Revista Internacional de ContaminacinAmbientalISSN: 0188-4999rvp@atmosfera.unam.mxUniversidad Nacional Autnoma de MxicoMxico

Sangabriel, Wendy; Ferrera-Cerrato, Ronald; Trejo-Aguilar, Dora; Mendoza-Lpez, Mara Remedios;Cruz-Snchez, J. Samuel; Lpez-Ortiz, Carlos; Delgadillo-Martnez, Julin; Alarcn, Alejandro

Tolerancia y capacidad de fitorremediacin de combustleo en el suelo por seis especies vegetalesRevista Internacional de Contaminacin Ambiental, vol. 22, nm. 2, 2006, pp. 63-73

Universidad Nacional Autnoma de MxicoDistrito Federal, Mxico

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=37022201

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Rev. Int. Contam. Ambient. 22 (2) 63-73, 2006

TOLERANCIA Y CAPACIDAD DE FITORREMEDIACIN DE COMBUSTLEO EN ELSUELO POR SEIS ESPECIES VEGETALES

Wendy SANGABRIEL1, Ronald FERRERA-CERRATO4, Dora TREJO-AGUILAR1,Mara Remedios MENDOZA-LPEZ2, J. Samuel CRUZ-SNCHEZ2, Carlos LPEZ-ORTIZ 3,

Julin DELGADILLO-MARTNEZ4 y Alejandro ALARCN4*

1Facultad de Agronoma. Universidad Veracruzana s/n. Lomas del Estadio. Xalapa 91090 Veracruz2Unidad de Servicios de Apoyo en Resolucin Analtica (SARA). Institutos de Investigacin. Universidad

Veracruzana. Dr. Luis Castelazo Ayala s/n. Col. Industrial nimas. Xalapa 91190 Veracruz3Facultad de Ingeniera Qumica y Ambiental, Universidad Veracruzana. Lomas del Estadio. Xalapa 91090 Veracruz4Microbiologa de Suelos. Colegio de Postgraduados Campus Montecillo. Carretera Mxico-Texcoco km 36.6.

Montecillo 56230 Estado de Mxico. C.P. *Correo electrnico: alexala@colpos.mx. Tel: (595) 952 0200 ext.1280, Fax: (595) 952 0287

(Recibido mayo 2006, aceptado septiembre 2006)

Palabras clave: seleccin, leguminosas, pastos, rizsfera, contaminantes orgnicos

RESUMEN

Se hizo un estudio en invernadero para evaluar la tolerancia y el crecimiento de tresespecies de leguminosas (Clitoria ternatea, Phaseolus coccineus, Cicer arietinum) ytres gramneas (Brachiaria hbrido, Brachiaria brizantha y Panicum maximum) ensuelo contaminado con combustleo, as como su capacidad de reducir el contenido dehidrocarburos provenientes del mismo. Se sembraron semillas en el suelo no contami-nado y en el suelo colectado de la comunidad Frijol Colorado, Veracruz, que fue conta-minada por un derrame accidental de combustleo (50,000 mg kg-1). A los 90 das, seevalu la tolerancia, crecimiento, la poblacin microbiana en la rizsfera y la degrada-cin de combustleo. Phaseolus coccineus fue la nica leguminosa con tolerancia ycrecimiento en suelo contaminado; mientras que las tres gramneas no fueron afectadasnegativamente por la presencia del contaminante, aunque el hbrido de Brachiariamostr mayor crecimiento. La poblacin rizosfrica de bacterias y hongos fuediferencialmente afectada por la presencia del contaminante en combinacin con laplanta. Sin embargo, la rizsfera de P. coccineus present mayor poblacin microbianaen el suelo contaminado en comparacin con las plantas restantes. La degradacin decombustleo evaluada cualitativamente por GC-MS, fue mayor en la rizsfera de B.brizantha y P. maximum. En contraste P. coccineus present una degradacin similar ala observada en suelo contaminado sin planta.

Key words: screening, grass species, legume species, rhizosphere, organic contaminants

ABSTRACT

A greenhouse experiment was conducted to evaluate the tolerance and growth of threelegume species (Clitoria ternatea, Phaseolus coccineus, and Cicer arietinum) andthree grass species (Brachiaria hybrid, Brachiaria brizantha and Panicum maximum)

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to fuel oil-contaminated soil, and to evaluate their ability to diminish the content of totalhydrocarbons from fuel oil. Seeds were sowed in non-contaminated and contaminatedsoil with fuel oil (50,000 mg kg-1) by an accidental spill, and collected from Frjol Colo-rado, Veracruz. After 90 days, plant tolerance and growth, rhizosphere microbial popu-lation, and fuel oil-degradation were evaluated. Phaseolus coccineus was the onlylegume that tolerated and grew up in contaminated soil; in contrast, the three grassspecies were not negatively affected by the fuel-oil in soil, though Brachiaria hybridshowed higher growth. Rhizosphere bacterial and fungal populations were differen-tially affected by the presence of the contaminant in combination with the plant. How-ever, highest microbial population was quantified in the P. coccineus rhizosphere atcontaminated soil when compared to the other plants. Fuel oil-degradation qualita-tively measured via GC-MS, was greater at the B. brizantha and P. maximum rhizo-sphere. In contrast, P. coccineus showed similar fuel oil-degradation to that observed atnon-planted contaminated soil.

INTRODUCCIN

En Mxico y otros pases, algunos suelos agrco-las muestran alteraciones en sus propiedades fsicas,qumicas y biolgicas causadas por la contaminacincon hidrocarburos derivados del petrleo (Andersonet al. 1993, Bregnard et al. 1996, Saval 1997, Zavala-Cruz et al. 2005). Tan solo en el estado de Veracruzdurante el ao 2002 (PROFEPA 2003), se reporta-ron 41 emergencias ambientales asociadas con ma-teriales peligrosos en los que se incluyen hidrocarbu-ros (55 %), elementos alcalinotrreos (9 %), cidos(9 %), alcoholes (9 %) y otros (18 %). Uno de loshidrocarburos que potencialmente pueden llegar acontaminar el suelo por accidentes ocurridos durantela conduccin y el transporte, es el combustleo, co-nocido tambin como fuel oil No. 6. Este combus-tible es elaborado a partir de productos residualesque se obtienen de los procesos de refinacin del pe-trleo crudo y est diseado para usarse especial-mente en hornos, secadores y calderas, as como paracalentadores (unidades de calefaccin) y en plantasde generacin de energa elctrica. Este combustibleest constituido por una mezcla compleja y variablede alcanos, alquenos, cicloalcanos e hidrocarburosaromticos; adems contiene porcentajes bajos decompuestos que contienen azufre y nitrgeno (Philipet al. 1984).

La contaminacin de suelo y agua con hidrocar-buros derivados del petrleo es un problema que seha extendido como resultado de derrames de conte-nedores, rupturas en tuberas subterrneas y variosprocesos industriales (Leahy y Colwell 1990,ORourke y Connolly 2003). El efecto negativo queproducen los hidrocarburos en las plantas es de dostipos (1) por contacto directo, lo que provoca la des-

integracin de la membrana de la clula y muerte dela misma, reduce el intercambio gaseoso, provocaclorosis e inhibe la germinacin de la semilla (Baker1970, Prado et al. 1999) y 2) de manera indirectamediante la alteracin de las condiciones fsicas y lafertilidad del suelo.

La limpieza de suelo contaminado presenta mu-chas dificultades. En la actualidad existe gran nme-ro de tcnicas ex situ e in situ empleadas como al-ternativas de remediacin de suelos contaminadoscon hidrocarburos, tales como la excavacin, incine-racin, lavado de suelo, entre otras, las cuales pue-den ser muy costosas. Las plantas pueden ayudar alimpiar o estabilizar un contaminante en el suelo si laconcentracin de ste no es fitotxica (Cunninghamet al. 1996). La interaccin raz-microorganismo con-tribuye significativamente en la reduccin, remocin,degradacin o estabilizacin de contaminantes. Deesta forma, la fitorremediacin constituye una estra-tegia menos costosa y ambientalmente amigable parasanear suelos contaminados con hidrocarburos(Cunningham et al. 1996).

Los mecanismos y la eficiencia de la fitorremedia-cin dependen del tipo de contaminante, de la diversi-dad microbiana y de las propiedades del suelo(Cunningham y Ow 1996). La habilidad de las plan-tas para crecer y establecerse en suelos contamina-dos es una caracterstica de seleccin para su uso enla fitorremediacin. La degradacin de contaminan-tes en suelos plantados con Festuca arundinacea,Sorghum bicolor, Vigna sinensis, Medicago sativay Juncus roemerianus ha sido mayor cuando secompara con suelos sin vegetacin (Schwab y Banks1994, Lin y Mendelssohn 1998, Wiltse et al. 1998,Hutchinson et al. 2001).

La fitorremediacin de suelos contaminados con

FITORREMEDIACIN CON PASTOS Y LEGUMINOSAS 65

hidrocarburos del petrleo se basa principalmente enla biodegradacin llevada a cabo en la rizsfera (Fricket al. 1999), por lo que el sistema radical de la plantaes un elemento importante. Las plantas y sus racespueden influenciar indirectamente la degradacinmediante la alteracin de las condiciones fsicas yqumicas del suelo (Cunningham et al. 1996). Enmuchos estudios, gramneas y leguminosas han sidoseleccionadas por su potencial para favorecer la dis-minucin de los contaminantes (Aprill y Sims 1990,Gunther et al. 1996, Reilley et al. 1996, Qiu et al.1997). El sistema radical de las gramneas es exten-so y fibroso, lo que les permite tener mayor rea desuperficie de raz por metro cbico de suelo que nin-guna otra especie de planta y pueden penetrar el sueloa una profundidad de hasta 3 m (Aprill y Sims 1990).Las leguminosas por su parte, son consideradas parala fitorremediacin debido a su habilidad para fijarnitrgeno, por lo que no compiten con otros microor-ganismos y plantas por el limitado suministro de ni-trgeno disponible en sitios contaminados (Gudin ySyratt 1975).

El objetivo del presente trabajo fue evaluar la tole-rancia y la capacidad de fitorremediacin de tres es-pecies de leguminosas (Clitoria ternatea, Phaseoluscoccineus y Cicer arietinum) y de tres especies degramneas (Brachiaria hbrido, Brachiaria brizan-tha y Panicum maximum), de un suelo contaminadocon combustleo por un derrame accidental.

MATERIALES Y MTODOS

Recoleccin de sueloSe utiliz suelo contaminado con combustleo a

una concentracin aproximada de 50,000 mg kg-1procedente de la localidad de Frijol Colorado, Vera-cruz. El rea afectada por el derrame fue de aproxi-madamente 100 m2. Las coordenadas del sitio de re-coleccin del suelo son 193516" latitud y 972106"longitud; una altitud de 2410 msnm, la temperaturamedia anual correspondiente fue de 12 C, la preci-pitacin media anual de 493.6 mm y el tipo de climafro-seco-regular. El suelo se caracteriz por presen-tar pH 6.6, as como 0.1 % N, 25 g g-1 P Olsen, 2.1 %de materia orgnica, y textura franca. Se recolecta-ron muestras de suelo de la zona contaminada (20-30 cm de profundidad) y se mezclaron homognea-mente formando una muestra compuesta. Tambin,en la misma rea muestreada, se recolect una mues-tra de suelo adyacente no contaminado y cultivadocon maz, el cual present caractersticas similaresen textura y pH. El mtodo de muestreo del suelo

tanto contaminado como no-contaminado fue en zig-zag de acuerdo con Paetz y Wilke (2005).

Establecimiento del experimentoSe hizo bajo bajo condiciones de invernadero con

temperatura mxima/mnima de 23.5/11.9 C y hume-dad relativa promedio de 63/71 %. El suelo tanto con-taminado (SC) como no-contaminado (SNC), fue ta-mizado (2 mm) y colocado en recipientes de vidriombar de 300 g de capacidad. En cada recipiente sesembraron tres semillas de seis especies vegetales,correspondientes a tres especies de leguminosas:Clitoria ternatea L., Phaseolus coccineus L. yCicer arietinum L., y tres especies de gramneas:Brachiaria hbrido pasto mulato (B. riziziensis 44-6X B. brizantha cv. Marandu), B. brizantha (Hochst.ex A. Rich.) Stapf. y Panicum maximum Jacq. Cadarecipiente fue irrigado frecuentemente con agua des-tilada. Unidades experimentales sin planta (testigos)con SC y SNC fueron incluidos para evaluar el efec-to de biorremediacin.

Evaluacin del crecimiento de las plantasSe evalu la altura de las plantas cada siete das,

empezando a los 15 das hasta los 85 das despus dela germinacin de las semillas. A los 90 das, se eva-lu el volumen radical mediante el mtodo del volu-men desplazado en probeta y el peso seco de la plan-ta mediante la colecta de cada rgano de la planta ysu exposicin a 70 C en estufa durante 72 horas.

Estudio microbiolgico de la rizsferaA los 90 das, se evalu la poblacin de bacterias

y hongos rizosfricos tanto totales como degrada-dores de hidrocarburos. Para la cuantificacin demicroorganismos se utiliz el mtodo de dilucin yde cuenta viable de unidades formadoras de colo-nias (UFC) crecidas en su respectivo medio de cul-tivo en caja de Petri (Ingraham e Ingraham 1998).Para la evaluacin de bacterias totales se utiliz agarnutritivo (Baker) y para hongos totales se utilizpapa-dextrosa agar de (PDA, Baker). Adems,para cuantificar las poblaciones de bacterias y hon-gos tolerantes a la presencia de petrleo, se utilizmedio mineral (por litro: 0.8 g K2HPO4, 0.2 gKH2PO4, 0.2 g MgSO47H2O, 0.06 g CalCl2, 0.1 gNaCl2, 0.025 Na2MoO42H2O, 0.28 NaFe-EDTA,5 g biotina y 10 g acido p-aminobenzoico; pH 7)en presencia de petrleo crudo como fuente de car-bono (Hernndez 1997). El petrleo se aplic enpapel filtro embebido y adherido en el interior de lacontratapa de la caja de Petri. Las cajas de Petrifueron incubadas a 25 C de 24 a 72 horas, depen-

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diendo del crecimiento microbiano en cada mediode cultivo.

Eficiencia de la degradacin de combustleo enel suelo rizosfrico

La degradacin de combustleo se determin alos 90 das, mediante la extraccin y la cuantificacinde compuestos del combustleo tanto de muestrasiniciales (tiempo cero) como de muestras de suelocolectadas de cada tratamiento al final del experi-mento. La extraccin de hidrocarburos a partir demuestras de suelo rizosfrico se realiz con dicloro-metano mediante agitacin mecnica (Schwab et al.1999), utilizando el mtodo modificado EPA 8270BSW-846 (USEPA 1986, Louchouarn et al. 2000). Losextractos fueron concentrados mediante evaporacindel solvente, colectando una alcuota final de 1 mL,para su posterior anlisis cualitativo.

Anlisis mediante cromatografa de gases-espectrometra de masas

Los extractos fueron analizados mediante GC-MSutilizando un cromatgrafo de gases Hewlett-PackardGCD PLUS G1800-B y una columna capilar HP-5(5 %-fenil)-metilpolisiloxano (30 m, 0.25 mm i.d., 0.25m de grosor). La temperatura del inyector fue de250 C y la del detector de 280 C, se utiliz gashelio como acarreador (1.0 mL min-1). La tempera-tura de la columna fue inicialmente ajustada a 70 C(4.0 min) e incrementada a 190 C a una tasa de 20 Cmin-1, para posteriormente ser llevada a 250 C a 10C min-1 y finalmente alcanz los 280 C a 30 Cmin-1 y mantenida por 10 min. Cada componente fueidentificado con base en sus tiempos de retencin yla comparacin de sus espectros de masa a 70 eVcon aquellos contenidos en la biblioteca del HP-Chemstation-NIST MS, versin A.00.00-1995. Seprocedi a realizar el anlisis cualitativo de los princi-pales compuestos del combustleo, por lo que msadelante se presentan los cromatogramas del GC-MS para mostrar la degradacin de los hidrocarbu-ros provenientes del combustleo por efecto de larizsfera de las plantas.

Diseo experimental y anlisis estadsticoEl experimento factorial 6 x 2, incluy 12 trata-

mientos con ocho repeticiones cada uno, distribuidosen un diseo experimental completamente al azar.Los factores considerados fueron presencia de com-bustleo en el suelo (suelo contaminado con 50,000mg kg-1 y suelo sin contaminar) y especie vegetal es-tablecida. Los datos obtenidos fueron analizados me-diante anlisis de varianza y la prueba de compara-

cin de medias (Tukey, =0.05) con el programa es-tadstico SAS (SAS Institute 2002).

RESULTADOS Y DISCUSIN

Efecto del suelo contaminado en la superviven-cia y desarrollo de las plantas

En el caso de las leguminosas, todas las plantasde Clitoria ternatea (Clt) y C. arietinum (Car) enSC murieron entre los 42 y los 56 das. Sin embargo,P. coccineus (Pcocc) fue la nica especie que mos-tr tolerancia a la presencia del combustleo, obser-vndose un 50 % de supervivencia al finalizar el ex-perimento a los 90 das. Por tal razn, slo se haralusin a esta especie para compararla con las gra-mneas en todas las variables mencionadas a conti-nuacin, aunque las unidades experimentales de Clty Car se mantuvieron hasta el final del experimento,con los residuos de la respectiva planta, para realizarel anlisis de la degradacin del combustleo.

La dinmica de crecimiento en altura de Pcoccestablecida en SNC mostr diferencias significativas(Tukey, =0.05) al compararse con las plantas deesta misma especie establecidas en SC (Fig. 1a).En general, la presencia de combustleo en el SCprodujo la disminucin de la altura de las plantas. Lastres especies de gramneas presentaron mayor tole-rancia a la presencia del contaminante, observndo-se 100 % de supervivencia a los 90 das. De acuerdocon la altura de las plantas (Fig. 1b), la especie mssusceptible al SC fue P. maximum (Pmax), mientrasque la especie Brachiaria hbrido (Bhib) y B. bri-zantha (Bbriz) presentaron mayor tolerancia al con-taminante, ambas con altura semejante, pero sig-nificativamente diferente (Tukey, =0.05) a la ob-servada en plantas en SNC.

A los 90 das, el efecto de la planta, condicin delsuelo y tratamiento fue diferencialmente significati-vo para la mayora de las variables de crecimiento delas plantas (Cuadro I). Pcocc en SNC mostr signi-ficativamente (Tukey, =0.05) mayor altura, volumenradical, mayor peso seco de la raz y de la parte a-rea, pero menor relacin raz: parte area en compa-racin con las dems especies tanto en SC como enSNC (Cuadro I).

En el caso de las gramneas, Pmax en SC presen-t significativamente (Tukey, =0.05) menor altura,volumen radical, pesos secos de raz y de parte a-rea (Cuadro I). Las dos especies de Brachiariapresentaron estadsticamente similar respuesta entodas las variables de crecimiento tanto en SNC comoen SC (Cuadro I).

FITORREMEDIACIN CON PASTOS Y LEGUMINOSAS 67

En lo que respecta al peso seco total, Pcocc tantoen SNC como en SC, present mayor biomasa que

las tres gramneas (Fig. 2). Por su parte, Bhib aun-que no estadsticamente diferente, present mayoracumulacin de biomasa seca en SC en compara-cin con Bbriz (Fig. 2). Pmax fue la especie quepresent menor acumulacin de biomasa en SNC ysta fue significativamente (Tukey, =0.05) reduci-da cuando se estableci en SC (Fig. 2).

Las seis especies presentaron diferencias en latolerancia a la toxicidad del combustleo en el suelo.Las leguminosas presentaron mayor susceptibilidadal suelo contaminado mientras que las gramneas tu-vieron mayor tolerancia. El efecto negativo de loshidrocarburos en el suelo sobre el crecimiento de lasleguminosas ha sido previamente demostrado paralas especies Calopogonium mucunoides, Centro-sema brasilianum y Stylosanthes capitata quemurieron entre los 42 y los 56 das al estar expuestasa petrleo crudo a una concentracin de 50,000 mgkg-1 (Merkl et al. 2005b), concentracin similar a laevaluada en el presente experimento. Este efectodenota la susceptibilidad de las leguminosas para cre-cer y desarrollarse a esta concentracin de combus-tleo en el suelo. Estas leguminosas pueden ser utili-zadas como bioindicadoras de contaminacin de sue-los con combustleo como ha sido mencionado porMalallah et al. (1996), sobre todo cuando en estos seencuentran concentraciones superiores a los 50,000mg kg-1. No obstante, Pcocc present mayor biomasaproducida en comparacin con las gramneas. En estaplanta, la presencia del combustleo estimul no sig-nificativamente, el peso seco total comparado con sutestigo en SNC. Al respecto, ciertas concentracio-nes de hidrocarburos del petrleo pueden estimular

Planta Condicin Altura Volumen Peso seco (g) Raz: partedel suelo (cm) radical (cm3) Parte area Raz area (g g-1)

Phaseolus coccineus Sin contaminar 105.4 a x 2.16 a 1.79 a 0.71 ab 0.41 bContaminado 87.5 b 1.07 bc 1.86 a 0.94 a 0.54 b

Bachiaria hbrido Sin contaminar 19.7 c 2.43 a 0.82 b 0.34 cde 0.43 bContaminado 17.6 c 1.67 ab 0.69 b 0.41 cd 0.58 ab

Brachiaria brizantha Sin contaminar 18.3 c 1.83 ab 0.83 b 0.60 bc 0.72 aContaminado 15.8 cd 2.07 a 0.55 bc 0.30 de 0.55 ab

Panicum maximun Sin contaminar 15.7 cd 0.53 cd 0.35 bc 0.14 ef 0.41 bContaminado 9.8 d 0.18 d 0.07 c 0.04 f 0.57 ab

Significancia:Planta 0.01 0.001 0.01 0.001 0.01

Condicin del suelo 0.001 0.001 NS NS 0.05Planta-Condicin del suelo 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001

CUADRO I. CRECIMIENTO DE PLANTAS ESTABLECIDAS EN SUELO NO-CONTAMINADO O CONTAMINA-DO CON COMBUSTLEO (50,000 mg kg-1) DESPUS DE 90 DAS

x Medias en la misma columna con letras idnticas son estadsticamente iguales de acuerdo con la prueba de comparacin demedias (Tukey, =0.05). NS=No significativo, n=8

7 14

25Bbriz SNCBhib SNCPmax SNC

Bbriz SCBhib SCPmax SC20

15

10

5

0

100

120

SNC

SC

80

60

40

20

0

Das despus de la siembra

a)

b)

Altu

ra (c

m)

Altu

ra (c

m)

21 28 35 42 49 56 63 70 77 85

7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 85

Fig. 1. Dinmica de crecimiento de: a) Phaseolus coccineus yb) tres especies de gramneas crecidas en suelo contami-nado y no contaminado. SNC= Suelo no-contaminado(Smbolos cerrados), SC=Suelo contaminado (Smbolosabiertos); Bbriz=Brachiaria brizantha, Bhib=Brachiariahbrido, Pmax=Panicum maximum. n=8. Medias errorestndar

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la germinacin y el crecimiento de algunas plantas(Quiones-Aguilar et al. 2003).

De acuerdo con la USEPA (1998), las gramneasy leguminosas tienen cualidades morfolgicas y fi-siolgicas que puedan ser utilizadas en la fitorreme-diacin de suelos contaminados con hidrocarburos.Las gramneas presentan sistemas radicales ms ex-tensos y fibrosos, en tanto que el sistema radical delas leguminosas puede desarrollarse a ms profundi-dad y adems de poder captar nitrgeno atmosfricoa travs de la simbiosis con Rhizobium. La selec-

cin de plantas para uso en fitorremediacin debecontemplar su capacidad de adaptarse a las concen-traciones del contaminante y a las condiciones am-bientales que imperan en las regiones con problemasde contaminacin (Kirk et al. 2002). Las especiesms susceptibles fueron Clt, Car (leguminosas) yPmax (gramnea); mientras que las plantas con ma-yor tolerancia fueron Pcocc, Bhib y Bbriz. La capa-cidad de las plantas para crecer en suelos contami-nados se relaciona con aspectos morfolgicos y fi-siolgicos de la raz que favorecen mayor captacinde agua y nutrimentos (De Jong 1980, Ilangovan yVivekanandan 1992, Malallah et al. 1996, Quiones-Aguilar et al. 2003, Merkl et al. 2005a).

Efecto del combustleo en la poblacin micro-biana de la rizsfera

La poblacin de bacterias totales de la rizsferafue significativamente estimulada por la presencia dela planta (p0.01), la condicin del suelo (p0.05) yla interaccin de ambos factores (p0.01). En el casode la respuesta de tratamientos, la rizsfera de Pcoccen SC present la mayor poblacin en comparacincon la poblacin de bacterias en SC-sin planta, la cualfue significativamente menor (p0.001) (Cuadro II).En el caso de las bacterias con capacidad de creceren presencia de hidrocarburos, fueron significativa-mente estimuladas por efecto de la planta (p0.001),por la condicin del suelo (p0.01) y por la interaccin

Planta Condicin Bacterias Bacterias Hongos Hongos filamentososdel suelo totales degradadoras filamentosos totales degradadores

UFC x 106 g-1 de hidrocarburos UFC x 103 g-1 de hidrocarburosUFC x 106 g-1 UFC x 103 g-1

Phaseolus coccineus Sin contaminar 17.6 ab x 10.6 ab 16.3 ab 11.6 cContaminado 27.0 a 16.6 a 18.3 a 15.0 abc

Bachiaria hbrido Sin contaminar 14.0 b 2.3 cd 14.0 ab 15.3 abcContaminado 12.6 b 10.0 ab 10.3 b 13.0 bc

Brachiaria brizantha Sin contaminar 18.3 ab 12.0 ab 18.6 a 21.3 aContaminado 15.0 b 12.3 ab 20.3 a 12.3 c

Panicum maximun Sin contaminar 16.0 b 10.0 ab 17.0 ab 20.6 abContaminado 14.0 b 8.06 bc 15.0 ab 12.6 c

Suelo sin planta Sin contaminar 1.0 c 1.0 d 10.6 b 13.0 cContaminado 14.3 b 10.0 ab 10.3 b 12.6 c

Significancia:Planta 0.01 0.001 0.001 0.05

Condicin del suelo 0.05 0.001 NS 0.01Planta-Condicin del suelo 0.001 0.001 0.001 0.001

CUADRO II. POBLACIN MICROBIANA (UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS, UFC, POR GRAMO DE SUELOSECO) EN LA RIZSFERA DE CUATRO ESPECIES Y SUELO SIN PLANTA EN PRESENCIA DE COMBUS-TLEO DESPUS DE 90 DAS

x Medias en la misma columna con letras idnticas son estadsticamente iguales de acuerdo con la prueba de comparacin de medias(Tukey, =0.05). NS=No significativo, n=8

Pcooc Bhib Bbriz Pmax

3.5

3

2.5

2

1.5

1

0.5

0

Especie vegetal

Suelo no contaminado

Suelo contaminado

Pes

o se

co to

tal (

g)

Fig. 2. Materia seca total de plantas expuestas a suelo no-contaminado y contaminado, despus de 90 das.Pcocc=Phaseolus coccineus, Bhib=Brachiaria hbrido,Bbriz=Brachiaria brizantha, Pmax=Panicum maximum.n=8. Barras error estandar

FITORREMEDIACIN CON PASTOS Y LEGUMINOSAS 69

planta- condicin del suelo (p0.01). La poblacin deestas bacterias fue significativamente mayor tantoen la rizsfera de Pcocc en SC como en SC-sin plan-ta, en comparacin con la poblacin de bacterias ob-servada para la rizsfera de las gramneas en SC yen SNC (Cuadro II). En general, las poblaciones debacterias totales y con capacidad de crecer en pre-sencia de hidrocarburos de la rizsfera de gramneastanto en SNC como en SC, no mostraron diferenciasestadsticas significativas (Cuadro II).

En el caso de hongos filamentosos, se observ unefecto significativo de la planta (p0.001) y del trata-miento (p0.001) (Cuadro II). Las rizsferas deBbriz y Pcocc tanto en SC como en SNC, presenta-ron significativamente (Tukey, =0.05) mayores po-blaciones de hongos en comparacin con aquellascuantificadas para SC- y SNC-sin planta y con larizsfera de Bhib en SC (Cuadro II). Aunque seobservaron diferencias significativas entre tratamien-tos, la poblacin de hongos filamentosos crecidos enpresencia de petrleo fue en general mayor, perono estadsticamente diferente, en la rizsfera deplantas establecidas en SNC en comparacin conla rizsfera de las plantas en SC (Cuadro II). Eneste caso, la rizsfera de Pmax en SNC presentpoblacin de hongos degradadores significativamen-te mayor (Tukey, =0.05) en comparacin con larizsfera de Pcocc en SNC y con el SC- y SNC-sinplanta (Cuadro II).

El efecto directo de las races se fundamenta enla secrecin de exudados que contribuyen en la pro-liferacin de microorganismos clave para ladesintoxicacin y la degradacin de contaminantesen el suelo (Davis et al. 2002). Los microorganismosson comnmente estimulados luego de la incorpora-cin de hidrocarburos del petrleo (Atlas 1995) y seha demostrado que existe correlacin entre el nme-ro de microorganismos y el grado de contaminacindel suelo (Wyszkowska y Kucharski 2001).

Aun cuando la evaluacin de microorganismoscultivables en laboratorio tiene limitaciones con res-pecto al bajo nmero de grupos capaces de creceren estos medios, esta evaluacin ha sido utilizadacomo una herramienta para estudiar la respuesta demicroorganismos ante el contaminante y la capaci-dad de utilizarlo como fuente de carbono y de ener-ga (Randall y Hemmingsen 1994, Van Hamme et al.2003). En general, las bacterias son menos suscepti-bles a hidrocarburos del petrleo en comparacin conlos hongos y actinomicetos (Wyszkowska yKucharski 2001). La variabilidad observada parabacterias y hongos filamentosos creciendo en pre-sencia de hidrocarburos en los tratamientos cuya

mayor poblacin fue obtenida en la rizsfera de plan-tas en SNC, puede explicarse en el sentido de la di-versidad fenotpica de bacterias no-degradadoras, quepueden crecer en presencia de hidrocarburos sin con-tribuir a su degradacin. Este efecto fenotpico pue-de sobreestimar aquellos grupos microbianos concapacidad de utilizar hidrocarburos del petrleo comofuente de carbono y energa, tal y como ha sido men-cionado por Randall y Hemmingsen (1994). No obs-tante, los microorganismos con capacidad de crecerante hidrocarburos del petrleo pueden participar co-metablicamente en la degradacin de estos com-puestos. Sin embargo, este estudio no contempl estaactividad microbiana, por lo que se recomienda la ca-racterizacin de aquellos microorganismos cuya ac-tividad fisiolgica influya en la degradacin de los hi-drocarburos del petrleo en el suelo.

Los microorganismos que habitan la rizsfera sondiferencialmente estimulados o inhibidos en funcinde la actividad fisiolgica y capacidad de crecimien-to de la planta en presencia de contaminantes (Merklet al. 2005b). La especie Pcocc favoreci en formams consistente una poblacin microbiana mayor enSC, lo que la convierte en una planta para realizarmayor investigacin sobre fitorremediacin. Similar-mente, las plantas del gnero Brachiaria tambinbeneficiaron a la poblacin microbiana, por lo queson candidatas a ser utilizadas en la fitorremediacin,como fue sealado por Merkl et al. (2005a,b).

Degradacin de hidrocarburos en la rizsfera delas plantas

Despus de 90 das no se observaron compues-tos del combustleo en las muestras de SNC (Fig.3c), mientras que en el SC (Fig. 3b) se observ lareduccin de los compuestos que integran al com-bustleo con respecto al anlisis de la muestra inicial(tiempo cero; Fig. 3a). Los resultados de CG-MSmuestran la presencia de hidrocarburos monoarom-ticos y policclicos aromticos principalmente (Cua-dro III). Las cuatro especies que mostraron tole-rancia, adaptacin y crecimiento en SC, presentarondiferencias en la degradacin de combustleo (Figs.4b, e, f y g). Su efecto fue selectivo en la desapari-cin de compuestos mono- o poliaromticos en com-paracin con el SC-sin planta (Fig. 4a).

En lo que respecta al tipo de plantas, las gram-neas contribuyeron en la degradacin de mayor n-mero de compuestos constituyentes del combustleoen comparacin con el SC-sin planta (Cuadro III).La tasa de degradacin de combustleo fue mayoren las rizsferas de Bbriz y de Pmax (Figs. 4e y g),en comparacin con el SC-sin planta (Fig. 4a). En

W. Sangabriel et al.70

el caso de las leguminosas, Pcocc contribuy en ladesaparicin de solo un compuesto del combustleo,

por lo que la degradacin de combustleo fue similara la obtenida en SC-sin planta (Fig. 4a-b). Dado quefue la nica especie leguminosa que se adapt y cre-ci en SC resulta interesante utilizar esta planta comomodelo en sistemas de fitorremediacin en futurasexperimentaciones.

De manera interesante, los residuos de las dosleguminosas Car y Clt, que no sobrevivieron despusde 40 das produjeron respectivamente la degrada-cin de cinco y tres compuestos que integran al com-bustleo (Cuadro III), por lo que la tasa de degra-dacin del combustleo fue mayor a la observada enel SC-sin planta (Figs. 4a, c, d). Al respecto, losresiduos vegetales pueden contribuir en la estimulacinde la actividad microbiana del suelo y por consiguiente,favorecer la degradacin de hidrocarburos del petr-leo (Miller 1996). En una investigacin futura se po-dra dirigir al manejo de abonos verdes para estimu-lar la fitorremediacin.

La utilizacin de leguminosas en fitorremediacinse basa en su capacidad de introducir nitrgeno at-mosfrico al sistema contaminado y con ello estimu-lar mayor actividad microbiana, especialmente demicroorganismos degradadores de hidrocarburos.Pcocc slo present capacidad de crecimiento en SCy su contribucin en la degradacin de combustleoen su rizsfera no fue significativa. En nuestro cono-cimiento, este es el primer reporte de tolerancia, adap-tacin, crecimiento, estimulacin de la poblacin mi-crobiana (excepto Rhizobium, cuyos ndulos nofueron observados en el sistema radical) de Pcoccen SC. No obstante, se requiere mayor estudio paradeterminar los efectos benficos de esta leguminosa

Tiempo Suelo contaminado con combustleo (% rea de la curva en el cromatograma)de retencin Suelo Cicer Clitoria Phaseolus Brachiaria Brachiaria Panicum

Compuesto (minutos) sin planta arietinum ternatea coccineus hibrido brizantha maximum

Acetofenona 6.33 1.95 Nd 1.95 2.02 Nd 1.69 1.602, 4, 6-Trimetilfenol 8.10 5.12 3.34 4.03 4.72 3.00 5.30 3.72Eteniltiobenceno 8.36 3.28 2.64 4.54 3.87 2.32 2.91 3.553,4.Dimetiltiofenol 9.32 10.16 7.31 12.07 11.25 6.75 9.42 7.83Hidroxitolueno butilado 10.14 1.15 Nd 1.52 1.09 Nd 1.13 Nd9,9-Dimetil-9-silafluoreno 11.34 1.04 Nd Nd Nd Nd Nd Nd(E)-Estilbeno 11.55 1.34 Nd Nd 0.81 Nd Nd Nd1,2-Dihidro-1-fenilnaftaleno 12.19 2.67 1.45 3.14 2.87 1.56 2.87 2.961-Fenilnaftaleno 12.69 2.72 1.99 3.31 2.61 1.68 2.55 2.689-Metil-9H-fluoreno 13.74 1.66 Nd Nd 1.17 Nd Nd Nd1-Metil-2-fenil-1H-indol 17.70 6.52 5.09 8.20 6.07 5.47 5.89 5.415-Fenil-1,1:3,1-terfenil, 20.50 1.71 1.39 2.77 2.43 3.29 2.11 2.64

CUADRO III.PRESENCIA DE COMPUESTOS ORGNICOS DERIVADOS DEL COMBUSTLEO EN SUELO CONTAMI-NADO SIN PLANTA Y CON PLANTA, DESPUS DE 90 DAS

Nd = Compuestos no detectados por efecto de su disipacin/degradacin en la rizsfera de su correspondiente plantaNo se encontraron estos compuestos en suelo no contaminado

Fig. 3. Cromatograma que ilustra la presencia de contaminantesorgnicos procedentes del derrame de combustleo ensuelo contaminado a tiempo cero (a), suelo contaminadodespus de 90 das, con respecto al suelo no contaminado(b) utilizados en el experimento

TIC: SC2.D

8.108.369.32

9.96 14.9115.54

16.68

16.72

7.0717.70

TIC: SNC2.D

TIC: SOIT.D

8.088.359.32

11.56

11.8512.1112.1912.69

13.7414.15

14.6614.9315.08

15.57

15.65

16.74

7.05

17.53

17.71

17.78

a) Suelo contaminado, tiempo cero.

b) Suelo contaminado, despus de 90 das.

c) Suelo no contaminado, despus de 90 das.

Abundancia

Abundancia

Abundancia

Tiempo >

Tiempo >

Tiempo >

7000000

6000000

5000000

4000000

3000000

3000000

2000000

1000000

2000000

1000000

6.00 8.00 10.00 12.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.0014.00

6.00 8.00 10.00 12.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.0014.00

6.00 8.00 10.00 12.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.0014.00

0

0

3000000

2000000

1000000

0

FITORREMEDIACIN CON PASTOS Y LEGUMINOSAS 71

con diferente manejo agronmico y en simbiosis conRhizobium y hongos micorrzicos arbusculares, parafavorecer la fitorremediacin de suelos contamina-dos por hidrocarburos.

En el SC-sin planta se pudo haber presentado de-gradacin natural de combustleo (atenuacin natu-ral) por efecto de la aplicacin de agua, misma quepuede estimular la actividad microbiana nativa al con-tar con mayor disponibilidad de oxgeno (Alexander1999). No obstante, el establecimiento de las plantasestimul significativamente la poblacin microbiana yla degradacin de combustleo, particularmente en larizsfera de Bbriz. En general, las gramneas tienencaractersticas morfolgicas ideales para la fitorreme-diacin de contaminantes orgnicos. En este sentido,Pmax y Bbriz contribuyeron de manera importante enla degradacin de combustleo. Merkl et al. (2005b)

demostraron que Bbriz tiene capacidad de reducir sig-nificativamente hidrocarburos del petrleo en ambien-tes tropicales. En nuestro estudio, el hbrido deBrachiaria (pasto mulato) generado por la cruza deB. riziziensis 44-6 x B. brizantha cv. Marandu, fue laespecie que menor efecto tuvo en la remediacin delSC con combustleo (Fig. 4f), aunque contribuy enla desaparicin de cinco de sus componentes con res-pecto al SC-sin planta (Cuadro III).

El establecimiento de plantas en suelos contami-nados trae cambios significativos en las caractersti-cas fsicas, qumicas y biolgicas de la rizsfera (Daviset al. 2002). Estos cambios pueden favorecer a losmicroorganismos rizosfricos, los cuales pueden inter-venir en procesos de oxidacin, degradacin y com-pleta mineralizacin de hidrocarburos del petrleo(Ferrera-Cerrato y Alarcn 2004, Pilon-Smits 2005).

TIC: PCSC2.D

7.058.088.36

6.33 8.40

9.32

10.14

13.3514.96

15.54

16.70

17.69

20.47

8.107.06

9.3213.3314.95

15.53

7.05

9.32

12.2012.70

13.3814.99

16.74

17.71

20.53

TIC: SC2.D

8.108.36

8.41

9.32

7.079.96 14.91

15.54

16.68

17.70

a) Suelo contaminado sin planta

b) Suelo contaminado + Phaseolus coccineus

e) Suelo contaminado + Brachiaria brizantha

f) Suelo contaminado + Brachiaria hbrido

g) Suelo contaminado + Panicum maximum

c) Suelo contaminado + Cicer arietinum

d) Suelo contaminado + Clitoria ternatea

Abundancia

Abundancia

Abundancia

Tiempo >

2000000

6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00

6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00

6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00

6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00

6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00

6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00

6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00

1800000

1400000

1200000

1000000

800000600000

400000

200000

0

0

1600000

Abundancia2000000

1800000

1400000

1200000

1000000

800000600000

400000

200000

1600000

0

Abundancia

20000001800000

140000012000001000000800000

600000400000

200000

1600000

20000001800000

1400000

1200000

1000000

800000

600000

400000

2000000

1600000

2000000

1000000

500000

1500000

Tiempo >

Tiempo >

0

Abundancia

2000000

1800000

1400000

1200000

1000000800000

600000

400000

200000

1600000

Tiempo >

Tiempo >

0Tiempo >

Abundancia

2000000

1000000

500000

1500000

0Tiempo >

7.04 9.30

16.64

7.03 9.30

16.64

Fig. 4. Cromatograma que ilustra la presencia de contaminantes orgnicos procedentes del derrame de combustleo en suelo contaminado(a) con respecto al suelo contaminado en presencia de leguminosas y gramneas: (b) Phaseolus coccineous, (c) Cicer arietinum,(d) Clitoria ternatea, (e) Brachiaria brizantha, (f) Brachiaria hbrido, y (g) Panicum maximum. Muestras analizadas despusde 90 das

W. Sangabriel et al.72

De este modo, la interaccin planta-rizsfera-micro-organismo es importante en la seleccin de aquellasplantas con mayor potencial de uso en la fitorremedia-cin de hidrocarburos del petrleo en el suelo.

CONCLUSIONES

Las especies de gramneas fueron ms tolerantesa la presencia de combustleo que las leguminosas.La presencia de plantas en suelo contaminado esti-mul la proliferacin de microorganismos en larizsfera, que tambin fueron estimulados por la pre-sencia del contaminante en el suelo. Phaseoluscoccineus fue la nica especie leguminosa en tole-rar y crecer en suelo contaminado y estimular la po-blacin microbiana de la rizsfera contaminada. Estaleguminosa puede tener uso en la fitorremediacinde suelos contaminados con hidrocarburos. Bracha-ria brizantha fue la especie con mayor capacidadde degradacin de combustleo en la rizsfera, lo quela hace una especie con cualidades para la fitorre-mediacin de suelos contaminados con hidrocarbu-ros del petrleo.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue financiado por el proyectoSEMARNAT-CONACyT Clave: 2002-CO1-0023.Microorganismos simbiticos de la rizsfera de le-guminosas y gramneas en la fitorremediacin de sue-los contaminados con hidrocarburos del petrleo.

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