Lesiones y Reparación del ADN

Lesión(alteración química en el ADN)

Mutación(Modificación en la secuencia del ADN)=/

Mutación: Cambio en la secuencia nucleotídica de una región corta de un genoma. Se producen por errores de la replicación del ADN o por acción de mutágenos (agentes químicos y radiación). Deficiencia en la reparación del ADN.

Tipos de mutaciones: Puntuales (transiciones y transversiones).InsercionesDeleciones

Efectos de las mutaciones: Letales o no letales. Organismos unicelulares o multicelulares.

Reparación de las mutaciones: Prereplicativa o posreplicativa.

Espontánea vs inducida

Somática vs germinal

Categoría de mutaciones

Cambios a nivel de un nucleótido (puntuales) en el ADN:

Sustitución de bases

Inserción: + A-T TGGTCGTAT TGGTCAGTAT ACCAGCATA ACCAGTCATA

Deleción: - G-C TGGTCGTAT TGGTCTAT ACCAGCATA ACCAGATA

Inserciones y deleciones

Tipos de mutaciones

Tipos de mutaciones

Alteraciones químicas producidas en las bases nitrogenadas

Agentes alquilantes: metilmetano sulfonato (mutágeno químico), añade grupos alquilo a las bases nucleotídicas. El efecto depende de la posición en la que es modificado el nucleótido.

Acción de los radicales libres sobre el DNA

GC TA

Las radiaciones ionizantes Producen diversos efectos que dependen del tipo de radiación y de su intensidad. Pueden actuar de forma indirecta al estimular la formación de moléculas reactivas, como peróxidos en las células.

Desaminación del ADN: la eliminación del grupo amino ocurre espontáneamente a baja frecuencia, que puede ser aumentada por agentes químicos (ácido nitroso: desamina A, C, G, T no tiene grupo amino). Bisulfito de sodio: desamina C. La pérdida también puede ser espontanea dependiente de temperatura y pH.

ACG

Grupos amino exocíclicos

Transición C T100 a 500 eventos

por célula en un día

CG UA TA

5mCG TG TA

Análogos de bases.Son bases púricas y pirimidínicas que presentan similitud a las bases convencionales y se incorporan erróneamente como sustratos durante la síntesis de ADN.

5-bromouracilo : análogo a la timina, pero se aparea con Guanina además de Adenina cuando existe en la forma enol (hacia donde está favorecido el equilibrio entre sus tautómeros).

Mutaciones causadas por mutágenos químicos

Efecto mutágeno del 5-bromouracilo

Es un análogo de Timina; se aparea con Adenina, pero su tautómero lo hace con Guanina.Resultado: transición T-A CG durante la replicación.

Efecto mutágeno de la 2-aminopurina:es un análogo de Adenina; se aparea con Timina, pero su tautómero lo hace con Citosina. Resultado: transición T-C durante la replicación.

La despurinización (pérdida espontánea de purinas) del DNA puede verse favorecida por acción de la temperatura. El calor estimula la degradación inducida por agua del enlace b-N-glucosídico, que une la base al componente hidrocarbonado del nucleótido. Esto sucede más a menudo con las purinas que con las pirimidinas, creando un sitio AP (apurínico/apirimidínico) o sitios sin bases. Una célula de mamífero pierde entre 2.000 a 10.000 purinas cada 20 h a 37ºC. En general los sitios apurínicos son reparados, pero si permanecen se producen mutaciones durante la replicación.

Ruptura del enlace glicocídico entre la base y la desoxirribosa. Se pierde G o A.

Pérdida de bases

Agentes intercalantes: Por lo general se asocian con mutaciones de inserción. Son moléculas planas que se intercalan en el ADN, aumentando la distancia entre los pares de bases adyacentes.

Radiación UV: Induce dimerización de bases pirimidínicas adyacentes, sobre todo si ambas son Timinas, originando un dímero de ciclobutilo. También se forman dímeros 5´CT3´; 5´TC3´; y 5´CC3´ en orden de frecuencia decreciente). Los dímeros de purina son mucho menos comunes. Por lo general se producen deleciones cuando se copia la cadena modificada.

Cuando los daños no son reparados, se pueden generar cambios en las secuencia de las bases durante la replicación, produciendo una mutación.

REPARACIÓN•Corrección directa del DNA dañado.•Eliminación de la región dañada del DNA y relleno con DNA recién sintetizado.

Sistemas de Reparación del ADNReparación directa

DNA fotoliasa: revierte los dimeros de timina - fotorreactivación Transferasas de grupos alquilo: eliminan los grupos alquilo

generados por mutágenos (metanosulfonato de etilo, nitrosoguanidina)

Escisión de la región dañada• Escisión de la región dañada seguida de reemplazamiento preciso

-Escisión de base-Escisión de nucleótidos

• Reparación de errores de replicación

- Desapareamientos (“mismatch repair”)

- Translesión (“by-pass”)

• Reparación de roturas de doble cadena

- Unión de extremos no-homólogos

- Unión de extremos homólogos: recombinación homóloga

Reparación directa

Reparación directa

Reparación por escisión Etapas principales

• Reconocer la lesión

• Eliminar la lesión escindiendo parte de una de las hebras

• Nueva síntesis para llenar el hueco

• Sellar la mella para restablecer la continuidad del DNA

Reparación por escisión de base• Una glucosilasa elimina la base, deja la cadena intacta

• La AP endonucleasa corta la cadena, la AP liasa elimina el azúcar

• La DNA polimerasa rellena el hueco

• La DNA ligasa sella la mella

Reparación por escisión de nucleótido• Un corte doble elimina la lesión, se elimina un oligonucleótido

(12-13 nucleótidos en E. Coli, 27-29 en humanos)

• La DNA polimerasa rellena el hueco

• La DNA ligasa sella la mella

Reparación por escisión de base

El sistema de reparación

por escisión de base

también repara los daños

en el DNA producidos por

despurinación de bases, a

partir de AP endonucleasa

Despurinación de GG

Es el sistema de reparación más genérico y flexible

Este sistema de reparación actúa sobre una gran variedad de lesiones

• Dímeros de pirimidina

• Modificaciones químicas con carcinógenos: benzopireno,

aflatoxina y con agentes quimioterápicos como cisplatino

• Bases desapareadas y pequeños lazos del DNA

Reparación por escisión de nucleótido

Este sistema, en E. Coli consta de 4 componentes

Función Componente

Escaneo DNA UvrA

Nucleasa: ESCINUCLEASA UvrB, UvrC

Helicasa UvrD

Sistema de replicación DNApol I/DNApol II; ligasa

Fig 9-16 .- Biología Molecular del Gen 5ª ed., Watson y col.

Reparación por escisión de nucleótido

Proteína de reconocimiento del daño

Alteración en la estructura del ADN producida por un dímero de Timina

Función E. Coli Humanos

Escaneo DNA UvrA XPA, XPC; RPA

Nucleasa: ESCINUCLEASA

UvrB, UvrC XPF, XPG

Helicasa UvrD XPB, XPD

Sistema de replicación

DNApol I/DNApol II;ligasa

DNApol d/e; ligasa

Comparación entre E. Coli y en humanos

Reparación por escisión de nucleótido

Reparación por escisión de nucleótido en humanos

Gen humano Función de la proteína

XPA Proteína de reconocimiento del daño (interacción con DNA lesionado)

XPB DNA helicasa, subunidad de TFIIH

XPC Reconocimiento inicial de la lesión. Interacción con TFIIH

XPD DNA helicasa, subunidad de TFIIH

XPF Actividad nucleasa (5’lesión)

XPG Actividad nucleasa (3’ lesión)

ERCC1 Unión a XPF y a proteína RPA

RPA Unión al complejo XPF-ERCC1 (reconocimiento de lesión junto a XPA)

Reparación por escisión de nucleótido en humanos

Reparación global de genoma

• El heterodímero XPC – hHR23B localiza lesiones que distorsionan a la doble hélice.

Reparación por escisión de nucleótido en humanosEste sistema de reparación también repara lesiones durante la transcripción.

En este caso (Reparación acoplada a la transcripción), es la RNA polimerasa (No XPC – hHR23B ) quien identifica el daño en el ADN. Se detiene la transcripción

Un tercer sistema de reparación reconoce a las bases no complementarias y pequeños lazos de ADN que se incorporan durante la replicación que no fueron eliminadas por la

DNA polimerasa

Reparación de errores de replicaciónReparación de bases desapareadas (“mismatch repair”)

Los eucariotas tienen un sistema de reparación similar.El reconocimiento de la cadena recientemente sintetizada se realiza por la presencia de roturas en ambos extremos de los fragmentos de Okazaki, mientras que la hebra conductora se puede identificar por su extremo 3´en crecimiento.

Cáncer colorectal hereditario no poliposo (HNPCC) o síndrome de Lynch

Consecuencia de un defecto en los mecanismos de reparación de los apareamientos incorrectos

Mutaciones en los genes hMSH2y hMLH1

Equivalentes humanos de los genes MutS y MutL de E. coli

Los pequeños lazos de ADN que se incorporan durante la replicación se pueden producir cuando…

Sistemas de reparación inducibles

Se activan cuando hay un daño extenso al DNA.En bacterias es el sistema SOS.

Se activa con daño extenso ej. UVLa tasa de mutación es más alta después de la reparación por este sistema que si no existiera.

Mutantes sin sistema SOS presentan menor tasa de mutación.

Reparación por síntesis de translesión “trans

lesion synthesis” (TLS)

Actúa un mecanismo de seguridad que permite que la

maquinaria de replicación se salte “by –pass” estos sitios

de lesión

¿Qué ocurre si la DNA pol de replicación encuentra una lesión, dímero de T o un sitio AP, que no ha sido

reparada?

Síntesis de translesiónEste sistema es muy propenso a cometer errores,

pero evita que un cromosoma se replique de manera incompleta

Reparación por síntesis de translesión

(TLS)

Polimerasas de translesión:

Familia Y de DNA polimerasas

• Sintetizan DNA a través del sitio de la lesión

• Son dependientes de molde

• Incorporan nucleótidos de

una manera independiente de

apareamiento de bases, por

eso cometen errores con

frecuencia

Fig 9-18 .- Biología Molecular del Gen 5ª ed., Watson y col.

E. Coli

Reparación de roturas de doble cadenaLas roturas de doble cadena son potencialmente letales

Causas de rotura de doble hebra

• Radiaciones ionizantes(rayos g, rayos X)• Especies de oxígeno reactivas• Quimioterápicos (bleomicina)

Se pueden reparar por un mecanismo conocido como reparación recombinatoria

Se conocen dos vías principales de reparación recombinatoria:

Recombinación con secuencias homólogas de un cromosoma intacto (Este mecanismo actúa tras la replicación, cuando las cromátidas hermanas aún permanecen unidas).Reparación mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ)(alta tasa de error)

Reparación mediante Unión de Extremos No

Homólogos (propenso a error)

• Los extremos rotos son alineados y recortados, luego son ligados.

• Varias proteínas participan en NHEJ:

• Ku-heterodímero de Ku70 y Ku80

• DNA ligasa IV

• Xrcc4

• Ku se une a los extremos del AND de doble cadena.

• El “recorte” de nucleótidos se lleva a cabo por el complejo Mre11, dependiente de ATP.

• Los baches son rellenados por DNA polimerasas y sellados por DNA ligasa IV y Xrcc4.

Reparación mediante recombinación con

secuencias homólogasLas roturas de cadena simple pueden repararse utilizando la cadena de ADN intacta, utilizandola como dadora de información de secuencia.

Las roturas de doble cadena, pueden repararse utilizando la información faltante de otro DNA de doble cadena, que puede provenir de:

• cromátidas hermanas, durante la fase S tardía o en G2 del ciclo celular• El cromosoma parental homólogo en organismos diploides• Elementos de secuencias repetidas

Using the sister as a template for repair(late S-phase)

Intramolecular information donor

Intermolecular information donorHomologous chromosome or ectopic sequence repeat

Reparación de Rotura de ADN de doble cadena mediante Recombinación Homóloga

1. Los extremos son recortados para generar ADN de cadena simple. Los extremos 3’ invaden a la secuencia homóloga y forman pares de Uniones de Holliday.

2. Síntesis de ADN y ligación

3. Resolución de ambas estructuras de Holliday.

Inmunofluorescencia verde (anticuerpos anti histona H2AX fosforilada; inmunofluorescencia roja (anticuerpos anti subunidad catalítica de ADN-PK). La imagen de la derecha muestra la superposición de las otras dos imágenes, apareciendo en amarillo los puntos en los que coincide una señal verde con una roja.Tras la irradiación (que genera muchas roturas bicatenarias en el ADN) de fibroblastos, se crean unos focos de reparación donde se concentran las maquinarias encargadas de llevar a cabo dicha reparación. Aunque en esta imagen se muestran moléculas que intervienen en la reparación no homóloga de extremos libres, la utilización de anticuerpos frente a componentes del sistema de reparación por recombinación homóloga (RAD51, NBS, etc) da lugar a imágenes similares.

Reparación de roturas de doble cadena mediante recombinación homóloga