2recep18 protei-nas g y sistema adenililciclasa

319

Proteínas Gy sistemaadenililciclasa

L

FERNANDO PICATOSTE Y ENRIQUE CLARO

Receptores de membrana ymecanismos de transducción

os receptores de membrana pueden clasifi-carse de acuerdo con los mecanismos impli-cados en la transmisión de la señal al inte-

rior celular. Según esta clasificación, se subdividen en receptores-canal, recep-tores con actividad enzimática y receptores acoplados a proteínas G (fig. 1).Los primeros son proteínas oligoméricas que forman un canal iónico cuyaapertura es modulada por los agonistas, de modo que el efecto primario deéstos se manifiesta mediante un cambio en la polaridad de la membrana. Aeste grupo pertenecen cierto número de receptores de neurotransmisores, comoel nicotínico de la acetilcolina, los ionotrópicos del glutamato o el receptorGABAA. Los receptores con actividad enzimática son proteínas monoméricasu oligoméricas con un dominio intracelular responsable de dicha actividad, lacual se activa tras la unión de los agonistas. Dentro de este grupo se conocenreceptores con actividades guanililciclasa (como los de péptidos natriuréticos),tirosina quinasa (como los de insulina y factores de crecimiento), fosfoproteínafosfatasa (implicados en la activación de linfocitos T y B), serina-treoninaquinasa (como el del factor de crecimiento transformante) e histidina quinasa(descritos en bacterias y levadura). También dentro de este grupo suelen in-cluirse receptores que, sin tener actividad enzimática, reclutan y activanenzimas citosólicos con actividad tirosina quinasa (como los receptores de cito-

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Receptores para neurotransmisores

quinas o las integrinas) o proteasa (Fas y receptores del factor de necrosistumoral, que activan caspasas apoptóticas). Finalmente, el último grupo dereceptores son proteínas monoméricas que, mediante la participación de pro-teínas reguladoras fijadoras de nucleótidos de guanina llamadas proteínas G,activan sistemas efectores, los cuales pueden ser canales iónicos o enzimasgeneradores de segundos mensajeros. Dentro de este grupo se puede encontrarun buen número de los receptores de neurotransmisores.

En los sistemas de receptores acoplados a proteínas G (GPCR) existeuna notable diversidad molecular en todos los componentes que participan.Así, entre los agonistas encontramos aminoácidos, aminas, péptidos y un grannúmero de señales sensoriales. Entre los receptores contamos con más de uncentenar (o un número muy superior si incluimos los receptores de odorantesde la mucosa olfatoria), agrupados en un cierto número de familias. Las pro-teínas G se han clasificado en cuatro grupos según las homologías de secuen-cia de una de sus subunidades (Gα), de las que se han descrito una veintena,si bien la diversidad de las otras dos subunidades que las componen (Gβ, 5variantes; Gγ, 11 variantes), determina que el número de proteínas G indivi-duales pueda ser elevado. El número de sistemas efectores es más reducido eincluye canales de K+ y de Ca2+, así como enzimas, tales como las adenililci-clasas, la fosfodiesterasa de GMP cíclico, las fosfolipasas C de fosfoinosítidosy, posiblemente, la fosfolipasa A2. Estos efectores generan un número tambiénlimitado de segundos mensajeros, como AMP cíclico, inositol trifosfato,diacilglicerol, Ca2+, etc., los cuales regulan actividades celulares a través de lamodulación de algunas proteína quinasas, entre las que podemos contar las

Figura 1 Tipos de receptores de membrana

Receptor-canal

Ion

Proteína G

Receptor acoplado aproteínas G (GPCR)

Actividad enzimática:- Guanililciclasa- Tirosina quinasa- Fosfoproteína fosfatasa- Serina/treonina quinasa- Histidina quinasa

Sistema efector:- Canales iónicos- Enzima (segundos

mensajeros)

Receptor-enzima

321

Proteínas G y sistema adenililciclasa

dependientes de AMP cíclico (proteína quinasa A, PKA), de calcio y fosfolí-pidos (proteína quinasa C, PKC) o de calcio y calmodulina (CaMK), así comolas proteína quinasas activadas por mitógenos, entre otras. Estos sistemasmodulan un buen número de funciones biológicas, entre las que se incluyen lapercepción sensorial, la neurotransmisión, funciones endocrinas, quimiotaxis,etc. Es importante mencionar aquí que los GPCR son capaces de interaccionarcon otras proteínas, además de las proteínas G, incluyendo proteína quinasas,β-arrestina, etc., lo que revela su versatilidad para participar en diversos pro-cesos de señalización. No obstante, aquí nos centraremos en la señalización víaproteínas G. En este capítulo veremos el sistema de la adenililciclasa y revisa-remos, al mismo tiempo, las características generales de los mecanismos detransducción en los que participan las proteínas G.

Sistema adenililciclasa

El sistema adenililciclasa, presente en muchas formas de vida y utiliza-do por un buen número de receptores, emplea la formación del segundo men-sajero AMP cíclico como mecanismo de transmisión de la señal al interiorcelular. El AMP cíclico se genera a partir de ATP por acción del enzima demembrana adenililciclasa y se inactiva transformándose en AMP por acción deenzimas llamados fosfodiesterasas de AMP cíclico, los cuales forman partede un amplio grupo que engloba a 11 familias de isoenzimas capaces de hidro-lizar nucleótidos cíclicos. La mayor parte de las acciones de este segundo men-sajero, desde sus conocidos efectos reguladores de importantes vías meta-bólicas hasta sus acciones específicas en el sistema nervioso central, son con-secuencia de su capacidad para activar la PKA, que fosforila otras proteínasen restos de serina y treonina. No obstante, también se han descrito accionesno mediadas por PKA, como es el caso de la modulación directa por AMPcíclico de factores intercambiadores de nucleótidos de guanina que activanproteínas G monoméricas de la familia Ras.

El sistema adenililciclasa consta de tres componentes proteicos ubicadosen la membrana plasmática: receptores, proteínas G y adenililciclasas. Entre losreceptores hay un cierto número que induce la activación de la adenililciclasa,mientras que otro grupo promueve su inhibición (tabla 1). Tanto unos comootros pertenecen al grupo cuya estructura se caracteriza por la presencia de sietesegmentos transmembrana y entre ellos encontramos un buen número de recep-tores de neurotransmisores, de modo que la mayoría de éstos interacciona conalgún subtipo de receptor acoplado al sistema de la ciclasa. En cuanto a losotros dos componentes, revisaremos sus características por separado.

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Proteínas G: papel en la transducción de señales

La adenililciclasa puede ser modulada por dos subtipos de proteínas Gllamadas Gs, estimulatorias, y Gi, inhibitorias. Estas proteínas son heterotrí-meros que forman parte de una gran familia de proteínas con actividadGTPasa, que engloba diversos subtipos de proteínas G tanto monoméricascomo heterotriméricas con un papel central en la señalización celular, y cuyadiversidad, estructura y papeles funcionales han sido intensamente estudiadosen los últimos años y de las que en otro capítulo de este libro se describen losaspectos estructurales. (Véase «Biología y estructura molecular de las proteí-nas G», a cargo de Elsa M. Valdizan y Ángel Pazos.)

El conocimiento de las características y funciones de Gs y Gi, así comode otras proteínas G, deriva, en gran parte, de las investigaciones sobre el siste-ma adenililciclasa, particularmente en el caso de su estimulación por los recep-tores adrenérgicos β. Una breve reseña histórica de los principales hallazgos eneste campo figura en la primera edición de este manual (Picatoste et al., 1996),

Adrenérgicos (α2A,2B,2C)Dopamina (D2,3,4)Serotonina (5HT1A,1B,1D,1E,1F,5A)Muscarínicos (M2,4)Histamina (H3,4)Adenosina (A1,3)Purinérgicos (P2Y12)Glutamato (mGLU2,3,4,6,7,8)GABA (GABAB)Canabinoides (CB1,2)Lisofosfolípidos (edg1-4,6,8)Receptores de péptidos: Opioides (µ, δ, κ, N/OFQ) Neuropéptido Y (Y1,2,4,5,6) Somatostatina (sst1-5) Angiotensina (AT1,2) Melatonina (MT1,2) Galanina (Gal1-3) LSH, FSH Péptidos quimiotácticos (C3a,5ª, fMLP) Rec. activados por proteasa (PAR1) Quimioquinas (CCR1-10, CXCR1-5, CX3CR1, XCR1)

Tabla 1 Receptores que activan o inhiben la adenililciclasa

Estimuladores Inhibidores

Adrenérgicos (β1-3)Dopamina (D1,5)Serotonina (5HT4,6,7)Histamina (H2)Adenosina (A2A,2B)Purinérgicos (P2Y11)Prostanoides (DP, IP, EP2,4)Receptores de péptidos: Vasopresina (V2) VIP/PACAP (VPAC1,2, PAC1) Melanocortina (MC1-5) Factor liberador de corticotropina (CRF1,2) Calcitonina, CGRP FSH, LSH, TSH

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y relatos más extensos pueden ser hallados en otras revisiones (Birnbaumer,1990; Levitzki, 1988; Lefkowitz et al., 1983; Schramm y Selinger, 1984).

Ciclo de las proteínas GDe acuerdo con el modelo comúnmente aceptado (fig. 2), existe un ci-

clo de disociación y asociación de las subunidades de la proteína G, activadopor intercambio del GDP por GTP en el lugar de unión de estos nucleótidosde la subunidad Gα. Dicho intercambio puede ser promovido por agonistas deGPCR que inducen la interacción del receptor con la proteína G triméricaunida a GDP, generándose un complejo ternario agonista–receptor–proteína G.La proteína G responde con un cambio conformacional que permite la diso-ciación de GDP y la unión de GTP, cuya concentración intracelular es muchomayor, con lo que la proteína G se activa y el dímero formado por las subuni-dades Gβγ se separa de la subunidad Gα. El receptor tiene menor afinidadpor la subunidad Gα que por el heterotrímero, por lo que también se disocia.Tanto la subunidad Gα unida a GTP como el dímero Gβγ pueden modularefectores hasta que la actividad GTPasa de la subunidad Gα la inactiva alhidrolizar el GTP. Esto conduce a la reasociación de las subunidades dandolugar al heterotrímero inactivo, disponible para un nuevo ciclo de activación.Durante el ciclo, la subunidad Gα cambia su conformación pasando por tresestados: heterotrímero, Gα-GTP y Gα-GDP. Si la activación tiene lugar conanálogos no hidrolizables del GTP, la proteína G no se desactivará y los efec-tores serán modulados de forma permanente. Por otro lado, las proteínas Gpueden ser también activadas por factores distintos de los GPCR, como en elcaso del AlF4

-, que mimetiza el fosfato γ ausente en el ADP y promueve ladisociación del heterotrímero o, como se ha descrito más recientemente, por un

Figura 2 Ciclo de las pro-teínas G y papel de los re-ceptores en la modulaciónde efectores

H-R -G

H + R

bg

H

L

H-R -GH GTPG

GDP

GDP

GTP

H-R -a

H O

PH GTP

a GTP

a GDP

2

i

EFECTORES

324


pequeño y heterogéneo grupo de proteínas conocidas genéricamente como AGS(de activators of G-protein signaling), cuyo papel funcional aún ignoramos.

La interacción del receptor con la proteína G también produce cambiosen la conformación del primero, con importantes secuelas funcionales. Éstasfueron analizadas por primera vez en estudios sobre los receptores adrenér-gicos β en membranas de eritrocitos, en las que la competición por agonistasde la fijación específica de antagonistas marcados radiactivamente presentacurvas bifásicas que se resuelven en dos componentes, correspondientes a dosafinidades distintas del receptor por el agonista, llamados RH (componente dealta afinidad) y RL (componente de baja afinidad). Este comportamiento no lomuestran los antagonistas y sus características dependen del agonista, de modoque cuanto mayor es la eficacia intrínseca de éste, tanto mayor es el porcen-taje de receptores en forma de RH y la razón entre las constantes de disocia-ción de ambos estados. Por otra parte, en presencia de GTP o sus análogos lascurvas de competición de los agonistas muestran un solo componente, quecorresponde al de baja afinidad, es decir, los nucleótidos de guanina transfor-man RH en RL. Estos resultados se interpretan asumiendo que RH está consti-tuido por el complejo ternario agonista–receptor–proteína G y RL por el re-ceptor separado de la proteína G. La primera demostración de esta propuestase llevó a cabo al verificar que los receptores adrenérgicos β, solubilizados yseparados por cromatografía de filtración en gel, poseen un mayor pesomolecular aparente cuando han sido incubados previamente con un agonista(que promoverá la formación del complejo ternario) que cuando lo han sidocon un antagonista. Además, el marcaje simultáneo de los receptores, con unagonista tritiado, y de la proteína G, mediante ADP-ribosilación catalizada porla toxina colérica usando [32P]NAD+ como sustrato, permite observar lacoelución de ambas marcas radiactivas en las columnas de filtración en gel,tras incubación de los receptores con el agonista.

La reversibilidad del primer paso del ciclo (formación del complejoternario y disociación del GDP) explica que, en los ensayos de fijación deradioligandos, el GDP también reduzca la afinidad del receptor por los ago-nistas. Por otro lado, la disociación del heterotrímero tras la unión de GTPdetermina que el receptor se libere y explica que, en presencia de concentra-ciones suficientemente altas de agonista y GTP, sólo un pequeño porcentaje delreceptor se encuentre en la forma de alta afinidad por el agonista.

Modulación de efectores por las subunidades de las proteínas GLas proteínas G heterotriméricas son generalmente identificadas por su

subunidad Gα, la cual les confiere especificidad de interacción con los efec-tores. Conocemos 20 subunidades Gα diferentes (21 si consideramos las va-

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riantes en distintas especies) que son expresión de 16 genes, generándose al-gunas de ellas por procesado alternativo de los transcritos primarios (varian-tes de splicing). Estas subunidades tienen pesos moleculares entre 39 y 52 kDay presentan entre un 45 % y un 95 % de homología de secuencia, de acuerdocon la cual se han agrupado en cuatro familias. En la tabla 2 se muestra di-cha clasificación, especificando la distribución tisular y los efectores que mo-dulan. Las subunidades Gα que median la activación de la adenililciclasa per-tenecen a la primera familia, la cual incluye las cuatro variantes de splicing dela subunidad Gαs, dos cortas (GαsS) y dos largas (GαsL), que difieren en elnúmero de aminoácidos, así como la subunidad Gαolf, presente en la mucosaolfatoria y en el núcleo estriado. Las subunidades Gαs también pueden activarun canal de Ca2+ dependiente de voltaje. Los tres tipos de subunidad Gαi, queparticipan en la inhibición de la adenililciclasa y que también modulan algu-nos canales iónicos, pertenecen a la segunda familia. Ésta incluye, además, lasdos variantes de Gαo, que regulan canales iónicos e inhiben la ciclasa, las dostransducinas, que activan la fosfodiesterasa de GMP cíclico en las neuronas dela retina, la Gαgust presente en las papilas gustativas y la Gαz que tambiéninhibe la ciclasa. La tercera familia agrupa las cuatro subunidades Gα (Gαq,Gα11, Gα14, Gα15/16) que activan la fosfolipasa Cβ de fosfoinosítidos y la cuar-ta las subunidades Gα12 y Gα13, que han sido propuestas como moduladorasdel intercambiador Na+/H+, de factores intercambiadores de nucleótidos de

Tabla 2 Familias de subunidades α de las proteínas G

Familia Subtipo Expresión Efectores

UbicuasUbicuasEpitelio olfatorio, núcleo estriadoRetina (bastones)Retina (conos)

Papilas gustativas

UbicuasCerebroCerebro, plaquetasUbicuas

Células hematopoyéticasUbicuas

αsS (x2)αsL (x2)αolf

αt-r

αt-c

αgust

αi1-3

αoA/αoB

αz

αq,11,14

α15/α16

α12,13

Gs

Gi

Gq

G12

↑ Adenililciclasa↑ Canal de Ca2+

↑ Adenililciclasa↑ Fosfodiesterasa

de GMP cíclico

↓ Fosfodiesterasade AMP cíclico

↓ Adenililciclasa↑ Canal de K+

↓ Adenililciclasa↑ Fosfolipasa Cβ

↑ Intercambiador Na+/H+

↑ Rho-GEF/Rho↑ PLCε

326


guanina para las proteínas G monoméricas de la familia Rho y de la reciente-mente descrita fosfolipasa Cε. Además de estos cuatro grupos, se ha descritola existencia de una subunidad Gαh de mayor tamaño (unos 80 kDa), ya quecontiene un dominio adicional con actividad transglutaminasa, y cuya activa-ción parece estar relacionada con la estimulación de una de las isoformas defosfolipasa C. Las subunidades Gα no presentan segmentos transmembrana,pero están modificadas covalentemente en la zona N-terminal por ácido mirís-tico (irreversiblemente), palmítico (de forma reversible) o ambos. Estas modi-ficaciones permiten su asociación con la membrana y también parecen afectara su interacción con las subunidades Gβγ y con algunos efectores. Finalmente,constituyen los sustratos de las toxinas colérica y pertusis que catalizan laADP-ribosilación de restos de arginina y cisteína respectivamente, tienen el cen-tro de fijación de los nucleótidos de guanina y muestran la actividad GTPasa.

Las subunidades Gβγ forman un dímero que sólo puede ser disociado encondiciones desnaturalizantes. En la tabla 3 se muestran las variantes de es-tas subunidades, su distribución y los efectores que modulan. Se conocen cin-co isoformas de las subunidades Gβ, de aproximadamente 36 kDa, que mues-tran entre un 50 % y un 83 % de homología de secuencia, y 11 subunidades

Tabla 3 Subunidades β y γ de las proteínas G

Subunidad Expresión Efectores modulados por los dímeros βγ

β1

β2

β3

β4

β5

γ1

γconos

γ11

γ10

γ5

γ12

γ7

γ2

γ3

γ4

γ3olf

↑ Adenililciclasa (II, IV, VII)

↓ Adenililciclasa (I, V, VI)↑ Fosfolipasa C-β1-3

↑ Fosfolipasa A2

↑ Fosfoinosítido 3-quinasa↑ Canal de K+ (GIRK1,2,4)↓ Canal de calcio (N, P/Q)

↑ Vía de las MAPK (Shc, Raf-1, Ras-GEF)↑ Tirosina quinasas (Bruton, Tsk)

Varios tejidosVarios tejidosVarios tejidosVarios tejidosCerebro principalmente

Retina (bastones)Retina (conos)

Varios tejidos

Varios tejidosCerebro principalmenteCerebro principalmente

Epitelio olfatorio

327


Gγ, de 6-9 kDa, que presentan mayor variedad. Las subunidades Gβ muestranmodificaciones covalentes que incluyen prenilación (con grupos farnesil ogeranilgeranil) y carboximetilación en la cisteína C-terminal, las cuales permi-ten su asociación a la membrana y regulan la interacción del dímero con lassubunidades Gα, los receptores y algunos efectores. No todas las combinacio-nes Gβγ parecen igualmente probables y, si bien son intercambiables entre lasdistintas subunidades Gα in vitro, aún no se conoce bien el grado de especifi-cidad de las interacciones entre ellas, que podría determinar la preferencia porcombinaciones heterotriméricas específicas.

Por lo que respecta a sus funciones, los dímeros Gβγ participan, en pri-mer lugar, en el reconocimiento de las proteínas G por los receptores, los cua-les presentan baja afinidad por las subunidades Gα disociadas. En esta funciónparece existir selectividad de isoformas de las subunidades Gβ y Gγ, como seha mostrado tras inhibición de la expresión de subtipos específicos de dichassubunidades con oligonucleótidos antisentido, lo que ha revelado, por ejemplo,que la modulación de canales de Ca+ en células GH3 por receptores de soma-tostatina y muscarínicos M4 está mediada específicamente por las combinacio-nes heterotriméricas Gαo2β1γ3 y Gαo1β3γ4, respectivamente. La asociación delos dímeros Gβγ con las subunidades Gα las desactiva como moduladoras deefectores y, además, permite a éstas ser ADP-ribosiladas por las toxinas colé-rica o pertusis. La capacidad para desactivar las subunidades Gα fue durantetiempo la principal función asignada a los dímeros Gβγ y, para algunos auto-res, un mecanismo por el que algunos agonistas podrían inducir la inhibiciónde la adenililciclasa, pues las subunidades Gβγ liberadas por activación de lasproteínas Gi pueden asociarse con la subunidad Gαs desplazando el equilibriode disociación de la proteína Gs hacia la formación del trímero inactivo. Sinnegar completamente esta posibilidad, la visión cambió al demostrarse que losdímeros Gβγ también modulan efectores directamente. Los efectos conocidoshasta ahora incluyen la activación de canales de K+, de tres isoenzimas de lafosfolipasa Cβ, de la fosfolipasa A2 en la retina, de la fosfoinosítido 3-quinasa,de receptor quinasas, de algunas tirosina quinasas y de tres de los isoenzimasde la adenililciclasa, además de la inhibición de otros tres de dichos isoenzimas(véase más adelante) y de canales de Ca2+. Estas acciones cesan, al igual quelas de las subunidades Gα, cuando éstas son inactivadas por la hidrólisis delGTP y se produce la reasociación del trímero.

Aspectos cinéticosTodas las proteínas G se desactivan por la hidrólisis del GTP catalizada

por su actividad GTPasa intrínseca, si bien la cinética de este paso varía no-tablemente de unas a otras. Las proteínas G monoméricas son las que presen-

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tan una cinética más lenta, hasta el punto de que necesitan, para hidrolizar elGTP, la colaboración de otras proteínas llamadas GAP (de GTPase activatingproteins). El estudio de las GAP ha conducido a la caracterización de un gru-po de más de una veintena de proteínas, etiquetado con el nombre de RGS (deregulators of G-protein signaling), que poseen un dominio característico deunos 25 kDa que contiene un haz de cuatro hélices α, el cual interaccionatanto con las proteínas G monoméricas como con subunidades Gα de lasheterotriméricas, reduciendo la energía de activación para la hidrólisis delGTP. En algunos casos este dominio aporta un residuo de arginina necesarioen el proceso catalítico, ya que estabiliza el estado de transición de la reacción,y que está ausente en proteínas G incapaces de hidrolizar el GTP sin la ayudade GAP. Esta arginina está presente en las proteínas Gαs y es precisamente elADP que se ribosila por acción de la toxina colérica, lo que conduce al blo-queo de su actividad GTPasa.

La cinética de activación del ciclo es de primer orden respecto al recep-tor, como se pone en evidencia al observarse que la velocidad de activación dela adenililciclasa por análogos no hidrolizables del GTP y agonistas adrenér-gicos β disminuye de forma proporcional a la inactivación de los receptorescon agentes alquilantes, sin que se modifique la máxima estimulación alcan-zada por la ciclasa. Asimismo, en experimentos de reconstitución cambiandola relación receptores adrenérgicos β/proteínas G en membranas de células cyc-

, se observa que una estequiometría 1/10 permite la activación por agonistasde todas las proteínas Gs. Estos datos indican que el receptor actúa como ca-talizador en el ciclo, de modo que una molécula del mismo puede activar va-rias de proteína G, lo cual determina la existencia de amplificación en dichaactivación. Una consecuencia de esto es que la Vmáx y la EC50 para la estimu-lación por agonistas de un efector han de variar de forma hiperbólica al variarla concentración de receptores, lo que ha sido verificado experimentalmentedeterminando los citados parámetros para la activación por agonistas de laadenililciclasa al variar la densidad de los receptores adrenérgicos β en un sis-tema de expresión heterólogo.

La desactivación de la proteína G por la GTPasa dirige el ciclo termo-dinámicamente y hace que éste tenga una cinética de estado estacionario enlugar de una de equilibrio. La constante catalítica de la GTPasa es aproxima-damente dos órdenes de magnitud inferior a la de la adenililciclasa, por lo quela proteína G se mantiene activa el tiempo suficiente para que se forme unbuen número de moléculas de AMP cíclico, generando una amplificación adi-cional a la indicada en el párrafo anterior. Estas amplificaciones característi-cas del ciclo de las proteínas G parecen, no obstante, estar moderadas en elcaso de algunos sistemas mediante la activación de la GTPasa por los propios

329


efectores, que pueden actuar como GAP, como se ha observado en los casos derodopsina-transducina-fosfodiesterasa de GMP cíclico y de receptores musca-rínicos M1-proteína Gq-fosfolipasa Cβ1, de modo que se produce una rápidainactivación del sistema cuando cesa el estímulo del agonista. Además, otrosfactores pueden modular la amplificación y, en general, la cinética de activaciónde los efectores. Por un lado la menor expresión de algún componente del sis-tema puede resultar limitante. En este contexto, se ha observado que, en gene-ral, las concentraciones de las proteínas G son al menos un orden de magnitudsuperior a las de receptores y efectores, por lo que éstos serían factores limi-tantes. Por otro, en los últimos años se han acumulado evidencias de la forma-ción de homo y heterodímeros entre receptores, así como de complejos en losque diversos componentes de un sistema de señalización se asocian uniéndosea proteínas de anclaje, como el descrito en el ojo de Drosophila, donde varioscomponentes de la ruta de señalización iniciada por la rodopsina (fosfolipasaCβ, proteina quinasa C, canal de Ca2+, calmodulina) se unen a la proteínaInaD mediante dominios de interacción proteína–proteína denominados PDZ.

Las amplificaciones constituyen la base de la existencia de reserva dereceptores, ampliamente ejemplificada en el caso de muchos receptores acopla-dos a proteínas G. Ello implica que basta con que tenga lugar un pequeñoporcentaje de ocupación del receptor por el agonista para que se produzca unaimportante fracción del efecto máximo. Es decir, en términos de parámetrosfarmacológicos, los valores de EC50 de los agonistas son marcadamente infe-riores a los correspondientes de KD. Este hecho representa una de las ventajasmás notables de la transducción a través de proteínas G: el sistema responde-rá frente a concentraciones de agonistas relativamente pequeñas (alta sensibi-lidad), aunque las afinidades de este tipo de receptores por sus agonistas seanmoderadas o bajas, lo que, a su vez, determina que las velocidades de disocia-ción de los complejos agonista–receptor sean altas y que las respuestas cesenrápidamente al bajar la concentración de agonistas (alta flexibilidad).

Adenililciclasa. Isoenzimas y regulación por proteínas G

La revisión del sistema adenililciclasa se completa con la descripción delas características del enzima efector. La primera purificación de la adenilil-ciclasa fue descrita en 1985 y el primer isoenzima fue clonado en 1989. Has-ta ahora se han clonado diez isoenzimas de mamíferos (nueve de membrana yuno citosólico) y se han caracterizado parcialmente sus mecanismos de regu-lación por proteínas G y otros factores. Los nueve isoenzimas de membrana(I-IX) son monómeros de unos 120 kDa con una homología de secuencia del

330


orden del 50 %. Por lo que respecta a su estructura, tras un corto segmentocitosólico en el extremo N-terminal, presentan un grupo de seis segmentostransmembrana seguido de un gran dominio citosólico (C1a), de unos 250aminoácidos, al cual sigue de nuevo el mismo motivo estructural de seis seg-mentos transmembrana y otro gran dominio citosólico (C2a). La adenililciclasacitosólica posee también dos dominios semejantes a los descritos, pero carecede los segmentos transmembrana. Esta isoforma no es modulada por proteí-nas G, sino que es activada por bicarbonato, de modo que constituye un sensorde actividad metabólica.

Los dos dominios citosólicos de las adenililciclasas presentan gran ho-mología entre sí, habiéndose observado que ambos interaccionan cooperativa-mente y son necesarios para la actividad catalítica. La estructura de estos do-minios, determinada en homodímeros del dominio C2a de la adenililciclasa II(ACII) y en dímeros C2a(ACII)/C1a(ACV), revela que ambos están constituidospor un sandwich α/β doblado y que se unen en una disposición cabeza–cola.En las dos interfases existen lugares de unión de ATP pero sólo uno es el cen-tro activo, siendo el otro el sitio de unión del activador forskolina. Asimismo,en los dominios citosólicos existen zonas que permiten la interacción consubunidades Gαs, Gαi y Gβγ de las proteínas G y, en algunos isoenzimas (I, IIIy VIII), existe un lugar de unión de Ca2+/calmodulina en el dominio C1a. Tan-to la unión de forskolina como la de la subunidad Gαs promueve la interacciónde los dos dominios y la constitución del centro activo (fig. 3). En cuanto a sudistribución, los isoenzimas I, II, IV, VII, VIII y IX se expresan preferentementeen el tejido cerebral, aunque también se encuentran en otros tejidos, las for-mas V y VI son mayoritarias en tejidos periféricos y la III se encuentra, sobretodo, en la mucosa olfatoria.

Todas las isoformas de membrana son activadas por la subunidad Gαs,pero existen marcadas diferencias entre ellas en lo referente a la modulaciónpor otros factores, estando todas reguladas de forma múltiple. En la tabla 4se resume lo que hoy sabemos sobre la modulación de los distintos isoenzimas

Figura 3 Adenililciclasa. Activación por Gαs y forskolina

ATP

FSKGTPsa-GTP, FSK

C

sa

2aC1a

331


por subunidades Gαs, Gαi, Gαo, Gαz, dímeros Gβγ, Ca2+ y proteína quinasas.En primer lugar, las subunidades Gαi, clásicamente relacionadas con la inhi-bición hormonal de la ciclasa, inhiben las adenililciclasas I, III, V, VI, VIII yIX. Otros miembros de la misma familia de subunidades Gα también inhibenalgunas isoformas: las subunidades Gαo inhiben la ciclasa I y la subunidad Gαzlas formas I y V. Por su parte, las subunidades Gβγ inhiben las adenililciclasasI, V y VI, mientras que activan las isoformas II, IV y VII, si bien, en este caso,la activación requiere la presencia de la subunidad Gαs.

Las concentraciones de subunidades Gβγ necesarias para estos efectosson claramente superiores a las que se precisan de Gαs, por lo que, en la célu-la, estas subunidades Gβγ no provendrán de Gs sino, probablemente, de otrasproteínas G más abundantes, al menos en el tejido cerebral, como las Gi y Go.Por otra parte, diversos isoenzimas de la ciclasa son regulados por incremen-tos en la concentración de Ca2+ y por activación de la PKC. Ambos factorespueden ser el resultado de la estimulación de receptores que, vía proteínas dela familia Gq, activan la fosfolipasa C de fosfoinosítidos, la cual, como se ex-plica en el siguiente capítulo, genera segundos mensajeros que movilizan Ca2+

intracelular y activan la PKC. Bajas concentraciones de Ca 2+ (< 1 µM), ac-tivan, vía calmodulina, las isoformas I y VIII y, en menor medida, la III.Asimismo, concentraciones del orden micromolar de Ca2+ inhiben, directamen-te, las ciclasas V y VI, así como a la IX, en este caso por mediación de lacalcineurina. Por su parte, varios isoenzimas de la PKC activan in vitro las

Isoen- Distribución αααααs αααααi αααααo αααααz βγβγβγβγβγ Ca2+ Proteínazima quinasas

I Cerebro, ↑ ↓ ↓(βγ) ↓ ↓ ↑(CaM) ↑(PKC),glándula suprarrenal ↓(CaMK-IV)

II Cerebro, músculo, ↑ ↑(αs) ↑(PKC)pulmón

III Epitelio olfatorio, ↑ ↓ ↑(CaM) ↑(PKC),cerebro (CaMK-III)

IV Cerebro ↑ ↑(αs) ↑(PKC)

V Miocardio, cerebro ↑ ↓ ↓ ↓ ↓(<1 µM) ↓(PKA),↑(PKCα/σ)

VI Amplia ↑ ↓ ↓ ↓(<1 µM) ↓(PKA,PKC)VII Cerebro, plaquetas ↑ ↑(αs) ↑(PKC)

VIII Cerebro, pulmón ↑ ↓ ↑(CaM)

IX Cerebro, músculo ↑ ↓ ↑(Calcineurina)

Tabla 4 Isoenzimas de la adenililciclasa. Distribución y regulación por subunidades de lasproteínas G, Ca2+ y proteína quinasas

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adenililciclasas I, II, III, IV, V y VII, e inhiben la VI, mientras que la PKAinhibe las formas V y VI, y algunas CaMK reducen la actividad de los subtiposI y III.

De acuerdo con estos datos, se ha propuesto clasificar los isoenzimas dela adenililciclasa en tres grupos. En el primero se hallarían las isoformas I yIII que son activadas por Ca2+/calmodulina e inhibidas por subunidades Gαiy Gβγ y por CaMK, en el segundo los isoenzimas II, IV y VII, activables porsubunidades Gβγ (en presencia de Gαs) y PKC y en el tercero los isoenzimasV y VI, inhibibles por subunidades Gαi, Ca2+ y PKA. Los isoenzimas VIII y IXpresentan propiedades de regulación que permitiría encajarlos en el primer ytercer grupo, respectivamente

Este complejo conjunto de modulaciones indica que el sistema de laadenililciclasa puede ser controlado por más receptores que los estrictamenteacoplados a las proteínas Gs o Gi. Su significado funcional está relacionado,probablemente, con la distribución de los isoenzimas y las diferentes proteínasG, así como con las concentraciones a las que actúa cada regulador. Así, laactivación en el tejido nervioso de las adenililciclasas II, IV y VII por lassubunidades Gβγ, en presencia de subunidades Gαs, constituye un caso de re-gulación condicional, pues exige la activación simultánea de proteínas Gs y deproteínas Gi o Go. Estos subtipos de adenililciclasa muestran alta expresión endicho tejido, en el que también son abundantes las proteínas Gi y Go, de modoque pueden proporcionar la alta concentración de subunidades Gβγ requerida.Esta regulación puede explicar la repetida observación de que la activación dela ciclasa por estimulación de receptores acoplados a la proteína Gs es poten-ciada por receptores acoplados a otras proteínas G, como las Gi o Go. Segúneste razonamiento, este tipo de regulación por subunidades Gβγ no se da enlos isoenzimas V y VI, que se encuentran preferentemente en tejidos periféri-cos, donde las proteínas Gi y Go son menos abundantes.

Los datos descritos revelan la insuficiencia del tradicional esquema quedescribe la ciclasa como un efector activado por ciertos receptores vía pro-teína Gs e inhibido, independientemente, por otros receptores vía proteína Gi.Para añadir aún mayor complejidad al esquema de regulación de las adeni-lilciclasas, recientemente se han aportado pruebas que indican que estosenzimas pueden dimerizar. Entre otras, éstas incluyen los efectos de mutan-tes inactivos que reducen la actividad ciclasa sin alterar su expresión o lacoinmunoprecipitación de homodímeros y heterodímeros de isoformas dela adenililciclasa. Lejos de ser completamente conocido, este largamente es-tudiado mecanismo de transducción es todavía un sistema con importantesaspectos por explorar.

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