5-33-46-47 75117787 85-s-o46 i148.206.53.84/tesiuami/uam20076.pdf · presencia de coproanticuerpos...

4 Nombre: Juana Herndndez Hernándcz

T e l é f o n o : 5-33-46-47

M a t r í c u l a : 75117787

Clave : 85-S-O46 I

/Carrera : I n g e n i e r o B ioquími co Indu ; t r i a l

T r i m e s t r e : P a s a n t e ,,

Horas semana : Tiempo completo

Lugar: H o s p i t a l de P e d i a t r í a d e l Centro Médico N a c i o n a l

IMSS

Fecha de i n i c i o : 6 de Marzo de 1985

/Fe cha de t e r m i n a c i ó n : 4 de Sept iembre de 1985 > ./ Nombre d e l t u t o r : D r : S a l v a d o r M a r t i n e z - C a i r o Cue 3

J e f e d e l Departamento de Inmtinología Reumatología y A l e r g i a d e l H o s p i t e l

de P e d i a t r í a d e l C.M.N. IMSS

/Título: P r o t e a e a de EndamoeUa h i n f o é y t i c n can e c t i v i d a d

s o b r e I g A humana.

,_--

Juana Herndndez Hernández C r : Sa

I .

P R O T E A S A DE €ndcmnrBn hidtolutica CON C A T I V I D A C

SOPEE I g A HUMANA

I

I . ) I N T R O D U C C I O N :

~i sistema inmune s e c r e t o r humano se l o c a l i z a en: - g lándulas mamarias l a c tan tes , i n t e s t i n o delgado, á rbo l r e g p i r a t o r i o , v í a s urogen i ta l es , g lándulas l a c r ima l es y sal&- v a l e s I 1 , 2 , 3 ) ( F i g . 1 )

La mucosa d e l i n t e s t i n o y pulmón cont iened npdulos - l i n f o i d e s s o l o s o agregados; e s t o s nodulos (cont ienen ma L cro fagos (fió), i o e cuales son c é l u l a s que poseen i a capac i

dad de s e l e c c i ona r y t ranspor tar ant igenos y materia p a r t i culada) es tan asoc iados a l a s mucosas. Los l f n f o b l a s t o s - de l o s nódulos l i n f o i d e s t i enen l a tendencia de 1 o c a l i a a ~ - s e como p a r t e d e l sistema inmune s e c r e t o r ( F i g . 2). Se ha

demostrado que l a re tenc ión de l o s l i n f o c i t o s en l o s nÓdg- los l i n f o i d e s e s tá asociado con e l metabolismo d e l á c ido - araquidónico ( 4 )

Estudios en modelos murinos, en donde es tos son cog- taminados con gérmemes; i nd i c a que e l crec imiento microbia no est imula e l d e sa r r o l l o y maduración de l a s cá lu las inmg nocompetentes de l a lámina p ropr i a d e l i n t e s t i no .

Como s e ha señalado en r e c i e n t e s r e v i s i one s d e l sís- tema inmune s e c r e t o r , l o s ant icuerpos que se l o c a l i z a n en l o s l í q u i d o s de l a s mucosas son de natura leza I g A y son producidos po r c é lu l a s plasmáticas que se encuentran ba jo l a membrana e p i t e l i a l de l a s mucosas. és tas c é lu l a s respon - den a l a producción de ant icuerpos a v a r i o s ant fgenos bas- t e r i anos y macromoléculas presentes en l a s u p e r f i c i e de - l a s mucosas (1.2,3)

-

Por l o que la-X<A t i e n e func ión de ant icuerpo para - ant fgenos de: bac t e r i as , virus, t óx inas y macromoléculas -

- 1 -

I .

._ de l a d i e t a í 5 I

,.

I .

I .. .. I..

..

.. i

,.

I .

I

*- . a

La s í n t e s i s de l a IgA por b l a s t o s de l o s nódulos lig- f o i d e s asoc iados a mucosas de g lándulas mamarias, pueden - induc i rse mediante un t ra tamiento con estrógenos, p roges t c

rona y p r o l a c t i na í 4 )

- f E l hígado parece tener un pape l muy importante en l a

v í a de ei iminacpón de l a IgA. Ya ha s ido demostrado que l a

IgA po l imér i ca (dímero. t r imer0 y tetrámero) e s t ranspor ta da ráp ida y act ivamente contra g rad iente de concentración

I en l a b i l i s : en donde e l componente s ec r e t o r actúa como re ceptor en l a s u p e r f i c i e sinuosa d e l hepátoc i to , l a IgA es

endocitada y transportada dentro de v es í cu las que s e f u s i g nan en l a membrana can i cu la r b i l i a r , en donde l a IgA e s - descargada I 6 )

I

Estudios r e c i e n t e s ind ican que l o s ant icuerpos de l a c l a s e IgA previenen e l acoplamiento de microorganismos pa- tógenos adherentes en l a s c é l u l a s e p i t e l i a l e s d e l huésped. Esta i nh i b i c i ón de l a adherencia de los microorganismos a

l a s cá lu las e p i t e l i a l e s puede s e r de gran importancia en - l a defensa inmune; a l e v i t a r que l o s patógenos adherentes puedan c o l on i z a r a los t e j i d o s d e l huésped. i n v a d i r l o s y - causar enfermedad I 7 . 8 I

I

Las inmunoglobulinas westán compuestas por cadenas p o l i p é p t i d i c a s que se r ep l i e gan para formar dos r eg i ones - g logu lares ; l a r e g i ón F a S , o porc ión de l a molécula que se

une a l antígeno, y l a r e g i ó n T c , o porción responsable de l a s func iones b i o l ó g i c a s t a l e s como: ? ¿ j a c ¿ 6 n d e CompíemeE t o y acopLamienfo Q l a b c h l u l a b fagoc¿L¿cab ( 9 , 7 0 I .

l a s inmunoglobulinas con enzimas p r o t e o l í t i c a s , t a l e s como Estas dos r eg i ones pueden s e r separadas a l t r a t a r a

- 2 - I

I

*- - I 1

i I

4

papafna, t r i p s i n a y quimiotr ips ina. Por e l l o son de cons i , derable i n t e r é s l o s ha l l a z go s d e l e f e c t o de las enzimas de microorganismos patógenos adherentes capaces de degradar a l a I g A en fragmentos Full /-) y Fc (-I: en v i s t a de l a i m - - ' ,

1

~

1

portante función de l a I g A secretora en l o s mecanismos de inmunidad.

f Las pro teasas de I g A fueron descubier tas después de

l a observación de fragmentos 7 c (-0 en mater ia f e c a l ( 1 1 3 La i d e n t i f i c a c i ó n de fragmentos F c (&I en e l moco d e l c g - l on s u g i r i ó l a presenc ia de una proteasa capaz de romper a l a molécula de I g A ; pero incapaz de continuar degradando L

a l fragmento Fc 1-C) de l a misma f 11 I

La proteasa de I g A , es una endopéptidasa metalode - - pendiente e laborada por c i e r t a s bac te r ias ee rób icas l o c a l i - zadas en l a cav idad o r a l , t r a c t o g a s t r o i n t e s t i n a l y genL- t o u r i n a r i o humano. Esta enzima rompe a l a I g A humana sé- ca y s e c r e t o r a e n l a r eg i ón sens ib l e ( l a r eg i ón de l a b i s g gra ) produciéndo fragmentos 7uB í*) y 'Fc /d): y es i n a c t i - - va contra o t r a c l a s e de inmunoglobulina. Su a c t i v i d a d p r g t e o l í t i c a ha s i d o evaluada con o t r a s pro te ínas y pépt idos como: caseína, g e l a t i n a , colágena de tendón bovino, en dog de ha s ido n ega t i v a I 12 I

La es t ruc tura pr imar ia de l a reg ión de l a b isagra de pro te ínas de I g A humana procedentes de mieloma muestran un contenido poco usual en cantidades de: p ro l ina , ser ina y - treonina; que son l o s aminoácidos sens ib l es a l e f e c t o h i - d r o l í t i c o de l a proteasa de I g A ( 12 )

Aunque l a I g A humana puede también s e r h i d r o l i z a d a - por algunas enzimas p r o t e o l í t i c a s elaboradas por microorgg nismos: pro teasa neu t r a l de d n c i l l u n n u l l t i l i b . t e rmo l i s ina

I - 3 -

4 _ - y pronasa; e s tas enzimas rompen a l a IgA pero so lo en e l - fragmento T U B (4 ) puede s e r recuperado i n t a c t o , en t an to - que e l fragmento ? c (a) e s enzimáticamente degradado a péE t i d o s ,más pequeños ( e s t o ocurre ba jo l a s mismas cond ic i g - nes de p r o t e ó l i s i s de l a proteasa e s p e c í f i c a de I g A ) ( 7 7 )

- Observaciones s i m i l a r e s en l a a c t i v i d a d h i d r o l f t i c a de la' IgA ocurr i e ron en l a s a l i v a humana y en e l t r a c t o d& ges t i vo . en l a s qud se s u g i r i ó que e l o r i g en de l a enzima era bacter iano 1 9 I

I

r Poster iormente se demostró que los patógenos adhere2 t es : S t a e p t o c o c c u h hUngu¿h, #e¿hhen¿a gonoanhone, 1. m e n ¿ &

g i t i d i h , Pheudomonn o u a u g i n o n a , H u e n , o p h ¿ h b ¿nf ! luenrae, - H . a e g y p t i u a y S. pnewnoniae s i n t e t i z a n una proteasa para l a IgA ( 12-20).

Muchas o t r a s e spec i e s bacter ianas no producen es ta - proteasa para l a IgA. Las pro teasas de S ~ ~ Q ~ ~ O C O C C U A A Q ~ - gu¿h y Neihhenia gonoaahoae se han pur i f i cado parcia lmente de sobrenadantes de medio de c u l t i v o bacter iano, mostrando una gran e s p e c i f i c i d a d para l a I gA ; es tas proteasas son ca paces de fragmentar espec i f i camente a l a IgA sé r i ca humana (pur i f i cada de pac ientes con mieloma) y a l a I g A secre tora

,

i !

Dos t i p o s de IgA ( I g A 7 - e I gA2 ) se han pur i f i cado d e l

suero humano y en secrec ión ( 27 1. Las prote ínas de I gA7 e IgA2 exhiben muchas reacc iones ent i gén icas cruzadas, e - t o ind i ca que hay una d i f e r e n c i a e s t ruc tura l s i g n i f i c a t i v a

La proteasa de IgA es e s p e c í f i c a para e l t i p o I gA7 - produciéndo fragmentos Fa& f e ) y Fc (4 en tanto que l a - I gAZes r e s i s t e n t e ; aún con t ratamiento enzimático prolonga do ( 2 7 I

- 4 -

4

El e n l a c e p é p t i d i c o s u c e p t i b l e a l a p r o t e ó l i s i s e s :

La r e s i s t e n c i a a l a p r o t e ó l i s i s de l a I g A 2 s e

p r o l i n a - t r e o n i n a l o c a l i z a d a en l a r e g i ó n de l a b i s a g r a - de l a I g A .

debe a : un p l e g a m i e n t o de doce aminoác idos en l a regi6h-1 - de l a b i s a g r a d e l a cadena pesada ( l a c u a l i n i c i a con e l - aminoácido t r e o n i n a d e l e n l a c e p r o l i n a - t r e o n i n a ) y a l a d i

f e r e n c i a en c u a n t o a l contenido de c a r b o h i d r a t o s . E l gra - - do de p l e g a m i e n t o de l a cadena pesada e s t á determinado p o r

l a e s t r u c t u r a p r i m a r i a , l a s r e g i o n e s de p l i e g e de l a I g A l

e I g A 2 d i f i e r e n s u s t a n c i a l m e n t e en conformación y además - en s u c e p t i b i l i d a d a l a t a q u e e n z i m á t i c o . O t r o f a c t o r no mg nos i m p o r t a n t e e s l a p r e s e n c i a o a u s e n c i a de e n l a c e s d i s u 2 f u r o i n t e r c a d e n a ( e n t r e cadenas pesadas y l i g e r a s ) ; e l hc- l o t i p o A m 2 ( - ) c o n t i e n e cadenas l i g e r a s con e n l a c e s d i s u l f g

ro, p o r e l l o es también r e s i s t e n t e a l a p r o t e ó l i s i s .

I -

En e l s u e r o y c a l o s t r o humano, e l 10% de l a I g A y e l 50% r e s p e c t i v a m e n t e son de n a t u r a l e z a I g A 2 . é s t e d a t o ha - s e r v i d o p a r a s u g e r i r que e l e n r r i q u e c i m i e n t o de l a s s e c r g -

c i o n e s con l a I g A 2 l e dá una v e n t a j a s e l e c t i v a mediante rg s i s t e n c i a a l a p r o t e a s a í 2 2 I

La p r o t e a s a de I g A e s ac t iva en un rango de pH de - 6.5 a 8.0 y e s t a b l e a 5 5 O C d u r a n t e una hora í I1 I , su a2 t i v i d a d p r o t e o l f t i c a e s suspendida p o r a d i c i ó n d e á c i d o - e t i l é n diamino t e t r a c é t i c o (EDTA) en c o n c e n t r a c i o n e s de - 50 m M ; l a e l i m i n a c i ó n d e l EDTA ( a g e n t e q u e l a n t e ) median t e d i á l i s i s y l a a d i c i ó n de MnC12. ZnC12 y CoC12 en una - c o n c e n t r a c i ó n d e 5 m M r e s t a u r a n l a a c t i v i d a d , m i e n t r a s que

e l CaC12 y e l MgC12 en c o n c e n t r a c i o n e s 'de 50 m M r e s t a u r a n s o l o p a r c i a l m e n t e l a a c t i v i d a d . O t r o s c a t i o n e s d i v a l e n t e s como: F e t 2 y Cut2 causan d e s n a t u r a l i z a c i ó n i r r e v e r s i b l e - - d e l s u s t r a t o d e l a p r o t e a s a I 1 2 . 7 5 ). La producc ión de p r o t e a s a p a r a l a I g A de Sineptococcuh hanquih puede s e r e s

I - 5 -

t í m u l a d a mediante l a a d i c i ó n de I g A s e c r e t o r a e s t é r i l , p r g c e d e n t e de p a r ó t i d a en una r e l a c i ó n d e l 10% ( 13 )

La d e g r a d a c i ó n de l a I g A i n d u c e l a f o r m a c i ó n de moni meros Fag ( ) c u y a s c a p a c i d a d e s d e u n i ó n a los a n t í g e n o s y

más a ú n ; c é l u l a s , e s t á n . reducidas .

l a f i j a c i ó n de complemento y a c o p l a m i e n t o a l a s

I

Ya se demostró una c o r r e l a c i ó n e n t r e v i r u l e n c i a y l a p r e s e n c i a de l a p r o t e a s a e s p e c í f i c a p a r a l a I g A ( 1 3 . 1 9 J

En l a amYDiasis i n v a s o r a , l o s t r o f o z o i t o s de Endamog

&a h¿Atolytica a l c a n z a n e l i n t e s t i n o g r u e s o ( 23 ) y pene- t r a n a t r a v é s de l a mucosa i n d u c i e n d o l a s í n t e s i s de a n t l -

c u e r p o s s é r i c o s ( 24-27 ). Del 80 a l 100% de p a c i e n t e s - con a b c e s o d h e p á t i c o o d e s i n t e r i a a m i b i a n a , muestran titi- l o s s i g n i f i c a t i v o s de a n t i c u e r p o s s é r i c o s . l o s que se han

.demostrado p o r p r u e b a s de : h e m a g l u t i n a c i ó n , i n m u n o f l u o r e s - c e n c i a , p r e c i p i t a c i ó n en g e l e i n m u n o e l e c t r o f o r é s i s c r u z a - da ( 24-27 )

En a l g u n o s p a c i e n t e s p o r t a d o r e s de q u i s t e s de Endamg

~ Q Q hiAtotyt¿ca, e l p a r á s i t o puede cambiar de comenzal a - p a r á s i t o , e i n v a d i r la mucosa i n d u c i é n d o l a p r o d u c c i ó n l o - c a l de I g A en e l i n t e s t i n o , e s t o ha s i d o demostrado p o r l a p r e s e n c i a de c o p r o a n t i c u e r p o s a n t i a m i b i a n o s ( 28-32 ) y - también l a s í n t e s i s de a n t i c u e r p o s s é r i c o s .

Los f a c t o r e s que cambian e s t e cambio s ú b i t o en l a c o g

d u c t a d e l p a r á s i t o son c o m p l e j o s , p e r o es p o s i b l e que i n v g l u c r e mecánismos e n z i m á t i c o s de a c t i v i d a d de una p r o t e a s a excretada p o r l a Endamoega hihtolytica especí f ica para l a

I g A . Como o c u r r e con o t r o s p a t ó g e n o s a d h e r e n t e s , l a p r g - d u c c i ó n de una p r o t e a s a e s p e c í f i c a c o n t r a I g A p o d r í a cons=

- 6 -

t i tuir un f a c t o r inpor tan te en l a v i r u l e n c i a de l a endamog

fla h i n t o e y a i c a , re lac ionado ccn l a adhesión y co l on i zac i ón d e l i n s t a s t i n o por l a s amibas.

E l contac to con l a mucosa o l a presenc ia da t r o f c z o i t o s de Endamoefla h ¿ c t c e y t ¿ c a en l h l u z i n t e s t i n e l , induce l a producción l o c a l de I g A y ant icuerpos Eér icos , que no - son capaces ~e e l im inar 21 pa rá s i t o Itid vivo" .

Con e s t o s antecedentes , nos i n t e r e s ó i n v e s t i g a r l a - presenc ia de una Froteasa e s p e c í f i c a pare le I g A en t r o f g - z o i t o s y sobrenadante d e l ci , l t , ivo de, &damoafla h i h t o t y t i c a

083ETI VOS :

Demostrar I t in v i t r o " l a e x f s t enc j s da m a proteasa - e s p e c i f i c a cont ra I g A producida p o r los t r o f o z o i t o s y e l 1 medio de c u l t i v o de ¿ndamoe8a h i n t a l y t i c a .

Ha l l a r los! ugtcdos adecuados de F c r i f j c a c iÓn d e í l a - I g A procedente de t r e s fuentes : Suero normal humano, suero de pac i en t e con Me loma y Ca los t ro humano.

Probar métodoe Ce p u r i f i a c i ó n p a r c i a l de l a pro tease en e l medio de c u l t i v o de o n d a a o e h h i n f o e y t i c a .

i

- 7 -

1 1 . ) M A T E R I A L Y METODOS

1.- Obtención de I g A s é r i c a y de mieloma.

( Thcnicn 1 I A ) P r e c i p i t a c i ó n con s u l f a t o de amonio

E l suero normal se obtuvo a p a r t i r de una unidad de I

sangre p e r i f é r i c a ; de un ind i v iduo sano, donador d e l Banco Centra l de Sangre d e l C.M.N, centr í fugando a 1,000 X g du-' - rante 20 minutos. E l plasma de mieloma t i p o 1,914 fué obte- - nido de un pac i en t e d e l Hosp i t a l de Oncología d e l C.M.N me d ian te p lasmaféres is . A l sobrenadante se ñe cuan t i f i c a su volumen en una probeta y se l e añade 1.0 m l de CaC12 1.0 M por cada 100 m l de plasma ( para e l iminar e l f i b r inógeno ) y/Ó 0.4 m l de dextrán s u l f a t o de sodio a l 10% por cada 100 m l de suero (para e l im inar l i popro t e ínas ) . E l plasma Ó - suero (según sea e l caso) es almacenado a 4 O C durante toda l a noche en p lano ho r i z on t a l (para incrementar l a super-- c i e de contac to eh t r e e l suero Ó plasma con: e l CaC12 y e l dextrán s u l f a t o de sodio ) , l a muestra es centr i fugada a - 1,000 X g po r 20 minutos para e l iminar e l sedimento: e l - cual e s t á c ons t i t u í do po r f i b r inógeno y l i popro t e ínas . E l suero s i n l i p o p r o t e í n a s s e l e determina su contenido pro - - t e f c o por e l método de Lowry ( Thcnicn 2 ) y se procede a saturar con s u l f a t o de amonio hasta l o g r a r una concentrs - ciÓn de 1.8 M (que equ i va l e a una saturación d e l 34%). La saturación puede r e a l i z a r s e con e l r e a c t i v o s ó l i d o como - con una so luc i ón saturada: en e l primer caso s e hace uso - de l a t ab l a de saturac ión ( T u B ~ Q I I Ó d e l Nomograma de - DixÓn T u B h 2 I . En e l segundo caso, se añade 1/3 d e l volumen d e l suero de so luc ión saturada de s u l f a t o de amo - n i o por 2/3 p a r t e s de suero: ~ l a ad i c i ón d e l su l f a t o de amo n i o ( s ó l i d o O en so luc ión ) f u é l en t a y con a g i t a c i ón magné - tics constante, se a jus t ó e l pH a 7.8 mediante l a ad ic ión

- -

- 8 -

*- . .s

de NaOH 2 N. do por un l apso ent re 30 y 60 minutos. La suspendón f u é centr í fugada a 1.000 X g durante 30 minutos a temperatura ambiente. E l sedimento (paquete de gamma g lobu l inas ) se - resuspendió en Buf fer de Tris-HC1 15 mM pH 8.0 hasta r e c g perar e l volumen i n i c i a l . E l proceso de saturación se rea

l i z ó t r e s veces , para e l im inar cant idades aprec i ab l e s de -. albúmina. E l t e r c e r sedimento además de s e r resuspendido

f u é d i a l i z a d o f T é c n i c a 3 I exhaustivamente contra e l mismo B u f f e r usando una membrana de "Espectrapor 2" y en una r e l a c i ón V:V 1:50-100 durante 1 8 horas a 4 C y con f recuen t e s recambios hasta que l a prueba de su l f a t o s f PnueBa 7 I , f u é negat i va . E l sobrenadante se sometio a l a s s i gu ientes pruebas: cuan t i f i cac i ón de p ro t e ínas , inmunodifusión en -

cuan t i f i c a c i ón de gamma g l obu l inas por inmunodifusión ra - -

Después d e a j u s t a r e l pH se continuo a g i t a n -

r

O

g e l í T h c n i c a 4 I * inmunoe iec t ro fo rés i s í T é c n i c a 5 I , -

d i a l .

B ) P u r i f i c a c i ó n de I g A s é r i c a y de mieloma por: Cromatograf ía de Intercambio IÓnico

I T é c n i c a 6 I

Una muestra de 1-2 g de p ro t e ína f u é cromatograf iada

DEAE-Sephadex A-50 y eluada con un g rad iente l í n e a 1 de - NaCl de 0.0 a 3.0 M en B u f f e r de Tris-HC1 15 mM pH 8.0 y - un f l u j o de 0.5 a 1.5 ml/min ( i n i c i a l y f i n a l r e spec t i va - - mente). E l e luado se c o l e c t ó en f r a c c i one s de 10.0 m l ob- teniéndose l a g r á f i c a correspondiente mediante una ce lda - de 1.0 m l y una densidad Óptica a 280 nm. A cada f r a c c i ón obtenida se l e h i z o inmunodifusión contra ant isuero e spe c i f i c o para I g A . Las f r a c c i one s obtenidas de I g A se conceE- t raron por u l t r a f i l t r a c i ó n í T h c n i c a 7 I con una membrana de "Amicon XM-lOO", ba jo una p res i ón de 3.5 Kg/cm . E l --

en una columna de v i d r i o de 3.0 X 40 cm; empacada con -

-

2

I - 9 -

c

concentrado s e d i a l i z ó en membrana "Espectrapor 2" contra agua d e s t i l a d a en una r e l a c i ó n V:V 1:50 durante 18 horas - con constantes recambios, l a f i n a l i d a d de é s ta d i á l i s i s e s

l a e l iminac ión d e l NaCl po r l o que s e dá como concluída -

Poster iormente de l a d i á l i s i s s e proced ió a l i o f i l i z a r - ( T h c n i c u 8 I

cuando l a prueba de c l o ruros e s nega t i va I PaueBn 2 ). -

2.- Obtención de IgA sec re to ra procedente de c a l o s - t r o humano A ) Por f i l t r a c i ó n en g e l

Las muestras de c a l o s t r o humano fueron co lectadas - de pac i en t es post-parto d e l Hosp i t a l de G inecoobs t e t r i c i a d e l C.M.N; l a c o l e c c i ón se r e a l i z ó manualmente con un "tira leche" e s t é r i l . E l p o o l r e su l t an t e se d i luyó 1:2 con - NaCl 0.15 M ( s o luc i ón .sal ina i s o t ó n i c a ) y s e c en t r í fugo a 15.000 rpm durante una hora a 2OC para e l iminar l f p i d o s y l i popro t e inas . Después de haber cent r í fugado se ob tuv ie - ron t r e s capas: un sobrenadante, un sedimrhto y una capa - de grasa (contenido p r o t e i c o , cé lu las-case ína y l f p i d o s - l i p op r o t e i nas respect ivamente) . Tanto l a capa de grasa c g mo e l sedimento fueron e l iminados. E l sobrenadante f u é re movido para s e r d i a l i z a d o exhaustivamente en Buffer de - Tris-HC1 20 m M con NaCl a l 2% y pH de 8.2 en una r e l a c i ó n V:V 1:lOO con constantes recambios, durante 18 horas y a - 4OC. La muestra de c a l o s t r o d i a l i z a d a se l e cuan t i f i c ó : contenido p r o t e í c o , contenido de carbohidratos ( T é c n i c a 9 ) y concentración de gamma g lobu l inas .

En una columna de v i d r i o de 3.0 X 40 cm empacada con Sephadex C-200. se a p l i c ó una muestra de c a l o s t r o c l a r i f - cado correspondiente a l 4% d e l volumen t o t a l de l a columna Ó bien en una concentración de 100 a 200 m g de prote ína.

I . - 1 0 -

< .

. I

I .

I .

. 1.

1 g e l f u é equ i l i b rado con Buf f e r de Tris-HC1 20 mM con

NaCl a l 2% y pH de 8.2 baño maría a 50°C curante 5 horas en agua d e s t i l ada , para

e l im inar dextranas so lub l es y poder e q u i l i b r a r con e l Bg - f f e r . La muestra f u é e l u i da con e l mísmo Bu f f e r obtenién- do f r acc i ones de 5.0 ml. Las f r acc i ones r i c a s en I g A fue- - ron determinadas por inm.unodifusiÓn en agarosa a l 1% en - Buf f e r de B a r b i t a l pH 8.6 $ fuerza i ó n i c a de 0.05, y an t i - sur0 e s p e c í f i c o para I g A sec re to ra ( * ) : de l a s cua les se - h i z o un p o o l que se concentró por u l t r a f i l t r a c i ó n en meg - brana "Amicon XM-50" y una pres ión de 3.5 Kg/cm . E l coz- centrado se d i a l i z ó cont ra agua des t i l ada a LoC durante 18 horas con recambios constantes, por Últ imo l a muestra f u é l i o f i l i zada.

- E l Sephadex G-200 se preparó en -

2

( * ) E l ant i suero e s p e c í f i c o para l a IgA, sec re to ra - fué donado po r e l Dr: Gustavo Acosta d e l Departamento de I n v e s t i g a c i ón d e l C.M.N.

B ) Obtención d e l componente s ec r e t o r por cromg- t o g r a f í a de Inmunoadsorción

I Técn i ca 10 )

Del t e r c e r p i c o de l a f i l t r a c i ó n d e l c a l o s t r o en Se- phadex G-200 y con una reacc ión p o s i t i v a de inmunodifusión en g e l contra I g A secre tora ; se concentró a 1/10 d e su vo lumen o r i g inañ por u l t r a f i l t r a c i ó n en una membrana de "Ami con XM-3OIt ba j o una pres ión de 3.5 Kg/cm . La muestra cog centrada se d i a l i z ó contra Bu f f e r de f o s f a t o s a l i no (PBS) 0.25 M y pH 7.2 con NaN3 a l 0.03% en una membrana "Espec - t r apo r 2" en una r e l a c i ó n V:V 1: 100 y ag i t ac i ón magnética

E l inmunoadsorvente (Anti'' 2gh secre tora acoplada a -

-

- -

2

-

Sepharosa LE) s e empacó po r gravedad en una columna de 10

- 11 -

'0

m l ( j e r i n ga ) . Se e q u i l i b r ó con 50 m l de PBS f r i o .

La muestra d i a l i z a d a se a p l i c ó a l a columna de inmu- noadsorción. se l a v o con Pbs r e c i c l a n d O l a s primeras t r e s f racc iones (para incrementar l a cant idad de componente se- c r e t o r pegado a l ant icuerpo a n t i I g A secre tora de l a c o - lumna. con t i o c i ana - - t o de amonio (NH SCN) 1.5 M en B u f f e r de PBS pH de 6.8, co - l e c tando f r a c c i one s de 2.0 m l .

l a e lus i ón de l a muestra se r e a l i z ó

4

Las f r a c c i one s con componente s ec r e t o r (detgactadas por inmunodifusión con a n t i I g A s é r i c a y s ec r e t o ra ) fueron concentradas po r u l t r a f i l t r a c i ó n en membrana "Amicon XM50tt

2 y una pres ión de 3.5 Kg/cm : e l concentrado se d i a l i z ó con

t r a PBS 0.15 M y pH 7.2 en una r e l a c i ó n V:V 1 : l O O y se guardo en conge lac ión.

-

3.- Organismos

Se u t i l i z a r o n t r o f o z o i t o s de endantoela h i n t o e y t i c a - de l a cepa H K - 9 ; l o s cua l e s fueron cu l t i vadas axénicamente en medio TPS (*)

(*) Cul t i vadas en e l Departamento de B i o l o g i a C é l u - - l a r d e l Cnetro de I n v e s t i g a c i ón y Estudios Avanzados d e l

1.P.N

Las amj-bas fueron separadas d e l medio de c u l t i v o por cent r i fugac ión a 400 X g durante 20 minutos, ajustando su c0ncentraciÓn.a 1 X l o6 células/ml en medio de c u l t i v o . - Sometiéndolas a conge lac ión en N2 l í q u i d o para su uso pos- t e r i o r . -

Se tomaron a l í c u o t a s de 1.0 m l ; una de e l l a s se l e - t r a t ó con Tr i tÓn X-100 a l 1 % (en Bu f f e r de Tris-HC1 50 mM

_I

- 12 -

pH 8.1) en baño maria a 3 7 O C durante 30,60,90 y 180 m inu - - t o s , a l a o t r a so l o se l e t r a t ó con Bu f f e r ba jo l a s mísmas condic iones . Se proced ió a c en t r í f u ga r a 400 X g durante- 20 minutos obteniéndo: un sedimento ( paquete c é lu l a r , trg tad0 y no t r a t ado con Tr i tÓn X-100) y un sobrenadadnte (me - d i o de c u l t i v o t ra tado y no t ra tado )

I 4.- Preparac ión de l a Pro teasa de I g A

E l sobrenadante d e l medio de c u l t i v o de las amibas - se proceso po r dos métodos:

A ) Por u l t r a f i l t r a c i ó n . (E 11) E l sobrenadante l i b r e de amibas, se u l t r a f i l t r ó

2 en membrana "Amicon XM-50" ba jo una p res i ón de 2.2 Kg/cm reduciéndo a l a 1/10 pa r t e d e l volumen i n i c i a l : p o s t e r i o r - mente se d i a l i z ó contra Bu f f e r de Tris-HC1 50 mM pH 8.1

B) Por saturación. (E I )

E l sobrenadante d e l medio de c u l t i v o 6e saturó a l 30% con s u l f a t o de amonio, poster iormente a l 601, e l se - dimento obten ido de a i s l ó por c en t r i fugac i ón a 1,000 X g - durante 30 minutos. E l sedimento se resuspendió en s o l ; - ciÓn sa l i na i s o t ó n i c a hasta obtener 1/80 d e l volumen o r i g 2 na l , poster iormente f u é sometido a d i á l i s i s contra solu - - ciÓn i s o t ó n i c a hasta l o g r a r que l a prueba de su l f a t o s fue- - r a negat i va . Después de l a d i á l i s i s l a muestra se l l e v ó - a 1/20 d e l volumen o r i g i n a l con so luc ión s a l i na i s o t ón i c a y se saturó a 70% con acetona a 4OC en donde e l sedimento fué resuspendido en Bu f f e r de tr is-HC1 50 m M pH 8.1 centésima d e l volumen i n i c i a l , d i a l i z ando en r e l a c i ó n V:V

1 : l O O

a una

durante 18 horas a AoC contra e l mísmo Buf fe r .

- 1 3 -

5.- I g A como sust ra to

Se prepararon po r dupl icado so luc iones de I g A proc-

dentes de t r e s fuentes: sur0 normal humano, plasma de mig- loma y c s l o s t r o ; a una concentrac ión de 5.0 mg/ml en Bg - f f e r de 'Tris-HC1 50 m M pH 8.1 La es tandar i zac ión se reg-

lid por -inmunodifusiÓn r a d i a l y ne f e l ome t r f a . B

6.- Determinación de l a r e l a c i ó n Óptima Ag/Ab ( 7hcn i ca 7 7 I

E l , ob j e t i v o de é s t a determinación f u é e l e v i t a r e l - exceso de ant fgeno o ant icuerpo en l a e l e c t r o f o r é s i s . I g A ' ( an t í geno ) se probó contra a n t í IgA s é r i c a (en e l caso de I g a procedente de suero normal humano y de plasma de - mieloma), y a n t i IgA sec r e t o ra para ca l os t ro .

La

E l ant isuero a n t i IgA s é r i c a f u é obtenida de l o s Lg- bo ra to r i o s Bohering.

En p lacas de l u c i t a en formade U s e h i z o una d i lu - - - c ión en s e r i e 1;2 de e l ant ígeno con Bu f f e r de Tris-HC1 50 m M pH 8.1, se incubó a 37'C durante 60 minutos. tiempo se h i z o una p laca de agarora a l 1% en Bu f f e r de Bar b i t a 1 pH 8.6 y fuerza i ó n i c a de 0.01 con un espezor de 2 - mm, a l a que s e l e h i c i e r o n pe r f o rac i ones de 2 mm en l a - par t e c en t r a l y dos canales en l o s extremos ( pa r t e s u p e r k or e i n f e r i o r )En Los o r i f i c i o s c en t r a l e s se depos i tó sobre - nadante de l a mezcla Ag/Ab incubado, e l canal super ior se i i e n o con ant ígeno y e i i n f e r i o r con e i ant icuerpo y s e - contínuo incubando a temperatura ambiente durante 18 horas

A l mismo

-7.- D i ges t i ón enzimática " i n ui tao' de I g A

( T é c n i c a 72 I

- 14 -

e - ,

Este proceso se e f e c tuó con l a f i n a l i d a d de t ene r l a degradación de l a molécula de IgA que pudiera s e r v i r como r e f e r e n c i a de l a a c t i v i dad p r o t e o l í t i c a .

A 100 mg de IgA “se l e añadió 1.0 mg de t r i p s i n a , - 0.01 M de c i s t e í ana en 10 m l de Bu f f e r de f s o f a t p s 0.1 M - pH 7.6. Se incubó en un baño a temperatura constante a - 37OC durante 72 horas; ‘durante(i1as que se tomaron muestras a 1 y 2 horas, añadiéndo yodacetamida a l 0.1% como inhibL- dor de l a p r o t e ó l i s i s ; l a s muestras obtenidas s e conge lg - ron hasta e l momento de l a l e c t r o f o r é s i s .

I

8.- Detecc ión de l a a c t i v i dad de proteasa contra I g A

Se incubaron volumenes i g u a l e s de l a s so luc iones de I g A (50111) de l a s t r e s fuentes ( s é r i c a , mieloma y c a l o s - t r o ) a una concentración de 5.0 mg/ml con: A ) t r o f o z o i t o s

de Endunoetk h i n t o t y t i c n t r a tados con T r i t Ó n X-100 a l 1%. B) t r o f o z o i t o s de EndurnoeBu h ¿ n t o @ y t i c a no t ra tados con - TritÓn X-100 a l I % , C ) medio de c u l t i v o p r e c i p i t ado con - su l f a t o de amonio ( E I ) , 0 ) medio de c u l t i v o concentrado - por u l t r a f i l t r a c i ó n ( E 1 1 ) . La inaubación se r e a l i z ó en baño maria a 37OC durante 30.60. 120 y 180 minutos.

La a c t i v i d a d p r o t e o l í t i c a s e d e t e c t ó por inmunoelec- - t r o f o r é s i s en agarosa t i p o I1 a l 1% en B u f f e r de b a r b i t a l pH 8.6 y fue r za i ó n i c a de 0.1; y ant i suero e s p e c í f i c o pa - ra I g A s é r i c a y secretora . E l cor r imiento e l e c t r o f o r é t i c o se h i z o ba jo l a s s i gu i en t es condic iones: 30 Vo l t s , 12-18 mil iampers; e l c on t ro l f u é suero humano Ó c a l o s t r o mezclg- do con una so luc ión de a zu l de bromofenol a l 0.01% en e l - ’

Buf f e r de corr imiento . Las p l acas obtenidas fueron f i j a - - das y t eñ idas con azul b r i l l a n t e de Cppmasie R-250.

- 1 5 -

1 1 1 . - RESULIADOS:

La columna empacada ( a 3 I! 30 cm) con S e p k d e x A-50; y que f u é empleada pare l a p x r i f i c a c i ó n de l a I gA s é r i c a - procedmt.e Ce: suero n c r ~ a l humano y suero de pac iente con Mieloma t,ipo !IbA t e n í a un volumeri vircic de 50 ml. detern inado ned iante exc lus i ón de una muestra de A z u l DFx- - t rán (pol.ímerc de e!.cva¿c peso moiécular ) a l 1% en Bu f f e r de corriul itatt> (Tris-ECI 15 mM pH 8) (Grá f i ca 1 )

Este f u é

De l a muestra de: 1 )suero de pac iente con Kioloma - obtenido d e l Hospita.1 de Qnco log ía d e l C.M.K. IMSS y 2 ) - deüpugs d e t r e s p r e c i p i t a c i c n e s con su1fat.c Ce anonio a - cica m t u r a c i ó n c1.e :.8 M ; a i 6 l o s s i gu i en t es r e s ~ l t a c o s . - a ) Por. El.ef.trofor6si.5, b) Mediant.6 determinación de p r o t e i . - nas por e l uétCdO ¿e Lowry.

n s PrGte ínas t o t s l e s AlbÚmir-a Glokul inas A l fa-1 A l fa -2 Be t ta Game.

Ab

a

/mi 10.2

3.1 7 r ‘I 0.38 1.17

4.55 1 .o 0.44

1 2

b a b

mg/rr.l mg / m i ‘ 9 ;&l 4.54 2.8 2.68

0.36

2.54 0.02 0.16 2.02

0.34 0.10

V Comc se .puede c k s e r v a r en 1.8 t.i<.i-Ia neter ic-r . l a cog- cerit,ración di: &,ro te inas S E ve bastante disminuido después d e l proceso de sa tc rac ión cor el s u l f a t o ae arncnio; e s t e - decrsnieritc, e s causado por l a e l im i r (oc i6n $.E> p r c t r í nas en -

- 16 - I

e l sobrens.dar~:e, l a s cua1 .e~ no l l e g a n w punto I s o e l é c - t r i c o con e s t a concec i rac ión d e se.1 y por IC tsnt,c nc I C - grsn prec iF i t ,ar . Es menester hacer not,ar q u e ? e 1 ~ s PI'S- -.

t.efnac: s t r i c a s ; l a s n . 6 ~ abm&n+#ek< Ecn l a s que migran en - l a reKi6n Ec?t;ta y e c t r e e l l a s se encuent.:.a l a I g A .

I g A : I g G I 9 M n>g/dl. nig/Gl m g i d l

Suero d s Kieloma 520 . I 2,200 540 Suero cor. C?C,E prec ip i t . . 3,000 1 , 6 C G 150

Suero con t r e s prec. 3,000 7 4U 82

Consi,derando EI ccr,t&nj.cc prc* te í co &e 1& muestrq, se a.plicÓ ur; volumen de 4 m l y u n e c.oncefitr&c:Ón de p r o t e i - nac < e 10.7 mg. Se ei.i;c cor, un grn?ier.te i í n s d cor,st; i tci d o por: t:C, ni.: de NaCl 0 . 3 b! en Bu f f e r de Tris-HC1 1 5 mlii - FH 8 y 150 m l de Bu f f e r d6 Tris-EC1 75 ml.; p€i e. E l c o r r i - miento coricj.uy6 con cr- f l u j o de 7 8 m l / h .

Se obt.iivierei 5C f r acc i ones con 100 go tas ccide ur.u - dt e l ? a s ; l a 4-8 f u é p c e i t j w . pir¿ IgG y de Ir; IC-36 fueron p o s i t i v a s ynrh I g A (FLgur6 3)

Se read i zarcn v a r i c r corr imj ~ n t i - ~ s cbt.eni.éndose un' - rend?iriierit.o d e l e i .9 % y u i x piireza d e l 84% (aetermir.sd« - por Ne fc lometr ía ) .

" 1 6 -

S e soc!f;t.i.b a c r o m a t o g r e f í a 6 e I c t . e r c s m b i c I ó n i c o Una.

v!!!cc:?t.aI d e 7 , 5 u81 d e s u e r o n a m a l . tumaie'c p r e c i p i t s c c 3X C O L

s ü l f a t o d e amonio (1.8M) y una c o a c a t , r a c i Ó n de 1'2.5 i g de

cor.t,t?n:dc F r o t e í c c . üsa.ndc. e l mfsnc; gra?cen<,e. l í n e a ) , ei f r a c i o r a m i e n t o sc- r e a l i z o c c n un f l u j o i n i c i a l de 18mlÍk.- Se x o l a c t a r o n 5s f r a c c l o c e f i de I C 0 g o t a s c a 2 a una.

Al i g u a l que en la : : ~ p e I a c j C n del Tuero 6 e p a r i e z t e

COK ~ ; i . e ~ o r n a ; si fra.ccic'nen;ici : . t ,c. cie suero c o r m a i hurrario 6á

uan gI.áf2 c.a coli. tre: . m c : c c - t ~ s ( e n t r e m e z c l a d e s ) . En dcends - 1 8 s dos p r i n t e i . ~ ~ . d i n p I i ; ~ b a 1 x s i t . i v a p a r 6 IgG ( f r a c c i o n e s

5-11 y 17-30) y en i n t e r c e r a SE er .c .~ent . ra la I g H (deterroL

ricdp u.e?iantt? inmLrcd.ifUsiÓn r a d j . 8 1 ) en l a s f r a c c i o n e s 28 e. Ln,

Como e .x .Fer imer , tcs p ~ e l i m i n a r e s se e f e c t u a r o n ~ C E t é 2 r i c a s 6 e p u r i l ; c a c i & i de l e I g A precedente de calcs:?.rc hg- mano; s í n i o g r s r okt .er ,ei hi cric.:: r e c u i i a i o s . La,. t é c n i c a s - eirplcrics f u e r o n : 1 ) F i l t r a c i ó n en Lc:phadtx C-20G oluenüo - con: a.) Ke.C1 O.'!.¿ K pH 6..& , b) grai2Sent.e l í n e a ? ?.E. KECI - C- 0:!4 Ii. er. B u f f e i dri PBS (1.: M p t 7.2 , C.: i*Ci! p a d i e - -

t c s c:scslcnodas de Ma C.1 d e 0-2 M en P u f f e r de Tri V-BCI. 70

" 1 7 -

- 1 8 -

*- .

- 19 -

T E C N I C A S

!

PRECIPITACION CON SULFATO DE AMONIO

( 7 h c n i c a 7 )

INTRODUCCION :

Uno de l o s componentes d e l suero son l a s prote ínas , -

l a s cua les se encuentran en una concentración d e l 6%. De I

acuerdo a su mobi l idad en un campo e l é c t r i c o , e s tas p r o t e i

nas se c l a s i f i c a n como: a l f a , be ta y gamma.

Cuando e s t a s se encuentran e l evadas causan h i p e r g s - mmaglobulimemia y puede s e r pa t o l ó g i c o . corn0 l o e s e l caso de mieloma mú l t i p l e y l a macroglobulinemia de Waldestrom.

Las inmunoglobulinas son un grupo de pro te ínas con - propiedades f i s i c oqu ím i ca s y c e r o l ó g i c a s que recientemente han s ido estudiadas extensamente.

Const i tuyen un grupo heterogéneo en cuanto a carga.- masa y a c t i v i d a d , b i o l ó g i c a . Su a i s lamiento en ent idades - f i s i c oqu ím i ca s d i s c r e t a s ímp l i ca una sel-ie de problemas y- es tema de i n v e s t i g a c i ón en algunos l abo ra to r i o s . '

Los ant icuerpos son inmunoglobulinas ( I g C , IgM, I g A

I g E e IgD) y s e encuentran en l a s f r a c c i one s beta y gamma d e l suero.

. De l t o t a l de g l obu l inas s é r i c a s , l a cant idad de a n t i

cuerpos es re la t i vamente pequeña, generalemente es menor - a l 10% d e l t o t a l de p ro t e ínas de un animal hiperinmuniaado

.

, , ."

,,.,

Las inmunoglobulinas de d i f e r e n t es espec ies pueden- mostrar propiedades f i s i c oqu ím i ca s d i f e r en t e s , por l o que e s importante considerar l a fuen te d e l mater ia l .

- 20 -

*- .

cuerpo en l a f r a c c i ó n pur i f i cada . i

, Las inmunoglobulinas representan a l a s pro te ínas bá- -

do punto i s o é l e c t r i c o y en e s t o se basan l a mayoría de los

I I I

* I

s i aa s d e l suero. Sus so lub i l i d ades co inc iden con su e l e va I

métodos de separación.

Los métodos de separac ión y p u r i f i c a c i ó n de an t i cue r por se r e f i e r e n generalmente como e s p e c í f i c o a y no espec i -

I f i c o s .

Aunque l a s g l obu l inas t i enen algunas propiedades f i - s i cas semejantes a l a s inmunoglobulinas, e l porcenta je de pureza ( 100 X g l obu l ina con func ión de anticuerpo/ t o t a l de g lobu l inas ) d e l producto f i n a l depende d e l contenido de l a s f r a c c i one s c í r cu l an t e s de inmunoglobulinas sér i cas .

Generalmente l o s métodos no e s p e c í f i c o s dan a l t o s - rendimientos y ba ja pureza, en t an to i en los e spe c í f i c o s se ob t i ene ba jo rendimiento con mayor pureza.

E l a i s lamiento y p u r i f i c a c i ó n de ant icuerpos por mé- - todos e s p e c í f i c o s t i enen un fundamento simple y cons is te - en l a propiedad que t i enen los ant icuerpos de p r e c i p i t a r .

. En cada caso metodo lóg ico , e l complejo resu l tante - puede s e r d i soc i ado ajustando e l pH a 3.0, que es l a condi ciÓn p r e f e r i b l e para l a mayoría de sístemas antígeno-antL - cuerpo y a s í obtener e l ant icuerpo.

-

- 21 -

e- 1

1

3

Los ant í genos so lub l es t i enen propiedades d i f e r e n t e s a l a s de l a s inmunoglobulinas, po r l o que e l complejo a n t i geno-anticuerpo, ambos pueden s e r removidos mediante prec2 p i t ac i ón Ó cent r i fugac ión d i f e r e n c i a l . Cuando el ant ígeno

es tá en forma inso lub l e , s o l o se r e qu i e r e de renover por cent r i fugac ión .

~

I L a d i s o c i a c i ón d e l complejo ant ígeno-ant isuerpo acg-

r r e también a pH cercanhs a 9.5; pero , l a desnatura l i zg - c i ón en l a s , so luc iones a l c á l i n a s , ocurre rápidamente, por l o que é s t e método t i e n e poco v a l o r .

Aunque e l p r e c i p i t ado e s p e c í f i c o (complejo i n s o l g - b l e ) c ons i s t e pr inc ipa lmente de ant í geno y ant icuerpo, una pequeña pero s i g n i f i c a t i v a cant idad de mate r i a l no e s p e c - f i c o también es tará presente si no se toman precauciones.

De p a r t i c u l a r importanc ia es l a i n c lu c i ón d e l complemento, por e l l o e s necesa r i o el "descomplementar" e l ant&- suero antes de que reacc ione con e l ant ígeno e s p e c í f i c o .

Aunque l a pureza de los ant i cuerpos d e l t i p o de l a s g lobu l inas , generalmente e s e l evada s i s e ob t i ene por méto - dos e spe c í f i c o s .

Otra t é cn i c a para e l a i s l amien to de ant icuerpos espg preparación de mat r i c es inso lub l es que cog-

adecuado unido a e l l a ' c o o v a c í f i c o s e s l a t i enen un ant ígeno e s p e c í f i c o l e n t em en t e .

E l uso de inmunoadsorventes f u é rec ientemente a p l i c a - da con e l nombre de Cromatograf ía por A f in idad.

E l adsorvente que or i g ina lmente f u é u t i l i z a d o f u é un

- 22 -

der ivado de l a c e lu l osa con un grupo p-amino b enc í l , e l

cual e s f á c i lmente d iazonizado acoplando a l o s ant ígenos p r o t e í c o s Ó haptenos.

-

Poster io rmente se descubrio que e l en lace de l a s p ro t e í nas era un en lace amido con l a carbox i met í1 ce lu losa .

I Se desa r ro l l a ron nuevas t é cn i cas y su uso más exte"-

s i v o con l a in t roducc ión de g e l e s de agarbsa y dextran cg- mo matr ices .

Las moléculas que ticenen grupos amido l i b r e s s e unen coovalentemente a l o s g e l e s mediante l a a c t i v a c i ó n con rc- d i c a l e s de bromuro de cianógeno que atacan a l g e l .

Los avances t é cn i cos de l a inmunología y Bioquímica han cont r ibu ido a l entendimiento de l a estructura de l a mo - l é cu l a d e l ant icuerpo.

E l a i s l amien to y p u r i f i c a c i ó n de ant icuerpos a pap - - t i r de un ant i suero por métodos e spe c í f i c o s . c ons i s t e en - l a ad i s i ón de un agente p r e c i p i t an t e d e l ant fgeno so lub l e Ó b ien l a adsorc ión del ant ígeno i n so lub l e e s p e c í f i c o .

En l a ac tua l idad se cuenta con agentes p r e c i p i t an t e s para l a s inmunoglobulinas t a l e s como: e tano l , s a l e s ne2 - t r a s ( s u l f a t o de amonio. s u l f a t o de sodio ) , p r e c i p i t a n t e s complejos ( r i v a n o l , s a l e s de aluminio, f o s f a t o s . sales de zinc) .

La p r e c i p i t a c i ó n de l a f r a c c i ón gamma d e l suero e s po s i b l e debido a que e s tas p ro t e ínas t i enen puntos i s o e l é c tri cos r e l a t i vamente a l t o s.

~~

- 2 3 -

e

Cuando l a f r a c c i ó n gamma s e t r a t a con p r e c i p i t a n t e s complejos, se forman complejos c a t i ón i c o s i n so lub l e s con -- l a mayoría de l a s o t r a s p ro t e ínas s é r i c a s a v a l o r e s de pH

donde l a f r a c c i ó n gamma queda como ant igen0 soluble ( s i n - formar t a l e s complejos) , po r io que e s necesa r i o precip' - t a r l a por o t r o método; pe ro p r e v i o a e s t o se r e a l i z a un - proceso de c l a r i f i c a c i ó n ; e s t e método Imp l i ca una s e r i e - de pasod y po r l o t an to v a r i a s t é cn i c a s y en e l l o se basa su poca ap l i cac i ón .

Las inmunoglobulinas d i f i e r e n unas de o t r a s , y a su vez de l a s o t r a s p r o t e í nas s é r i c a s en cuanto a su s o l u b i l i dad en so luc iones acuosas, és ta c a r a c t e r í s t i c a puede ser - empleada para f r a c c i o n a r l a s en c l ases .

Durante mas de 100 años, l a s s a l e s minera les s e han ap l i cado en l a p r e c i p i t a c i ó n y f racc ionamiento de l a s prg- t e ínas .

Hammarsten y Méhu en 1878 fueron l o s pr imeros en i n - - v e s t i g a r e l e f e c t o de l a p r e c i p i t a c i ó n nio. Hofmeister en 1888 r e a i z ó i n t e r e san t e s i n v e s t i g a c i o - - n e s acerca de l a e f i c i e n c i a de los aniones y ca t iones como agentes : jp rec ip i tantes y l a s l e y e s f i s i c oqu ím i ca s que r i g e n t a l e s reacc iones .

d e l s u l f a t o de amo -

En 1937 K j enda l l f u é e l primero que pub l i có e l méto- - do a segu i r para l a p r e c i p i t a c i ó n de l a f r a c c i ó n gamma sh- r i c a mediante e l uso del s u l f a t o de amonio.

I,. S i se t r a t an a l a s gamma g l obu l inas con sa l e s mine- r a l e s neutras, a medida de que se incrementa l a concentra- ciÓn sa l ina en e l medio, e x í s t e una i n t e r a c c i ón de l a s mg-

- ~

- 24 - I

?

lécu'ias de agua con l o s g r u p o s p o l a r e s de l a s moléculas - p r o t e í c a s h a c i é n d o l a s c a d a v e z más h i d r ó f o b a s

l u b i l i e a r l a s .

h a s t a i n s o -

. L a c o n c e n t r a c i ó n s a l i n a a l a q u e cada p r o t e í n a p r e c i

p i t a e s d i f e r e n t e : aunque en e l caso de n o l é c u l a s e s t r e c h a monte r e l a c i o n a d a s como es e l caso ,de Pa s i n m u n o g l o b u l i n a s l a d i f e r e n c i a no e s l o s u f i c i e n t e m e n t e g r a n d e como p a r a - d a r un p r e c i p i t a d o de g r a n p u r e z a . P o r l o que é s t e m é t - do se emplea p a r a . c o n c e n t r a r i n m u n o g l o b u l i n a s , más no s e p a ra a c a d a una de e l l a s como e n t i d a d e s i n d i v i d u a l e s .

I

S e ha i n v e s t i g a d o l a i n f l u e n c i a de una s e r i e de v a - r i a b l e s que i n t e r v i e n e n en l a p r e c i p i t a c i ó n de l a s p r o t e i - nas: s a l e s m i n e r a l e s ( c l o r u r o d e s o d i o . s u l f a t o de amonio) f u e r z a i ó n i c a , pH, c o n c e n t r a c i ó n de p F o t e í n a s y temperat&-

ra.

En c u a n b a s a l e s m i n e r a l e s . los i Ó n e s d i v a l e n t e s : - s u l f a t 0 , p r e c i p i t a n a l a hemoglobina más e f i c i e n t e m e n t e que

e l iÓn monovalente c l o r u r o . E s t e e f e c t o s e l e a t r i b u y e a l a I 1 d e s h i d r a t a c i Ó n " de l a p r o t e í n a p o r l a s a l .

E l s u l f a t o de amonio t i n e l a v e n t a j a de que sus s o l u c i o n e s s a t u r a d a s c o n t i e n e n g r a n d e s c a n t i d a d e s de l a s a l y su s o l i b i l i d a d depende muy poco de l a t e m p e r a t u r a . S e recomienda u s a r en r e a c t i v o l i b r e de c o n t a m i n a n t e s m e t á l i c o s . p u e s e s t o s i Ó n e s pueden f o r m a r enlaces con a l g u n a s p r o t e i - n a s , y a l g u n o s pueden c a t a l i z a r r e a c c i o n e s de o x i d a c i ó n .

E l s u l f a t o de s o d i o t i e n e una s o l u b i l i d a d l i m i t a d a a b a j a s ~ t e m p e r a t u r a s . Algunos a u t o r e s recomiendan e l uso - de e s t a s a l a 370C. A 3OoC su a c t i v i d a d p r e c i p i t a n t e e s -

- 25 -

u..

comparable a l a d e l s u l f a t o de amonio. E l su l f a t o de so - d i o presenta l a venta ja de no contener n i t rógeno, por l o - que e v i t a l a d i s t o r c i ón en l a cuan t i f i c a c i ón de pro te ínas .

E l su l f a t o de magnecio p r e c i p i t a l a f r a c c i ón de l a s gamma g l obu l inas s é r i cas . E l c l o ruro de sodio es usado - Únicamente para l a p r e c i p i t a c i ó n de f ib r inógeno .

I

E l c on t r o l d e l pH e s un f a c t o r importante en l a prg- c i p i t a c i ó n de l a s pro te ínas ; no obs tente se ha observado -

I ** que su va l o r , en e l suero no juega un papel muy importante I ,< en e l f racc ionamiento con s a l e s mir)erales neutras, pero s i , v * l o e s para e l f raccionamiento con etanol .

I:::

1)'. ~

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1" I..

I...

La concentración de p ro t e ínas en e l medio de precipi- t a c i ón , t i e n e doble e f e c t o : i n f l u y e en los l í m i t e s de l a p r e c i p i t a c i ón y en l a c op r e c i p i t a c i ón de l a s pro te ínas ' - acompañantes.

La temperatura no e s tan c r í t i c a para l a p r e c i p i t a - c iÓn de l a s p ro t e ínas con sa l e s minera les neutras , como l o e s cuando se usa etanol . S i se usan sa l e s minerales no s e r equ i e r e de equipo de en f r iamiento y puede r e a l i z a r s e - a temperatura ambiente.

Cuando se t r a t a de p r o t e í nas temosensibles o de r e a2 c iones esz imát icas . es recomendable t r aba j a r a ba jas temps raturas.

Las pro te ínas , t a l e s como: hemoglobina, miosina y - l a s s é r i c a s preeentan ba jas s o lub i l i d ades con calentamien- t o : e s menor a 25OC que a O°C. La mayoría de l a s p r o t e i - nas p r e c i p i t an a temperaturas templadas o f r i a s . E l i n c r g

-

rq I L..

- 2 6 - -

*- .

mento de l a t e m p e r a t u r a puede s e r una e t a p a e f e c t i v a p a r a

l a c r i s t a l i z a c i ó n de p r o t e í n a s . , a s í p o r e j e m p l o : l a h a p t o g l o b u l i n a , p r o t e í n a C r e a c t i v a y prea lbúmina en s o l u c i o n e s

< c o n c e n t r a d a s de sa les . S i n embargo, l a c r i s t a l i z a c i ó n de

l a a lbúmina humana s u c e d e Únicamente con un l a r g o a l m a c e n a m i e n t o e n r e f r i g e r a c i ó n .

I Los p r o c e d i m i e n t o s con s a l e s m i n e r a l e s n e u t r a s p r e -

s e n t a n c i e r t a s v e n t a j a s s o b r e e l f r a c c i o n a m i e n t o con e t a - n o l , en l a c o n c e n t r a c i ó n p r e l i m i n a r y p u r i f i c a c i ó n p a r c i a l de l a s i n m u n o g l o b u l i n a s . Además, e s t e p r o c e d i m i e n t o e s - s e n c i l l o y con menor p e l i g r o d e d e s n a t u r a l i z a c i ó n p a r a l a s p r o t e í n a s .

E l e x c e s o de l a s s a l e s en l o s p r e c i p i t a d o s r e c o n s t i - t u f d o s son e l i m i n a d o s r á p i d a m e n t e p o r t é c n i c a s de filtra 2 ciÓn en gel Ó m e d i a n t e una d i á l i s i s prolongada.

Para e l f r a c c i o n a m i e n t o de sur0 en a l g u n a s e s p e c i e s como e l p o l i o , l a p r e c i p i t a c i ó n c o n s a l e s m i n e r a l e s n e 2 - t r a s e s s u p e r i o r a l a p r e c i p i t a c i ó n con e t a n o l , en b a s e a r e n d i m i e n t o y pureza.

Generalmente e s p r e f e r i b l e t r a b a j a r con p r o t e í n a s - a b a j a s t e m p e r a t u r a s y con p r e s e r v a t i v o s Ó i n h i b i d o r e s d e l a a c t i v i d a d e n z i m á t i c a y/o c r e c i m i e n t o m i c r o b i a n o .

L a v e l o c i d a d y f i n a l i z a c i ó n de l a p r e c i p i t a c i ó n , es- t á d e t e r m i n a d a por : t e m p e r a t u r a , c o n c e n t r a c i ó n de l a s a l , - y. c o n t e n i d o p r o t e i c o .

A n t e r i o r m e n t e l a c o n c e n t r a c i ó n d e l s u l f a t o de amonio - era c i t a d a como s a t u r a c i ó n p o r c e n t u a l de l a s a l en s o l u -

- 27 -. I

y2

ción, aunque és ta , e s tá . in f luenc iada un poco por l a temperatura: por ello, es p r e f e r i b l e c i t a r l a en concentrac iones molares.

E l s u l f a t o de amonio a O°C es de 5.35 M y temperat i -

ra ambiente e s de 5.75 M Ó 700 y 760 g de s a l por l i t r o de

so luc ión respect ivamente. I

Las concentrac iones de s u l f a t o de sod io en los p ro c e dimientos de p r e c i p i t a c i ó n e s dado cbmo so luc ión porcen - t u a l ( W / V ) as í no se considera l a i n f l u e n c i a de l a tempera - tura. A 5OC el s u l f a t o de sod io a l 18% (W/V), es una solu - ciÓn sabresaturada y excesivamente ines tab l e : tendiéndo a c r i s t a l i z a r . P o r e l l o e s p r e f e r i b l e t r aba j a r a temperatu- - ra ambiente con és ta s a l y añadir una go ta de to lueno para i n h i b i r el crec imiento microbian0 part icu larmente s i es ta- rá almacenado durante l a r g o per iódo.

Los métodos de p r e c i p i t a c i ón , generalmente no dán - preparaciones de inmunoglobulinas de gran pureza. S ín em-

bargo e s t o hace f á c i l el f raccionamiento de grandes volume nes de suero, que l o s métodos cromatográ f icos , de l o s cua- - l e s también se obt ienen concentrados de gamma g l obu l inas Ó para l a p u r i f i c a c i ó n de suero humano por cromatogra f ía , - f i l t r a c i ó n en g e l , c e n t r i f u g a c i h por g rad i en t e Ó elect-- f o r é s i s .

P r e c i p i t a c i ón de pro te ínas s é r i c a s con s u l f a t o de a- - monio.

Este procedimiento de concentración de gamma g l o b u l i nas es e l más simple y uno de l o s métodos más e f i c i e n t e s , - s i no se r e qu i e r e de preparar pu r i f i c ados de cada una de -

- Le -

*’ .

.<

l a s inmunoglobulinas.

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i I 1 I i ! !

I

\

I.

E l método dá una preparación que cont ienen a l a mayo r í a de l a s inmunoglobulinas junto con o t r a s g l obu l inas s i- r i c a s y un po rcen ta j e de albúmina r e l a t i vamente ba jo .

La saturac ión con su:l fato de amonio puede e f e c tuarse

A ) Po r ad i s i ón de so luc ión saturada de s u l f a t o de a-

E) Adis iÓn de s u l f a t o de amonio s ó l i d o .

de dos formas:

monio.

E l pr imer caso se usa pre ferentemente cuando e l c o l 2 men de l a muestra es pequeño; en t an to e l segundo se e; - p l e a en e l caso de que se t r a t en de volumenes grandes, ya que l a ad i s i ón d e l s u l f a t o de amonio s ó l i d o en l u ga r de en so luc ión reduce e l volumen de t raba j o .

En ambos procedimientos s e p a r t e de suero, po r l o - - que l a obtenc ión de é s t e a p a r t i r de sangre p e r i f é r i c a

es común en l o s dos casos. * S i l a muestra de sangre es obtenida con ant icoagu -

l a n t e se s i gue e l procedimiento que a cont inuación se des- - c r i b e :

Ma te r i a l y equipo: - Balanza a n a l í t i c a - B8.ianza g ranatar ia - Cent r í fuga con cabeza l - Espátula - Pape l pa ra f i lm - P í p e t a s e r o l ó g i c a de 1 0 . m l - Probe ta de 100 m l - Tubos de c en t r í fuga

- 29 - j

en c a c o de q u e l a muestra no se emplee i n m e d i a t a -

m e n t e , puede ser almecenada a 4 C a d i c i o n a n d o una p i z c a de a z i d a d e s o d i o (NaN ) como i n h i b i d o r d e l c r ecim i en t o ba c t e r i ano.

8.- Se c u a n t i f i c a l a c a n t i d a d de p r o t e í n a s y c a r b o h i -

O

3

d r a t o c a l s u e r o o b t e n i d o .

*.- Cuando l a muestra'de s a n g r e es o b t e n i d a s i n ant&- c o a g u l a n t e , l a o b t e n c i ó n d e l s u e r o s e r e a l i z a d e

l a manera que s e d e s c r i b e a c o n t i n u a c i ó n :

M a t e r i a l y e q u i p o : /

- B a l a n z a g r a n a t a r i a - A p l i c a d o r e s de madera - C e n t r í f u g a con c a b e z a l - P í p e t a c e r o l ó g i c a de 10 m l

- P r o b e t a de 100 m l - Tubos de c e n t r í f u g a

Muestra :

- S a n g r e t o t a l p e r i f é r i c a

Método:

1 . - L a s a n g r e se d e j a c o a g u l a r a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e p a r a e l i m i n a r t o d o s l o s fac tores d e l a c o a g u l a - c i ó n

2.- E l c o á g u l o se e l i m i n a aprovechando l a p r o p i e d a d - 3.- La muestra se c e n t r i f u g a a 1.000 X g d u r a n t e 20 - 4.- Después d e c e n t r i f u g a r , se o b t i e n e un sedimento

que t i e n e e s t e de a d h e r i r s e a l a madera.

m i n u t o s a t e m p a r t u r a ambiente .

c o n s t i t u í d o p o r e l p a q u e t e g l o b u l a r e l c u a l se d e p o s i t a d o en una p r o b e t a p a r a medir e l volumen ob-

-30 --

React i vos:

- CaCIZ - Dextran s u l f a t o de sod io (SIGMA)

M u e s t r a :

- Sangre t o t a l p e r i f é r i c a

%-

, .I

.. "

Método:

1.- La sangre t o t a l p e r i f é r i c a se cen t r í fuga a 1,000

X g a temperatura ambiente, durante 20 minutos.

2.- E l sobrenadante obtenido s e separa con ayuda de - una p í p e t a s e r o l ó g i c a y se v i e r t e en una probeta para c u a n t i f i c a r su volumen.

3.- A e l plasma obtenido se l e añaden 1.0 m l de so lg- ciÓn 1.0 M de CaC12 por cada 10 m l de plasma, pa- r a e l im inar f ib r inógeno .

4.- También se t r a t a a l plasma con dextran su l f a t o de sod io , con l a f i n a l i d a d de p r e c i p i t a r a l a s l ipc- p ro t e ínas ; para e s t o s e ad is ionsn 0.4 m l de dex-- ran su l f a t o de sodio a l 10% p o r cada 10 m l de - plasma Ó 0.04 g de r e a c t i v o s ó l i d o .

5.- Una v e z añadidos l o s r e a c t i v o s , l a brobeta se cu- - bre con para f i lm y s e d e j a reposar a 4 O C durante toda l a noche en plano h o r i z o n t a l para ineremen - t a r l a s u p e r f i c i e de con tac to en t r e l o s r e a c t i v o s y e l plasma.

6.- A l d í a s i gu i en t e , se procede a c en t r í f u ga r ba j o - l a s mismas condic iones an tes d e s c r i t a s para eLim' nar e l sedimento que se encuRntra cons t i tu ido por un coágulo que son l a s l i p o p r o t e i n a s y e l f i b r2 - nógeno. En t an to e l sobrenadante l o cont i tuye e l suero.

7.- E l sobrenadante se a i s l a con una p ípe ta serolÓgL- ca y s e l e cuan t i f i c a su volumen en una probeta;-

I

- 3 1 -

'I. I -

, - I ' I: I '::

t e n i d o .

5.- Se p r o c e d e a c u a n t i f i c a r p r o t e í n a s y c a r b o h i d r g -

6.- E l s u e r o puede a l m a c e n a r s e en r e f r i g e r a c i ó n a ñ g - t o s d e l s u e r o o b t e n i d o .

d i e n d o a z i d a de s o d i o .

A ) P r e c i p i t a c i Ó n con s o l u c i ó n saturada d e (NH 4 2 ) SO I

M a t e r i a l y e q u i p o :

- A g i t a d o r m a g n é t i c o I

- B a r r a m a g n é t i c a con c o b e r t u r a de t e f l ó n - B u r e t a Ó embudo d e s e p a r a c i ó n ( 2 5 y 500 m i )

- C e n t r í f u g a con c a b e z a l - G r a d i l l a

- Material p a r a d i á l i s i s - M a t e r i a l p a r a i n m u n o e l e c t r o f o r é s i s - Material p a r a inmunodifusión - Material p a r a p r u e b a de s u l f a t o s - Matraces E r l e n m e y e r de 1 2 5 , 250 y 500 m l

d e i o n i z a d a - P i c e t a con a g u a d e s t i l a d a y - P i n z a s p a r a bureta - P f p e t a s c e r o l ó g i c a s de 5 y - P o t e n c i ó m e t r o - P r o b e t a s d e 50.100 y 250 m l

O m l

- S o p o r t e u n i v e r s a l con a n i l l o - Tubos d e c e n t r í f u g a

S o l u c i o n es :

- S o l u c i ó n s a t u r a d a d e (NH4)2S04 - B u f f e r c o m e r c i a l d e pH c o n o c i d o

- 32 -

.¿'

hasta l o g r a r e l volumen i n i c i a l . E l pr imer sedimento con t i ene cant idades aprec ia-

b l e s de albúmina, l a cua l puede ser removida me- d ian te t r a s p r e c i p i t a s o n es con t ínuas .

9.- Para e l im inar l a mayor pa ra t e de l a albúmina pg- s i b l e , se r e p i t e de l a etapa 3 a l a 8 dos veces

más. 10.- E l t e r c e r sedimento se resuspende en algún Bg -

f f e r hasta l o g r a r e l volumen i n i c i a l y se dia l&- za contra e l mísmo Buf f e r en una r e l a c i ón V:V de 1:50-100 a 4OC durante 18-24 horas, con constan-

t e s recambios. 11.- Antes de hacer cada recambio, se procede a hacer

l a prueba de los su l f a t o s a l Buffer d i a l i z an t e ; - l a d i á l i s i s se suspende cuando l a prueba es negg t i v a .

12.- Cuando e l exceso de s u l f a t o s ha s ido removido, - e l contenido de l a membrana se cen t r i fuga a 1,000 X g durante 20 minutos, s i es que hubo forma - ciÓn de sedimento, en caso con t ra r i o se suspende és ta etapa.

13.- E l sobrenadante obtenido después de c en t r í f u ga r se l e determina su volumen para c a l cu l a r l a d i l g

siÓn que ha ocur r ido durante l a d i á l i s i s . 14.- Para hacer una eva luac ión cuan t i t a t i v a y c u a l i t a

t i v a de é s t e método se hacen l a s s i gu i en t es p r u e bas a l a s muestras (suero o r i g i n a l , sedimento rs suspendido an tes de l a d i á l i s i s , sedimento resu2 pendido después de l a d i á l i s i s ) : Pruebas c u a l i t a

t i v a s : Inmunodifución, Inmunoelectro forés is . prue bas cua1itativas:DeterminaciÓn de pro te ínas y d e terminación de inmunoglobulinas po r inmunodifE - siÓn r ad i a l .

I ' - 34 - I

React i vo s :

So 1 u ci on e s :

- Bu f f e r - B u f f e r de r e f e r e n c i a

Muestra:

6 ) P r e c i p i t a c i ó n con ( N H ) SO s ó l i d o 4 2 4

Mater ia l y e q u i p o :

- Ag i t ado r magnético - Balanza a n á l i t i c a - Balanza granatar fa - Barra magnética con cobertura de t e f l ó n - Centr í fuga con cabeza l - Espátula - G r a d i l l a - Mate r i a l para a i á l i s i s - Mate r i a l para inmunodifusión - M a t e r i a l para inmunoe lec t ro fo rés i s - Mate r i a l para l a prueba de s u l f a t o s - Matraz Erlenmeyer de 125. 250 y 509 m l - Pape l aluminio - P i c e t a con agua deioniaada - Potenciómetro - Probe tas de 50,100, 250 y 2,000 m l - Tubos de e cn t r í fuga

- Suero

- 35 -

M é t o d o :

1.- A l a muestra de suero s e l e determina su volumen midiéndo é s t e en una probeta .

2.- La muestra se depos i ta en un matraz Erlenmeyer - cuyo volumen t o t a l deberá s e r 3-5 veces e l vo lg - men de l a muestra.

3.- E l matraz se co l oca sobre de un ag i t ado r magnétL co y s e in t roduce en e l suero una barra magné t - ea con cobertura de t e f l ó n .

nee2

c a r i a para p r e c i p i t a r l a f r a c c i ón gamma s e r i c a . De acuerdo a l o s datos obtenidos en l a i i t e r a t - r a l a f r a c c i ó n gamma s é r i c a p r e c i p i t a con una sg turac ión de (NH4)2s04 d e l 28-738. que l a concentracion de r ad i c a l e s (NH ) SO i n i - c i a 1 en e l suero e s de 0 % ; e l porcenta je de s a t2 rac i ón que se r equ i e r e e s d e l 33%. l a cant idad - de (NH ) SO para conseguir és ta saturac ión se - ob t i éne de l a t a b l a de saturación ( 7 a U a I ) Ó - d e l nomograma de Dixon 17a8!a 2) . En ambas cg-

8 0 s s e hace un a ju s t e p o r concentración i n i c i a l y e l volumen t o t a l d e l suero. S i se hace a j u s t e po r volumen i n i c i a l y usando l a t a b l a , l a r e l a - c i ón e s l a s i gu i en t e :

I I

4.- Se procede a pesar l a cant idad de (NH ) SO 4 2 ,L

Considerando

4 2 4

4 2 4

Para 100 m l de suero --------------- 19.6 g

x g Volumen de suero -_- -___--_____-

5.- Se procede a pesar l a cant idad de (NH ) SO chi- L 2 4 - cula'da en l a etapa e n t e r i o r ; l a cual se pesa en balanza a n á l i t i c a .

6.- E l suero se somete a a g i t a c i ón constante y l e n t a procurando e v i t a r l a formación de espuma.

I - 3 6 -.

*- . c.

7.- E l (NH ) SO se añade lentamente, conforme é s t e 4 2 L

s e va so lub i l i z ando en e l suero, s i l a ad ic ión - se hace rápidamente; é s t o puede causar agrega - c iÓn de l a s gamma g l obu l inas que forman un agrg-. gad0 inso lub l e . Cuando se termina de añadir to da l a cant idad de (NH ) SO pesada, l a so luc ión L 2 L se torna l echosa y se mantiene en a g i t a c i ón de -

I 30-60 minutos más.

20 minutos, el sobrenadante que se obt i ene e s de . sechado, y el sedimento s e resuspende a su vo lg -

9.- Para obtener l a f r a c c i ó n gamma s é r i c a de mayor - pureza, es recomendable r e p e t i r 5-8 dos veces - más.

10.- E l t e r c e r sedimento después de haber s ido resuspendido en e l Buffer, se d i a l i z a contra e l mísrno i B u f f e r en una r e l a c i ó n V:V 1:lOO a 4 O C durante - e l tiempo que sea necesar io , hasta l o g r a r l a e l l minación completa de l o s r a d i c a l e s su l f a t o ; para l o g r a r l o se r e a l i z a n constantes recambios de BE+ f f e r d i a l i z a n t e a l cual se l e hace l a prueba de l o s s u l f a t o s hasta que é s ta sea negat i va .

8.- La suspensión se c en t r í f u ga a 1,000 X g durante

men i n i c i a l con algún Bu f f e r . I

11.- La eva luac ión d e l método se e f ec túa de i g u a l f o x ma que en e l e d c r i t o anter iormente.

12.- La muestra puede s e r almacenada en r e f r i g e r a c i ó n s i no tendrá uso inmediato; en é s t e caso se aña- de una p i z c a de a z ida de sodio para e v i t a r e l - crec imiento microbiano. f 33-14)

- 37 -

ESTIMACION DE P R O T E I N A S POR EL METODO DE L O W R Y

( T h c n i c a 2 I

I n t r o d u c c i o n ;

.

Es un método de c u n t i f i c a c i ó n c o l o r i m é t r i c a p o r e l - uso d e l r e a c t i v o de F o l í n - f e n o l C i o c a l j e u ; en donde e l de- s a r r o l l o d e l c o l o r a z u l , se produce a l a g r e g a r el r e a c t i v o

de f e n o l a una s o l u c i ó n a l c a l i n a d e p r o t e í n a s , l a i d t e n s i - dad d e l n o l o r está dada por l a c a n t i d a d . d e p r o t e í n a en f u n - ciÓn de s u c o n t e n i d o d e - t i r o s i n a y t r i p t o f a n o .

L a i n t e n s i d a d d e l c o l o r d e s a r r o l l a d o puede v a r i a r - con d i f e r e n t e s p r o t e í n a s ; p o r e l l o es n e c e s a r i o que l a cur - v a de c a l i b r a c i ó n b a s a d a en el a n á l i s i s d e n i t r ó g e n o se e s

t a b l e z c a p o r l a p r o t e í n a Ó m e z c l a s de las p r o t e í n a s de i n - v e s t i g a c i ó n .

Una r e l a c i ó n l í n e a 1 e n t r e l a c o n c e n t r a c i ó n de l a p r o - t e í n a y l a i n t e n s i d a d d e l color o b t e n i d o p o r e l t r a t a m i e n - t o con e l r e a c t i v o d e F o l í n - f e n o l C i o c a l t e u , se o b s e r v a - Únicamente en un l í m i t a d o rango d e c o n c e n t r a c i ó n .

Se c o n o c e n o t r o s f a c t o r e s que t i e n e n un p a p e l impor-

t a n t e , p r í n c i p a l m e n t e e i t iempo que se expone l a p r o t e í n a ‘ a l a s o l u c i ó n a l c a l i n a a n t e s de a g r e g a r el r e a c t i v o de fe- no1 y l a p r e s e n c i a de -SH o de o t r o s g r u p o s r e d u c t o r e s .

L a p r o t e í n a d e s c o n o c i d a puede ser d i l u i d a y e n s a y a d a en una p r i m e r a d e t e r m i n a c i ó n , s i e m p r e y cuando el r e s u l t a - do o b t e n i d o dé l a D.0 que e n t r e d e n t r o de l a c u r v a de C a l i

b r a c i ó n . en c a s o c o n t r a r i o s e h a c e una d i l u c i ó n mayor d e - l a m u e s t r a y se a n a l i z a nuevamente.

-

- 3.8 -

.E

Mínimo e s v e i n t e v e c e s más s e n s i b l e que el método de

B i u r e t .


- B a l a n z a a n a l í t i c a - Baño a t e m p e r a t u r a c o n s t a n t e - C é l d a s p a r a e s p e c t r o f o t ó m e t r o

- E s p á t u l a - E s p e c t r o f o tómetro - G r a d i l l a s - M a t r a c e s v o l u m é t r i c o c de 1 0 0 , 2 5 0 y 500 m i - Matraz E r l e n m e y e r de 250 m l - P a p e l a l u m i n i o

- P e p e l p a r a f i l m - P f p e t a s s e r o l ó g i c a s de 1 . 5 y 10 m l - P í p e t a Eppendorf de 5 0 , 2 5 0 u 1 - P r o b e t a de 100 m l - Tubos de ensayo de 13 X 100 mm ( 3 p o r cada mues - -

tra,más 18 p a r a l a curva e s t á n d a r y 3 p a r a r e a c t i - v o s )

- V o r t e x

R e a c t i v o s :

- Agua d e i o n i z a d a

- K N a C H O

- Nazco3 - N a O H

- CUSOL 2H20 4 4 6'

- Albúmina sér ica bovina

( BSA

S o l u c i o n c s :

- S o l u c i ó n s t o c k de BSA ( 8 mg/ml )

- 39 -

I

- So luc ión estándar de BSA: D 1:50 de l a so luc ión - stock; l a cual tendrá una concentración t e ó r i c a de 160 ug/ml, é s t e v a l o r es corroborado midiendo l a - DO a 280 nm y ten iendo como blanco agua de ion i zada

ug de BSA= D O 280 nm X 1 . 5 1 5 X 1.000

- F o l í n A: So luc ión de Na2C03 a l 2% en NaOH 0.1 N - P o l í n B 1 : So luc ión de CuSO 4 ' - F o l í n B 2 : So luc ión de KNaC H O 4 4 6' - FCR: Se r e qu i e r e de 2 . 5 m l de é s t e r e a c t i v o po r c g

I 5 H20al 1 %

2 H20 a l 2 %

4 da tubo :

49.0 m l de F o l í n A 0 . 5 m l de F o l í n B 1

0 . 5 m l de F o l í n B2

- Reac t i vo de Fo l í n - f eno l C i oca l t eu en D 1 :2

M é t o d o :

1 . - Se procede a preparar l a s so luc ines antes mencig nadas.

2 . - La determinación, ímp l i ca e l t r i p l i c a d o de: e s - tándar de p r o t e í na que cubre e l rango de l a curva de c a l i b r a c i ó n , muestras y blancos. La curva estándar s e r e a l i z a con l a so luc ión estándar de BSA en donde e l tubo 6 e s e l que cont iene l a con cen t rac i ón correspondiente a l a D O a 280 nm y - usando e l c o e f i c i e n t e de ex t inc i ón de 1 . 5 1 5 La muestra de l a curva estándar deberá contener un volumen de 500 u l .

3.- Se co locan en una g r a d i l l a : l a cuerva estándar,- l a s muestras y los blancos y se procede a añadir 2 . 5 m l d e l r e a c t i v o FCR a l mfsmo tiempo se van - ag i tando manualmente, se dejan reposar durante - 1 5 minutos a temperatura ambiente.

- 40 - I

I

4.- Se añade 0.5 m l de r e a c t i v o de Fo l í n - f eno l C i o ca l t eu a cada uno de l o s tubos, agi tando en vo r t ex , después de l o cua l se someten a baño maria a 50'

cent í g rados durante 10 minutos. 5.- Cuando se sacan d e l baño, se dejan reposar (para

e n f r i a r ) a temperatura ambiente, en caso de que se r equ i e ra e n f r i a r rápidamente se someten a re- f r i g e r a c i ó n .

6.- Se mide l a D.0 a 700 nm de cada uno de l o s tubos usando como blanco e l tubo 1 de l a curva están- dar.

(pues l a determinación s e r e a l i z a p o r t r i p l i c a d o ) 8.- Los r esu l t ados obten idos como medias de l a s mues -

t r a s uasadas como curva estándar son g r a f i c adas en pape l m i l imé t r i c o , con l a D.0 en l a s ordena - - das y l a concentrac ión de pro te ína en l a s abc i - - sas . Por úl t imo se t r a z a una r eac ta a t r a v é s - de é s t o s puntos y es l o que const i tuye l a cuerva estándar de c a l i b r a c i ón .

9.- Por Úl t imo , la media de l a D O de l a s muestras e s

extrapo lada en l a curva, obteniéndo a s í l a con - cent rac ión de p r o t e í nas para cada muestra.

10.- S i l a D O de l a s muestras excede el l í m i t e supe- r i o r de l a cuerva estándar, l a muestra es d i l u í - da y ensayada nuevamente.

7.- De cada muestra s e ob t i ene l a media de l a D O --

Nota: Los r e a c t i v o s pueden almacenarse en r e f r i g e r a - c i ón hasta po r dos meses, después de l o cua l - deberán s e r desechados. A excepción d e l FCR - que edebe ser preparado e l d í a de l a determina c ión. í 4 5 . 4 6 1

i I !

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I -*-4 1 -

..

6.

a D I A L I S I S ( T é c n i c a 3 I

I NTRODUCCION :

La d i á l i s i s c o n s i s t e en l a d i f u s i ón de moléculas pe- queñas a t r a v é s de una membrana semipermeable; y no permi-

t e e l paso de moléculas de e levado peso molécular , por 6s-

t a capacidad es un método de separación de so lu tos de d i f e r en t e tamaño molecular en una so luc ión l í qu i da .

1 La d i á l i s i s también s e usa en l a p u r i f i c a c i ó n de co- l o i d e s , para e s t a b l e c e r i g u a l concentración de i one s en t r e so luc iones que cont ienen macromoléculas y Bu f f e r ; (como - I

por ejemplo en l a preparac ión de muestras de p ro t e ína para

e l e c t r o f o r é s i s ) . I 1 1

Las ap l i c a c i one s p r á c t i c a s ' i ndus t r i a l e s incluyen: l a separación de NaOH de hemice lu losa en so luc iones de rayon, e s t e proceso s e r e a l i z a u t i l i z a n d o membranas de c e l o f án ; - l a separación en t r e el ác i do su l fÚr i co de l o s s u l f a t o s de

n íque l y cobre en so luc iones acuosas.

Las membranas de c e l u l o s a se usan para d i a l i z a r san - g r e humana l i b r e de venenos en e l r iñon a r t i f i c i a l .

La so luc i ón a d i a l i z a r se co loca dentro de una mem - - brana semipermeable que generalmente e s de c e lu l osa , y es- t a baina e s suspendida en agua Ó algún Buffer. t r o l i t o s y o t r o s ma t e r i a l e s de ba jo peso molecular se d i - - funden' a t r a v é s de l a membrana hasta que su concentración se i g u a l e a ambos l ados de l a membrana. Por r epe t i d o s cam b i o s d e l d i a l i z a d o ( s o lu c i ón fuera de l a baina o membrana)

Los e l e c

I ''I

I , ,-

I ':: I 'I:

se puede causar un e q u i l i b r i o en t r e l a so luc ión del inte - r i o r de l a baina y e l s o l v en t e deseado. E l proceso puede a c e l e r a r s e po r a g i t a c i ón magnética d e l d i a l i z a d o y por ca; b i o s constantes.

Un diámetro pequeño en e l tubo de d i á l i s i s , incremeg

t a el área de contacto , r d a t i v o a l volumen de l a so luc ión que será d i a l i z a d a y a s í l a d i á l i s i s puede s e r más rápida.

I

Los mate r i a l e s b i o l ó g i c o s t a l e s como l a s p ro t e ínas - deben d i a l i z a r s e en r e f r i g e r a c i ó n para d isminuir e l c r e c i - miento microbian0 y l a desnatura l i zac ión de l a s mismas.

Comercialmente se dispone de bainas de c e lu l o sa de - d i f e r e n t e tamaño de poro y diámetro; el tamaño de poro e s el que determina el tamaño de molécula que d e j a pasar l a - membrana semipermeable ( Espectrapor) .

Mater ia l y equipo:

- Ag i t ado r magnético - Agua d e s t i l ada Ó Buffer - Barra magnética con conertura de t e f l ó n - Broches para d i á l i s i s Ó h i l o

- Embudo pequeño - Probe ta de 100 y 2,000 m l - Muestra a d i a l i z a r - Vaina de ace ta to de c e lu l osa - Vaso de p r e c i p i t ado de 3-4 1 - Re f r i g e r ado r Ó cuarto f r i o

Soluciones :

B u f f e r con el cual se desea d i a l i z a r

1.- Se s e l e cc i ona e l tamaño de poro de l a membrana.-/ de acuerdo a l peso molecular d e l ma t e r i a l que se va a d i a l i z a r y e l que se pretende e l iminar : p r c curando usar l a membrana con e l diámetro más pe- queño para incrementar l a s u p e r f i c i e de contacto en t r e l a muestra y l a so luc ión d i a l i z a n t e .

2.- Se prepara el Buf fe r o so luc ión con l a cual s e - pretende e s t ab l e c e r e l e q u i l i b r i o i ó n i c o de l a - muestra.

3.- Se determina e l volumen de l a muestra: midiéndo- l a en una probeta.

4.- De acuerdo a l volumen de l a muestra a d i a l i z a r - es l a l ong i tud de l a va ina de c e lu l osa ; é s t a lon g i t u d se e s t ab l e c e de acuerdo a l a capacidad de de l a membrana po r mm.

5.- Se procede a l a v a r l a membrana de ce lu losa : e l - proceso cons i s t e en e l im inar l a cub ie r ta de g l i - c é r i na que l a membrana t r a é como p ro t ecc i ón para e v i t a r que sea quebradiza. La g l i c é r i n a es e l i - minada mediante lavados contínuos con agua d e s t i l ada , dejámdola remojar toda l a noche Ó bien re-. mojándola con agua d e s t i l a d a c a l i en t e .

6.- En e l r e f r i g e r a d o r se co l oca el s i gu i en t e dispo- s i t i v o : sabre un a g i t ado r magnético se pone un - r e c i p i e n t e (p robe ta o vaso de p rec ip i t ado ) que - contenga una barra magnética con cobertura de te f l ó n . De acuerdo a l volumen de l a muestra a d i g l i z a r . se v i e r t e n dentro de l a probeta o vaso de p r e c i p i t ado 50-100 veces el volumen, pero ahora de l a so luc ión d i a l i z a n t e (que puede ser : agua.- Bu f f e r Ó cua lqú ie r o t r a so luc ión )

7.- La membrana se enjuaga perfectamente y se c i e r r a

I

i

. .

4

uno de sus e x t r e m o s con un b r o c h e p a r a d i á l i s i s ;

p o r el o t r o extremo se v i e r t e l a m u e s t r a con ayu - da de un embudo.

8.- E l o t r o e x t r e m o se c i e r r a de i g u a l forma y se - i n t r o d u c e l a b o l s a de d i á l i s i s en el B u f f e r Ó so - l u c i ó n d i a l i z a n t e ; d e s p u é s d e l o cua l s e somete

a a g i t a c i ó n m a g n é t i c a l e n t a p e r o c o n s t a n t e . 9.- Se h a c e n c a m b i o s de l a s o l u c i ó n d i a l i z a n t e m í n i -

mo c a d a o c h o h o r a s . S i e s p o s i b l e se hacen p r u e

b a s a l d i a l i z a d o que d e t e c t e l a p r e s e n c i a d e l ma t e r i a l d i f u n d i d o . L o s r e c a m b i o s s e e f e c t u a n - h a s t a que l a p r u e b a sea n e g a t i v a ; e s t o i m p l i c a - que ha habido un r e c a m b i o t o t a l de i o n e s y s e - c o n s i d e r a que l a d i á l i s i s ha s i d o c o n c l u i d a .

10.- Una v e z t e r m i n a d a l a d i á l i s i s , s i l o que i n t e r e - sa e s l a m u e s t r a c o n t e n i d a d e n t r o de l a v a i n a , -

' s e p r o c e d e a sacar e l material q u i t a n d o e l b r o - - the. En c a s o de que e l material c o n t e n g a p r e c i -

p i t a d o , p o r a g r e g a c i ó n se p r o c e d e a c e n t r i f u g a r p a r a e l i m i n a r l o coma sedimento. ( 4 7 )

- 4 5 - I

Q

I N M U N O D I F U S I O N

( Técnica 4 )

INTRODUCCION :

La t é cn i c a de d i f u s i ó n en g e l , invo lucra reacc iones de p r e c i p i t a c i ó n en t r e e l ant ígeno y e l ant jcuerpo en un - medio semi-só l ido ( g e l ) , para l o cual se emplea como sopor t e iuna so luc ión de agar o agarosa.

Ex i s t en algunos métodos de inmunodifusión, como los desar ro l l ados por: P r e e r y Ouchterlony; en donde el a n t í g g no y el ant icuerpo se depos i tan dentro de pequeños o r i f i - c i o s hechos en e l g e l . y e s t o s di funden e l uno hacia el - ot ro . Ot ro t i p o de métodos son l o s de: Oudín e inmunodifu - siÓn r a d i a l , en l o s cua les uno de l o s r e a c t i v o s (ant fgeno Ó ant icuerpo ) se incorpora directamente en e l g e l y e l - o t r o se icoloca en l o s o r i f i c o s hechos en l a s u p e r f i c i e d e l

g e l , é s t e Últ imo di funde a t r a v é s d e l g e l que cont iene el o t r o como r e a c t i v o inmóv i l .

E l o b j e t i v o de l o s métodos de: P r ee r , Oudín y Ouch - t e r l ony e s e l de r e a l i z a r una d i f u s i ón completa, l a cua l - en Óptimas concentrac iones de ant ígeno y ant icuerpo forman bandas v i s i b l e s de p r e c i p i t a c i ón . Estos métodos proporc io - nan r eso luc i ón e i d e n t i f i c a c i ó n de componentes de ’mezclas, por l o que son Ú t i l e s para l a evaluación de l a pureza de - ant ígenos o ant icuerpos. E l número de bandas formadas in - d i ca en número mínimo de s istemas antfgeno-ant icuerpo presentes.

Se ha encontrado que son dos l a s condic iones l a s r e s ponsables de que s e formen bandas mú l t i p l e s en un s o l o s í 2 tema: exceso de concentrac ión de ant ígeno y dos pesos mole -

- 4.6 - I

/ .

1'.

1 .-

I.' ,..

I,: I,:: I . . I . . I : : I 'i I,::

I ". 1 , . !

,.

,.

I " I . .

I : :

cu lares d e l ant ígeno.

Es importante hacer no tar que l a s bandas de p r e c i p i - t a c i ón son e l resu l tado de una r eacc i ón e s p e c í f i c a an t f g e - no-anticuerpo.

Esta t é cn i c a t i e n e un a l t o grado de s ens i b i l i d ad , y I

l a cant idad mínima que d e t e c t a son unos cuantos microgrg - mos de ant í geno y de ant icuerpo.

E l método desa r ro l l ado por Oudín. invo luc ra l a d i f u -

s ión un id i recc ionak de uno de l o s r eac t i vos . Se emplean tubos de 2-3 mm de diámetro i n t e rno y cont ienen una capa - de agar en l a cua l e l ant i suero e s dispersado uniformemen- t e y en l a s u p e r f i c i e super io r se co loca una s o l c i ón de - antígeno. E l antfgeno d i funde dentro d e l agar d e s a r r o l l a g do banda de p r e c i í t a c i ó n producto de una reacc ión de iden-

tidad, e l método se l lama inmunodifusión simple.

E l método de P r e e r es también unidimensional, pero - ambos ant ígeno y ant icuerpo difunden. Ant isuero no d i l u í - do se co loca en e l fondo de un tubo previamente r e v e s t i d o de agar, se co l oca una capa de agar sobre e l ant i suero , y l a so luc ión de ant ígeno se depos i ta en l a s u p e r f i c i e de l a capa de g e l . E l ant iegeno y e l anticuerpo migran formando bandas de p r e c i p i t a c i ó n en l a capa d e l g e l . Es te método - invo lucra dob le d i f u s i ón , y aunque ambos difunden l a r e a s ciÓn ocurre en una pa r t e donde ninguno estaba or ig inalmen- t e .

E l método de Ouchterlony cons i s t e en que e l ant fgeno y e l ant icuerpo estan presentes como so luc iones en c e l da s de agar separadas. Los r e a c t i v o s migran uno hac ia e l o t r o y se p r e c i p i t an en l a p a r t e media d e l s i t i o de ap l i cac i ón .

*. 4 7 -

c Una dob l e d i fus i ón es tá invo lucrada, pero l a d i fus i ón e s - b i dim en s i onal más no monodim enc i ona l . Mater ia l y equipo:

Balanza a n á l i t i c a Camara húmeda Cámara obscura Cortador de g e l Embudo de t a l l e Esopos Espátula

l a r g o

Frasco de p l á s t i c o de 100 m l Incubadora a 6OoC

Lámina de asbesto Matraz Erlenmeyer de 250 m l con tapón de rosca Mechero Bunsen Masita y n f v e l Pape l aluminio Pape l f i l t r o Whatban NO 1 P i p é t a s e ro l óg i ca de 5 m l P lacas de v i d r i o Probe tas de 50 y 100 m l R e l o j Ó cronómetro Soporte un iversa l con a n i l l o Termómetro Tubos c ap i l a r e s Vaso de p rec ip i t ado de 500 m l

React i vos :

- Acido a c é t i c o - Ac ido c l o r h í d r i c o - A lcoho l e t í l i c o abso luto

': - Agar n o b l e e s p e c i a l (DIFCO) - Azida d e s o d i o

- A n t í g e n o

- A n t i c u e r o e s p e c í f i c o c o n t r a e l a n t i g e n 0 - Azul b r i l l a n t e de Coomassie R-250 - H u f f e r : B a r b i t a l , V e r o n a l . de B o r a t o s Ó PES - Cloruro de s o d i o

I . Sol u c i ones :

I .

, .. ~

1 . - Agar: E l a g a r se usa a l 1 % (W/V) en a l g ú n B u f f e r A ) Se p e s a 1 g d e a g a r y 0.01 g de a z i d a de so - -

d i o y se d e p o s i t a n en e l fondo d e l m a t r a z Er - l e n m e y e r y se a g r e g a p o r Últ imo 100 m l de Bu-

f f e r . B) E l m a t r a z es i n t r o d u c i d o en un baño maria de

8 O - 9 O 0 C h a s t a l o g r a r su completa d i s o l u c i ó n ; - e s t o se l o g r a d e s p u é s de a l g u n o s minutos y - con a g i t a c i ó n manual, en e l c a s o de h a b e r péf

d i d a de volumen p o r e v a p o r a c i ó n se añade un - volumen e q u i v a l e n t e de B u f f e r .

( V e r p r e p a r a c i ó n en e l métg

3.- S o l u c i ó n d e s t e ñ i d o r a ( V e r método de Inmunelec F

4 . - S o l u c i ó n de l a v a d o : C o n s i s t e en una s o l u c i ó n is0 -

2.- S o l u c i ó n de t i n s i ó n . do de I n m u n o e l e c t r o f o r é s i s )

t r o f o r é s i s )

t ó n i c a de N a C l (0 .85% = 0.15 N)

Método:

1 . - S e l a v a n p e r e f e c t a m e n t e l a s p l a c a s de v i d r i o con j a b ó n y se e n j u a g a n con abundante agua común y - p o s t e r i o r m e n t e con agua d e s t i l a d a , se d e j a n se -

I , - k 9 - ~: i

2.-

3.-

- 4 . -

5.-

6.-

7.-

8.-

9.-

10.-

ca r a temperatura ambiente Ó b ien se meten en - una incubadora a 6OoC; después de sacarse se l i m

p ian con a l c oho l e t í l i c o abso luto para e v i t a r e l exceso de grasa sobre su supe r f i c i e . Se prepara e l medio de soporte ( aga r a i 1 % ) como

f u é d e s c r i t o anter iormente. Las p l acas de v i d r i o se colocan a l ineadas en-una

I mesi ta , l a cua l ha s ido n i v e l ada previamente. Con ayuda de un esopo se a p l i c a una precapa de - g e l . e s t o de hace con l a f i n a l i d a d de que l a pia. ca de g e l no se desprenda de l a p l aca de v i d r i o

Después de haberse secado l a precapa de g e l ( l o cual puede e f e c tuarse a temperatura ambiente Ó - b ién en una incubadore a 6OoC) , se añade a cada una de l a s p l acas so luc ión de agar a l 1% , e n un volumen adecuado para obtener p l a ca s con un espe - zar de 2 mm. Se dejan g e l i f i c a r l a s p l acas a temperatura ag - b i en t e . E l número de p l acas a preparar es cons i derando que en cada p laca es p o s i b l e a p l i c a r un número determinado de muestras. E l g e l es per fo rado con un cor tador , l a e l e cc i ón de é s t e depende d e l número de muestras y l a d is - p o n i b i l i d a d de ant ígeno y ant icuerpo. Los o r i f i c i o s de ap l i c a c i ón se hacen extrayéndo e l agar mediante bomba de v a c i o Ó con una ahuja h ipo d 6 rmi ca . Con ayuda de tubos c a p i l a r e s se a p l i c a cada una de l a s muestras y en e l cent ro generalmente se - a p l i c a e l ant isuero . Las p l acas son depositadas en una cámara húmeda y se mantienen en e l l a durante l a s 18 horas que

t a rda l a formación de l a s bandas de p r e c i p i t a -

en l o s procesos de lavado. /

-

,

i e-.

c ión.

después de l a s 18 horas de incubación, se dejan po r un per iódo mayor: que no debe exceder de 72 horas. S i después de e s t e per iódo aún no se ob-e servan, l a prueba se cons idera negat iva . En el caso de que l a s bandas ha l l an aparecido desde - l a s 12-18 horas se procede a secar y t e ñ i r de - acuerdo a l método d e s c r i t o en l a inmunoelectro fg r é s i s .

11.- S i no se l og ran observar bandas de p r e c i p i t a c i ó n

Evaluación : I

La eva luac ión se r e a l i z a mediante l a observación de: número de l í n e a s de p r e c i p i t a c i ón , e in tens idad de l a s mí2 < ,

mas.

Los ant i sueros obten idos po r ant ígenos inoculados

con adyuvante completo de Freud son mucho más intensas .

-

I / i

E

Uso y l im i t a c i one s :

Sus ap l i c a c i one s gene ra l e s son:

A) Determinar l a homogeneidad de los sístemas a n t í g e no-anticuerpo.

B ) Determinar el número mínimo de sístemas e x i s t e n - t e s .

C) Después de l a p u r i f i c a c i ó n de una mezcla a n t i g é n i ca.

Seguido de la p u r i f i c a c i ó n de c i e r t o s ant ígenos se - productos na tura l e s l a d i f u s i ón en g e l t i e n e l a desventa ja de que no l l e g a a de t ec ta r inpurezas. l a s cuales no son a0 t i g én i cas . Símilarmente, a s í l o s complejos ant ígeno-ant i -

.

cuerpo l o s cua l e s no forman p rec ip i t ado , se mantienen in- s i b l e s . La r e l a t i v a c o r t a d i s tanc ia en t r e l a s paredes no dá una c l a r a separac ión de todas l a s bandas de p r e c i p i t i n a Algunas emergen en una amplia zona. Incubaciones c o r t a s - no desa r ro l l an todas l a s bandas de p r e c i p i t a c i ó n , dpando una impresión f a l s a de homogeneidad. S i l a p laca de d i fu - s ión enge l e s t r a s n f e r i d a a cuarto f r i o después de 3 - 4 d l as a temperatura ambiente durante una semana más, pueden - observarse bandas ad i c i ona l e s . S i además se usan conce2 - t r a c i one s e l e vadas de ant ígeno o ant icuerpo l a area en t r e l a s dos paredes t i e n e exceso de ambos.

6

Es necesa r i o usar algunas d i lus i ones de ant ígeno y - se l e cc i onar e l que dá una c l a r a separación y mayor númeroiii de bandas para es tud ios pos t e r i o r es . ( 4 8 - 5 4 )

I - 52 -

INMUNOE~ECTROFORESIS e ( T h c n i c a 5 I

I N T R O D U C C I O N :

La inmunoe l e c t r o f é r i s i s e s una t é cn i c a para e l estu-

d i o de ant fgenos y ant icuerpop en l a que s e combinan dos - métodos: l a e l e c t r o f o r é s i s seguida de una inmunodifusión. Es l a combinación de ambos en base a dos dB sus prop iedg - des: l a hab i l i dad que t i e n e un.ant icuerpo de p r e c i p i t a r - con su ant ígeno e s p e c í f i c o (inmunodifusión). y l a mob i l i - -

( e i e c t r o f o r é s i s ) . dad c a r a c t e r í s t i c a d e l ant ígeno en un f l u j o e l é c t r i c o - I

I i

!

i

- Detec tar e i d e n t i f i c a r componentes i nd i v i dua l e s en ' I

La t é cn i c a ha s ido comúnmente usada para:

un sístema de componentes múl t ip l es .

. >

- Para determinar l a pureza de un s o l o componente en

- Para determinar l a e f i c a c i a de un procedimiento de f racc ionamiento , en l a separación de un mate r i a l - dado.

e l sístema.

- Para reconocer p r o t e í nas atóp icas .

El. agar que se recomienda para é s ta t é cn i ca es: bac- t o agar (DIFCO), agar nob le e spe c i a l (DIFCO) e t c ; e l uso - de agarosa en l u ga r d e l agar se recomienda s i en l a el- - t r o f o r é s i s l a e lectroendoósmosis ha s ido ev i tada. General mente se usa una concentración de agar d e l 1-2 % en un Bu- f f e r cuyo pH se encuentra ba jo e l rango de 6 a 9.

Se prepararn p lacas de g e l con un espezor de 2-3 m m . La muestra a ana l i z a r se co l oca en o r i f i c i o s de 2 mm de - diámetro hechos con un cor tador de g e l . Las p lacas ya con

- 53 -

4

l a muestra s e colocan en l a c e l da de e l e c t r o f o r é s i s y s e - es tab l e ce un g rad i en t e de 2-10 volts/cm de placa: aunque - usando e l l í m i t e super io r produce e l calentamiento que e s

un e f e c t o indeseab le y que puede ser e l iminado s i l a s ba - r r a s de sostén y e l Bu f f e r de cor r imiento han s ido almace- nadas en r e f r i g e r a c i ó n antes de s e r usadas Ó con ayuda de un baño a 4OC, e l a t o v o l t a j e no so l o producee fec tos indeseables , s ino también incrementa l a migración e l e c t r o f o r é - t i c a .

En l a micro técn ica , l a e l e c t r o f o r é s i s de una muestra de suero se separa adecuadamente en f r a c c i one s s i se rea- za en 45 minutos ba j o un po t enc i a l de 6 volts/cm.

La cant idad de muestra problema es de a l r r ededor de 0.001 m l (1.0 u i ) y e l r e a c t i v o usado como ant i suero e s - de 0.05 m l ( 50 u l ) .

Si se usa un Bu f f e r a l c a l i n o ; l a mayoría de l a s mol$ culas de l a s p r o t e í nas son'cargadas negativamente y su mo- b i l i d a d e s t a r á d i r i g i d a hacia e l ánodo. Algunas p ro t e ínas s i n embargo. migran a l cátodo como resu l tado de una eZec - trosndoósmosis, l a p r i n c i p a l causa de é s t e e f e c t o e s l a - carga nega t i v a en e l medio de sopor te y e l l í q u i d o presen- t e en e l g e l asume l a carga p o s i t i v a y se mueve hacia e l - cátodo.

-

Son muchos los f a c t o r e s de importancia que deben ser

- Tamaño y espezor d e l punto de o r i gen . - Dis tanc ia d e l punto de o r i g en y e l canal - R e i a c i ón ant ígeno- a n t i cuerpo - Pureza d e l agar - pH y sueraa i ó n i c a d e l Buffer de corr imiento

considerados cuando se usa ésta t é cn i ca :

1 - 5 4 - '

- Fuerza d e l f l u j o e l é c t r i c o - Temperatura - Tiempo de cor r imiento - Tiempo de formación de l a s bandas de i den t idad

e n t r e e l ant ígeno y ant icuerpo.

Cuando l a fue r za i ó n i c a e s ba ja , l a formación de cog 4

p l e j o s ant ígeno-ant icuerpo puede no o c u r r i r , Ó g l obu l inas i n so lub l e s en agua pueden p r e c i p i t a r dándo una banda de - p r e c i p i t a c i ó n no e spe c í f i c a . Los Bu f f e r s con pH que están

ba jo e l rango de 6.5 a 8.2 ocasiona l o s d i s tu rb i o s antes - mencionados, aunque alguna p r e c i p i t a c i ó n nb e s p e c í f i c a p u ~ de o c u r r i r a pH menores de 6.5

Una ve z obtenidas l a s bandas de p r e c i p i t a c i ón , é s tas pueden s e r t eñ i das con: amido negro Ó a z u l ' b r i l l a n t e de - Coomassie R-250 ; l a co l o rac i ón de l a s bandas o f r e c e l a s - s i gu i en t e s v en ta j as , hace v i s i b l e s l a s bandas de p r e c i p i t a - ciÓn y permi te l a conservación de l a s mismas por tiempo io de f in ido .

Mater ia l y equ ipo :

- Balanza a n á l i t i c a - Cámara paar e i e c t r o f o r é s i s - Cámara húmeda - Cámara obscura - Cortador de g e l - Embudo de t a l l e l a r g o

- Espátula - Fuente de poder: Transformador (O--i25 mAmp)

- Frascos de p l á s t i c o de 100 m l y de 1.0 1

- Esopos

Vo l t ímet ro (0-500 v o l t s )

i

- 5 5 -

$-.

i

Incubadora a 60'G

Lámina de asbesto Katraz Erlenmeyer de 250 m l con tapón de rosca Mechero Bunsen Masita y n i v e l Pape l a luminio Pape l f i l t r o Wattman No 1 P í p e t a Eppendorf de 10 y 50 u 1 P íp e t a c e r o l ó g i c a de 5 m l y 10 m l P l a ca s de v i d r i o Probeta de 100, 500 y 1000 a l Puntas para p í p e t a Eppendorf R e l o j Ó cronómetro Soporte un i ve r sa l con a n i l l o Termómetro Vaso de p r e c i p i t ado de 500 m l

Reactivos:

, ./.

, .I

, I.

,..

,..

- Acido a c é t i c o - Acido c l o r h í d r i c o - Alcoho l e t í l i c o abso lu to - Agarosa t i p o I1 (SIGMA) - Agua de ionizada - Azida de sodio - A ' z u l b r i l l a n t e de Goomassie R-250 (SIGMA) - Cloruro de sod io - Antigen0 - Anticuerpo e s p e c í f i c o para e l ant igen0 - Buffer de cor r imiento ( Barb i t a l , Veronal )

Soiuc ioncs :

- Agarosa a l 1% en e l Buffer de corr imiento

,

- 56 - I

Q

- Soluc ión de t i n s i ón : Una so luc i ón de t i n s i ó n conveniente comtiene amido negro Ó a zu l b r i l l a n t e de Coomassie R-250

A ) Se pesan0.2 g de alguno de 19s co l o ran tes antes mencionados y se dep i s i t an dentro de un matraz vo lumétr i co de 100 m l .

E) Se añade a l matraz L5 m l de e t ano l a l ,96% C) Se garegan 45 m l de agua de ionizada D)’ Se ad is ionan 10 m l de ác ido a c é t i c o g l a c i a l E) E l c o l o r an t e se d i sue l v e en l a mezcla ác ido - e ta

no1 a temparatura ambiente: l a so luc ión se d e j a reposar durante un d ía . después de l o cual se - f i l t r a y almacena en un r e c i p i e n t e de p l á s t i c o .

L a t i n s i ó n de inmunoprecipitados con a zu l b r i l l a n - t e es c e r ca de t r e s veces más s ens i b l e que l a t i n - siÓn con amido negro. Esto es una ven ta j a , como - l a s e n s i b i l i d a d se incrementa, e s t o t r a é como con- secuencia un decremento en e l consumo de ant fgeno.

A) 450 m l de e tano l t 100 m l de ác ido a c é t i c o t - - Soluc ión desteñidora :

450 m l de agua d e s t i l ada son mezclados en una - probeta .

B) La so luc ión es t r ans f e r i da a un f r a s c o de p lás -

La so luc ión es usada para remover e l exceso de so-

l u c i ón de t i n s i ó n d e l g e l . Después de s e r usada, es ta so luc ión puede ser r e g 2 nerada paspandola a t r a v é s de uli f i l t r o de carbón.

Esta so luc i ón es ta cons t i tu ida p o r NaCl 0.15 M, y su func ión es l a de e l iminar e l exceso de p r o t e í - nas que no p r e c i p i t a r on en e l g e l .

Después d e l lavado con so luc ión sa l ina , se lavan - con agua d e s t i l a d a para remover e l exceso de NaC1.

t i c o para su almacenamiento.

- Soluc ión de lavado:

I

Método: . 1 .-

2.-

3.-

L.-

5.-

6.-

7.- 8.-

9.-

10.-

11.-

Las p l acas de v i d r i o se l a van con so luc ión de - ex t rán a l 5% y abundante agua d e s t i l ada , se sg - can a temperatura ambiente Ó a 60 C ; una vez se- cas se l impian con a l c o h o l abso luto para e i i m i - nar l a grasa que pudiera e s t a r impregnada. Se prepara e i soporte ( g e l ) con agarosa t i p o 11 a l 1 % (W/V) en algún B u f f e r . Las p l acas de v i d r i o s e colocan sobre. una mesita previamente n ive lada . Se a p l i c a una precapa de g e l a l a s p lacas de v i - d r i o con ayuda de un esopo, e s ta precapa s e d e j a secar a temparatura ambiente. Seca l a precapa de g e l , s e a p l i c a g e l con una p i pe ta s e r o l ó g i c a en s u f i c i e n t e cant idad para o b t e ner una p laca con un espezor de 2 mm Se dejan g e l i f i c a r l a s p l acas a temperatura a g - b iente . Con e l cortador de g e l se per fo ran l a s placas. Se ex t ra6 el g e l en l o s puntos de ap l i c a c i ón ,- mediante una ahuja hipodérmica Ó bomba de vac io . Las muestras son pa l i cadas en l o s o r i f i c i o s en - a l í c u o t a s de 10 u l . para e l l o se hace uso de l a p f p e t a Eppendorf. Como c on t r o l , en una de l a s p lacas se ap l i c a una muestra de suero normal humano y o t r a a l í cuo t a -

(W/V) en e l Buf f e r de corr imiento . E l azul de - bromofenol t i e n e l a capacidad de en lazarse con - l a albúmina que e s l a p ro t e ína s é r i c a con mayor mob i l idad e l e c t r o f o r é t i c a , por l o t an to será e l i nd i cador d e l tiempo de corr imiento . E l Bu f f e r de cor r imiento se v i e r t e en cant idades

O

I

de so luc ión de a zu l de bromofenol a l 0.001% -

- 5 8 -

v..

1 !

i I *- . !

!

! 1

*, i g u a l e s en cada ce lda de l a cámara de e l c t r o f o r i

s i s 12.- La ( 5 ) p l a ca ( s ) se co loca (n ) sobre las barras de

13.- La(É) p l aca ( s ) y el B u f f e r de corr imiento se une

14.- Se es tab l e ce un g rad i en t e e l é c t r i c o de 3-5 v o l t s

sopor te de l a ce lda de e l e c t r o f o r é s i s .

por medio de puentes de papel f i l t r o ("mechas")

j :

por cada cent ímetro de l a p laca I 15.- Cuando e l co l o ran te h a l l a migrado hasta e l ext-

mo d e l anódo se suspende e l g rad i en t e e l é c t r i c o . 16.- Se ex t ra6 e l canal de i a ( s ) p laca (s ) con una -

ahuja hipodpermica Ó bomba de vac io . 17.- Se +p l i can aproximadamente 50 u 1 de ant i sue ro en

el canal Para e v i t a r l o s e f e c t o s de prozona y postzona - que son causados por exceso de ant fgeno y a n t i - cuerpo, es necesa r i o hacer l a determinación de - l a r e l a c i ón Óptima ant ígeno-ant icuerpo. Esta - t é cn i c a es bastante Ú t i l sobre todo cuando uno - l o s r e a c t i v o s (ant í geno o ant icuerpo) son i i m & - tantes .

18.- Las p lacas se co locan en una cámara húmeda a t e g peratura ambiente durante 18-36 horas para que - se d e sa r r o l l en l a s bandas de p rec ip i t ac i ón .

c i ón l a s i gu i en t e etapa e s i a t ins i ón . La t i n s i ó n se e f e c túa en v a r i a s etaoas:

A ) RemosiÓn de p ro t e ínas no p rec ip i t adas después de l a inmunoelectrof o r é s i s .

B) Lavado d e l g e l C ) Secado d e l g e l D ) TinsiÓn E ) Secado y f i j a c i ó n de l a p laca A ) Es d i f í c i l e d s c r i b i r un procedimiento gene ra l

19.- Una v e z desa r ro l l adas l a s bandas de p r e c i p i t a -

- 59 -

, ,..

su f i c i en t e para remover l a s p ro t e ínas no p r z c i p i t adas en e l g e l después de l a e l e c t r o f o -

r é s i s , pues depende d e l sistema empleado. En algunos casos e l pape l f i l t r o sobre

e l g e l después de l a e l e c t r o f o r é s i s y e l s e -

cado d e l g e l puede ser s u f i c i e n t e , mientras que en o t ros casos s e - r e qu i e r e de continuas pres iones y lavados para e l iminar esas pro- h a s no p rec ip i t adas .

f

La remosión de esas. p ro t e ínas d e l g e l

- E l uso de pequeñas cant idades de an- t igeno-ant icuerpo en e l g e l como sea pos ib l e .

es f a c i l i t a d a por:

- Usando ant i suero de animales en ayu- no, pues l a s l i p o p r o t e í n a s t ienden a en lazarse con e l g e l .

- Usando un pu r i f i c ado de inmunoglobu- l i n a s en luga r d e l ant i suero t o t a l .

- Usando una capa de g e l de 1 mm de es pezor en l uga r de una de 2 mm.

Hay dos procedimientos gene ra l e s l o s - cua les pueden s e r usados so los o con combing c iones.

a ) Presionando e l g e l y b) Lavado de g e l Cada combinación se t r a b a j a para con-

c iones de cada caso i nd i v i dua l . Se recomieo da que e l gel se pres ione s i es necesar io VE

r i a s veces y f ina lmente l a v a r l a s .

a ) P res ión d e l g e l de acuerdo a Laure l1 ¿l ~ Después de l a e l c t r o f o r é s i s el gel

se cubre con una capa de papel f i l -

t r o ( s í n burbujas) y sobre de é s t e

e-.

se co l oca una capa de papel absor - vente de 2-3 cm de espezor.

ii) Se a p l i c a una pres ión de 10g/cm , - que puede ser l og rada con una p l a ca de v i d r i o Ó con l i b r o s .

iii) Después de 10-15 minutos de prse ión e l pape l secante se remueve: de es- t a forma l a capa de g e l se reduce a un simple f i l m y l a s i gu i en t e etapa puede ser :

2

1.- E l procedimiento de p res i ón puede ser r epe t i do , cambian- do desde e l pape l f i l t r o .

2.-.Se q u i t a e l pape l f i l t r o y - e l g e l se l a v a son so luc ión s a l i n a (como se descr ibe pos t e r io rmente ) .

3.- E l g e l cub ie r to con e l papel f i l t r o se seca con a i r e ca - l i e n t e ó en un termostáto a 6OoC.

Las burbujas en t r e e l papel f i l t r o y e l g e l son indeseables , por que - durante l a pres ión o secado d e l g e l puede ocas ionar ruptura d e l mismo,- pueden s e r e l iminadas con agua des-

t i l a d a Ó per fo rando las con una ahu- j a hipodérmica. E l g e l pres ionsdo hasta un film fa-

c i l i t a e l procedimiento de lavado,- p u e s decrece l a d i s t anc i a de d i f g - s ión en e l g e l , además de que hace que e l g e l se adhiera más firmemen- t e a l a p l a ca de v i d r i o . Cuando e l

I - 61 -

I "

p a p e l f i l t r o debe s e r removido d e l

f i l m d e l g e l s e n e c e s i t a humedecer-

l o con agua d e s t i l a d a y se despren-

dera con f a c i l i d a d .

B ) L a s p l a c a s d e v i d r i o con e l g e l o r i g i n a l Ó - p r e s i o n a d o se c o l o c a n en s o l u c i ó n s a l i n a Ó - agua d e s t i l a d a .

I i) E l g e l e s l avado con N a C l 0 . 1 5 M -

tres v e c e s p o r p e r i ó d o s de pol' lo - menos 1 5 m i n u t o s , .aunque es p r e f e r k

b l e h a c e r uso de p e r i ó d o s mas lag - g o s ; t a l e s como d u r a n t e t o d a l a no-

c h e .

ii) Se lava e l g e l p o r l o menos una vez con agua d e s t i l a d a , e s t o se h a c e = con l a f i n a l i d a d de e l i m i n a r e l ex- c e s o de NaCl y evi tar que l a s s a l e s c r i s t a l i c e n s o b r e e l g e l .

iii) Nuevamente se p r e s i o n a e l g e l . p a r a o b t e n e r un f i l m , pues con los l a v a -

dos e l g e l se h i d r a t a .

¿u) E l p a p e l s e c a n t e se e l i m i n a y l a - p l a c a de g e l con e l p a p e l f i l t r o se

seca con a i r e c a l i e n t e , t e r m o s t á t o

Ó a t e m p e r a t u r a embiente.

C ) E l s e c a d o d e l g e l puede h a c e r s e con a i r e ca- l i e n t e Ó b i e n con un s e c a d o r manual, Ó en un t e r m o s t á t o a 6OoC.

Un g e l con un e s p e z o r de 1 - 1 . 5 m m des-

pués de h a b e r s i d o pres ionado se c u b r e con - un p a p e l f i l t r o p r a i n c r e m e n t a r l a s u p e r f i - - tie d e e v a p o r a c i ó n y p r e v e n i r el e x c e s o de secado .

Mucho Ó poco c a l o r puede causar rompi-

- 62 -

, I.

i

'2 1

miento d e l g e l , se se seca con a i r e c a l i e n t e puede om i t i r s e e l pape l f i l t r o .

E l pape l f i l t r o una vez secada l a p e l f cu la d e l g e l se qu i t a de l a mfsma. humede - c i éndo l o con agua d e s t i l ada .

E l secado de l o s g e l e s puede e fectuar- se más rápidamente s i han s i do presionados - antes.

D) E l g e l debe s e r una p e l í c u l a f i n a antes de - proceder a t e ñ i r de acuerdo a l s i gu i en t e p rg cedimiento:

¿ I En r e c i p i e n t e s de p l á s t i c o se co loca l a so luc ión de t ins i ón .

¿ ¿ I Se introducen l a s p l c a s de 10-15 m i

¿¿¿I La so lcuión desteñidora se v i e r t e - en t r e s r e c i p i e n t e s de p l á s t i c o . Después de ser t eñ idas l a s p lacas , - se pasan a l a so luc ión desteñidora por per iódos de 10-15 minutos. La

Última so luc ión deberá contener g l&

cer ina ai 3% para p r o t e j e r e i g e l . termostáto a

6Ooc Ó b ien a temperatura ambiente. La f i j a ciÓn cons i s t e en l a r o tu lac i ón de l a s p lacas para su f á c i l i d e n t i f i c a c i ó n . 48~53-55

- -

- nutos.

E) E l secado puede e f e c tuarse en

- 6 3 - ,

Q

S E P A R A C I O N DE I N M U N O G L O B U L I N A S P O R C R O M A T O G R A F I A E N COLUMNA

í Técnica 6 I


La cromatogra f ía en columna. se emplea príncipaimen-

t e para intercambio i ó n i c o y f i l t r a d o molecular . Las t éc - n i cas cromatográ f icas en e l f racc ionamiento de pro te ínas - ha cont r ibu ido enormemente en l o s avances l ogrados en Inmg no l og í a ; en- donde se emplea fundamentalmente para e l a i s l g miento y p u r i f i c a c i ó n de ant ígenos y ant icuerpos.

I

/

La cromatogra f fa de intercambio i ó n i c o fué i n t r oduc i da por Pe te rson , Sober y colaboradores en 1956 y l a f i l t r a - ciÓn en gel l a in t rodu jo Porath y F l od in en 1959. f u é e i primero en a p l i c a r l a f i l t r a c i ó n en g e l para sepa - r a r l o s componentes p r o t e í c o s d e l suero.

F l od in

Estas t é cn i cas junto con o t r a s como: e l e c t r o f o r é s i s e l e c t r oen foque y fraccionamiento con s a l e s neutras sun bá- sicamente l o s métodos de separación de l a s inmunoglobuli - - nas.

La cromatogra f ía de in tercambio i ó n i c o separa me2 - c l a s de p r o t e í nas t a l e a como l a s s é r i c a s , tomando como ven - t a j a l a d i f e r e n c i a de sus cragas netas.

E l s ístema de intercambio i ó n i c o cons i s t e en una ma- t r i z i n so lub l e (adsorvente ) que generalmente se empaca d- t r o de una columna, y de una f a s e so lub l e (Bu f f e r ) que con t i e n e iones . BI adsorvente y l a s p ro t e ínas so lubles deben t ene r cargas opuestas, a s í l a s p ro t e ínas quedan f i j a s a l - adsorvente mediante f u e r z a s e l e c t r o s t á t i c a s . Las p r o t e í - - nas son desplazadas con mayor o menor d i f i c u l t a d de manera

-

- 6 4 -

!

*- .

.p

secuencia3 d e l adsorvente por losmiones d e l Bu f f e r e luente La separación se e fec túa po r l a d i f e r e n c i a de carga e l é c - t r i c a de l a s macromoléculas que serán separadas y se l o g r a po r cambio de Bu f f e r ; e s t o es , por incremento de l a fuerza i ó n i c a (contenido de s a l e s ) y/o po r cambio de pH (concen - t r ac i ón de protones ) hasta el punto i s o e l é c t r i c o de l a p r o t e ína .

I

La d i s t r i buc i ón de $a p ro t e í na en e l eluado de l a - cromatogra f ía e s t á determinada en gtan parte : por el mís- mo f a c t o r que 'determina l a mov i l i dad e l e c t r o f o r é t i c a " l a - densidad u,e carga neta').

Tanto el tamaño como l a conformación de l a prote ína. tambien ayuda a determinar en nÚmeromde enlaces que se es - tab lecen en t r e l a p ro t e fna y el adsorvente.

En l a cromatogra f fa de in tercambio iÓn i -0 a s í como - el de l a f i l t r a c i ó n en gel se usan matr ices: l a s cuales se encuentran empacadas dentro de un soporte, l a s columnas. - Estas pueden ser de p l á s t i c o 6 de v i d r i o y s e encuentran - d ispon ib les comercialmente. Estan p r o v i s t a s de tapas remo v i b l e s y con p i e z a s que permiten l a entrada y s a l i da de - f l u i d o a t r a v é s de pequeños o r i f i c i o s l o ca l i z ados en el - cent ro de l a tapa super io r e i n f e r i o r .

Las columnas de v i d r i o po r l o genera l t i enen un f i l - t r o en l a tapa i n f e r i o r ; y é s t e s e encuentra sobre de una malla. E l f i l t r o t i e n e como f i n a l i d a d el de e v i t a r l a sa- l i d a de l a matr i z , en t an to l a mal la prev i ene l a obs t ruc - ciÓn en e l o r i f i c i o de s a l i da . En caso que l a columna ca- r e z ca de e s t os aditamentos, pueden s e r subst i tu idos por p= p e l f i l t r o con el mísmo diámetro i n t e rno de l a columna y - lana de v i d r i o respect ivamente.

I

e-.

.ai

Generalmente l a s columnas t i enen un forr.do plano, - d e l cual se proyec ta un tubo de s a l i d a exáctamente en e l - cent ro y en algunos casos también e s t a p r o v i s t a se una v- vu la que s i e r v e para r e gu l a r el f l u j o de sa l ida .

La p a r t e super io r puede ser cub ie r ta por una tapa - nimple Ó b ien con un enchufe t i p o conexión; a l a tapa tam-

bién se l e puede conectar un r e s e r v o r i o mediante el uso de un tubo de p o l i e t i l e n o de diámetro pequeño y que co inc ida con e l diámetro de l o s o r i f i c i o s de s a l i da y entrada d e l - r e s e r v o r i o y columna respect ivamente.

Es importante e l e g i r e l tamaño de l a columna, considerando l a r e l a c i ó n al tura/diámetro d e l volumen de l a ma - tr fz , e s t a r e l a c i ó n debe s e r como mínimo de 1 O : l a 20:l

Otra cons iderac ión importante para s e l e cc i onar y u- sar l a cromatogra f fa en columna es e l v a l o r d e l voluman - vac i o (que es e l volumen de eluado contenido desde el f on - do d e l g e l Ó r e s i na a l s i t i o de entrada d e l e luente , c ons l derando l a s conexiones) , este debe s e r adecuado d e v t a l manera que reduzca l a zona de remezclado y por l o tanto e l - tiempo de e lus ión .

Las mat r i c es cpmúnmente usadas en t é cn i c a s de i n t e r - cambio i ó n i c o , están cons t i tu idas de adsorventes t a l e s como: f i b r a s de c e lu l osa , g e l e s de dextrán (Sephadex) o b t e n i

dos a p a r t i r de dextran0 a l c a i i n o y ep i c l o rh id r ina , g e l e s d e agarosa (Sepharosa y Bici-gel) que es un po l i s a cá r i do li

n e l a l de n-ga lactosa y de l a 3,6-anhidro D-galactosa: to - don e l l o s pueden s e r intercambiadores de aniónes y c a t i ó - nes.

-

Los intercambiadores de i ónes son d i spon ib l e s como -

*- . I". l . 8 . .

I:: , I '-

I .,-

f

intercambiadores de ca t i ónes con grupos func ionales ; d é b i l - mente ác idos ( c a rbox ime t í l , CM) Ó fuertemente ác idos ( su l - f op r op i l , SP), e intercambiadores an ión icos con grupos dé- bi lmente bás i cos ( d i e t i l - a m i n o - e t i l , DEAE) Ó fuertemente - bás icos ( d i e t í l - 2 - h i r o x i p r o p í l , QEA).

E l grupo DEAE se usa para l a adsorción de mo-léculas con carga nega t i va , y e l CM para e l f raccionamiento he SUS t anc ias con carga p o s i t i v a .

En l a f i l t r a c i ó n en g e l se emplean comúnmente como - matr i z i n s o l u b l e g e l i f i c a d a , l a agarosa (const i tuFente no

i ó n i c o d e l agar ) , enr re jado de moléculas de dextrán (Sephg dex) y g e l e s de p o l i a r í l a m i d a (copol ímero de acr í l amida y met i l én-b isacr i l amida ) como l o e s (R ioge l -P )

LOS g e i a s permiten que l a s moléculas penetren a l o s gránulos de l a matr i z , a s í se incrementa su capacidad. - Los adsorventes usados para l a f i l t r a c i ó n en g e l deben cu- b r i r l o s s i gu i en t e s r e qu i s í t o s : tamaño cor resc to de poro,- Ésto i nd i c a que l a s p r o t e í nas deberan ser capaces de d i f u g dirse 'dentro d e l g e l para que se r e a i i c e e l tamizado mole- cu lar ; ser i nhe r t e , cua lqu ie r a f i n i dad o grupos cargados - d e l g e l para con e l mate r i a l a separar, i n t e r f e r i r á en l a separación; e l tamaño d e l l echo , e l g e l deberá e s t a r f i na - mente d i sperso para obtener d i f u s i ón rápida y una sepa- - c ión e f e c t i v a .

E l grade de penet rac ión depende de: e l enrre jado d e l g e l , pH, fue r za i ó n i c a y d e l tamaño de l a s macromoléculas a separar.

La v e l o c idad con l a que una molécula desciende por una columna empacada, depende d e l número de microes fe ras -

I - 67 -

16 . e x i s t e n t e s en l a columna. Ya que l a s moléculas d e l so lu to

mantienen un e q u i l i b f i o de concentrac ión en t r e l a f a s e d e l p e l y l a f a s e l í q u i d a , l a muestra desciende uniformemente

por l a columna.

Las p r o t e í nas grandes, por encima d e l l í m i t e de ex - c lus ión , no entran en e l i n t e r i o r de l a s microes fé ras d e l g e l y avanzan en e l f r e n t e d e l so lu to ; l a s p ro t e ínas pequg ñas s i penetran en l q s microes f é ras por l o que t i enen que a t ravesa r e s t e espac io y e l volumen que rodea a l a s micro- e s f é ras .

I

/

E l peso molécular no e s e l Único f a c t o r que r i g e Is entrada de l a s moléculas en e l g e l ; son importantes o t r o s f a c t o r e s : temperatura ambiental, grádo de h i dratacióri.

Las matr i ces de g e l son bas tante h i d r o f í l i c a s y su - volumen e s t á s u j e t o a compresión y expansión; dependiendo de l a f u e r z a i ó n i c a y e l pH d e l Bu f f e r e luente .

En tan to , en l o s adsorventes para l a cromatogra f ía - de intercambio i ó n i c o t i enen l a mayor pa r t e de sus grupos func iona les en l a supe r f i c i e . e levando su capacidad de adsorc ión de l a s p ro t e ínas y p o r ello grandes cant idades de suero pueden s e r separadas rápidamente.

E l núraero de grupos func i ona l e s l f g a d o s a l a matr fz e s expresado en mMoles de grupo func i ona l por gramo de ma- t r i z (mEquivalente/g) y e s t o determina su capacidad como - intercambiador i ó n i c o .

Es deseab le una ba ja densidad de grupos cargados - (1.0 mEquivalente/g) po r que contr ibuye a l a f á c i l e lus i ón

y disminuye l a adsorc ión de e l e c t r o l i t o s pequeños.

- 6 8 -

.B

La capacidad de un intercambidor i ó n i c o , es m6xima.a

un v a l o r de pH donde todos l o s grupos están ioniaados.

Considerando que l a s p ro t e ínas son an f o t é r i c a s se se lecciGna e l pH, y dependiendo de e s t o l a s pro te ínas pueden e x i s t i r como moléculas cargadas p o s i t i v a Ó negativamente.

I Los g e l e s de agarosa d i f i e r a n de los de Sephadex en que e l gel adquiere r f g u i d e z aparente, por l a formación de una doble h i l i c e en t r e l a s cadenas de po l i sacá r idos adya - centes, y e s t a s se encuentran en mayor cantidad que en sus cadenas f l e x i b l e s .

Se dispone de g e l e s de agarosa para l a separación de - mscromoléculas con PM menores de 100.000 y super iores a

150 mi l lones . E l tamaño de poro de l a agarosa se ve poco a f ec tado cuando se cambia de moléculas de agua a l a de o t r o s so l ventes .

-

Tanto e l Sephadex como l o s g e l e s de po l i a c r í l amida , - los hay en tamaño de poro para l a separación de moléculas de PM de algunos c i en t o s a 200,000

Las moléculas más grandes que e l tamaño d e l poro d e l - g e l son exc lu fdas en e l "volumen vac io " , y l a s pequeñas

que e l poro d e l g e l . penetran a é s t e en va r i o s grados de pendiéndo de su tamaño y forma.

- _ Para una buena r eso luc i ón de una meada de p ro t e ínas

por cromatogra f ía en columna, é s t a no debe sobrecargarse;- a s í por ejemplo: para l a DEAE-Celolusa secrecomienda no I I -

usar más de 30-50 mg de p ro t e ína po r g de DEAE-Celulosa.

Cuando La f i l t r a c i ó n en. g e l e s usada, e l volumen de

- 69 -

l a muestra e s más importante que l a concentración: y é s t a

no debe de exceder d e l 4% d e l t o t a l de volumen de l a ma - - t r í z empacada. S ín embargo, l a concentración ser6 impor - t an t e conforma l a v i s cos idad de l a milestra s e incremente. Las muestras bastante v i s cosas se separan mal por l a f i l - tracuón en g e l . en g e l , l a v i s cos idad de l a muestra no debe s e r mayor a l - doble d e l v a l o r de l $ v i scos idad d e l Bu f f e r e luente .

Para poder usar l a t é cn i ca de f i l t r a c i ó n

E l volumen de empaque de l a matr í z ( l e cho ) es e l volumen t o t a l de l a mat r i z hidratada en algún Bu f f e r . E l vo - lumen va c i o e s e l ,volumen d e l Bu f f e r , e l cual ha s i d o completamente e l u i do de l a columna donde aparece l a promer - f r a c c i ó n d e l eluado que contenga l a muestra.

E l volumen va c i o en una columna de c e lu l osa e s aproximadamente e l LO% d e l volumen de l a mat r í z y se puede determinar mediante e l paso de mate r i a l que se e luye ba j o - l a s mismas condic ionas de'pH y fue r za i ó n i c a con l a s cua - - l e s se va a t r aba ja r .

Se manera s i m i l a r en l a f i l t r a c i ó n en g e l ; e l vais-- men va c i o de una columna puede determinarse por l a ad i s i ón de una muestra de PM e l evado y se e luye completamente d e l g e l , con e s t a f i n a l i d a d puede emplearse Azul Dextrán 2x10 6

(Pharmacia F i n e Chemical, lnc . , P iscataway N.3.) en una so luc i ón a l 1 % en algún Bu f f e r .

-

Antes de empacar l a matr i z (adsorvente ) en l a columna: algunas de e l l a s requieren algún t ratamiento p rev i o .dc pendiendo de sus c a r a c t e r í s t i c a s pa r t í cu ia r es .

en todas e l l a s l a s pa r t í cu l a s f i n a s deben s e r removL das para obtener un smpacadu homogéneo y po r l o t an to un 1

--70 -

e-.

i’

buen f l u j o , en p r e s e n c i a d e &as mismas en a l g u n o s c a s o s - c a u s a l a f o r m a c i ó n de grumos que t r a é n como s o n s e c u e n c i a

l a o c l u s i ó n d e b u r b u j a s 6 b i e n un empacado b a s t a n t e ce - r r a d o p o r I C que e l f l u j o desminuye e i n c l u s i v e l l e g a a - d e s a p a r e c e r .

DEAE- C e l u l o sa : L a s p r e p a r a c i o n e s c o m e r c i a l e s de e s t e a d s o r v e n t e -

no son p r o d u c t o s u n i f o r m e s . Y su d e f i c i e n c i a más común es su b a j a c a p a c i d a d e n l a z a n t e de p r o t e í n a s ; p a r a c o r r e -

g i r este < e f e c t o , puede u s a r s e en mayor c a n t i d a d Ó b i e n p r o b a r o t r a p r e p a r a c i ó n d e DEAE-Celulosa,

L a DEAE-Celulosa se h i d r a t a h a c i é n d o una s u s p e n s i ó n (W/V) en yna r e l a c i ó n V : V 1:50-100 en N a O H 0 . 5 N d u r a n t e

1 8 - 2 4 h o r a s . Después de e s t o se e l i m i n a e l N a O H , filt,ráo- d o l a con ayuda de un embudo Buchner . E l f i l t r a d o se resus pende en agua d e i o n i z a d a en l a mísma r e l a c i ó n y se p r o c e d e a e l i m i n a r p a r t í c u l a s f i n a s como s e d e s c r i b i r á p o s t e r i o r - mente. L a h i d r a t a c i ó n es recomendable h a c e r l a a L O C . como medida de s e g u r i d a d p a r a e v i t a r l a c o n t a m i n a c i ó n m i c r o b i a - na .

R e a l m e n t e , l a p r e p a r a c i ó n de l a DEAE-Celulosa c o n s i s - t e en l a h i d r a t a c i ó n y e l i m i n a c i ó n de p a r t í c u l a s f i n a s .

CM-Celulosa: Se p r e p a r a de l a misma forma que l a DEAE-Celulosa, -

con l a v a r i a n t e de q u e l a s o l u c i ó n h i d r a t a n t e e s una mez - cia de N a O H 0 .5 M y N a C l 0 . 5 M

-

Sephadex: Comerc ia lmente se d i s p o n e de los s i g u i e n t e s g r a d o s :

s u p e r f i n o , mzdio y g r u e s o ; degendiéndo d e l tamaño de l a -

I - 7 1 , -

p a r t í c u l a . P a r a una buena r e s o l u c i ó n se recomienaa usar: e l grado s u p e r f i n o , e l medio y g r u e s o son recomendables - p a r a p r u e b a s p r e l i m i n a r e s donde l a v e l o c i d a d d e l f l u j o e s más i m p o r t a n t e que l a r e s o l u c i ó n . Otra a p l i c a c i ó n muy di-

f u n d i d a p a r a e l g r a d o g r u e s o es l a d e s a l a c i ó n de l a s mues t r a s .

I L o s g e l e s d e Sephadex son muy h i d r o f í l i c o s y en su

mayor ia se h i d r a t a n comple tamente ; e l t iempo qbe r e q u i g - r e n p a r a e l l o , v a r í a en r e l a c i ó n a . l a porosida 'd d e l g e l .

A t e m p e r a t u r a a m b i e n t e el. t i empo de h i d r a t a c i ó n pa-

ra G-25 y G-50 e s de 2 - 3 h o r a s ; p a r a 0-75 24 h o r a s ; en - t a n t o p a r a G - 7 0 0 y G-200 su t i empo puede ser d i s m h u i d o s i se r e a l i z a en un baño a t e m p e r a t u r a de 60-80°C a s o l a m e n t e

5 h o r a s .

Para l a hidrataci 'on de Sephadex , e l g e l s e añade con a g i t s c i f m l e n t a

con 10 v e c e s e l volumen d e l g e l h i d r a t a d o ( p a r a ca lcu lar - e s t e v a l o r e s n e c e s a r i o o b t e n e r e l volumen que dá 1 g d e l

g e l y e s t o v i e n e e s p e c i f i c a d o en e l r e a c t i v o ) ; l a a g i t g ciÓn f a c i l i t a l a h i d r a t a c i ó n de l a s moléculas d e l g e l .

y a un volumen de agua d e i o n i z a d a o B u f f e r

-

Agarosa :

E s t o s g e l e s son b a s t a n t e . h i d r o f í l i c o s p o r l o que su

t iempo de h i d r a t a c i ó n e s c o r t o , de 1-2 h o r a s . C o m e r c i a l - mente se d i s p o n e de e l l o s como S e p h a r o s a (Pharmacia F i n e - C h e m i c a l , I n c . P i w a t a w a y . , N.J.) Ó como B i o - G e l A ( B i o - - Rad Laborator&&*,. Richmond C . A ) S e d i s p o n e también de - sus d e r i v a d o s DXAE y CM como i n t e r c a m b i a d o r e s i ó n i c o s p a r a

l a c r o m a t o g r a f í a de a f i n i d a d .

._ .

Geles de i n t e r c a m b i o i ó n i c o :

- 72 -

I. 1

*' .

e Los g e l e s de intercambio i ó n i c o , como e l Sephadex -

pueden d e j a r s e h id ra ta r . en exceso de Bu f f e r , de donde caE tan l o s i óne s que serán intercambiables .

La DEAE y QAE-Sephaclex e x i s t en en forma de c loruros . en t an to que e l CM y SP-Sephadex como s a l e s sódicas. Por e s ta razón l a h id ra tac i ón e s p r e f e r i b l e hacer la en una so-

l uc i ón de NaCl 0.5 M ; aunque también puede r e a l i z a r s e en - sq luc iones que carezcan de e s t o s i ónes , en e s t e caso l a so l uc i ón deberá s e r concentrada de e s t o s nuevos i ones . E l - tiempo de h idratac ión 'es bastante c o r t o en r e l a c i ó n a l que se n e c e r i t a r i a para l o g r a r l a h idra tac ión completa d e l Se- phadex; pues s o l o se n e c e s i t a de 30-60 minutos.

Ge les de po l i a c r í l amida , e s t o s g e l e s se hinchan a su

máxima capacidad por que r e t i enen e l agua que captan d e l - Buf f e r en donde se hidratan. Comercialmente s e dispone de Bio-Rad Labo ra t o r i e s como Bio-Gel p.

E l adsorvente debe empacarse homogéneamente y en p l g no ho r i z on t a l , e l mate r i a l desciende lentamente empacando- se, en t an to se e l imina e l volumen de B u f f e r equ iva lente , - ya que e s t e e s reemplazado.

A l empacar l a suspensión ( t an t o e l adsorvente como - l a columna) deben e s t a r a temperatura a l a cu la se va a - r e a l i z a r l a cromatogra f fa . Esto ayuda a e v i t a r l a forma - ciÓn de burbujas durante e l empacado de l a r es ina , y psra mayor seguridad pueden ser el iminadas por d e gas i f i c a c i ón - con vac io .

La cromatogra f fa en DEAE-Celulosa se emplea para e l f racc ionamiento de todas l a s p ro t e ínas s é r i cas . incluyendo l a s inmunoglobulinas.

. 7 ' - . - . I

Lo DEAE-Celulosa también f u é usada por Ao r t e r para - l a separación de dos t i p o s de fragmentos de l a s inmunoglobul inas , e l Fab y Fc producidos po r l a d i g e s t i ón enzimáti- ca con papaína.

La CM-Celulosa cont i ene grupos func iona les que son - ac t i vados 8 pH en t r e 3.0-6.0 La cromatogra f ía en CM-Celg l o s a es especia lmente Ú t i l en e l f racc ionamiedto de inmuno g l obu l inas que no fueron adsorv idas por intercambiadores - I

de aniones como l a DEAE-Celulosa.

Las inmunoglobulinas de sueron hiperiqinunes han s ido f racc ionados en columnas con CM-Celulosa. Esta cromatogrg f í a fué también usada po r F o r t e r para separar l o s fragmen- t o s Fab (1,111 y Fc (111) obtenidas después de l a d i g e s - - t iÓn enz imát ica de gamma g l obu l i nas de conejo con papaína.

La cromatogra f ía p o r f i l t r a c i ó n en g e l separa a l a s moléculas en base a l tamaño molecular . ( l a inmunoglobulina más grande del suero normal) puede s e r separada de l a s o t r a s inmunoglobulinas s é r i c a s mediante - é s t a t é cn i ca ; l a IgG puede obtenerse l i b r e de l a s no inmu- nog lobul inas s é r i c a s mediante f i l t r a c i ó n en g e l .

Por e l l o l a IgM -

Las moléculas de I gA , que t i enen U tamaño intermedio en t r e l a IgM e IgG pueden s e r separadas rec i rculando en c g lumnos por f i l t r a c i ó n en g e l , aunque algunos l abo ra t o r i o s separan a l a I gA de o t r a s fuen tes d i f e r e n t e s a l s u e r o ( t a l como l o es e l c a l o s t r o ) e n donde l a concentración es e l e v a da y hay pocos contaminant,es p r o t e í c o s .

-

La f i l t r a c i ó n en.ge: s’ ha usado ampliamente para se parar cadenas p o l i p é p t i d i c a s l í g e r a s y pesadas de las mol6

culas de l a s inmunoglobulinas.

- 74 -

a

La mayor l i m i t a c i ó n de l a cromatogra f fa de f i l t r g - c ión en g e l e s su ba ja capacidad en términos de m l de sue-

ro Ó mg de p ro t e ína que pueden ser ap l i cados a l a columna para obtener buenos result,ados.

La inmunocromatograf íe ha s ido desarro l lada usando -un medio cromatográ f ico cons i s t en t e de ant icuerpos ( con t ra un determinante an t i g én i c o e s p é c i f i c o ) acoplado a una ma - t r í z como l a Sepharosa. Es t e ma t e r i a l puede s e r usado pa- r a l a separac ióh en conjunto, y también puede s e r ampacada en una columna.

I

Esta t é cn i c a i n vo luc ra e l acoplamiento de un an t i g e - no e s p e c í f i c o ( frecuentemente hapteno) a un mate r i a l inso- l u b l e para s e r usado en l a separación de ant icuerpos d i r i - g i dos contra é s t e ant í geno . inmunoglo bul ina s que no tengan e spe c i f i c i dad de a n t i cuerpc

Es te método puede e l im inar a

Le p u r i f i c a c i ó n de inmunoglobulinas e s f a c i l i t a d a to mando como ven ta j a l a s va r i ac i onas moléculares, y pueden s e r separadas po r procedimientos de f racc ionamiento basa - dos en d i f e r e n t e s p r i n c i p i o s f i s i coqu im icos .

MATERIAL Y EQUIPO:

- Adsor'vente - Bamha de v a c í o - Columna con a c c i e s o r i o s - Cronómetro - Embudo de t a l l e 1.argo

- Embudo Buchener - Matraz K i t a sa t o - Prcbe ta de 500. 100 m l - Vaso de p r e c i p i t ados de 600 m l y 4 1.

- 7 5 -

6..

React ivos :

- Adsorvente - Agua detonizada

- NaOH - Reac t i vos para e l B u f f e r de corr imiento

- H C 1

I

Soluciones :

- Buffer de cor r imiento

- HC1 0.1 N /

- NaOH 0.1 N

Método :

1.- Se e l i g e a l adsorvente dependiéndo de l a muestrm y e l proceso que s e desea r e a l i z a r con e l l a ; c r g matogra f fa de intercambio i ón i c o Ó f i l t r a c i ó n en g e l .

t rucc iones d e l f ab r i c an t e . 2.- E l adsorvente e s h idratado de acuerdo a l a s ins -

3.- Se acondic iona e l adsorvente con e l Buf f e r de co -

4 . - Se procede a d e g a s i f i c a r l a suspensión (adsorven t e y Bu f f e r ) mediante vac io .

5.- E l adsorvente e s empacado e n l a columna por gravedad, ev i tando l a formación de burbujas.

6.- E l f l u j o de l a columna empacada debe e s t a r en e l rango e spe c i f i c ado por e l f ab r i can te , en caso - con t ra r i o se procede a desempacar y empacar nue- vam en t e .

r r imiento .

- -

7.- La muestra deberá s e r d i a l i aada en e l Bu f f e r de cor r imiento (si e l proceso e s cromatogra f ía de -

- 76 -

.

.-

4

in tercambio i ó n i c o . en caso de f i l t r a c i ó n en g e l e s t e proceso e s omit ido )

8.- Las condic iones de fraccionamiento son e s t i p u l a das de acuerdo a l o s f i n e s . ( 5 6 - 6 9 )

f

. I

7 7 - _.

4

.

U L T R A F I L T R A C I Q N

( T h c n i c n 7 I


Las so luc iones que cont ienen macromoléculas pueden - se r concentradas madiante U l t r a f i l t r a c i ó n ; l a cual es una

I t é cn i ca eñ i a que e l agua, i one s y pequeñas moléculas s e - remueven de l a so luc ión mediante el paso de é s tas a t r a v é s de una membrana semipermeable y l a s macromoléculas son re-. t ec idas .

I

E l so l v en t e , i one s y pequeñas moléculas se f o r zan a pasar a t r a v i s de l a membrana, mediante l a ap l i cac i ón de - pres ión p o s i t i v a , nega t i va ó g ra v i t a c i ona l .

Cuando se co l e c t a el. so l v en t e , a é s t e se l e design6 como: U l t r a f i l t r a d o .

s i se usa pres ión p o s i t i v a , i a so luc ión a concentrar se co l oca dent ro de un c i l i n d r o Ó ce lda , en l a que Ee e n - cuentra un f i l t r o que e s tina membrana delgada de tamaño de poro d e f i n i d o ( l a e l e c c i ón d e l t m a ñ c de poro depende de - l a s dimensiones y PM de l a Ó l a s macromoléculas que se p rg tendan a i s l a r Ó concentrar, s i se r e qu i e r e de concentrar - se usará l a membrana con tamaño de poro más pequeño para - que quede r e t en ida ; s i s e q u i e r e e l im inar s e usa una mem = brana con poro mayor para f a c i l i t a r su sa l i da ) colocada so

bre un sopor te de f i b r a de v i d r i o que sevencuentra en e l - fondo de l a ce lda . La fuen te de p r es i ón e s un tanque de - gas i nhe r t e e l cual normalmente es n i t rógeno .

Generalmente l o que se pretende con e s t e proceso es

l a concentrac ión de l a muestra, y l a s macromoléculas son -

I - 78 -

E

c o l e c t a d a s s o b r e l a s u p e r f i c i e de l a membrana. Para e v i - tar l a a c u m u l a c i ó n de material s o b r e l a membrana y p o s i b l e

mente l a d e s n a t u r a l i z a c i ó n de p r o t e í n a s l á b i l e s , el mate - r i a l que se e n c u e n t r a dencltro de l a c e l d a se m a n t i e n e en - a g i t a c i ó n c o n s t a n t e , : e s t o se l o g r a c o l o c a n d o un magnet3 - d e n t r o de l a c e l d a y s o b r e l a membrana ( e x í s t e equipo que l o t r a é i n t e g r a d o y no c a u s a f r i c c i ó n s o b r e l a membrana; - ya que k s t o puede causar e l d e s p r e n d i m i e n t o Ce l a c o b e r t u r a que p e r m i t e l a f i l t r a p i ó n s e l e c t i v a ) . L a c e l d a que c o n t i e

n e l a s o l u c i ó n , se c o l o c a s o b r e de un a g i t a d o r m a g n é t i c o y

se e p l i c a l a p r e s i ó n d e l g a s i n h e r t e .

L a u l t r a f i l t r a c i ó n y mezclado de l a s o l u c i ó n o c u r r e

s i m u l t á n e a m e n t e , a s í se p r e v i e n e l a a c u m u l a c i ó n d e l mate - r i a l s o b r e l a s u p e r f i c i e de l a membrana.

Comerc ia lmente s e d i s p o n e de c e l d a s d e d i f e r e n t e s tg maños, de membranas que v a r í a n con r e s p e c t o a sus caracte- r í s t i c a s y e l tamaño de l a s m o l é c u l a s de s o l u r o que pueden

r e t e n e r (Membranas D i a f l o , Amicon Corp. . Cambridge, MA: - M i l l i p o r e f i l t e r s , M i l l i p o r e Corp. , B e d f o r d , M A )

Pequeñas m u e s t r a s , pueden también ser c o n c e n t r a d a s - c o n v e n i e n t e m e n t e p o r f i l t r a c i ó n g r a v i t a c i o n a l ; en donde l a m u e s t r a se c o l o c a en un f i l t r o c ó n i c o y é s t e a su v e z en - un t u b o de c e n t r í f u g a (Amicon Corp. , Cambridge, MA). La - c o n c e n t r a c i ó n r á p i d a puede o b t e n e r s e a f u e r z a s c e n t r í f u g a s

r e l a t i v a m e n t e b a j a s .


- Cgmara de U l t r a f i l t r a c i ó n con mágneto - Embudo de t a l l e c o r t o - Membrana "Amicon"

-. 79 -

c

- P r o b e t a de 1 0 0 y 2 5 0 m l - Tanque de n i t r ó g e n o - , V a s o de p r e c i p i t a d o de 600 m l

S o l u c i o n e s :

- M u e s t r a a u l t r a f i l t r a r

~ Método:

1 . - S e e l i g e - e l tamaño de p o r o de l a membrana de g - c u e r d o a lo que se d e s e e ; s i c o n c e n t r a r O e l i m i -

nar . 2.- L a membrana se l a v a con abundante agua d e i o n i e a -

da ffiediante a g i t a c i ó n c o n s t a n t e , p a r a e l i m i n a r - i a g l i c e r i n a que traé como p r o t e c c i ó n .

3.- E l volumen de l a m u e s t r a se c u e n t i f i c a en u n a - p r o b e t a .

&.- S e arma e l d i s p o s i t i v o de U l t r a f i l t r a c i ó n con l a membrana e l e g i d a .

5.- se a p l i c a l a p r e s i ó i i p o s i t i v a con n i t r ó e e n o ; ég t a d e b e e s t a r en e l rango que e s p e c í f i c a e l fa- b r i c a c t e p a r a a s e g u r a r s e de una buena r e s o l u c i ó n

6.- S e r e c o l e c t a e l u l t r a f i l t r a d o , c u a n t i f i c a n d o a l f i n a l d e l p r c c e s o e l c o n c e n t r a d o y u l t r a f i l t r a d o

p o r volumen Ó c o n c e n t r a c i ó n de p r o t e í n a s . 47

- 80 -_ I

I

L I O F I L I Z A C I O N

( T h c n i c a 8 1

INTRODUCCION :

La l i o f i l i z a c i ó n e s un método pare l a c o n c e n t r a c i h

de so lu tos de una sc luc ión, mediante l a evaporación d e l - agua a t r a v é s de vac io . La so luc ión puede $or l o tanto - ser desecada completamente Ó solo r educ i r l a de volumen.

La so luc ión que s e rá concentrada se e n f r i z a -7OOC - dentro de un v a c i o de qproxírnadamente 50,mm de Hg; ba j o e s - t a s condic iones , e l agua e s removida en forma de gas y s e c o l e c t a en un condensador a -7OOC. E l sobreenfr iamiento - causa que e l agua sublime rápidamente d e l ma te r i a l conge lg

do.

Las so luc iones con un e l evado contenido de s a l e s Ó - con so l v en t es orgánicos deberán s e r primeramente d i a l i z a - das contra un so l v en t e de ba ja f u e r z a i ón i ca .

,La muestra debe contener un c i e r t o l í m i t e en l a con- cent rac ión de s a l e s , (e jemplo: en e l suero es permis ib l e - un po rcen ta j e no mayor d e l 1 % ) .

Es necesar io e l r e g i s t r a r e l volumen y contenido de

sa l e s de l a muestra ; ya que son los f a c t o r e s de l o s cua-- l e 8 depenoe en que moaeEto s e suspende e l proceso además de l a concenración f i n a l de s a l e s en e l ma te r i a l seco Ó - cmcentrado.

La l i o f i l i a a c i ó n no es el Único métbdo que se usa pa ra l a concentración de so luc iones ; pero s í es e l método - e f i c i e n t e para l a perservac ión de mate r i a l e s b i o l ó g i c o s l$

-

- - e 1 -

b i l e s , t a l e s como: enzimas, complemento agcwtes i n f e c c i g - sos. - Mater ia l y equipo:

- Embudo de t a l l e corto, - Frascos arnpúla de 100 m l , Ó matraces Erlenmeyer

- L i o f i l i zadora - P i p e t a s Pasteur - Probietas de d i f e r e n t e s capacidades - Rec i p i en t e de p l á s t i c o (cuadrangular)

I

React i v o s : .

- Acetona - H i e l o seco

Soluciones:

- Muestra a l i o f i l i z a r

Método:

1.- > A l a muestra a l i o f i l i z a r se l e cua l l t i f i c a su - contenido p r o t e í c o , se r e g i s t r a su volumen y se estima i a concentración de sa l es .

2.- Cusndo l a concentrac ión de s i l ies es e levada, l a muestra s e d i a l i z a contra un Buffer de ba ja f u e r za i ón i c a -has t a l o g r a r una concetrac ión de s a l e s baja.

3.- La muestra se depos i ta en f rascns o matraces Er- l e rmeyer ; cuyo volumen debe ser 3-5 veces a l de l a muestra.

2.- Las muestras son congeladas en un baño de h i e l o

seco y acetona

I - 82 -

e-. . ..

I

5.- Las muestras s e colocan ó conectan en i a i i o f i i i zcrdora.

6.- Se a p l i c a e l v a e i o para l o g r a r l a l i o f i l i z a c i ó n . 7.- La l i o f i l i s a c i ó n concluye cusndo toda l a muestra

queda completamente seca. 8.- Cuando s o l o se r equ i e r e de l a disminución de cn-

lumen es ma6 recomendable usar l a U l t r a f i l t r a - ciÓn Ó bien marcar l o s r e c i p i e n t e s ( f r a s co s Ó m a t r a c e s Erlenmeyer) e l volumen que se desea..

9.- E l l i o f i l i z a d o se Conserva durante l a r g o s periÓ- dos con l a gran ven ta j a de que l a a c t i v i dad bio-

. .

l ó g i c a de l a s preparac iones s e conserva. /

10.- S i s e r e qu i r e d e l uso de so l o una pa r t e d e l l i o - f i l i z a d o , es aecomendable hacer a l í cuo t a s ; por - eso e s importante d o s i f i c a r mediante contenido - p r o t e í c o , de t a l forma que a s í s o l o se resuspen- der6 l a can%ida3 necesar ia , ev i tando l a p o s i b l e contaminaci in bacter iana y por l o t an to l a dismi - nución en cü?imto a l a a c t i v i d a d b i o l ó g i c a . ( 7 0 -

731

. . . .

- ..:

I - 8 3 -

- c

D E T E R M I N A C I O N D E C A R B O H J D R A T O S

( H2S04 - C6H5-OH )

í T h c n i c u 9 I


Este-método no i n c l u y e una p r e v i a h i d r ó l i s i s y l i b e - rac ión de lo's const i tuyentes monosacáridos de l a s mueg- - t r a s ; pero se una e l ácidci s u l f ú r i c o concentrado en preseo c i a de f e n o l . .

I

Los carbohidratos forman ya sea f u r fu ra l d eh í s o Ó sus

homólogos con un ác ido f u e r t e . Estos der ivados de l o s ca r

bohidratos producen compeustos c o l o r i d o s por po l ime r i z a - ciÓn o condensación con f e n o l e s aromáticos.

Esta e s La base de la reacc ión de Mol ich y también - de l a prueba d e l Orc ino l de Bea l , l a cual f u 6 originalmen-

t e diseñada para pentosas y ác idos hexurónicos.

La reacc ion de l a Antrona t a l vez , e s l a ve rs ión más conocida. C i e r t a s moléculas que i ont i enen -SH, taInbién - reaccionan con grupos f u r f u r a l e s .

La reacc ión d e l & i d o s u l f ú r i c o y c i s t e i n a desarro - - liada por Dische (1949) f u i l a más estudiada en e s t e t i p o de reacciones.

' Dubois y colaboradores (1956) h i c i e ron un procedi - - miento, el cual e s provabiemente e l más sens ib l e en e s t e - t i p o de reacciones. I

- e4 -

1

i

I .-

2.-

3.-

4 . -

a

Mater ia l y equipo :

- Balanza a n a l í t i c a - Celdas para espec t ro fo tómetro - EspátuLa - ~ s p e c t r o f o t ó m e t r o - G r a d i l l a - Mezclador de t u b o s (Vor tex ) - P i c e t a con agua d e s t i l ada

- Prop ípe ta - Tubos de ensayo

React i v o s :

- Acido s u l f ú r i c o concentrado - Feno l

Soluciones :

- Fenol a l 5% - Muestras

Método:

:*

Se prepara un stock de dextrán en una concentra- c i ón de 1.000 ug/ml en agua des t i l ada . E l dex - trsn deberá e s t a r desecado previamente. A p a r t i r d e l stock se hace un estándar que cog - t enga una concentración de 200 ug/ml; para e s t o s e hace una d i l u s i ó n 1:5 en agua d e s t i l ada d e l - stock. Se hace una solución a l 5% de f e n o l en agÚa des- t i l a d a En una g r a d i l l a , se acomodan l o s tubos de ensayo

-I 85 - I

en cant idad doble a l número de muestras a pro - - bar más doce, que son para l a curva estándar.

5.- A l a s muestras problema s e l e s hace una d i l u c i ón 1 : l O hasta 1:lOOO. con l a f i n a l i d a d de que su va l o r en t r e dentro de l a curva estándar. Es recomendable hacer v a r i a s d i l u s i one s de l a misme - I

muestra, as$ alpunas s e r v i r an para corroborar re su l tados y en ok'ros casos s e r v i r á para que l a - más d i l u i d a en t r e en e l rango, de l a curva están-

dar. 6.- Ca&a d i lue idn de l a muestra que eea preparsda se

co l oca 1,0 m1,en un tubo de ensayo, partiérido - d e l número 7 ( e s t a operac ión se r e a l i z a por dg - p l i c a d o )

7.- Se hace l a curira de c a l i b r e c i ó n de acuerdo a l SL g u i en te pro t o c 01. o :

A ) Del tubo 2 a l 6 s e añaden 0.2. 0.4, 0.6, - 0.8 y 1.0 m l de l a so luc ión estándzr de - dextran respect ivamente.

B) En l o s tubos 1 al 5 se añade 1.0, 0.8, 0.6 0.4 y 0.2 m l de agus dest i lac ia ; de t a l f o r ma que ceda uno de los tubos contenga 1.0

~

I

m l de solución. C ) A cada uno de los tubos; t an to de l a s de -

l a curva de c a l i b r a c i ón , como l o s de l a s - muestras problema s e l e s agrega 1.0 m l de l a so luc ión de f e n c l a l 5%. Conforme se - va añadiendo el r e a c t i v o , se a g i t a manualmente par8 homogeneizar l a s muestras.

8.- Se agregan rápidamente 5.0 m l de á c i do su l f ú r i c o concentrado. procurando que éste r e s v a l e po r l a s paredes d e l tubo.

9.- Mezc lar inmediatemente en e l vo r t e x 10.- De jar l o s tubos e n f r i e r E temperatura ambiente -

- 86 -

7*1py’ --;

Q durante 60 minutos, ya que l a reacc ión a l me- w

c l a r ác ido s u l f ú r i c o con agua es bastante e xo t é g mica. E l t iempo de enfr iamiento puede ser r edud do s i 103 tubos son in t roduc idos en un-baño de - h i e l o .

usando como blanco el tubo 1 de l a curva están”-

dar. 12.- De l a s l e c t u r a s obtenidas, se hace una g r á f i c a -

en pape l m i l im&t r i c o , donde l a D.0 va en l a s or- denadas y l a concentración en les absisas.

13.- Para determinar l a cant idad de carbohidratos de

11.- Cada tubo se l e e en el espectro fo tómetro a 490 w

cada una de l a s muestras rpoblema. se hace uso - de l a curva estándar. En donde se toma l a D.0 - obtenida d e l tubo de l a muestra problema y se e s

t r a p o l a en l a curva de c a l i b r a c i ón para obtener i a concentración.

14.- La cant idad r e a l de carbohidratos contenida en - una muestra, se ob t i ene mul t ip l i cando l a concen- t r a c i ón obten ids para cada muestra p o r du r espec t i v o f a c t o r de d i lus iór i .

Uso y l i r c i tac iones :

E l ác ido su l f ú r i c o - f eno l , no reacc ions con: h i d r ox i azúcares y amino azúcares. ex t inc i ón molécular más que l a s hexosas.

Las pentosas muestran una ba ja

Este procedimiento es especia lmente usado para a n á i i - s i s ráp ido de un gran número de muestras de e f l u en t e de

cromatograf ía .

Para e s tud ios cuan t i t a t i v o s se debe agregar el ác ido su l fú r i co a l a muestra p r een f r i ada y gusrdar la en h i e l o .

. - 8 7 - I

Q

En caso de que e l d e s a r r o l o d e l c o l o r tome tiempo, - entonces se mete an baño mar ia durante 1 5 minutos después de lo cua l s e debe guardar. en r e f r i g e r a c i ó n . .

El c o l o r d e s a r r o l l a d o e s e s t a b l e a 4OC durante 24 - horas . [ ?4,75 )

I - 88 -

C ROM AT O G R AF I A DE I N M U NO AD SO R C I O N

( Técnica 10 I

I N T R O D U C C I O N : .i

La Cromatograf ia de Inmunoadsorción también es cono- c ida como Cromatograf ja de A f in idad . Es un método select i_- vo, que hace uso de l a propiedad que t ienen l a s prope ínas de en lazarse a l i gandos de una manera e s p e c í f i c a e i r r e v e x s i b l e . En donde e l l i gando o i nh i b i do r compet i t i vo se une coovalentemente a un po l imero i n so lub l e o g e l : e s t e g e l dg be presentar a su dez l a s s i gu i en t e s c a r a c t e r í s t i c a s : s e r

uniforme, de t a l forma que permita un empaque homogéneo, - debe p e r m i t i r l a entrada y s a l i da de grandes moléculas, dg be t ene r un tamaño uniforme, s e r e s f é r i c o y r í g i d o . Den - t r o de l o s sopor tes , los que más frecuentemente SOP usados son los po l ímeros de dextran (sephadex) y l o s der i vados de l a agarosa (sepharosa). E l acoplameinto de l a s p r o t e í nas se r e a l i z a usando haluros de cianógenc a t r a v é s d e l cual - se unen l a s p ro t e ínas con l o s pequeños der i vados d e l car- h idra to d e l g e l . Las matr i ces preparadas con agarosa son super iores a o t r o s po l ímeros inso lub les .

MATERIAL Y E Q U I P O : R E A C T I V O S :

- Campana de ex t racc i ón - Baño maria a 2OoC - Bomba de v a c i o - Embudo Buchner - Matraz K i t a sa t o - V a r i l l a de v i d r i o - PO tencióm e t r o - Pape l f i l t r o

- Sepharosa 4B - Agua d e s t i l ada - CNBr - NaOH - H C 1 - Hexametilen-diamino - Buffer Co?/HCO3 0.2M

p~ I O a ~ O C

i *- .

Q

METODO :

Aminación -de l a S e p h a r o s a .

1.- E l hexano 1 , 6 diamino produce una reacc ión endo- térmica por l o que es necesa r i o someter lo a baño maria. ,

2.- A jus ta r e l pH a 10, para ello se añade HC1 conc. como l a reaccic 'n e s exotérmica, e s t o se r e a l i z a dent ro de un baño con h i e l o y con e l e l e c t r odo - d e l potenciómetro dent ro de l a so luc ión.

3.= Meter un vaso de p r e c i p i t a d c s en baño de h i e l o - sobre un a g i t ado r magcét ico. Sobre é s t e vaso de p r e c i p i t adc añadir LOO m l de Sepharosa 4B ( Pre- v iamerte lavada CCI: ztundante agua d e s t i l ada a - 4 O C ) .

4.- De ja r e n f r i s r 2-3 minutos con e l e l e c t r odo dentro

( a pH neutro) y con a g i t a c i ó n constante.

11 (mantener en e l baño de h i e l o ) . 5.- Agregar NaOh 8 M 2-4 go t a s para obtener un pH de

6.- A b r i r l a l a t a de CNBr (con ab r e l a t a ) Se t i r a e l

empaque conservador y s e busca l a b o t e l l a que con - tenga e l r e a c t i v o . Se abre cortando l a covertura de Cu que cubre .la tapa de l a b o t e l l a .

7.- Con ayuda de una espátula añadir l o s 100 g de CN Br poco c poco, y agrega r s u f i c i e n t e NaOH para - mantener e1 pH en 11 (Se añaden aproxímadamfr-te 80 m i ) .

8.- Se continua ag i tando durante 25 minutos dentro -

9.- Añadir poco a poco agua d e s t i l ada (controlandc - e l pH a 11 con NaOH). Se de j a 15 min. en el bs- ño de h i e l o a que se e s t a k i l i s e e l pH.

d e l baño de h i e l o .

10.- Sacar l a Sepharosa d e l h i e l o para 1a .d iso luc iÓn d e l CNBr, y s i se c a l i e n t a mucho, Fonér l e Unas - p i z ca s de h i e l o dentro d e l vasc.

11.- Se pasa todo e l contenido d e l vaso a t.ravés de - un f i l t r o , con ayuda d e l embudo Euchner.

12.- La Sepharosa se n e u t r a l i z a a5c.d.iéndo Bu f f e r de - C03/HCQ3 pH 10, sobre e l f i l t r o y con vac io . A - n~edida d,e que se añade e l Buf fe r , se a g i t a cor - l a v a r i l l a . A l mismo t iempo se checa e l pH d e l - hexano 1,6.diamino, a que tenga un pH devlO y - e s t o s e l o g r a mediante ad i c i one s de HClconc.

grande' (de 2 L ) y se añade €1 r e a c t i v o hexano - 1.6 diamino. Poster ioremente se co loca en un ck- a r t o de temperat,tira de i s re f r i ge rac ión tapedo con para f i lm y s e somete a a g i t a c i ón cons1;snte deran t e toda l a noche.

I

13.- Se vac i a l a Sepharosa en UI vaso de p r e c i p i t ado

14.- A l d í a s i gu i en t e se l a v a en e l f i l t r o con ayuda de un embudo Buchner, con 3-4 l i t r o s de agua des - t i l a d a . Y se vac:ia en un vaso l imp i o con agua -- des t i l ada .

15.- Se r e a l i z a l a pr-ueka de l a aminación. Se toma -- una muestra de l o Sepharosa aminada y no aniinada Se añade 1.0 m l de so luc ión de Tetraborato de so - die, más t r e s go tas de t r in i t r obencensu l f ona t c - de sod io a l 3%, dejándo reposar durante una hora La reacc ión se considera como p o s i t i v a ( e s t o es aminada) s i da una c o l o r a c td naranja. Y negat i va (no aminada) s i se presenta ur.a co lo rac ión blan- ca.

F I 3 A C I O N DE L A FRCl'iEINA A L A S E P H A R O S A AMIbiADA O A C

T I V A D A . -

,I

,I. - 91 -

* M A T E R I A L : RE A C T I V O S :

- Boomba d e v a c i o - Embudo Euchner - H C 0 3

- co3

- M a t r a z K i t a s a t o - G l u t a r a l d e h í d o

- P a p e l f i l t r o - RaOH - P a r i i i a m a g n é t i c a - NaCl

- Magneto - CeFharosa amir-ada f

R E A C T I V O S :

- B u f f e r CC3/HC0, 0.2 M pH 9 . 5 - Na CL 0/5 M (500 m l ) - N a O H 0.5 M - G l u t a r a l d e h í d o a l ;?5%

1 . - L a v a r l a S e p h a r o s a amirada en e l embudo Buchner c o n : a g u a s d e s t i l a d a , N a O H 0.5 M , B u f f e r . Qui tar t o d o el l í q u i d o a l a S e p h a r o s a ( h a s t a d e j a r más ó menos seca)

2.- C e r r a r comFlet.amente el embudo y añadir 1 m l de g l u t a r a l d e h í d o más 6 m l de B u f f e r , e s t o p r o d u c e

una s o l u c i ó n de g l u t a r a l d e h í d o a l 2.5%. Y p o r ca da 3 m l de S e p h 6 r o s a se a g r e g a n 7 m l d e l a mez-

c l a m h c i a n e d a a n t e r i o r n e u t e . S e v a c i a e l g l u t - a l d e h í d o a l a S e p h a r o s a y se d e j a r e a c c i o n a r dg- r a n t e 1 5 m i n u t o s ( l a r e a c c i ó n s e v e r i f i c a p o r - q u e aparece una c o l o r a c i ó n amar i l l enta )

3.- S e l a v a con abundante agua d e s t i l a d a h a s t a que - d e s a p a r e c e el exceso de g l u t a r a l d e h í d o (lo cual s e c a p t a p o r e l olor) y s e v u e l v e e l a v a r con Bz f f e r .

4 . - E l a c o p l a m i e n t o de l a p r o t e í n a se r e a l i z a de l a

- 92 - I

I

.X_.. . . tl. . .

%-

s i gu i en t e manera:

.. .

1 Volumen de SnpharCJSa ac t i vada con g l i t a r a l d e - hído más 1 Vo l de Bu f f e r , se añade 1 volumen de l a so lúc ión p r o t e í c a en una concentración e e 10

mg/ml ( en e l Ruf f e r ) . Se a g i t a a temperatura - ambiente durante 1-4 horas, ( e s t a a g i t a c i ón &e-

be ser tsuave ) y poster iormente an r e f r i g e r a c i ó n durante toda l a noche.

5.- Se f i l t r a en vac io . obteniéndo e l l i q u i d o f i l - t rado, el cual se l e e a 280 nm . Esta l e c tu ra - s i r v e para determinar l a cant idad de p ro t e ína - f i j a d a a l a Sepharosa y ob tener e l % de acoplamiento. ( 64 .66 ,76 ,77 )

I

/

- 9 3 - !

&

D E T E R M I N A C I O N DE LA R E L A C I O N O P T I M A AglAb POR

DIFUSION EN GEL

( T h c n i c a 1 1 )


L a r e l a c i ó n ó p t i m a a n t í g e n o - a n t i c u e r p o t i e n e como - f i n a l i d a d , e l de e s t a b l e c e r l a c a n t i d a d de a n t i g e r i o y de - a n t i c u e r p o n e c e s a r i a s p a r a l a reacción de i d e n t i d a d , como

l o es l a f o r m a c i ó n de p r e o i p i t i n a s ; de t a l forma que no se u s e en e x c e s o Ó l i m i t a c i ó r . de níngunc de e l l o s .


- Bajlanza a n a l í t i c a - Baño a t e m p e r a t u r a c o n s t a n t e - Cámara húmeda - C o r t a d o r de g e l - Equipo M i c r o t i t t e r :

A ) P l a c a s de l u c i t a ( f o r m a d e U) B) M i c r o p i p e t a s 2 5 y 50 u 1 C ) M i c r o d i l u t o r e s 2 5 y 50 u1

- ESOPO

- E s p á t u l a - E s t u f a a 37OC - M a t r a z E r l e n m e y e r de 250 m l - Mesita y n í v e l - P a p e l a l u m i n i o - P i p e t a s Eppendorf ( 1 0 , 5 0 , 100, y 1.000 ul) - P i p e t a s s e r o l ó g i c a s de 5.0 m l - P l a c a s de v i d r i o ( 7 5 X 2 5 m m ) " p o r t a o b j e t o s " - P u n t a s p a r a p í p e t a Eppendorf - Termómetro

- 94 - I

R e a c t i v o s :

- A c i d o a c é t i c o g l a c i a l

- Agarosa t i p o I T (SIGMA) - Agua d e s t i l a d a

- A l c o h o l a b s o l u t o - A n t í g e n a - A n t i s u e r o e s p e c í f i c o p a r k el r n t í g e n o

- Azida d e s o d i o - Azul b r i l l a n t e de Coomabie R-250

#

- Buffer ( B a r b i t a l , V e r o n a l , PBS, B o r a t o s , T r i s - H C 1 ) /

P r o c e d i m i e n t o :

1 . - L a s p l z c a s de v . idr io s e l a v a n p e r f e c t a m e n t e , y - se l i m p i a n con a l c o h o l a b s o l u t o p a r a e l i m i n a r l a g r a s a que p u d i e r a e s t a r impreganada en e l l a s .

B u f f e r , añadiendo a z i d a de s o d i o aomo a n t i b a c t e -

r i a n o . Con e s t a s o l u c i ó n se p r e p a r a n p l a c a s de

g e l con un e s p e z o r de 2 m m ; y p a r a ello hay que

v e r t i r 4.5 m l en la p l a c a de v i d r i o .

2.- S e p r e p a r a en baño maria a g a r o s a a l 1 % en a lgún

3.- Al a n t í g e n o se l e c u a n t i f i c a su c o n t e n i d o p r o t e i -

4.- S e h a c e una s o l u c i ó n d e l a n t i g e n 0 con e l mismo - B u f f e r con e l cual se p r e p a r o l a a g a r o o a , p a r a - t e n e r l o en una c o n c e n t r a c i ó n d e 1.0 mg/ml.

5.- L a s p l a c a s de l u c i t a se l a v a n con s o l u c i ó n de ex t r a n a l 5%. enjuagando con abundante agua d e s t i - l a d a .

6.- Se h a c e una s e r i e de d i l u c i o n e s 1:2 de a n t i s u e r o en l a p l a c a de l u c i t a , de l a s i g u i e n t e manera: A ) Con ayuda de una m i c r o p i p e t a se c o l o c a n 25 u1

c o .

-

d e B u f f e r a p a r t i r d e l segundo p o s i t o en una

<- 95 - , -

e-.

c h i l e r a de l a s p l acas de l u c i t a .

B) Se añaden 25 u1 de ant isuero en e l primer pp

C ) Se e fectúan d i l u s i one s ser iadas 1:2 u t i l i z a 2 s i t o .

do l o s m ic rod i lu to r es . 7.- Se ap l i can 25 u1 de l a so luc ión de ant ígeno que

8.- Cada p o s i t o s e homogeniza indiv idualmente con - ayuda de un c ap i l a r .

9.- La p l aca de l u c i t a e s cub ie r ta con o t r a o b i én - con para f i lm y se incuba a 37OC durante una hora

10.- Mientras tanto , s e cor tan l a s microceldas como * s e muestra a cont inuación.

t i e n e una concentrac ión de 1 mgjml,

11.- Después de l a incubación de l a mezcla antígeno-- ant icuerpo, se toman 1Oul d e l sobrenadante con - una p í p e t a Eppendorf y s e dep3siten en una ce lda de l a p laca de g e l s iguiendo e l mismo orden que l a s d i lus i ones de l a p laca de l u c i t a , usando pa- r a cada una de e l l a s una punta d i f e r en t e .

12.- E l canal super io r de l a p laca de g e l se l l e n a de ant icuerpo (ant i suero ) y e i i n f e r i o r con i a solg ciÓn de antígeno.

13.- La p laca de g e l , s e depós i ta en una cámara húme- da y se incuba EL 37OC durante toda l a noche.

14.- La p l aca de g e l puede preservarse po r tiempo i n - c le i in ido ; para e l l o e s necesar io secar y t e l i r - siguiendo en mísmo procedimiento que e l que se - usa para l a s p l acas de Inmunoelectro fóres is e 12 munodifución en g e l .

- 96 - I

E v a l u a c i ó n :

En l a s c e l d a s en donde s e e n c u e n t r a e l a n t i g e n 0 en - e x c e s o , s e forma una banda d e p r e c i p i t i n a e n t r e e l o r i f & - c i o y e l c a n a l en donde se e n c u e n t r a e l a n t i c u e r p o : e s t e - c a s o se dá f r e c u e n t e m e n t e en l a s Últimas c e l d a s en donde - se c o l o c a n l a s d i l u q i o n e s v a g o r e s d e a n t i c u e r p o . En t a n t o en l o s p r i m e r o s o r i f i c i o s ! e l e x c e s o de a n t i c u e r p o e s cg - mÚn y c o n s C s t e en una banda de p r e c i p i t i n a que s e encueg - t r a d e l otro l a d o de l o s o r i f i c i o s c e n t r a l e s .

L a r e l a c i ó n óptimg w n t í g F n o - a n t i c u e r p o s e e n c u e n t r a

cuando hay cambio en l a p o s i c i ó n de l a s bandas de p r e c i p i -

t i n s . í 78.79 )

usos:

E s t e método e s c o n v e n i e n t e ; p u e s no r e q u i e r e más de una g o t a de l a s s o l u c i o n e s y se emplea poco t iempo p a r a ob t e n e r i n f o r m a c i ó n acerca d e l a a c t i v i d a d aproximada de l a s p r e p a r a c i o n e s . Adenás s i r v e de g u i s p a r s la p r e c i p i t a c i ó n

c u a n t i t a t i v a . .s.-

- 97 -

..

. .

..

,. .

,.

. "

z'

Preparación y a i s lamiento de fragmentos obtenidos mediante h i d r ó l i s i s enzimática

f Thcn i ca 7 2 1

Para o b j e t i v o s p r á c t i c o s se sug i e r e e l uso de enzimas p r o t e o l í t i c a s para l a degradación de ant icuerpos; también e s Ú t i l para c a r a c t e r í s t i c a s bás i cas de l a estructura de - l o s ant icuerpos .

"desperd ic iado" , l a s an t i t ox f ans de o r í g en animal que pg - dr ían s e r menos an t i g én i cas y seguras para el uso tapateÚ- t i c o ; han increme ntado el conocimiento de enfermedades hg manas. E l uso de enzimas p r o t e o l í t i c a s ha incrementado e l conocimiento acerca de l a estructura de los anticuerpos. - Las enzimas que t i enen mayor uso son: l a paapína y l a t r i E sina .

1

Uno de l o s mejores u s o s p r á c t i c o s de l a enzima e s -

Hid rÓ l i s i s con P a p a i n a :

En 1942, Peterman demostró que l a papaína rompe l a - IgG en gragmentos que t i enen un c o e f i c i e n t e de sedimenta - ciÓn 5.3 S y 3.7 S y con PM de 45,000. Observó que e l cog f i c i e n t e de sedimentación era s i m i l a r en e l case d e l f r a g mento mayor a l obtenido después de una d i g es t i ó i i con peps i - na.

Estudios s im i l a r e s hechos rec ien iemente en IgG iiuua- na t ra tada con papaína dá fragmentos con Pm de 47,000, a l - gunos de l o s cua les r e t i enen su ac t i v i dad de ant icuerpo.

Peterman uso papaína cruda y c r i s t a l i n a en sus estu- d i o s o r i g i n a l e s , l a enzimcs. c r i s t a l i n a no estaba aún d i s p -

n ib l e . Recientemente P o r t e r demostró que l a h i d r ó l i s i s de IgG de cone jo con papaína c r i s t a l i n a , aunado con t é cn i cas r e f inadas de separación diÓ dos t i p o s de fragmentos. Uno - de e l l o s ( f r a c c i ó n I y I1 6 frgamento Fab), l a a c t i v i dad - de ant icuerpo f u é r e t en ida ; e l o t r o fragmento f u é c r i s t a l i zab le y no d í o a c t i v i d a d ( f r a c c i ón I11 Ó Fc ) .

Las observac iones de P o r t e r deseRcadeharon estudios de h i d r ó l i s i s enz imát icas de l a s inmunoglobulinas. I

Rompimiento con Papaína c r i s t a l i n a ’ i

150 mg de gamma g l obu l i na y 1.5 mg de mercuripapafna son d i s u e l t o s en 10 m l de Bu f f e r de f c s f a t o de sodio 0.01

M pH 7.0. 0.01 M de c i s t e i n a , 0-002 M de e t i l énd i smino tg - t r a c é t a t o de sod io (EDTA): l a so luc ión es incubada durante 16 horas a 37OC. Después e s d i a l i z a d a contra Bu f f e r de - ace ta to 0.01 M pH 5.5 para cromatogra f iar en CM-Celulosa (0,71 meq/g). l a s dimensiones de l a columna son 2.L X 35 cm y l a camara de mezclado d e l g rad i en t e en de 1.2 1, Los Bu f f e r s son a c e t a t o de soi i io 0.01 M pH 5.5 con grad iente a 0.9 M de a c e t a t o de sod io pH 5.5.

Los es tud ios subsecuentes han demostrado que no son espec ies homogpeneas o subunidades exactas pero son proiiu - c idas a r t i f i c i a l m e n t e mediante e l tratamiento de una enz i - ma capaz de a taca r en l o s en laces pépt id icos .

Las l lamadas f r a c c i one s 1.11 y III están cons t i tu i - das po r fragmentos s im i l a r e s Fab pero son der ivados de d i - f e r e n t e s moléculas de inmunoglobulinas.

.

Se han propuesto v a r i a s mod i f i cac iones a l p r o c ed i -

- 9 9 -

* P o d r í a p i o b a r s e p a r t í c u l a r m e n t e p a r & e l uso d e e s t 2

d i o s r e f i n a d o s d e los f r a g m e n t o s . Cebra y c o l a b o r a d o r e s - han demostrado d i r e c t a m e n t e que a1 f r a c c i o n a m i e n t o d e l a - IgG de c o n e j o se r e a l i z a en dos e t a p a s c o n s i s t e n t e s er. l a p r o t e ó l i s i s y rompimiento de e n l a c e s d i s u l f u r o .

DespuLs del t ratamiento con p a p a f n a i n s o l u b l e en - agua, un promedio de c i n c o e n l a c e s p e p t í d i c o s p o r m o l é c u l a f u e r o n ro to ls s i n ningun cambio en e l PM. E l t r a t a m i e n t o - s u b s e c u e n t e c o n c i s t e í n a causa l a p r o d u c c i ó n de un c o e f i c i e n t e de s e d i m e n t a c i ó n de 3.5 S

d e fragmentos

/

D o c i e n t o s mg d e gamma-globulina en N a C l 0.9% ( a j u s - ndo e l pH a 8.5 y c o n t e n i e n d o EDTA 0.002MO. es mezclado - con d i e z mg de enzima i n s o l u b l e . A n t e s de l a a d i s i ó n , l a enzima e s l a v a d a en c i n c o volumenens de N a C l 0.9%. L a enzima es e n t o n c e s r e s u s p e n d i d a m e d i a n t e a g i t a c i ó n , y l a - p r o t e ó l i s i s puede s e g u i r s e mediante t i t u l a c i ó n con N a O H - 0.1 N en un pH de 8.5 y a 2 5 O C . La enzima i n s o l u b l e en - agua se remueve r á p i d a m e n t e a un t iempo deseado p o r i i l t r a - c i ó n en papal Whatman No 1 . L a r e d u c c i ó n de los h i d r o l i z a - dos se r e a l i z a en N a C l 0.9% c o n t e n i e n d o 0.01M de c i s t e f n a a pH de 8 . 8 y 3 7 O C d u r a n t e d o c e h o r a s .

H i d r Ó l i s i s c o n P e p s i n a .

Numerosos e s t u d i o s han s i d o r e p o r t a d o s que i n d i c a n - que l a p e p s i i i a r e d u c e en Pm de l a s i n m u n o g l o b u l i n a s s i n - d e s t r u c c i ó n d e su a c t i v i d a d .

La h i d r ó l i s i e con p e p s i n a ha s i d o e x t e n s a m e n t e estu- d i a d a p o r N I s o n o f f y r o l . Sus t r a b a j o s i n d i c a n que el trc t a m i e n t o de gamma-globulina G de c o n e j o t r a t a d a con p e p s i - na p r o d e c e g r u p o s d e fragff ientos con c o e f i c i e n t e s de s e d i -

- 1co -

miento de h i d r ó l i s i s .

L a h i d r ó l i s i s puede s e r suspenaida mediante l a adL - c iÓn de: N - e t i l é n mele imida ,p-mercur i benzoato Ó yodacetg-

mida.

L a s c o n d i c i o n e s p a r a un rompimiento Óptimo s o n en pH

e n t r e 5 - 6 , en donde en e l c a s o de inmunoglobul ina de cone-

j s s e f r a c c i o n a en 15 minutos a 37 C . I

I

O

L a s v e l o c i d a d e s de rompimeinto se reducen c o n s i d e r a -

blememte s i se usa mercur ipapaína en a u s e n c i a de a u l f h i d -

los(-SH) que son a c t i v a d o r e s d e l EDTA. En p r e s c e n c i a de - c í s t e i n a 0.01 M , e l 80% de l a inmunoglobul ina humana y de

c o n e j o son f r a c c i o n a d a s en un l a p s o d e 10 minutos y a pH - de 6.0 y una temperatura de 37OC. La v e l o c i d a d de h i d r ó l i

s i s d e inmunoglobul inas d i f i e r e de d i f e r e n t e s a n i m a i e s en

e l s i g u i e n t e orden d e c r e c i e n t e : c o n e j o , humano, b o v i n o , - e q u i n o , p o r c i n o .

L a c r o m a t o g r a f í a d e l h i d r o l i z a d o de p a p a í n a de l a s inmunoglobul inas humanas en CM- C e l u l o s a en a l g u n a s condi-

c i o n e s usadas p a r a l a s de c o n e j o , f a i l a p a r a r e s o l v e r l o s .

fragmenkos F a b y F c . La separticmi puede r e a l i z a r s e en - D U E - C e l u l o s a ( 0 . 9 meq/g) d e n t r o de l a s s i g u i e n t e s c o n d i - c i o n e s : tamaño de l a columna 2 X 60 cm. &ara d e mezclado

500 m l . B u f f e r p a r a g r a d i e n t e de e l u s i ó n : f o s f a t o de sodio

de 0.005 a 0.5 M pH 7.8.

H i d r Ó l i s i s con papaína i n s o l u b l e :

E s t e ~ método t i e n e l a v e n t a j a de minimizar l a i n e s p e - c i f i c i d a d de p r o t e ó l i s i s en l a p r o d u c c i ó n de f ragmentos de

inmunoglobul inas .

4

mentación de 5 S que equiva len a PM apróximadamerte de - 106,000. Es te fragmento cont iene l a f r a c c i ó n de l a cadena pesada que correspoende a l a f r a c c i ó n Fc: es d i v a l en t e y es capaz de p r e c i p i t a r con ant ígenos. La reducción de es- t e fragmento con mercaptanos rompe e l Enlace d i su l f u r o - 16- b i l rpduciéndose fragmentos 3.5 S con Pm de 56,OOC. Hay e v i denc ias de qu el en lace d i su l f u r o que enlaza a l o s fragmen t o s 3.5 S es e l en lace en t r e l a s cadenas pesadas. S i e s t e en lace es reducido y l a -globulins e s entonces t ratada - con pepsina, l o s fragmentos 3.5 S son obtenidoe directamen - t e . La r eox idac i ón de e s t o s dá o r i g en a los de 5 S

Dos gramcs ?e gamma-globulina se t r a tan con 20 mg - de pepsina c r i s t a l i z a d a en 76 m l de Bu f f e r de ace ta to de - sodio 0.1 M, pH 4.5. Después de 20 horas a 37'12 , una peque ña cant idad de p r e c i p i t a d o e s removido mediante c en t r i fuga - ciÓn , el pH e s e l evado a 8 con NaOH 1.0 N. y Na SO (25g/

2 4 100 m i ) se añaden go ta a go ta gtemperatura ambiente, con - ag i t a c i ón constante hasta l o g r a r una concentración de 18 g por 100 ml. E l Frec ip i yado que se forma servepara mediante

c en t r i fugac i ón , se C i sue l v e en agua y d i a l i z a contra 4 1 - de B u f f e r de e c e t a t o de sod io 0.1 M. Los fragmentos 5 S pue den entonces se r a i s l a d o s mediante f i l t r a c i ó n en g e l y d%- l i s i s . í 80 I

i

-

i

.' 102 -

.

i I

f

T A B L A S P R U E B A. S Y S O L U C I O N E S

S o & ~ c ¿ d n naiunada de fNH412S04


- Balanza , a n á l i t i c a - Baño a temperatura constante - Barra magnética con cobertura de t e f l ó n - Embudo de t a l l e l a r g o

- Frasco de v i d r i o de 500 m l para almacenamiento

- Matraz Erlenmeyer de 1 l i t r o ( 2 ) - Pape l aluminio - Pape l f i l t r o Wattman No 1 - P a r r i l l a con a g i t a c i ó n magnética - P i c e t a con agua de ionizada - Potenciómetro - Probeta de 250 m l - Soporte i i n i v e r sa l con a n i l l o - Tapón de hule d e l No8 - Termómetro

I

- Espátula I

R e a c t i v o s : . - Agua de ionizada

Método:

1.- E l baño maría se a jus ta a una temperatura cons -

2 . - Se colocan 200 m l de agua deioniPada en e l ma - t r a z Erlenmeyer y se somete baño maria hasta - l o g r a r l a miema temperatura en l a solución; para e l l o se r e c t i f i c a constantemente l a temperatura

lar i te a 5OoC

~

- 103 -

*- .

c

in t roduc iendo e l termómetro.

3.- Se in t roduce una barra magnética con cobertura - de t e f l i n en e l matraz.

4 . - Se pesan 200 g de s u l f a t o de amonio 5.- Una v e z l o g rado que el agua tenga una temperatu-

r a de 5OoC, e l matraz se t r a n s f i e r e a una pa r r i - iicr con agi tacuón magnética.

6.- La p a r r i l l a se a jus ta de t a l forma que l a tempera tura d e l agua permanezca constante a 5OoC.

7.- E l crgua se somete a a g i t a c i ón y se añade e l sul - f a t o de amonio, l a so luc ión se a g i t a derante una hora y para e v i t a r l a evaporación, el matraz se

cubre con un tapón de hule d e l No 8. 8.- La so luc ión se de j a reposar derante toda Ba ng -

9.- La so luc ión se f i l t r a por igravedad sobre un pa - - che a temperatura ambiente.

pel f i l t r o Wattman del No 1 .

10.- La UoluciÓri f i l t r a d a se elmacena en un f r a s c o a temeratura ambienie por tiempo i nde f i n i do .

- 104 - I

Duffen de 7nin-HCe 0 . 7 5 17 pK 8 . 1

M a t e r i a l y equ ipo :

I i a i a n z a a n á i i t i a a

E s p á t u l a A g i t a d o r m a g n é t i c o Vaso de p r e c i p i t a d o de 1 1 P o t e n c i ó n i e t r o

Matraces a f o r a d o s de 1 1 Embudo Buchner

Matraz K i t a s a t o de 2 1 P i c e t a Bomba d e v a c i o P a p e l a l u m i n i o

I

Re a c t i v o s :

T r i s ( h i d r o x i m e t í n amino metano)

HC1

Método :

1 . - P r e p a r a r una s o l u c i ó n s t o c k de T R i s 0.3 M , que - 2.- Hacer una s o l u c i ó n 1 N de HC1 (83ml/ 1 de sol'n) 3.- A 500 m l de l a s o l u c i ó n s t o c k de T r i s se l e a j u s -

t a a l pH a 8.1 con NaCl 1 N. 4 . - A l a s o l u c i ó n con e l pH a j u s t a d o se a f o r a con

agua d e i o n i z a d a a 1 1.

e q u i v a l e a 36.3 g/l de s o l u c i ó n

- 5.- E l B u f f e r s e f i l t r a en v a c i o o p o r gravedad. 6.- A p a r t i r de é s t e , puede p r e p e r a r s e o t r o s de menor

M o l a r i d a d .

I - 105 -'

Q

7 . - Para preparar e l Buffer de 0 . 0 1 5 M solamente debe h a c e r s e una d i l u s i ó n 1 : l O

6. - S i e l B u f f e r s e usara p a r a Cromatografia, s e de- a e r e a mediante vac io con e l f i n de que no se - ocluya a i r e dentro de l a columna.

.. l @ g ..

* = Prueba de los SO4

fPaur8a 1 )

M a t e r i a l :

- B a l a n z a a n á l i t i c a - Embudo pequeño de t a l l e c o r t o

- E s p á t u l a - F r a s c o de 100 m i - G r a d i l l a - Matraz a f o r a d o de 100 m l - P a p e l a l u m i n i o

- P í p e t a s s e r o l ó g i c a s de 5 m l ( 2 ) - Tubos de ensayo (13 X 100 m m )

R e a c t i v o s :

Agua d e i o n i z a d a

BaC12

Método :

1. - P r e p a r a c i ó n de una s o l u c i ó n a l 1 % (0.C5M) de BaC12 A) S e p e s a 1.0 g de BaC12 y s e v i e r t e d e n t r o d e l

matraz a f o r a d o de 100 m l con ayuda d e l embudo, - s e d i s u e l v e con 40 m 1 de agua d e i o n i z a d a , una

vez d i s u e l t o s e a f o r a l a s o l u c i 6 n a 100 m l . 2.- S e c o l o c a n 5.0 m l de BaC12 a l 1 % en un tubo de -

ensayo y s e añade i g u a l volumen de l í q u i d o s i a l i z a n t e .

- 107 - I

.* i

c

Evaiuacióii :

Se cons idera como reac ió i i p o s l t i v a cuando a l mezclar

e l l i q u i d o d i a l i z a n t e con l a so luc ión de BaC12 aparece un p r e c i p i t ado blanco, en e s t e caso s e l l e v a a cabo l a s i gu i en t e reacc ión de sus t i tuc i ón : .

I

4 2 NH; C1- t BaSO

La r eacc i ón e s n ega t i v a cuando no aparece i n d i c i o 'de

p r e c i p i t a c i ó n d e l BaSO que e s una s a l i nso lub l e . 4

0. C o c a 0 -c 3 5 u L<

c O

7 o u i \ o m m m o M c - ~ m m m

a, - 7

a

.,-

Tie l e s f i g u r a s ( t i p o ) 8-1 1 o b i e n i d a s pcr Intzucoeiac-

t r o f o r é s i s de i a Igp. p r o c e d e n t e de 5 u e r c d a poci .ent ,e con - Kieloma y s u e r o normal h u m t ~ i - . ~ ir icubarh ccin t r o f c i c i t c ~ s de Endan:o,?:bc. h i d c l y t i c a ; s e puede O ' C S E T F S . ~ u n c:smtiio en l a - mcl-!j.lidad % l ? c t r o f o r é t i c a de l a I g A . E s t e mísmo c e n b i o - puede observarE:e cusriUc. 1.q IgA e e s c . ~ e t , i d a a u n a t?.rlrÓli-- sis e n z i m á t i c a c c n T r i p s i d a . dc:rerit.a L h o r a s a 37 C .

O

Tomando en oUe.nta l a h í d r ó l i s i s enzim6.t ica J; los rg suit.adcs f i e p c r t a d o s F o r Fle i i t . y c o l a b o r a d o r e e nos h a c e p e g sar que ese c a ~ b i o en l a mobi l idac! ( n a y o r pars l a s mueg - t r a s obtenide,z d e s p u é s de I n c u k e r wri I c e t r o f c z o l t o s t r a - - tadcs con t r i t ó n X - i C o ) , puede & t r i t s u i i * s e 8 uc e f e c t . c e c z i m á t i c o .

E l T r i t o r . S-ICO actúa ccmo d e t e r g e n t e scbre I C s trg- f o s o i t o s f a v o r e c i e n d o 3 6 1iberac j .Cn d e l c o n t e n i d o i n t r a c e - - l u l a r ; y s i tomemos en c u e n t a que se t r a t a de ma e n d o p e p t i dasa es ta puede ser s i n t e t i z a d a el. igual que un m e t a b o l i t o secunda ris.

S e nhtuvo un l i g e r o e f e c t o s o b r e e l C a l o s t r o , s i e m p r e y cuando l a i n c u b a c i ó n f u e s e mayor que p a r a l a s mestrag - de M i e l c n e y suero normal humano. F s t o es c o n g r u e n t e con - l o s d a t o s r e p o r t a d o s en l a b i b l i o g r a f í a ; pues e s l a s e c r g - c i ¿ n en donde predomina e l i s o t i p o 2 , que e e r e s i s t e n t e a l e f e c t o p r o t e o i í t i c c .

No R e afirmar c a t e g o r i c a m e n t e qua l a enzina c . 0 2

c e n t r a d a ?6 un e f e c t c r i o t a b l e ; p u e s es n e c e s a r i o t e n e r u n a como p a t r ó n de comparación.

.I

- 110 -

e- - 4

E l cambi.0 en la mol:~i l jdad e l e a t r o f o r e t i c a puede s e r causada POT m a contorc ión de l a molécula Ó p o r su fragmen t.aci.Ón. Cualquiera de e s t o s casos causa u.fi cambio sobre - e l fragmento Fab y p o r los tantc l a IgA no pueden e v i t a r - e l acop¡umiento de l a & ¿ c . m c d a h ¿ & o L y t i c a scbre l a s cálc l a s e p i t e l i e l e s .

, ,,

, I

f

-.

7

- 1 1 1 - I

.

V. - DISCUSION:

E : x f s t e una s u s t a n c i a i n t r a c e l u l a r en le$. & , r o f o z c i t o s

de-EndamosUa h i d o l y t i c a quo p r e s e n t a UEE a c t i v i d a d enzima t i c a s e m e j a n t e a l a p r c d u c i d a p c r l a t r i p s i n a c.obre l a I g A

p r o c e d e n t e de suel-o normal . humarici y IC Mieioma. E l e f e c t o

e s mayor s o b r e l a IgA p r c . c s d e r t e de suero n o r e a l humano,. - y mencx' el l a p r o c e d e n t e de c a 1 o s t ~ i . o . El gradG d e l e f e c t o depende d e l i s o t i p o de l a I g A SrF-dcminante en cada una de

l a s f u e n t e s .

Es n e c e s a r i o h a c e i u s o de técnicas de maycr s e n s i t & -

l i d a d p a r a h a c e r l a d e t e c c i ó n de l o s f ragmentos Fak ( ) y

F c ( ).

Tembién s e n e c e s i t a h a c e r ciÓn de l a p r o t e a s a h a c i é n d o un IgA de las d i f e r e n t e s f u e n t e s .

Se r c q r i e r e d e l e n t i s u e r c

una i n d u c c i ó n . de l a p r o d u c c u l t i v o suplementado con -

e s p e c í f i c o para. d e t e c t a r - el i s o t i p o de l a IgA, d e tal Porlra. qUe se l o g r e un sustrg- t o s u c e p t i b l e de s e r a t e c e d o .

Dado que l a a m i b i a s i s e s uno de los problemas Gue

más a q u e j a n a l a p o b l a c i ó n mexicana , se debe e n c a u s e r mayo r e s E s f u e r z o s a e s t e t i p o ?.e i r v e s t i g a c i ó n ; h a s t a l o g r a r - e l i m i n a r l o .

-112 -

I

Q

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