3 FACTORES AMBIENTALES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO, DESARROLLO Y REPRODUCCIÓN

DE MICROORGANISMOS.

ROSA MARIA FLORES MORENO

MICROAMBIENTE NATURAL

La producción de células en el ambiente es mucho menor que en el laboratorio, debido a algunas características del medio natural:

• Disponibilidad de nutrientes, suele ser baja.

• La distribución de dichos nutrientes a lo largo del hábitat microbiano no suele ser uniforme.

• Salvo raras excepciones los microorganismos no se encuentran en cultivos axénicos en los medios naturales, por lo que deben competir por los nutrientes.

La alteración de los alimentos es un hecho normal. Entre el 20% y el 30% de los alimentos que se pierden es debido a los microorganismos.

Factores que influyen en el desarrollo microbiano

Factores intrínsecos: (Limitaciones del sustrato)• Disponibilidad de nutrientes.• Incidencia del pH.• Potencial O/R• Contenido de humedad (Actividad del agua)• Componentes antimicrobianos

Factores extrínsecos: (limitaciones ambientales):• Humedad relativa • Temperatura• Composición de la atmosfera

pH

Organismo Margen de PH

Hongos 0 -11

Levaduras 1.5 – 8.8

Bacterias Gram negativas

Margen muy estrecho

Patógenos Margen más estrecho

La función del pH del medio o alimento es modificar el sistema enzimático y el transporte de nutrientes en la célula microbiana.Se ha de tener en cuenta que puede existir un cierto efecto tampón, de manera que cuando un organismo crece en un alimento, sus metabolitos pueden modificar el pH de éste.

Lactobacillus tolera mucho mejor este factor cuando están involucrados los ácidos cítrico, fosfórico y tartárico que en presencia de ácido acético o láctico.

Las patógenas intestinales se desarrollan entre 4.2 y 8.7 mientras que V. parahemoyticus toleran un rango más amplio de pH (4.9 a 10.7)

En ambientes de pH bajo dominan bacterias fermentativas, como las lácticas, las anaerobias y hongos que si bien son neutrófilos como grupo, se favorecen en ambientes ácidos por falta de competencia de las bacterias, los medios de cultivo se acidifican con ácidos orgánicos, láctico, acético, ya que penetran sin disociarse y dentro liberan los protones que alteran el pH interno de las células.

Acidófilos: Intervalos de 2-5

Acidófilas obligadas: Thiobacillus y Archaeas

Sulfolobus y Thermoplasma

Alcalófilos: intervalos de 10-11, Bacillus

Neutrófilos intervalos de 6-8

pH

Actividad de agua (aw)

• Es el principal componente del protoplasma bacteriano; el medio donde suceden las reacciones químicas y sus productos.

• La disponibilidad se mide por un parámetro denominado: actividad de agua (aw) o potencial de agua. Valores normales entre 0.90- 0.99.

• Es la relación del vapor de agua del alimento y la presión de vapor del agua pura, que es 1.

AW =P vapor agua en alimentoP vapor agua pura

HR = AW x 100

• La mayoría de los patógenos necesitan aW superiores a 0,9. Una excepción es S.aureus, que puede crecer con aW de 0,86. Con menos de 0,7 de aW muy pocas podrán crecer y muy concretas.

• Dependiendo de las características de cada alimento tendremos unas condiciones de AW. Los alimentos frescos tiene una Aw de 0,98, y a partir de aquí la AW va bajando.

ORGANISMOS Aw

Mayoría de la bacterias

> 0.93

Bacterias halófilas > 0.75

Levaduras 0.62 – 0.84

Hongos 0.06 – 0.83

Alimentos de baja humedad• AW 0 – 0,6 No hay ningún organismo que pueda crecer. Los más resistentes:

Zygosaccaharomyces rousi necesita 0,62 y Aspergillus rousi necesita 0,64.

Alimentos de humedad intermedia • AW 0,6 – 0,85 No resisten tanto como los anteriores, de manera que puede ser

necesaria la adición de un antifúngico. No podrá crecer ninguna bacteria que requieren 0,9, ni S.aureus que requiere 0,86. Normalmente tendrán pH bajo

Los alimentos desecados son alimentos estables, están diseñados para durar. Pero podemos tener problemas, ocasionados por la reactividad química del alimento. • Oxidación de los lípidos. Enranciamiento • Reacción de Maillard. Reacción entre los grupos carbonilo de los azúcares y los

grupos amino de las proteínas. Da un sabor amargo.

El primer problema se puede evitar asegurando bien el cierre del producto, o por la adición de antioxidantes. El segundo problema es más complejo. Se puede reducir su incidencia reduciendo la cantidad de azúcares, o bien reduciendo el contenido de agua. Al reducir el contenido de agua se reducirá también el riesgo de enranciamiento.

Medios Efectos

Isotónico Turgente, la célula se divide

Hipotónico Plasmoptisis, la célula se llena de agua y si la membrana y pared no resisten la presión osmótica, la célula estalla (irreversible)

Hipertónico Plasmólisis, Algunas células pueden recuperarse al colocarlas en medio isotónico. Caso de conservación de alimentos por alta concentración de sal o azúcares

Presión osmóticaLos microrganismos deben desarrollarse con adecuadas concentraciones de solutos, si esta no se controla, los organismos no se desarrollan e incluso se llega a la lisis celular

Sal y AzúcarSon los conservantes que se usan en mayor cantidad. Ambos actúan por desecación osmótica. Al subir la concentración de los solutos, se podrá provocar la plasmólisis de los organismos presentes. Para conseguir el mismo efecto hará falta 6 veces más azúcar que sal.

Halófilo: discretos (1-6 %) y moderados (6-15 %) de NaCl Halotolerante: crecen en amplio rango de actividad de aguaHalófilos extremos: 17-36 % NaCl

SALINIDAD

En función de su tolerancia a ambientes con baja aw, los microorganismos que pueden crecer en estas condiciones se clasifican en halotolerantes, halófilos y xerófilos según toleren o requieran condiciones salinas o hipersalinas, respectivamente.

Potencial Oxido – Reducción

Se define como la facilidad con la que un sustrato gana o pierde electrones. Se da un diferencial de potencial. Si este diferencial es positivo se oxida la sustancia. Si es negativo se reduce.

Los siguientes tipos de microorganismos: aerobias, microaerófilos, aeróbicos facultativos, anaerobios estrictos. En base al alimento crecerán unos u otros organismos, pero también es importante la presencia de oxígeno en la atmósfera y su capacidad de penetración en ésta.

Puede darse una típica secuenciación, de manera que en el alimento crezcan en primer lugar aerobios, pero a medida que se agote el oxígeno y los componentes del alimento aparecerán otros organismos en un caso típico de sinergismo

Sustancias antimicrobianas presentes en los alimentos

• Se clasifican en dos tipos. Las sustancias que matan organismos son biocídas, así como las que impiden el crecimiento son biostáticas.

• Muchos vegetales pueden tener sustancia antimicrobianas, aunque también las podemos encontrar en los animales. Algunos ejemplos de sustancias con efecto antimicrobiano son inmunoglobulinas, caseína, en la caseína y algunos ácidos grasos libres pueden tener efectos antimicrobianos en determinadas condiciones, lactoferina y el lisozima, presente en huevos y leche.

• En el caso de la margarina, que es una suspensión de microgotas de lípidos en agua, es difícil que se altere, porque en cada gota no hay nitrógeno suficiente para que se multiplique el organismo, por lo que la margarina será más o menos estable.

Existen algunos alimentos más seguros por su estructura, que actúan como barreras biológicas contra la invasión microbiana.

• Clavo contiene eugenol• Ajo contiene allicina• Canela cuenta con un aldheído• Mostaza contiene isotiocianato

Factores intrínsecos de la contaminación de alimentos

Parametros Bacterias Levaduras Hongos y mohos

Condiciones especiales

pH 4.5 – 8Lácticas3.2 – 10.5

1.5 -8.5 0 – 11 Optimas generales

Agua disponible

0.9 – 0.97 0.88 – 0.92 0.64 – 0.80 Osmófilas 0-6Halófilas 0-7Xerófilas 0.61

Potencial redoxEh

Rumen -350Anaerobias

+200 a +400Aeróbicas (oxi)

+200 a +400Aeróbicos (oxi)

Embutidos cárnicos +200 (oxi)

Factores extrínsecos

Organismos T, mínima T. Optima T. Máxima

Psicrófilos -15 10 - 15 18 - 20

Mesófilos 5 - 10 30 – 37 45

Termótrofos 15 42 – 46 50

Termófilos 25 – 42 50 – 80 60 - 85

Los factores de la conservación de los alimentos son tres: T, HR y atmosfera de conservación.

TEMPERATURA: Existen algunos patógenos capaces de multiplicarse en frío, como serían Salmonella, Vibrio o Yersinia. De hecho existen organismos capaces de crecer incluso en el congelador, como los psicrófilos. Los organismos dejan de multiplicarse debido a su necesidad de agua, ya que en condiciones de frío el agua es menos biodisponible, siendo su AW menor a 0,86.

• Si congelamos los alimentos entre –18 y –20º C, estaremos seguros que no se produce crecimiento de los organismos, pero se podrá producir actividad enzimática. Para estar seguros que no se produce ninguna alteración, deberemos realizar ultracongelación, a menos de –40º C.

• Otro factor que se ha de tener en cuenta son los termótrofos, en los alimentos que se venden calientes.

• Muchos organismos pueden continuar replicándose a bajas temperaturas. Vibrio sp puede replicarse a –5°C, mientras que Yersinia enterolítica puede hacerlo a –2°C; su temperatura de crecimiento es de 14°C. Muchas bacterias G- pueden replicarse a temperaturas de tan solo 5° C, de hecho muchas bacterias lácticas pueden replicarse a esta temperatura

Temperatura

Tipo Rango deTemperatura

TemperaturaOptima

M.O

Psicrofilo 0 - 20 15 Algas

Mesofilo 20 - 40 38 E. coli

Termofilo 40 - 70 60 Bacillusstearothermophillus

Hipertermofilos

90 - 115 106 Thermusacuaticus

• El factor temperatura es el más importante para regular la velocidad y el tipo de alteración de la carne. Con índices de 10⁴ y 10⁵ serán carnes no alteradas. Con 10⁶ hay ligeros signos de alteración, de manera que entre 10⁶ y 10⁷ hay grandes indicios, mientras que con 10⁸ ya no es consumible la carne. Con 10⁹ hablaríamos ya de putrefacción.

Humedad relativa

La HR del ambiente circulante en el almacén de los alimentos es determinante para el agua disponible Aw y para el crecimiento superficial de µorganismos.

La relación entre temperatura y HR durante el almacenamiento determina la suceptibilidad de contaminación para cada tipo o fuente de alimento

La HR se equilibrará con el agua del alimento, o como mínimo tiende a ello. Será útil entonces usar humidificadores o desecadores para regular el contenido de agua de la atmósfera. Además para evitar que se equilibre, otra opción es la de usar envoltorios alrededor del alimento, haciendo que éste tenga una atmósfera aislada.

Atmósfera• La atmósfera a la que se encuentra un es básica para su

conservación, sobre todo a nivel de presión parcial de oxígeno y su capacidad de difusión.

• Se observó que había algunos gases que parecían tener funciones inhibidoras del crecimiento de bacterias. Puede ser de utilidad añadir hielo seco, dióxido de carbono sólido, para conservar las frutas. Una atmósfera rica en CO₂ inhibirá el crecimiento de algunas bacterias, pero también beneficiará el crecimiento de otras.

• Controlando la atmósfera del alimento podemos alargar su vida útil. En el caso del pescado es uno de los alimentos que más se altera. En atmósferas controladas, el pescado puede llegar a durar semanas, sin la atmósfera controlada no pasa de unos pocos días. Se cambian los organismos que normalmente alterarían el pescado, como Pseudomonas o Alteromonas, por otras bacterias, con tiempos de generación más largos, de tipo láctico.

Normalmente será la combinación de la regulación de la atmósfera con el control de la temperatura como se alargará la vida útil de los alimentos.

La alteración de los gases ambientales sería otra alternativa para mantener la estabilidad del alimento en cuestión. El almacenamiento bajo condiciones controladas o atmósferas modificadas consiste en introducir o intercambiar O₂ por CO₂, N₂, O₃ o combinaciones de ellos. El O₃ (ppm) en el almacenamiento es efectivo para controlar una variedad de µorganismos por su potencial O/R, la combinación de CO₂ y O₃ se usa de modo eficiente en el almacén de canales de carne, por largo periodo de tiempo. Las bacterias G- son más sensibles al CO₂ que las G+ como las Pseudomonas y las bacterias lácteas y las anaeróbicas de las menos sensibles.

• Aerobios estrictos: los que requieren oxigeno como aceptor terminal de electrones, no proliferan en ausencia de O2. ej. Mycobacterium bovis.

• Microaerofilos: utilizan O2 a niveles muy bajos. Un 12%. No proliferen en la superficie de un medio sólido. Ej. Haemophillus suis

• Anaerobios estrictos: las que no emplean oxigeno para su metabolismo, sino qe obtienen su energía de reacciones fermentativas. Ej. Clostridium tetani

• Anaerobios aerotolerantes: pueden crecer en presencia o ausencia de oxigeno, pero la energía la obtienen por fermentación. Ej. Bacterias acidolacticas.

• Anaerobios facultativos: son bacterias que proliferan mediante procesos oxidativos, utilizando oxigeno como aceptor terminal de electrones, o en anaerobiosis, empleando reacciones de fermentación para obtener energía. Ej. Streptococcus, E. coli

Necesidades de gases

FACTORES IMPORTANTES PARA HONGOSPH

PROMEDIO 2-9

OPTIMO 5.6

TEMPERATURA

PROMEDIO 0-62 Cº

OPTIMA 22-30 Cº

GASES AEROBIOS

CONCENTRACION DE AZUCARES EN EL MEDIO 4 %

CARBONO HETEROTROFICOS

LUZ NINGUNA

Factor Rango optimo Ejemplos en alimentos Efecto principal

TemperaturaPsicrófilosMesófilosTermófilos

Unidades °C 5 - 20 20 – 3020 – 45 30 - 40 >45 55 – 65

Psicrófilos: Alcalígenes, alteromonas, corynebacterium, Flavobacterium, Lactobacillus, Micrococcus, PseudomanasMesofilos: Enterobacterias, Staphyloccus, Enterococcus, Proteus, Aspergillus, Cladosporium, Thamnidium, algunas levadurasTermófilos: Bacillus, Clostridium

Tiempo de generación

HR Unidades %Bacterias 90 – 97Levaduras 60 – 94Hongos 61 – 93

Escherichia, Bacillus, Enterobacter, candida, Saccharomyces, Rhyzopus, Mucor, Aspergillus

Afecta el crecimiento superficial y la Aw del alimento

AtmosferaOxígeno

AerobiosAnaerobiosMicroaerofílicos

Pseudomonas Clostridium Mohos

Lactobacillus

Alto potencial O/RBajo potencial

CO₂ Concentración mayores de 10%

Retarda el crecimiento e hongosReduce la alteración por Pseudomonas, Streptococcus, Proteus y Micrococcus en carne

Oxidante en superficie de cárnicos, inhibidor competitivo del etileno en almacenes de frutas

N₂ En atmósferas controladas se agrega hasta el 100% bajo vacío

Reduce la presencia de Lactobacillus en productos cárnicos

Parámetros extrínsecos en la contaminación y desarrollo microbiano de alimentos

Crecimiento de poblaciones

Es el aumento en el número de células de una población.• Velocidad de crecimiento es el cambio en el numero de

células o en la masa celular, experimentado por unidad de tiempo.

• Durante el ciclo de division celular, todos los componentes se duplican.

Tiempo de generación: es el tiempo que se requiere para que la población se duplique.• Los tiempos de generación varían ampliamente entre las

diferentes bacterias.

Ej. 1 a 3 horas, 10 min, o varios días.

Pseudomonas sp 0°C Tiempo de generación 600 – 700 min20°C Tiempo de generación 50 min

Cultivo puro de bacterias en un medio liquido CURVA DE CREMIENTO

• Fase 1: de adaptación o latencia. El crecimiento de la población no inicia inmediatamente, sino después de cierto periodo de tiempo, el cual puede ser breve o largo, dependiendo de varios factores.

Fase 2: de crecimiento exponencial o logarítmico. Es la consecuencia del hecho de que cada célula se divide en dos. Las bacterias se encuentran en un estado optimo. Su velocidad esta influenciada por temperatura, nutrientes.

Fase 3: estacionaria. El medio de cultivo no se renueva, comienzan a acumularse metabolitos tóxicos, se modifica el pH, los nutrientes se agotan, la velocidad de multiplicación se retrasa y hay un equilibrio entre bacterias vivas y muertas.

Fase 4: de Muerte. Cuando continua el crecimiento en el medio de cultivo viejo se produce una inversión numérica con respecto a la fase exponencial. En este periodo son mas las bacterias muertas que las vivas, hasta que se termina con la muerte de todas.

Si son bacterias con capacidad de esporular, se produce la esporulación en esta fase.

Cultivo continuo

• Un biorreactor es un aparato que se utiliza para obtener un cultivo continuo en medio renovado, permite mantener poblaciones de células en crecimiento exponencial por largos periodos de tiempo.

• Medidas indirectas del crecimiento bacteriano

cámaras de Petroff-Hausser

Medida de la masa de células:

TURBIDIMETRIA

espectrofotómetro

• Método de siembra en espiral en placa. Se trata de una máquina que distribuye el inóculo líquido en la superficie de una placa en rotación con el medio adecuado. El brazo dispensador se mueve desde el centro de la placa hacia el exterior, depositando la muestra en espiral la cánula asociada al brazo va dejando ir un volumen decreciente de muestra, de manera que en una sola placa desciende el orden de magnitud hasta en 4 grados. El recuento se hace usando una plantilla especial, junto con una máquina, normalmente equipada con láser para el recuento. Es un método totalmente automatizado, el hombre no interviene.

Recuento de viables

• Método del Número Más Probable (NMP). Un método estadístico para averiguar el número de organismos. Se basa en la presunción de que independientemente del número de organismos que haya en la muestra, pasado un cierto tiempo, si están los organismos que creemos, la prueba deberá ser positiva. Las tablas que se usan se elaboran mediante programas informáticos.

• La técnica del NMP puede ser más precisa incluso que la de recuento de UFC. Se ha de tener en cuenta siempre que todos los tubos del NMP no pueden ser positivos, ya que en ese caso se debe volver a empezar, pero con una dilución mayor a la empleada.