Introducción

Practica 3: Técnicas inmunológicas

Las técnicas inmunológicas son aquellas que se basan en la especificidad antígeno-anticuerpo, este tipo de técnicas han evolucionado de manera importante en las últimas décadas, ya que se han desarrollado pruebas con mayor especificidad y sensibilidad. Entre las técnicas más utilizadas se encuentran: la inmunofluorescencia indirecta (IFI), el ensayo inmunoenzimático (ELISA), el ensayo múltiple y la electroinmunotransferencia (EIT). Cada una de ellas presenta diferencias pero conservan el fundamento general que es el reconocimiento de la unión antígeno-anticuerpo, por lo que presentamos las características más importantes de dichas pruebas, la reacción de Ag-Ac pose dos características intrínsecas, la afinidad y la avidez (Diego F. Hernández Ramírez, 2010).

Afinidad: " La fuerza combinada de las interacciones no covalentes entre un sitio de unión de antígeno único es la afinidad del anticuerpo por ese epitopo"; Avidez: Se denomina a la fuerza de unión entre un antígeno y un anticuerpo polivalente.

REACCIONES DE PRECIPITACIÓN.

Este tipo de reacción Permite detectar la presencia y cantidad de antígenos y anticuerpos específicos, ya que detecta principalmente un Ac que es la IgG (Inmunoglobulina G).

-Inmunoelectroforesis: es una técnica cualitativa que permite la identificación de diferentes compuestos proteicos presentes en muestras biológicas a través de arcos de precipitación, esta técnica se realiza preferentemente en geles de agarosa y en ella se diferencian dos etapas:

1. La muestra se somete a una separación electroforética.

2. Una vez realizada la separación, las proteínas interaccionan con los Ac específicos aplicadas en el agar en un canal paralelo al eje de migración,

posteriormente se empiezan a observar arcos de precipitación cuya forma y posición dependen de las características inmunoquímicas y de la concentración de cada proteína.

Esta curva de inmunoprecipitación, también conocida como curva dosis-

respuesta, constituye la base de la mayoría de los procedimientos inmunológicos para la cuantificación de proteínas.

(Internacional)

REACCIONES DE AGLUTINACIÓN. Son útiles para la detección de antígenos y anticuerpos. Su fundamento es inducir una agrupación microscópicamente visible de partículas, causada por interacciones antígeno anticuerpo que forman puentes entre ellas.

ENZIMOINMUNOANÁLISIS: ELISA. Se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro

Reacciones de inmofluorescencia (IF), empleada para identificar anticuerpos o antígenos específicos. En este caso utiliza Ac conjugados con fluorocromos las cuales son moléculas que al ser excitadas con la energía de una determinada longitud de onda son capaces de emitir energía de una longitud de onda mayor, dentro de esta técnica se tienen dos tipos:

-IF directa, permite la detección de Ag

-IF indirecta, permite la detección de Ac

La Citofluorometría de flujo es una técnica que permite el análisis rápido de la morfología de las células en un medio liquido.se basa en la reflexión/refracción de un delgado rayo laser que incide sobre cada célula según va asando. La citofluorometria analiza, además, la presencia/ausencia de proteínas celulares para las que existan una anticuerpo, o parámetros bioquímicos (calcio…) para los que existía un fluoroforo adecuado. (c.lopezlarrea, 1995)

- Identificación de marcadores celulares con anticuerpos.

- Fenotipificación por antígenos de superficie.

- Detección intracelular de iones o moléculas.

- Estudios de activación de células: monitoreo de concentraciones intracelulares de Ca2+ y otros iones, activación de factores de transcripción, fosforilación de proteínas, etc.

Western Blot

También llamado Inmunoblot • Técnica utilizada para identificar una proteína en una muestra que contiene varias proteínas

Las proteínas de la muestra se separan mediante electroforesis en gel en función de suPeso molecular• A continuación se utiliza un anticuerpo específico para detectar la proteína de interés• El resultado aporta información sobre el peso molecular de la proteína y su cantidadRelativa en la muestra(Veiga, 2013)PRUEVAS INMUNOLOGICAS RAPIDASEs una de las técnicas de inmunodiagnóstico más modernas cuyas principales ventajas son la simplicidad y rapidez de la prueba. Cada vez son más las aplicaciones de esta técnica, tanto en el ámbito de los test, debido a que no es necesario reactivos ni instrumentación adicional, como en el campo clínico. El ejemplo más conocido son los test de embarazo de las farmacias, psa, test de troponina I, y recientemente test sobre el VIH.

RESULTADOS

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ANALISIS DE RESULTADO

El sistema empleado en este test es un inmunoensayo en fase sólida para la detección cualitativa de un nivel anormal del antígeno prostático total (t-PSA) en suero humano.

Su utilidad en diagnóstico radica en el hecho de ser uno de los pocos marcadores tumorales cuya detección por encima de determinada concentración presenta utilidad clínica en el diagnóstico del cáncer de próstata, el segundo cáncer masculino en importancia y el más significativo en edades avanzadas. El test se usa únicamente para obtener un resultado preliminar. En cualquier caso el resultado debe ser interpretado por un profesionalEl principio de la técnica que se realizo es que el suero reacciona con las partículas de látex coloidal que están conjugadas con anticuerpos monoclonales específicos contra PSA que migran por un proceso cromatográfico hacia la zona de reacción. En esta zona, hay anticuerpos contra PSA que reaccionarán con el complejo partículas de látex coloidal-anticuerpos-PSA. Esta reacción origina una línea roja/rosa,INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Negativo:Sólo aparecera una línea transversal AZUL en la zona central del dispositivo de reacción (letra ―C(control)). Siempre debe aparecer esta línea. Positivo: Además de la línea AZUL de control aparece otra línea transversal ROSA/ROJA en la zona central del dispositivo de reacción (letra ―T(test)) marcada. La intensidad de esta coloración va a ser variable según la concentración presente de antígeno.

No válido: Si no aparece una línea C en la zona del control tras 5 minutos de la adición de la muestra. Toda línea que pueda aparecer pasados 5 minutos no tendrá valor diagnóstico.

CUESTIONARIO1.- Investigue que otras pruebas rápidas por inmunocromatografía se pueden utilizar con fines diagnósticos. Dengue: Prueba rápida por inmunocromatografíaDeterminación cualitativa y simultánea deanticuerpos IgG e IgMMuestra de suero, plasma o sangre totalResultados en 20 minutosIncluye bufferVIH: Las pruebas rápidas analizan la sangre de una vena o de una punción del dedo, o liquido oral para buscar la presencia de anticuerpos que combaten el VIH. Así como es valido para todas las pruebas de detección, un resultado reactivo de una prueba rápida del VIH debe ser confirmada por una prueba confirmatoria de seguimiento antes de que se haga un diagnostico definitivo de infecciónHepatitis B (HBsAg): Prueba rápida por inmunocromatografíaDeterminación cualitativa del antígeno de superficiede Hepatitis B (HBsAg)Muestra de suero o plasmaResultados en 10-20 minutos

2.- Mencione tres ventajas de las pruebas de aglutinación frente a las de precipitación.

Aglutinación: es instantánea, se lleva a cabo a temperatura ambiente y el Ag se encuentra particulado.Precipitación: el Ag se encuentra soluble, incubación de 48 horas y a 37ºc.

3.- ¿Qué muestra biológica es la requerida para realizar cada una de las técnicas descritas en esta práctica? Todas son pruebas serológicas, así que se utiliza plasma o suero.

4.- Mencione la utilidad diagnóstica de las pruebas rápidas con fundamento inmunológico.Detectan la infección más rápido utilizando los anticuerpos en el casete donde se va a unir el antígeno.

5.- Mencione dos auto-Ag determinados por inmunofluorescencia en enfermedades auto inmunitaria. Epidermólisis ampollosa Enfermedad mixta del tejido conectivo.

CONCLUSIONESEn esta práctica realizamos la reacción antígeno anticuerpo, como ya anteriormente se citó un antígeno es todo agente extraño que entra en un organismo, una vez en contacto con el sistema inmune desencadena una la respuesta específica del sistema inmunitario, es decir, es capaz de producir anticuerpos específicos para ese agente extraño con el fin de eliminarlo. Por lo que también se entendió que los antígenos suele ser moléculas grandes, se hallan básicamente en la superficie d los microorganismos (capside (virus), capsula, pared bacteriana etc.), el tamaño del antígenos es importante porque va a influir en la capacidad de desencadenar el sistema inmunitario, entre más grande es el tamaño del antígeno; mayor es la capacidad de la respuesta inmunitario.El mecanismo por el cual reconoce los antígenos con anticuerpos es; para que un antígeno que entra a un ser vivo, lo primero que se efectúa es el reconocimiento por parte de los Linfocitos B, después forma una proteínas especificas con el fin de provocar la destrucción de ese antígeno. (Los anticuerpos son unas proteínas globulares llamados inmunoglobulina (igG, igM, igA, igD e igE) Cabe mencionar que la especificidad de este complejo es importante; debido en la región variable, (la región variable son los centros de unión de antígeno con anticuerpo) por lo que cada anticuerpo solo puede actuar sobre los antígenos que pueden establecer enlaces con los aminoácidos de esa zona. Una vez unido el antígeno, es cuando se va a formar la reacción, dicho reacción puede ser de varias maneras, por reacción de aglutinación, que ocurre cuando las moléculas de antígeno se hallan en la superficie de células extrañas en el organismo. Por ejemplo; pensemos que a cada célula se fija varios anticuerpos, cada uno estableces a su vez enlaces con varias células, el resultado va a ser una red complejo para que los fagocitos los reconozca fácilmente y posteriormente los destruya. Un claro ejemplo sería una transfusión sanguínea, cuando una persona recibe un tipo de sangre diferente, los glóbulos rojos va a ser aglutinados por los

anticuerpos del receptor. Otra prueba que se revisó fue la de neutralización cuyo objetivo es que los anticuerpos cuando se une al antígeno bloquea la capacidad de entrada a la célula del organismo; la reacción precipitación, en esta reacción tenemos que pensar que los antígenos están disueltos en sangre (ya sea toxina o bacteria) y cuando se une con anticuerpo forma un complejo precipitado y de esta manera le es fagocitado. La opsonización consiste en que la superficie de las bacterias es cubierta por anticuerpos, la parte constante de cada anticuerpo se va a fijar a los receptores presentes en esa membrana, por lo que los fagocitos captan la parte variable del anticuerpo facilitando su destrucción.Una de las funciones principal es la activación de la cascada del complementoUna de las pruebas realizadas en vivo fue la de antígeno prostático, en la actualidad se sabe que es el mejor marcador biológico que tenemos para detectar cáncer de próstata, aunque tiene una escasa sensibilidad y especificidad, ya que los niveles del PSA pueden verse afectados por muchos factores.La elevación del PSA en plasma es proporcional a la masa tumoral presente y, de esta forma, el PSA en sangre es una gran prueba para detectar la presencia de un cáncer de próstata. Cuanto más avanzado sea el proceso tumoral será más frecuente encontrar valores por encima de la normalidad y éstos suelen ser más elevados.

Bibliografíac.lopezlarrea INMUNOLOGIA [Libro]. - MADRID : cloputence, 1995. - Vol. i.

Diego F. Hernández Ramírez Javier Cabiedes Técnicas inmunológicas que apoyan el diagnóstico de las enfermedades autoinmunes [Publicación periódica]. - mexico DF : DOI: 10.1016, 2010. - 3 : Vol. 6.

Internacional IAC IAC Internacional [En línea]. - http://iacinternacional.com.ar/introduccion/.

Veiga Ariana Western Blot [Informe]. - MEXICO : ABECAM, 2013.

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