3. técnicas de microscopía con luz visible y sus aplicaciones · microscopía de campo claro se...

3. Técnicas de microscopíacon luz visible

y sus aplicaciones

Técnicas de microscopía con luz visible

● Microscopías de campo claro y campo oscuro

● Microscopía de polarización

● Microscopía de contraste de fases

● Microscopía de contraste interferencial (Nomarski)

Microscopía de campo claro

Se contrasta el objeto que se observa del medio que

le rodea o las diferentes partes del mismo objeto

gracias a que la luz que lo atraviesa con respecto a

la que no lo atraviesa presenta diferencias

en su longitud de onda (diferencias de color)

y/o de amplitud (diferencias de intensidad)

3. Técnicas de microscopía con luz visible

Microscopía de campo claro

Int. del fondo – Int. de la muestra% contraste = x 100

Int. del fondo


Microscopía de campo oscuro

La imagen se forma sólo con los rayos difractados por

el objeto.(Es el mismo principio que nos permite ver las estrellas de noche o las partículas de polvo en un rayo de luz cuando entramos en una sala oscura.)

Especialmente indicada para muestras con poco

contraste.


Microscopía de campo oscuro3. Técnicas de microscopía con luz visible

objetivo

muestra

condensadora

diafragma

Microscopía de campo oscuro

La luz se hace incidir muy oblicuamente sobre la preparación.Los rayos que la atraviesan o no, pero que siguen más o menos la trayectoria inicial no son recogidos por el objetivo.Sólo la luz que es difractada por el objeto, o que el objeto refleja casualmente, llega al objetivo.

De esta manera la imagen del objeto aparece clara sobre un fondo oscuro.



Esta iluminación está especialmente indicada para preparaciones delgadas y sin teñir.

Glóbulos rojos


Montaje de organismos vivos del agua


Es especialmente útil para observar células en suspensión.

Permite encontrar fácilmente el plano focal correcto a bajos aumentos en muestras pequeñas y con poco contraste.


Es necesario emplear un objetivo con una A.N. algo inferior a la A.N. que ilumina la condensadora de campo oscuro para evitar que luz directa entre en la imagen.

La eficacia de este sistema también depende de que el haz luminoso sea intenso y no dispersado, ya que sólo se va a utilizar parte de la luz.Para ello se usa una fuente luminosa homogénea y brillante como un filamento incandescente.

Microscopía de polarización3. Técnicas de microscopía con luz visible

LUZ POLARIZADA:Las ondas electromagnéticas son de naturaleza transversal, es decir, el vector de vibración es perpendicular a la dirección del desplazamiento.


LUZ POLARIZADA:Si se restringe la vibración de los vectores eléctricos a un solo plano mediante un filtro se obtiene luz linealmente polarizada respecto a un solo plano de vibración.


LUZ POLARIZADA:Los polarizadores son filtros que contienen moléculas poliméricas de cadena larga orientadas en una única dirección.


LUZ POLARIZADA:Si ahora un rayo polarizado incide sobre una segunda lámina polarizadora, la intensidad y la amplitud de la onda que atraviese la segunda lámina dependerán del ángulo de incidencia respecto a la dirección de polarización.

● Si las dos láminas son paralelas en sus direcciones de polarización, se transmite toda la luz.

● Si las dos láminas son perpendiculares, el rayo no consigue atravesar la segunda.


Polarización cruzadaLa base de la microscopía de polarización.


Birrefringencia:

Existen materiales que poseen doble refringencia.

Esta propiedad es indicativa de anisotropía óptica, es decir, que el comportamiento de la luz al atravesarlos no es el mismo independientemente de la dirección en la que incide.

La calcita, CaCO3, es un material birrefringente.


Birrefringencia:

La luz que entra en un material birrefringente se descompone en dos rayos.

Cada uno está determinado por un índice de refracción y cada uno vibra sólo en una dirección (polarizados) pero a ángulos rectos uno del otro.

Originalmente los polarizadores se hacían de calcita y se conocen como “Prismas de Nicol”.


La técnica explota las propiedades ópticas de la anisotropía para revelar información detallada acerca de la estructura y composición de los materiales.

La finalidad es conseguir contrastar las diferentes estructuras observadas aprovechando que entre ellas pueda haber alguna que sea capaz de cambiar el plano de polarización de la luz, es decir, que haya alguna sustancia birrefringente ella misma.


Los microscopios de polarización incorporan dos láminas polarizadoras. La primera llamada polarizador se sitúa después de la fuente luminosa, generalmente en el soporte de filtros de la subplatina. La segunda, denominada analizador, se dispone entre el objetivo y el ocular. Ambas tienen que girar fácilmente y ser capaces de fijación. También conviene que estén graduadas para que se pueda apreciar el ángulo que se giran.


● Cuando el polarizador se dispone de forma que su dirección de polarización es perpendicular a la del analizador el campo aparece totalmente oscuro en ausencia de la preparación.

● Al colocar la muestra aquellas zonas de la preparación que no sean capaces de variar el plano de polarización de la luz que las atraviesa aparecerán completamente oscuras.Mientras que las que sí sean capaces aparecerán más o menos claras según la magnitud de la variación en el plano de polarización que sufra la luz al atravesarlas.


Dominios de nucleaciónde cristal líquido ferroeléctrico

Coke de petróleo


Almidón de maíz Diatomeas

Microscopía de contraste de fases3. Técnicas de microscopía con luz visible

● La mayoría de los detalles de las células vivas son

indetectables mediante la microscopía de campo

claro porque hay muy poco contraste entre las

estructuras ya que tienen similar transparencia y

son incoloras.

● A no ser que el medio de montaje sea

extremadamente fino, el modo de campo oscuro

puede distorsionar los detalles.


● Es una técnica de aumento de contraste

especialmente indicada para la observación de

muestras transparentes o sin teñir.

Permite observar muestras vivas sin que

previamente haya que matarlas, fijarlas y teñirlas.

● Así, la dinámica de los procesos biológicos se

puede observar y grabar con elevado contraste y

los pequeños detalles de la muestra se ven con

gran claridad.


● Se basa en el hecho de que cuando interfieren

ondas que tienen un determinado desfase se

produce una interferencia constructiva (con mayor

amplitud) o destructiva (con menor amplitud).


+ =

+ =

Interferenciaconstructiva

Interferenciadestructiva


● El objetivo es manipular el desfase de dos haces

de luz para trasladar esas pequeñas variaciones de

fase a los correspondientes cambios de amplitud

que se visualizan como diferencias de contraste.

● Pequeñas diferencias de fase se convierten en

cambios de intensidad.


Luz incidente

Desfase


● El contraste de fases básicamente es un método de

iluminación que trata una determinada porción de la

luz (la que ha sufrido difracción al atravesar el

objeto) de forma diferente al resto (la que no ha

sufrido ninguna alteración) para, a continuación,

provocar que la primera porción de la luz interfiera

con el resto, de manera que resulte una imagen

visible de una muestra transparente.


La formación de la imagen es un resultado de la

interferencia de la luz directa y la luz difractada.

La luz directa (sin desviar) se proyecta por el

objetivo y se extiende de forma homogénea en el

plano imagen en el diafragma del ocular. Allí la luz

difractada causa interferencia y reduce la

intensidad dando lugar a áreas más o menos

oscuras.


Luz de la fuenteAnillo anular

Lente condensadora

Muestra

Lente objetivo

Placa de fase

Plano focal posterior


● El primer paso es separar la luz directa de la luz

difractada. Para ello se coloca, en el plano focal de

la condensadora, un diafragma anular que proyecta

en el infinito la imagen de un haz anular.

Este cono de luz hueco pasa a través de la muestra

sin desviarse y la débil luz difractada por la muestra

se extiende en todo el plano focal posterior del

objetivo.



Lente condensadora

Muestra

Lente objetivo

Placa de fase



● Después se acelera la luz que no se ha desviado

mediante una lámina colocada en el plano focal

posterior del objetivo, que contiene un anillo,

llamado anillo de fase.

Este anillo es más fino que el resto de la lámina de

forma que la luz que pase a través de él (la luz no

difractada) viaja una distancia más corta al

atravesar el objetivo que la luz difractada.



Lente condensadora

Muestra

Lente objetivo

Placa de fase



● Así, cuando la luz directa y la luz difractada llegan

al plano imagen están desfasadas en ½ λ y cuando

interfieren lo hacen destructivamente y los detalles

de la muestra aparecen oscuros sobre un fondo

más claro.

● El efecto final es la imagen de una muestra que

tuviera variaciones de densidad en lugar de

variaciones de índice de refracción.


AJUSTE DEL MICROSCOPIO:

● La correspondencia entre las placas de fase de los

objetivos y los diafragmas anulares de la

condensadora ha de ser exacta. A cada placa le

corresponde un diafragma anular y el centrado de

ambos ha de ser exacto.

● El centrado se realiza con una lente de Bertrand

que permite enfocar el diafragma anular del

condensador.


AJUSTE DEL MICROSCOPIO:

● La iluminación de Köhler debe estar ajustada y el

diafragma de apertura completamente abierto para

trabajar en modo contraste de fases.


AJUSTE DEL MICROSCOPIO:● Para centrar las placas con el diafragma anular se

inserta la lente de Bertrand y se enfoca. Se gira el disco de la condensadora para insertar el diafragma anular que corresponda y se hacen coincidir con unos tornillos de ajuste


Limitaciones:

● Las imágenes presentan “halos” alrededor de los

detalles.

● Puede empeorar la resolución.

● No funciona bien con muestras gruesas porque los

desplazamientos de fase ocurren en áreas ligeramente

por debajo o por encima del plano de foco.

Estos desplazamientos pueden confundir y distorsionar

los detalles de la imagen.


Pescado cteonide(teleosteo)

Células ováricasde hamster

Glóbulos rojoshumanos

Microscopía de contraste interferencial

Nomarski

DIC


Microscopía de contraste interferencial 3. Técnicas de microscopía con luz visible

El principio es el mismo que en el caso de una placa de

fases:

La interacción de los rayos difractados por el objeto con

rayos que no lo hayan atravesado de manera que se

puedan apreciar diferencias de amplitud derivadas de

esta interacción.

● Pequeñas diferencias de fase se convierten en

cambios de intensidad entre las zonas adyacentes.


● El dispositivo consiste en la separación de los rayos

provenientes del condensador en dos haces que viajan

en direcciones ligeramente diferentes.

● Después de atravesar el objeto los dos haces son

recombinados.

● El diferente desfase causado por el objeto en los haces

se transforma en un contraste de amplitud al sumarse o

restarse las fases de éstos.


● Si la iluminación es monocromática la imagen

presentará un contraste de intensidad con el fondo.

● Si la iluminación es policromática, como la variación de

fase introducida por el objeto depende de la longitud de

onda, el resultado será una imagen de colores sobre un

fondo elegible (mediante el ajuste de la diferencia de

camino entre los haces).

● Esta técnica elimina los efectos de halo de la

microscopía de contraste de fases.

Microscopía de contraste interferencial3. Técnicas de microscopía con luz visible

● Los sistemas de contraste diferencial interferencial desarrollados por Nomarski emplean un filtro de polarización para producir luz vibrando sólo en un plano perpendicular a la dirección del haz de luz.

● Este haz pasa a través de un prisma de Wollaston modificado que separa el haz de luz en dos rayos perpendiculares el uno al otro (de modo que no pueden causar interferencia).

● Los dos rayos pasan a través de la lente condensadora y emergen como dos haces paralelos que están extremadamente juntos, pero que tienen una ligera diferencia de caminos.


● El haz separado entra en la muestra y ambos haces son desviados de acuerdo con su interacción con las características de la muestra (grosor, forma e índice de refracción).

● Los dos haces de luz alterados individualmente por sus interacciones con la muestra pasan a través del objetivo y se recombinan por el prisma combinador de haces de Wollaston modificado, después de atravesar el objetivo.

● Esto elimina el corte o distancia y la diferencia de caminos original entre el par de haces.


● Como resultado de haber atravesado la muestra, los caminos de los dos haces paralelos no son de la misma longitud (hay una diferencia de camino óptico) para las diferentes áreas de la muestra.

● Para que ambos haces puedan interferir, las vibraciones de los haces de diferente longitud de caminos se deben llevar al mismo plano y eje.

● Para ello se coloca un segundo polarizador (el analizador) a continuación del prisma de Wollaston recombinador.


● El haz de luz pasa a través del analizador cruzado con el primer polarizador que los lleva al mismo plano y eje.

● Así ocurre una diferencia interferencial entre los dos haces originalmente independientes que se observan como diferencias en intensidad y color.

● Las diferencias en la intensidad de la luz o el color observado dependen de variaciones en los índices de refracción y/o grosor de las muestras.


● Cuando el segundo prisma se coloca de forma que produzca la imagen más gris se produce la visión tridimensional más evidente de la muestra.Rotando la muestra 180º se consigue que las zonas que aparecían elevadas aparezcan hundidas y viceversa.

● Con una fuente de luz blanca, la luz de diferentes colores tiene diferentes longitudes de camino después de atravesar la muestra.Algunas áreas generan interferencia constructiva para un color y destructiva para otros.


Contraste de fases Contraste interferencial

Alga spirulina



Cianobacteria



Glóbulos rojos

Aplicaciones3. Técnicas de microscopía con luz visible

Según la configuración del microscopio:● Microscopios derechos:

● Preparaciones de cortes histológicos y cortes semifinos, frotis, células vivas, muestras microbiológicas, láminas geológicas delgadas, probetas de ciencia de materiales de tamaño reducido, …

● Microscopios invertidos:● Preparaciones de cortes histológicos y cortes semifinos,

frotis, células cultivadas dentro de cámara de cultivo, plancton y microorganismos en suspensión, microorganismos cultivados en placa de Petri, micromanipulación de células y embriones, probetas de ciencia de materiales, trabajo con subplatinas especiales, ...


Según el tipo de iluminación:● Microscopía de campo oscuro:

● Está especialmente indicada para muestras con poco contraste:espiroquetas, flagelatos, suspensiones celulares, técnicas de flujo celular, parásitos, conteo de granos de autorradiografía, ...


Según el tipo de iluminación:● Microscopía de luz polarizada:

● Estudio de todas aquellas estructuras en las que se prevé una cierta ordenación que las hará, probablemente, anisótropas, tales como las paredes de celulosa de las células vegetales, las fibras musculares, etc.

● Casos de interés clínico como la detección de diferentes sustancias minerales en los tejidos: sílice y asbestos en los tejidos pulmonares, mica y almidón en granulomas postoperatorios, etc.



● Estudio de moléculas biológicas altamente ordenadas como DNA, almidón, madera y urea.

● Numerosos cristales, estructuras fibrosas (naturales y artificiales), pigmentos, lípidos, proteínas, huesos y depósitos de amiloide exhiben birrefringencia y por tanto ofrecen información bajo luz polarizada.



● Aplicaciones geológicas, principalmente para el estudio de minerales en secciones rocosas delgadas.

● Minerales naturales e industriales, materiales compuestos tales como cementos, cerámicas, fibras minerales y polímeros.

● Identificación de fibras de asbestos, estudio de la formación rocosa, polímeros naturales y sintéticos, fibras de nylon, etc.


Según el tipo de iluminación:● Microscopía de contraste de fases:

● Obtención de imágenes de elevado contraste de muestras transparentes:Células vivas (generalmente en cultivo) microorganismos, secciones finas de tejido, patrones de litografía, fibras, dispersiones de látex, fragmentos de vidrio y partículas subcelulares (incluyendo el núcleo y otros orgánulos).

● Secciones en parafina o resina sin teñir y muestras congeladas.



● En investigación médica y biológica especialmente en los campos de citología e histología:

● Visualización de componentes celulares internos como las membranas, núcleo, mitocondrias, cromosomas, aparato de Golgi y gránulos del citoplasma en células animales y vegetales.

● Diagnóstico de células tumorales y para ver el crecimiento, dinámica y comportamiento de una gran variedad de células vivas en cultivo.

● Hematología, virología, bacteriología, parasitología, paleontología y biología marina.



● Aplicaciones químicas e industriales: mineralogía, cristalografía y morfología de polímeros. Microcristales sin color, polvo, partículas sólidas y polímeros cristalinos que tienen un índice de refracción que difiere sólo ligeramente del medio de inmersión.

● Productos comerciales como arcillas, grasas, aceites, jabones, pinturas, pigmentos, alimentos, drogas, tejidos y otras fibras.

● Examen de superficies: circuitos integrados, dislocaciones cristalinas, defectos y litografía.

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