbiología General

Fundamento Teórico: Para construir una curva completa de crecimiento bacteriano se necesita medir, a diferentes intervalos de tiempo regulares, el tamaño de la población bacteriana del cultivo en crecimiento. Como este procedimiento llevaría muchas horas, se ha diseñado el experimento solo para las fases lag y log. La medición del tamaño de la población bacteriana se llevará a cabo por dos métodos:

I. Indirecto: utilizando el espectrofotómetro. Se mide la turbidez del cultivo bacteriano a medida que aumenta la masa celular del mismo.

II. Directo: realizando recuento de células viables (UFC/ml), mediante la técnica de diluciones seriadas.

Desarrollo experimental:

1) Preparar 5 juegos (t0, t40, t80, t120, t160) de Eppendorfs con solución fisiológica estéril para realizar las diluciones seriadas correspondientes a los distintos tiempos después de la inoculación. Rotular los tubos estériles desde 10-1 hasta 10-6.

2) Rotular las placas con Agar Nutritivo con el valor de la dilución que se siembran (considerar el factor de dilución aportado por la alicuota que se toma de la última dilución)

3) Inocular en medio estéril con un cultivo de fase logarítmica. Medir la DO de una alícuota de cultivo. La absorbancia inicial a 550-600 nm debe ser cercana a 0.1 (Considerar que una DO de 0.1 equivale aproximadamente a 5.107 UFC/ml para los cultivos de E.Coli) Utilizar una cubeta con medio de cultivo estéril como blanco.

4) Realizar los cálculos para las diluciones seriadas del cultivo en estudio que permitan, a partir de la siembra de 100 l de la última dilución, obtener entre 30 y 300 colonias. Sembrar con espátula de Drigalsky la superficie de una placa de Petri.

5) Mantener el cultivo a 37ºC con agitación y a intervalos de 40 minutos, medir la absorbancia del mismo a 550-600 nm asegurándose de resuspender completamente las bacterias antes de tomar cada muestra.

6) Repetir lo indicado en el paso 4 para cada intervalo de tiempo.7) Incubar a 37ºC durante 24-48 hs todas las cajas de Petri rotuladas con el

tiempo de inoculación y la dilución sembrada en cada caso.8) Contar las colonias y realizar los cálculos necesarios para obtener la

concentración bacteriana en la muestra original.9) Graficar:

a) Los log de las absorbancias en las ordenadas y los tiempos de incubación en las abscisas.

b) Los log de los recuentos bacterianos en las ordenadas y los tiempos de incubación en la abscisa.

c) Obtener el tiempo de generación del cultivo en las condiciones ensayadas.

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