2009a-2013a 005350891 universidad de guadalajara
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2009A-2013A 005350891
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA
CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y
AGROPECUARIAS
Identificación molecular de levaduras de la tuba
TRABAJO DE TITULACIÓN EN LA MODALIDAD DE
TESIS PROFESIONAL
PARA OBTENER EL TITULO DE
LICENCIADO EN BIOLOGÍA
PRESENTA
LEONARDO ALEJANDRO RODRÍGUEZ LÓPEZ
Las Agujas, Zapopan, Jalisco, Mayo del 2015
2009A-2013A 005350891
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA
CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y
AGROPECUARIAS
Identificación molecular de levaduras de la tuba
TRABAJO DE TITULACIÓN EN LA MODALIDAD DE
TESIS PROFESIONAL
PARA OBTENER EL TITULO DE
LICENCIADO EN BIOLOGÍA
PRESENTA
LEONARDO ALEJANDRO RODRÍGUEZ LÓPEZ
DIRECTOR DE TESIS:
Dr. José Armando Arias García
ASESORA DE TESIS:
Dra. Olivia Rodríguez Alcántar
Las Agujas, Zapopan, Jalisco, Mayo del 2015
“Si una persona es perseverante, aunque
sea dura de entendimiento, se hará
inteligente; y aunque sea débil se
transformará en fuerte.”
Leonardo Da Vinci
DEDICATORIA
A mi madre Marina Patricia López Carrillo y hermano Víctor Hugo Rodríguez López que siempre
me apoyaron en mis proyectos y en mi carrera.
Este es el resultado de la perseverancia y dedicación por lo que me hace feliz.
A mi familia en general que siempre tuvo fe en mí de que fuera alguien en la vida.
AGRADECIMIENTOS
A todos mis maestros por su paciencia, tiempo y sus conocimientos que herede y que haré
trascender en mi vida.
A mi director de tesis, el Dr. Armando Arias García, por su dedicación, por la confianza en mí
para llevar a cabo este proyecto y por su poyo en los momentos difíciles.
A mi asesora de tesis, la Dra. Olivia Rodríguez Alcántar de la cual siempre tuve el apoyo
incondicional para ayudarme en todo momento.
A mis sinodales Dr.Conrado Soto Velazco, Dra. Josefina Casas Solís y M.C. Margarita Bonilla
Moreno, por el tiempo invertido y atenciones personalizadas que tuvieron conmigo.
A la Dra. Anne Santerre a la cual le debo mi pasión por la biología molecular y quien me apoyo
durante la fase experimental de esta tesis al facilitarme equipo faltante para mi investigación.
A mi tutor, el Dr. Ramón Reynoso Orozco por su apoyo y consejos en toda mi carrera, también
quiero agradecerle por enseñarme a seguir el buen camino de la ciencia.
Al Dr. Ricardo Solís Zamora por siempre apoyarme en todo momento durante mi investigación.
Finalmente, a todas las personas que me apoyaron en tiempos difíciles y en tiempos felices.
i
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN........................................................................................................................................ 1
ANTECEDENTES ...................................................................................................................................... 1
1. QUÉ ES FERMENTACIÓN ........................................................................................................................ 1 1.2 MICROBIOLOGÍA Y TIPOS DE FERMENTACIONES .................................................................................... 2 1.3 IMPORTANCIA DE LAS FERMENTACIONES TRADICIONALES E INDUSTRIALES ............................................ 3 2. TUBA ................................................................................................................................................... 3 2.1 QUÉ ES LA TUBA Y SU ORIGEN ............................................................................................................. 3 2.2 CÓMO SE ELABORA LA TUBA ............................................................................................................... 4 2.3 IMPORTANCIA ECONÓMICA DE LA TUBA ................................................................................................ 5 2.4 MICROBIOLOGÍA DE LA TUBA ............................................................................................................... 5 3. LEVADURAS ......................................................................................................................................... 6 3.1 QUÉ SON LAS LEVADURAS .................................................................................................................. 6 3.2 PAPEL DE LAS LEVADURAS EN LAS FERMENTACIONES .......................................................................... 6 3.3 DIVERSIDAD DE FERMENTACIONES TRADICIONALES E INDUSTRIALES ..................................................... 7 4. IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS ............................................................................................................ 8 4.1 TÉCNICAS CONVENCIONALES .............................................................................................................. 8 4.2 TÉCNICAS MOLECULARES ................................................................................................................... 9
4.2.1 Secuenciación de los genes ribosomales ................................................................................. 9 4.2.2 RFLPs ...................................................................................................................................... 10 4.2.3 PCR-DGGE ............................................................................................................................. 10 4.2.4 PCR en tiempo real ................................................................................................................. 11
4.3 IMPORTANCIA DE LAS TÉCNICAS MOLECULARES ................................................................................. 11
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA..................................................................................................... 12
JUSTIFICACIÓN ...................................................................................................................................... 13
HIPÓTESIS .............................................................................................................................................. 14
OBJETIVO GENERAL ............................................................................................................................. 15
OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ............................................................................................................... 15
MATERIALES Y METODOS ................................................................................................................... 16
1. MEDIOS DE CULTIVO: ...................................................................................................................... 16 A) YPD (Extracto de Levadura, peptona con dextrosa) ................................................................ 16 B) GPYA (Glucosa, Peptona, Extracto de Levadura con Agar) ................................................... 16 C) GPYA con cloranfenicol ........................................................................................................... 16
2. AISLAMIENTO DE CEPAS .................................................................................................................. 16 3. IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS POR MEDIO DE RFLPS .................................................................... 17
ii
RESULTADOS ......................................................................................................................................... 19
DISCUSIÓN .............................................................................................................................................. 22
CONCLUSIÓN ......................................................................................................................................... 24
LITERATURA CITADA ............................................................................................................................ 25
ANEXO ..................................................................................................................................................... 32
ANEXO 1. ............................................................................................................................................. 32
1
INTRODUCCIÓN
El arte de producir bebidas fermentadas, se ha desarrollado a través de los años y convertido
mayoritariamente en una tecnología. Las materias primas que se utilizan en las bebidas
fermentadas son sustratos ricos en azúcares, los cuales son procesados por levaduras y como
producto final etanol, a este proceso se le llama fermentación (Waites et al.,, 2001; Wainwright,
1995). Entre las fermentaciones están los que son a base de jugo de piña como el tepache, a
base de granos como el pozol, el tejuino y otros preparados como la tuba a partir de la savia de
una planta (Wiseman, 1988).
La tuba es una bebida introducida a México en el siglo XVI desde las Filipinas, adoptándola
fácilmente durante los años. Actualmente es una bebida fermentada tradicional que se vende y se
consume en los estados de Colima y Jalisco.
Las técnicas de identificación de levaduras presentes en la fermentación para la producción de
alimentos y bebidas alcohólicas y no alcohólicas utilizan frecuentemente métodos de identificación
convencionales basados en la morfología, la esporulación y actividad fisiológica de las levaduras.
El desarrollo reciente de las técnicas moleculares basadas en la PCR (Reacción en Cadena de
Polimerasa) ha proporcionado oportunidades para la identificación de cepas de levaduras y
permiten ser más específicas y con una sustancial reducción en el tiempo requerido cuando se
compara con los métodos convencionales (Ezeronye y Legras, 2008). El número de estudios
sobre la diversidad microbiológica de levaduras en savias en México y específicamente en “tuba”
es muy limitado, por lo anterior, se propone identificar las especies de levaduras presentes en una
fermentación mediante herramientas moleculares.
ANTECEDENTES
1. Qué es fermentación
La fermentación es una tecnología en los alimentos muy antigua, la cual se encuentra presente en
prácticamente todas las culturas del mundo. En la actualidad, los alimentos fermentados como el
vino, la cerveza, el pan y el yogurt se producen de manera industrial y se encuentran al alcance
de muchas personas en el mundo. Sin embargo, existen otros alimentos fermentados que se
producen en menor escala, de forma artesanal, semicomercial, o bien, sólo se consumen por
2
ciertos grupos sociales o etnias, a esto se le conoce como "alimentos fermentados tradicionales"
(Quintero-Salazar et al., 2012). Los alimentos fermentados tienen diferentes tipos de
fermentaciones y microbiota, es por ello que se usan diferentes fermentaciones para cada tipo de
alimento. Algunos ejemplos de ellos están la fermentación alcohólica para producción de bebidas
alcohólicas o la fermentación acética para producción de vinagres, entre otras.
1.2 Microbiología y tipos de fermentaciones
La fermentación es esencialmente un proceso que se lleva a cabo en un recipiente llamado
fermentador, mediante el cual determinados sustratos que componen el medio de cultivo son
transformados por acción microbiológica en metabolitos y biomasa. En los seres vivos, la
fermentación es un proceso anaeróbico y en él no intervienen las mitocondrias, ni la cadena
respiratoria. El proceso de fermentación es característico de algunas bacterias y levaduras. El
microorganismo va aumentando su concentración en el transcurso del proceso, al mismo tiempo
que el medio se va modificando y se forman productos nuevos como consecuencia de las
actividades catabólicas y anabólicas. Los dos fenómenos, crecimiento y formación de producto,
tienen lugar durante el desarrollo del proceso simultáneamente (Merchuk, 1994).
Entre los tipos de fermentaciones se encuentran:
Alcohólica: ésta es llevada a cabo al disgregarse las moléculas de glucosa de las que la
levadura adquiere la energía necesaria para sobrevivir, obteniendo el alcohol y CO2 como
resultado de la fermentación. Este tipo de fermentación se da principalmente por levaduras
del género Saccharomyces (Tórtora, 2007).
Láctica: es una ruta metabólica anaeróbica que se da a cabo en el citosol de la célula, en
la cual se oxida incompletamente la glucosa para obtener energía y de esta reacción el
desecho que se obtiene es el ácido láctico (Tórtora, 2007).
Acética: es la fermentación bacteriana por Acetobacter, Gluconobacter, Gluconacetobacter
entre otros géneros de bacterias aeróbicas, que transforma el alcohol en ácido acético. La
fermentación acética del vino da como resultado el vinagre debido a un exceso de oxígeno
(Sengun, 2011; Tórtora, 2007).
Butírica: es la transformación de los glúcidos en ácido butírico por acción de bacterias de
la especie Clostridium butyricum en un ambiente sin oxígeno. Lleva a cabo a partir de la
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lactosa con formación de ácido butírico y gas. Es una de las principales características de
las bacterias del género Clostridium, aunado a la aparición de olores pútridos y
desagradables (Du, 2012).
Las fermentaciones pueden ser naturales, cuando las condiciones ambientales permiten la
interacción de los microorganismos y los sustratos orgánicos susceptibles; las artificiales, cuando
el hombre propicia las condiciones y el contacto referido (Tórtora, 2007; Merchuk, 1994). A estos
procesos naturales o artificiales se les puede dar uso para producir alimentos a nivel industrial.
1.3 Importancia de las fermentaciones tradicionales e industriales
Hoy en día, el impacto e importancia de las fermentaciones tradicionales con levaduras en
alimentos y bebidas se extienden más allá de las nociones populares como el pan, cerveza y vino.
En un contexto positivo las levaduras, contribuyen a la fermentación de una amplia gama de otros
productos básicos como bebidas fermentadas como la tuba, donde varias especies de levaduras
pueden funcionar en forma conjunta con las bacterias y los hongos filamentosos. Muchos
ingredientes de alimentos valiosos y auxiliares tecnológicos ahora derivan de las levaduras.
Algunas de estas últimas tienen una fuerte actividad antifúngica, lo que les permite ser explotadas
como nuevos agentes en el control biológico de descomposición de los alimentos. La actividad
probiótica de algunas levaduras es otra propiedad que está atrayendo cada vez más interés al
sector industrial y esto implica poder identificarlas correctamente por sus diferentes propiedades
(Fernández-Espinar et al., 2006).
2. Tuba
2.1 Qué es la tuba y su origen
El nombre y forma de preparación de la tuba fueron introducidos por los españoles a México
desde las Filipinas, junto con la palmera en el Galeón de Manila, en el siglo XVI. En ese entonces
las Filipinas también habían sido conquistadas por el imperio español y los trabajadores que
llegaron a cultivar arroz y caña de azúcar en Colima intercambiaron sus costumbres con los
habitantes de ese estado mexicano. El término Tubâ es una palabra de origen filipino, cuyo
nombre designa al líquido que emana de la savia de la palma (Cocos nucifera L.) (Velázquez-
Monreal, 2011).
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Cocos nucifera pertenece a la tribu Cocoeae, subfamilia Arecoideae de las Arecaceae. Se
caracteriza por presentar tallos de hasta 20 m de alto, solitarios, a menudo reclinados y con hojas
pinnadas. La inflorescencia es interfoliar, de ramificación simple con una bráctea peduncular semi-
leñosa; las flores son unisexuales, agrupadas en tríadas en la base de las ramas floríferas, con
una flor pistilada central y dos estaminadas laterales. El fruto es uniseminado, característico
principalmente por su gran tamaño (Guevara y Jauregui, 2008). El origen y domesticación de la
palma de coco es desconocido, sin embargo, se han planteado algunas teorías como la de
Harries (1978), quien señaló su posible origen en la región Pacífico-Asiática, mientras que Gunn
(2004) menciona que haya sido en América del Sur. Esta planta de la palma de coco, se da
principalmente en zonas costeras, en la que florece todo el año, por lo que, siempre es posible la
producción de tuba. Sin embargo, estas producen cantidades menores de néctar durante abril y
mayo, por lo que su producción disminuye en estos meses y su elaboración es más difícil de lo
habitual (Ohler, 1986).
2.2 Cómo se elabora la tuba
La tuba se obtiene por la fermentación natural de la savia (también nombrada néctar o agua miel)
obtenida de la inflorescencia de la palma de coco, que después del proceso de fermentado y de
cocción queda lista para consumirse como una bebida natural, dulce, nutritiva y energética
(Velázquez-Monreal, 2011).
Para extraer la savia se aprovechan las inflorescencias tiernas que están cubiertas por la espata
(bráctea amplia). Lo primero que se hace es doblar el eje de la espata para que la savia salga de
un corte que mide entre tres y cinco centímetros. El doblez debe hacerse con las precauciones
debidas para no romper el racimo floral. Una vez hecho esto se tira de la punta de la espata hacia
abajo para que la savia salga rápidamente y se colecte. Este proceso se hace de una a dos veces
al día durante dos semanas. Para evitar que la espata se abra, se amarra con un lazo. La calidad
del producto depende de la limpieza y renovación de los depósitos donde se colecta esta savia
(Granados-Sánchez y López-Ríos, 2002).
Entre las características principales de la savia de la palma de coco, se encuentra que su color
pardo a blanquecino es debido al desarrollo de microorganismos, los cuales desencadenan la
fermentación después de 5 horas de ser cosechada. Si la tuba es dejada sin moverse durante 8
días, se convierte en un vinagre muy útil en uso doméstico o también sirve para elaborar
aguardiente. Además, la tuba es rica en azúcares en niveles de hasta 90 g/l, los cuales se
5
fermentan por acción de los microorganismos. Contiene vitamina C, fósforo, aminoácidos y
minerales, es auxiliar contra la gastritis, y se ha mencionado que presenta actividad contra
parásitos (Velázquez-Monreal, 2011; Ezeronye y Legras, 2008).
La fermentación de la savia de coco se lleva a un punto de ebullición durante unos minutos para
detener el proceso de fermentación y que no se convierta en vinagre. Lo anterior, permite ofrecer
el producto por vendedores que se desplazan en la ciudad y así poder comerciarla en su punto
óptimo de venta (Velázquez-Monreal, 2011).
2.3 Importancia económica de la tuba
La tuba se consume regularmente en otras partes del mundo, como Ghana, Filipinas, Malasia y
Sudáfrica (Velázquez-Monreal, 2011). En África se conoce como “legmi”, en la India del Sur como
“kallu”, mientras que en Borneo tiene los nombres de “bahar” y “goribon” (Jespersen, 2003).
En la actualidad México cuenta con una producción y comercialización de la tuba en regiones
costeras del Pacífico, principalmente en los estados de Colima, Guerrero y Michoacán (Granados-
Sánchez y López-Ríos, 2002). La importancia del estudio de la tuba se ha expandido no solo en
nuestro país sino a otros continentes como África, siendo el continente con más estudios
microbiológicos en este tipo de bebidas.
2.4 Microbiología de la tuba
Se ha utilizado la savia de otras especies de palmas como sustrato para el crecimiento de
microorganismos y la producción de otras bebidas fermentadas. En África se utiliza la especie de
palma Elaeis guinneesis para la producción del vino de palma (Amoa-Awua et al., 2006). Este vino
contiene de 3 a 4 % de alcohol, dependiendo de la etapa de fermentación en la que se consume
(Ezeronye y Legras, 2008).
La fermentación es inmediatamente después de la colección, debido a las levaduras presentes en
el aire. A menudo, este proceso se estimula por la levadura residual presente en el envase donde
se colecta (de tuba anteriormente almacenada ya que no se lavan), y por microorganismos
asociados que son principalmente levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae, bacterias
ácido lácticas y ácido acéticas, lo cual indica que el inicio de la fermentación es múltiple (Stringini
et al., 2009).
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Algunos estudios de calidad microbiológica, producción de vino de palma y diversidad entre
especies de levaduras (Agu et al., 1999; Uzochukwu et al., 1999; Amoa-Awua et al., 2006; Ogbulie
et al., 2007; Ciani et al., 2012) afirman que la fermentación se da mediante la inoculación por
medio de vectores como son los insectos que visitan la palma. Por ejemplo la mosca de la fruta
Drosophila melanogaster (Meigen, 1830), que caminan en el tallo y espata recolectando varias
especies de levaduras. Algunas especies de los hongos y levaduras identificadas en la
fermentación de la savia de la palma incluyen a Schizosaccharomyces pombe (Linder 1893),
Pichia pastoris (Phaff 1956) y algunos miembros de los géneros Candida y Saccharomyces (Ciani
et al., 2012).
3. Levaduras
3.1 Qué son las levaduras
Las levaduras son hongos unicelulares microscópicos que suelen ser de forma esférica, ovoide,
elipsoide o alargada. Algunas especies bajo ciertas condiciones son dimórficos, es decir
presentan un talo pseudomicelial. El tamaño de éstas últimas, oscila de 1 a 9 µm de ancho y de 2
a más de 20 µm de longitud según la especie, nutrición, edad y otros factores (Carlile et al., 2001).
3.2 Papel de las levaduras en las fermentaciones
Las levaduras y productos derivados de estas contribuyen al sabor de los alimentos y aroma o
bien, sirven como biocatalizadores que llevan a cabo la fermentación o biotransformación de los
componentes de los alimentos produciendo de este modo una variedad de productos con
características deseables. El uso de las levaduras y los productos derivados de ellas tales como:
agentes saborizantes y biocatalizadores para carnes comestibles, pan, otros productos de
panadería, quesos, margarina, sabores, yogures, kefirs, otros productos lácteos fermentados,
alimentos para animales, bebidas alcohólicas, perfumes, sabores frutales, productos de soja,
derivados fermentados granos de cacao, té fermentado, jarabes fermentados, encurtidos, sidras,
vinagres, y una gran variedad de otros alimentos y bebidas fermentadas, las hacen importantes
para su uso en el sector industrial alimentario (Abbas, 2001, 2003, 2004).
Las levaduras también se han aprovechado como fuente de colorantes, vitaminas, antioxidantes y
como suplementos para sus atributos nutracéuticos o promotoras de la salud (Fernández-Espinar
et al., 2006). Algunas especies de levaduras ampliamente utilizadas para obtener estos productos
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pertenecen a los géneros Saccharomyces, Candida, Debaryomyces, Geotrichum, Hansenula,
Kloeckera, Kluyveromyces, Pichia, Schizosaccharomyces, Sporobolomyces, Yarrowia y
Zygosaccharomyces, por nombrar sólo unos pocos (Fernández-Espinar et al., 2006).
3.3 Diversidad de fermentaciones tradicionales e industriales
Entre los principales tipos de fermentación tradicional se encuentran los que son a base de
cereales como el maíz, del cual se elabora el pozol y el tejuino, mientras que de la cebada se
hace la cerveza. Entre otros sustratos para la fermentación se encuentran las que son a partir de
frutas como las uvas, de la cual se obtiene vino; del jugo piña el tepache, del jugo del Agave
tequilana el tequila y del jugo de la manzana la sidra (Wiseman, 1988). Finalmente los que son a
base de savias, como la tuba que proviene de la palma cocotera (Velázquez-Monreal, 2011).
Las fermentaciones industriales se llevan a cabo en fermentadores o bioreactores. En estos
fermentadores el sustrato es convertido a un compuesto o metabolito con la ayuda de un
microorganismo (Waites, 2001). Existen diferentes tipos de fermentaciones industriales como
son:
La fermentación discontinua (“batch”) puede ser considerada como un "sistema cerrado". Al
inicio de la operación se añade la solución esterilizada de nutrientes y se inocula con el
microorganismo. Se debe controlar la temperatura, el oxígeno y el pH (Waites, 2001).
La fermentación alimentada (fed-batch) es cuando los sustratos se añaden escalonadamente a
medida que progresa la fermentación. La formación de muchos metabolitos secundarios
disminuye debido a la cantidad de glucosa que está en el medio (efecto glucosa), por esta razón
en este tipo de fermentación los elementos críticos de la solución de nutrientes se añaden en
pequeñas concentraciones al principio del proceso y continúan añadiéndose en pequeñas dosis
durante la fase de producción (Waites, 2001).
Finalmente la fermentación continua se establece en un sistema abierto. La solución nutritiva
estéril se añade continuamente al tanque de fermentación (biorreactor) y una cantidad equivalente
de la solución utilizada de los nutrientes con los microorganismos, se saca simultáneamente del
sistema (Waites, 2001).
8
Todos estos tipos de fermentaciones dan pauta a producir diferentes productos dependiendo la
levadura que se inocule en el medio, ya que cada especie de éstas varía las características de las
fermentaciones, es por ello que es importante la identificación de cada una.
4. Identificación de levaduras
4.1 Técnicas convencionales
En la actualidad se cuenta con diversos métodos de identificación para levaduras, los cuales
varían en tiempo, especificidad, sensibilidad y costos (Freydiere, 1997). El estudio morfológico
comprende la evaluación de características de la colonia tales como: color, textura, topografía de
la superficie, bordes, presencia o ausencia de hifas, pseudohifas, cápsula, blastoconidias,
artroconidias, ballistoconidias, entre otras (Barnett et al., 1990).
La identificación fisiológica y bioquímica de las levaduras se elabora mediante el uso de medios
diferenciales (por nutrientes o pH) los cuales han permitido definir el patrón catabólico que
presenta un género o especie. Entre los estudios más frecuentes se encuentran: los de
fermentación a partir de glucosa, galactosa, maltosa y sacarosa, otros son los medios de
asimilación como: glucosa al 50 %, glucosa al 60 %, formación de almidón, reacción de diazonium
azul, medio con metanol y medio con etanol. De este tipo de estudios se han derivado los ensayos
de asimilación (auxonograma-degradación aeróbica) y fermentación (zimograma-degradación
anaeróbica) de carbohidratos para la identificación de levaduras. En el auxanograma, la
asimilación del azúcar se detecta por el crecimiento visible y cambio en el indicador de color que
se utiliza en el medio de cultivo, mientras que en el zimograma, el producto se detecta a través de
la producción de gas (hidrógeno y anhídrido carbónico). Los patrones de asimilación y
fermentación de muchos géneros y especies se encuentran disponibles en la literatura los cuales
son utilizados para su comparación, estas técnicas han sido empleadas por diferentes autores
para identificar levaduras (Ginnis, 1980; Hoog, 1995; Fisher y Cook, 1998).
Otro ejemplo de prueba fisiológica es la prueba de ureasa debido a que algunos géneros como,
Cryptococcus, Rhodotorula y Trichosporon son bastante comunes y difíciles de diferenciar,
pueden caracterizarse conociendo la capacidad de la levadura de hidrolizar la molécula de urea
en dos moléculas de amonio por la acción de la enzima ureasa; esto genera un incremento del pH
del medio y en consecuencia un cambio de color del mismo, un ejemplo de especie usada en esta
prueba de identificación es Cryptococcus skinneri (Phaff y Souza 1962, Mac-Faddin, 1980,
9
Magalhães et al., 2008, Fisher y Cook, 1998). A partir de los constantes avances en biología
molecular se han desarrollado técnicas para la identificación de levaduras más exactas.
4.2 Técnicas moleculares
Las técnicas moleculares que existen actualmente para identificar levaduras fueron desarrolladas
como una alternativa a las pruebas morfofisiológicas tradicionales y para obtener una rápida y
exacta identificación. Entre las más utilizadas son: secuenciación de las regiones ribosomales,
(D1/D2 del gen 26S), el estudio del polimorfismo de los fragmentos de restricción (RFLP)
principalmente la región ribosomal ITS-5.8S, la cual es la más usada para identificar levaduras. En
esta última, los productos de amplificación de la región ITS-5.8S que tengan diferente tamaño
corresponderán a diferentes especies; en caso de que los fragmentos amplificados sean del
mismo tamaño es necesario recurrir a la digestión de estos fragmentos para poder identificarlos
definitivamente. El tamaño de los fragmentos resultantes se determina por comparación con
marcadores apropiados para así diferenciarse de entre otros individuos (Dlauchy et al, 1999). La
técnica de electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (PCR-DGGE) empleando
iniciadores universales para complementar la técnica RFLP y la PCR en tiempo real, nos ahorra
bastante tiempo al saber que en ese momento tenemos la amplificación del fragmento deseado
(Fernández-Espinar et al., 2006).
4.2.1 Secuenciación de los genes ribosomales
Los genes ribosomales (5.8S, 18S y 26S) se agrupan en conjunto formando unidades de
transcripción que se repiten en el genoma de entre 100 y 200 veces. En cada unidad de
transcripción existen otras dos regiones, los espaciadores internos transcritos (ITS) y los externos
(ETS), regiones que se transcriben pero no se procesan. A su vez, las unidades que codifican
están separadas por los espaciadores intergénicos, también llamados NTS. El gen 5S no se
incluyen en la unidad de transcripción descrita anteriormente, pero se encuentra adyacente en la
misma unidad de repetición en tándem en el caso de las levaduras. Los genes ribosomales 5.8S,
18S y 26S, así como las ITS y NTS, representan herramientas fundamentales para establecer las
relaciones filogenéticas y para identificar las especies debido a las secuencias conservadas que
se encuentran allí (Kurtzman y Robnett, 1998).
Este método, se basa en la obtención y comparación de las secuencias de ácidos nucleótidos de
estas regiones génicas que codifican el ribosoma. Las dos regiones más utilizadas son las que
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corresponden a los dominios D1/ D2 situados en el extremo 5' del gen 26S (Kurtzman y Robnett,
1998) y la secuencia del gen ribosomal 18S (James et al., 1997). La disponibilidad de secuencias
en la base de datos del Genbank, especialmente en el caso de la región D1/D2 de 26S de genes,
hace que esta técnica sea muy útil para determinar levaduras desconocidas, y para ello se
considera el porcentaje de homología de sus secuencias (Kurtzman y Robnett, 1998).
4.2.2 RFLPs
La técnica de RFLP de las regiones ITS-5.8S, se desarrolló como una alternativa de identificación
de levaduras de manera rápida para su utilización en la industria. Esta herramienta ha sido
utilizada por diferentes autores para identificar levaduras aisladas de diferentes fuentes como:
mostos de vinos (Espinosa, 2002; Las Heras-Vázquez, 2003; González et al., 2006; Hierro, 2006),
sidra (Coton, 2006), jugo de naranja (Arias, 2002), miel (Carvalho, 2005), cerveza de sorgo
(Naumova, 2003), masa (Pulvirenti, 2001), productos lácteos (Caggia, 2001; Vasdinyei, 2003) y en
muestras clínicas para la identificación de levaduras y hongos patógenos (De Llanos, 2004, 2006;
Tappia-Tussell et al., 2006).
Este método de identificación más simple se desarrolló en paralelo, basado en la amplificación por
PCR de las regiones del ADN ribosomal y cortándolo usando enzimas de restricción. Esta técnica
se llama “polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción” (Restriction Fragment
Length Polymorphism) (RFLPS), la cual se refiere a secuencias específicas de nucleótidos en
el ADN que son reconocidas y cortadas por las enzimas de restricción y que varían entre
individuos de una especie (Dlauchy et al., 1999). Una forma de reconfirmar el método es el uso de
la técnica PCR-DGGE sin conocer previamente la especie ya que con ella se pueden distinguir
mutaciones en organismos estrechamente relacionados.
4.2.3 PCR-DGGE
La técnica de huella genética basada en la amplificación PCR y en gel electroforesis con gradiente
desnaturalizante (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE), se introdujo en la ecología
microbiana. La separación de los amplicones de ADN se basa en la disminución de la movilidad
electroforética de una molécula de ADN de doble cadena en geles de poliacrilamida que
contienen un gradiente lineal de desnaturalizantes de ADN (una mezcla de urea y formamida). La
movilidad de la molécula se retarda en la concentración a la que las hebras de ADN se disocian.
El ADN se amplifica específicamente por PCR usado por grupos particulares de cebadores
11
universales. Los fragmentos de PCR que se corrieron en el gel desnaturalizante se pueden aislar
a partir del gel y se pueden utilizar en las reacciones de secuenciación para la identificación de
especies (Fernández-Espinar et al., 2006). Para el ahorro de tiempo en amplificación de PCR se
recomienda utilizar la técnica PCR en tiempo real, debido a que con ella se tiene la certeza de
que se está amplificando dicha región en ese momento, y se puede trabajar en conjunto con
RFLPs.
4.2.4 PCR en tiempo real
En el PCR en tiempo real, los productos de amplificación se observan en una gráfica cuando se
llevan a cabo la PCR. La técnica se basa en la detección y cuantificación de una sonda
fluorescente cuya señal aumenta en proporción directa a la cantidad de producto de PCR en la
reacción. El proceso, se lleva a cabo en un termociclador que tiene un sistema de detección capaz
de capturar y cuantificar la señal emitida por el donante (ADN con sonda) al final de cada ciclo
para cada muestra. La información obtenida se representa como una curva de amplificación que
proporciona información de la cantidad de ADN que se amplifica. Este número de ciclo se
denomina ciclo umbral (Ct) y es inversamente proporcional al número de copias de la muestra
(cantidad de ADN). Por lo tanto, se puede utilizar para evaluar la cantidad inicial de la muestra
numéricamente (ADN o células) con gran precisión, dentro de una amplia gama de
concentraciones (Fernández-Espinar et al., 2006).
4.3 Importancia de las técnicas moleculares
Debido a la trascendencia de las levaduras en los procesos de fermentación, es necesario
identificarlas por lo que se debe contar con una técnica rápida, confiable y económica para ello.
Las técnicas morfofisiológicas convencionales son tardadas ya que requieren de la realización de
muchas pruebas para lograr una correcta identificación, poco reproducibles y en ocasiones
conducen a una identificación errónea (Esteve-Zarzoso et al., 1999).
12
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Las técnicas moleculares actualmente se utilizan para la identificación de organismos a nivel
especie, gracias a su especificidad y rapidez, se han utilizado para la identificación de levaduras
en el área alimentaria. Debido al papel que desempeñan las levaduras en la tuba como el aroma,
sabor y grado de fermentación es importante identificar cuales participan ya que se conoce poco
sobre las especies de levaduras que están implicadas en este proceso fermentativo. Por lo
anterior se propone determinar la diversidad de especies de levaduras presentes en la
fermentación de la savia de palma (Cocos nucifera) para la obtención de la tuba mediante
técnicas moleculares.
13
JUSTIFICACIÓN
En una fermentación natural para la producción de la tuba, cooperan una gran variedad de
especies de levaduras. Aun cuando ya se han realizado algunos estudios de diversidad
microbiológica, estos han sido con técnicas morfológicas y bioquímicas, las cuales requieren de
más tiempo y son menos exactas, en comparación con las técnicas moleculares, que son más
rápidas y no dependen del ambiente. Por ello se propone, conocer las especies de levaduras que
participan en esta fermentación, mediante la utilización de dichas técnicas para así poder obtener
información sobre la diversidad de especies presentes en la tuba para futuros trabajos de
investigación.
14
HIPÓTESIS
Existe una alta diversidad de especies y cepas de levaduras en el proceso de fermentación de la
tuba, sin embargo, es probable que Saccharomyces cerevisiae sea la que predomine y la que
realice la fermentación.
15
OBJETIVO GENERAL
Determinar la diversidad de especies de levaduras presentes en la bebida fermentada tuba a
través de técnicas moleculares (RFLP).
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
1. Aislar cepas de levaduras a partir de la bebida fermentada tuba procedente del estado de
Colima y que se ofrece para su venta en el estado de Jalisco.
2. Realizar una caracterización genética molecular de las cepas de levaduras aisladas de
tuba.
3. Identificar las cepas de levaduras por medio de la comparación de patrones de restricción
de la región génica ITS-5.8S
16
MATERIALES Y METODOS
1. Medios de cultivo:
A) YPD (Extracto de Levadura, peptona con dextrosa)
Se preparó medio de cultivo YPD con 10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona
bacteriológica, 20 g de glucosa, disueltos en 1 L de agua destilada y se esterilizó en autoclave a
121 °C durante 20 minutos.
B) GPYA (Glucosa, Peptona, Extracto de Levadura con Agar)
El medio GPYA se preparó con 5 g de extracto de levadura, 5 g de peptona bacteriológica, 40 g
de glucosa, 20 g de agar bacteriológico disueltos en 1 L de agua destilada y posteriormente se
esterilizó en autoclave a 121 °C durante 20 minutos.
C) GPYA con cloranfenicol
Al medio GPYA, se le añadió cloranfenicol a una concentración 50 µg/mL al medio, para inhibir el
crecimiento bacteriano.
2. Aislamiento de cepas
Se obtuvo una muestra de tuba que se ofrecía en el tianguis del municipio de Tonalá (proveniente
de colima). Posteriormente se refrigero a 4 °C para evitar que se fermentara hasta su análisis que
fue al día siguiente. El aislamiento de levaduras se hizo mediante diluciones seriadas de la
muestra de tuba procedente del estado de Colima. Para ello, se utilizó 1 mL de tuba y se diluyó
con 9 mL de agua destilada estéril para obtener una dilución 1:10. Por medio de diluciones
seriadas se obtuvo una dilución final de 1:10,000. Se inocularon cajas con medio GPYA con
cloranfenicol con 50 µL de las dos últimas diluciones y se distribuyeron en la superficie del medio.
Después de la incubación durante 2 a 4 días a una temperatura de 28 °C, se aislaron las distintas
colonias al azar, en cajas de Petri con medio PGYA sólido adicionado con antibiótico, cada caja se
dividió en 2 secciones rotuladas con el número de muestra (cada sección para una especie de
levadura aislada) para poder hacer biomasa y preservar gran cantidad de muestra en 700 µL de
glicerol al 20 % en 100 tubos Eppendorf cada uno para una colonia aislada a -20 °C para su
uso posterior.
17
3. Identificación de levaduras por medio de RFLPs
Para la identificación molecular de las cepas de levaduras, se realizó una extracción de ADN
según Querol et al., (1992) su principio es romper la pared celular por medio de la enzima
zimoliasa. Primero se produjo biomasa de cada una de las levaduras aisladas en cajas de petri
con medio solido de GPY o YPD, se Incubó durante toda la noche a 30 °C (modificación del
protocolo original). Se extrajo un poco de biomasa (2 asas) del medio con un asa y se colocó cada
una de las muestras en tubos Eppendorf de 1.5 mL con agua destilada estéril, se centrifugó a
12,000 rpm durante 3 minutos a 24 °C, seguido de esto se decantó y resuspendió el pellet con 1
mL de agua destilada estéril, se agitó, se disolvió con el vórtex y se centrifugó en las mismas
condiciones. Se decantó y resuspendió el pellet en 500 µL de Solución 1 (Sorbito 0.9 M, EDTA 0.1
M), se añadieron 4 µL de una solución de Zimoliasa 20T (mg/mL), después se agitó en vórtex por
2 minutos. Se incubó a 37 °C durante 20 minutos para después centrifugar a 12,000 rpm durante
3 minutos, se decantó y resuspendió el pellet en 500 µL de Solución 2 (50 mM Tris HCl, 20 mM
EDTA). Se añadieron 13 µL de una solución SDS al 10 % (agitar lentamente para evitar burbujas).
Se incubó a 65 °C durante 5 minutos. Se añadió 200 µL de acetato potásico 5 M y se agitó
suavemente moviendo el tubo 2 o 3 veces, se dejó en hielo (gradilla congelada) durante 10
minutos. Se centrifugó a 14,000 rpm durante 15 minutos a 4 °C. Manteniéndolo en hielo (gradilla
congelada). Se pasó el sobrenadante a otro tubo Eppendorf que contenía 700 µL de isopropanol.
Se agitó suavemente y se dejó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se centrifugó a
12,000 rpm durante 10 minutos. Se decantó y se lavó con 500 µL de etanol al 70 %. Se centrifugó
a 12,000 rpm durante 5 minutos y se decantó. Secamos el alcohol con la ayuda de una punta de
pipeta amarilla. Se colocaron los tubos Eppendorf abiertos 1 hora a 37 °C para secar el ADN
(modificación del protocolo original), o bien se podían dejar 20 minutos en campana de
desecación con vacío. Se resuspendió el pellet en 18 µL de HPLC y almacenó a -20 °C.
Seguido de esto se hizo una cuantificación para ver la concentración y pureza del ADN para
después ajustar a 50 ng/µl cada muestra. Se determinó la lectura a 260 nm en un
espectrofotómetro (HINOTEK) para conocer la cantidad de ADN obtenido de cada una de las
cepas aisladas. Así mismo se determinó la calidad de ADN al obtener la lectura en el espectro a
280 nm y con ello la relación 260 nm/280 nm.
Posteriormente, se amplificó la región que incluye el gen ribosomal 5.8S y las regiones
intergénicas ITS1 e ITS2 con los oligonucleótidos ITS1 e ITS4 (White et al., 1990). La reacción en
cadena de la polimerasa de amplificación, se realizó con un termociclador Techne (TC-3000), de
18
acuerdo a las condiciones de amplificación propuestas por Silva-Filho et al., (2005) a una
temperatura de calentamiento inicial de 94 °C durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos de 94 °C
durante 15 s, 55 °C durante 45 s y 72 °C durante 90 s, con una extensión final a 72 °C durante 6
minutos. Los 100 productos de PCR se visualizaron mediante electroforesis en geles de agarosa
al 1.4 % (se elaboraron 4 geles en total), y se estimó el tamaño de los productos de PCR por
comparación del marcador estándar de “100-pb ADN ladder” marca invitrogen.
Cada uno de los productos de PCR de la región 5.8S-ITS fueron digeridos por separado con las
enzimas de restricción HhaI, HaeIII y HinfI, para obtener los polimorfismos de los fragmentos de
restricción (RFLP) (Esteve-Zarzoso et al., 1999) y las bandas se separaron por electroforesis en
geles de agarosa al 3 % en solución TAE (Tris-acetato-EDTA) 1X y se visualizaron con luz UV
(ultravioleta) tras la tinción con gelred (0.5 µg/µL). Como marcador de peso molecular se utilizó el
de 100 pb. Con los geles se obtuvieron los patrones de restricción de cada cepa con las tres
enzimas de restricción y estos se compararon con los de la base de datos de la Universidad de
Valencia - CSIC (http://www.yeast-id.com/) para su determinación a nivel de especie y/o género.
19
cepa Cantidad Pureza cepa Cantidad Pureza cepa Cantidad Pureza cepa Cantidad Pureza
1 1167.50 1.91 26 637.50 1.9 51 257.50 1.45 76 760.00 1.60
2 1280.00 2.12 27 915.00 1.7 52 200.00 1.74 77 627.50 1.62
3 775.00 1.72 28 832.50 1.71 53 190.00 1.36 78 480.00 1.54
4 607.50 1.85 29 562.50 1.9 54 300.00 1.85 79 632.50 1.72
5 652.50 1.76 30 842.50 2.39 55 337.50 1.85 80 642.50 1.63
6 662.50 1.62 31 477.50 1.80 56 297.50 1.31 81 475.00 1.98
7 407.50 1.73 32 845.00 1.82 57 302.50 1.53 82 755.00 1.59
8 490.00 1.83 33 850.00 1.87 58 330.00 1.48 83 452.50 1.63
9 360.00 1.82 34 855.00 1.83 59 250.00 1.79 84 360.00 1.69
10 645.00 1.94 35 905.00 1.69 60 1190.00 1.60 85 245.00 1.66
11 760.00 1.94 36 752.50 1.55 61 837.50 1.54 86 295.00 2.00
12 1017.50 1.92 37 645.00 1.68 62 375.00 1.55 87 372.50 1.52
13 1330.00 1.60 38 832.50 1.80 63 367.50 1.58 88 402.50 1.66
14 365.00 1.76 39 575.00 1.84 64 655.00 1.45 89 317.50 1.61
15 430.00 1.81 40 717.50 1.97 65 837.50 1.68 90 342.50 1.71
16 665.00 1.77 41 195.00 2.11 66 592.50 1.53 91 357.50 1.81
17 797.50 1.93 42 505.00 2.08 67 317.50 1.49 92 777.50 1.59
18 1015.00 1.95 43 645.00 1.87 68 345.00 1.82 93 577.50 1.47
19 675.00 1.70 44 547.50 2.05 69 247.50 1.71 94 375.00 1.95
20 702.50 1.64 45 295.00 1.90 70 200.00 1.74 95 697.50 1.51
21 815.00 1.62 46 317.50 1.79 71 262.50 1.69 96 267.50 1.51
22 1142.50 1.75 47 357.50 1.88 72 370.00 1.78 97 622.50 1.99
23 910.00 2.08 48 682.50 1.74 73 592.50 1.61 98 375.00 1.97
24 745.00 2.10 49 515.00 1.49 74 580.00 1.65 99 1522.50 1.79
25 660.00 1.75 50 227.50 1.78 75 497.50 1.73 100 465.00 1.65
RESULTADOS
Con base en la muestra de la tuba obtenida, se aislaron y purificaron 100 cepas de levaduras en
medio de cultivo GPYA con cloranfenicol. Los resultados de la cuantificación y pureza del ADN se
muestran en la tabla 1. En general, se obtuvieron buenas cantidades de ADN según índices de
control de pureza de Maniatis et al., (1982) y variaron desde 195 ng/µL hasta 1522 ng/µL. En
cuanto a la pureza se observó que la relación 260 nm/280 nm varía desde 1.45 hasta 2.12,
indicando que las muestras variaron de calidades siendo el 25 % de calidad baja y el 75 % calidad
excelente según el parámetro de Maniatis et al., (1982).
El resultado del tamaño de los productos de PCR fue de 565 y 750 pb, sólo en 4 cepas no fue
posible amplificar la región génica. Con la digestión del producto de PCR mediante las
endonucleasas, se obtuvieron dos patrones de restricción que se muestran en la tabla 3. Al
comparar los patrones de restricción obtenidos con los de la base de datos de la Universidad de
Valencia - CSIC (http://www.yeast-id.com/) para su determinación, se logró identificar que los
patrones observados correspondieron a las especies Cryptococcus skinneri y Candida boidinii
(tabla 2).
Tabla 1. Cantidad de ADN obtenida (ng/µL) de las cepas aisladas de la tuba y la pureza del ADN se obtuvo a razón de 260 nm/280 nm obteniendo un buen control de pureza del 75 % total de las muestras.
20
Especie de levadura
identificada
AP (pb)
Fragmentos de restricción (pb)
Hha I Hae III Hinf I
Cryptococcus skinneri 565 260+200 400+110 220+150+120+60
Candida boidinii 750 350+310+ 90 700 390 + 190 + 160
Tabla 2. Identificación de las cepas de levaduras aisladas de la tuba y tamaño de la región génica ITS-5.8S amplificada por PCR y los fragmentos de restricción obtenidos después de la digestión con las endonucleasas Hha I, Hae III y Hinf I.
Para determinar la predominancia las especies identificadas en la fermentación, se realizó en
base a la frecuencia de los patrones de restricción, se observó que el 72 % de las cepas
corresponden a la especie Cryptococcus skinneri mientras que el 28 % correspondieron a
Candida boidinii (figura 1).
Fig. 1 Frecuencia de los patrones de restricción de las cepas de levaduras aisladas en la tuba.
Cryptococcus skineri Candida boidinii
21
Tabla 3. Se muestra en la primera columna el tamaño del amplificado por medio de la PCR, en las siguientes tres columnas se muestra los tamaños en pares de bases de los fragmentos de restricción obtenidos con cada una de las enzimas de restricción, en la penúltima columna se muestra la especie correspondiente a los RFLPS, finalmente en la última columna se muestra el porcentaje encontrado de cada una de las especies
.
Producto
de PCR
(pb)
Fragmento de restricción (pb)
Especie
Frecuencia (%)
Hha I
Hae III
Hinf I
565 260+200 400+110 220+150+120+60 Cryptococcus
skinneri 72
750 350+310+
90 700 390 + 190 + 160 Candida boidinii 28
22
DISCUSIÓN
La importancia económica y cultural de la tuba en estados costeros como Jalisco, Colima,
Guerrero y Michoacán, es algo que no se debe ignorar ya que en Ghana, Filipinas, Malasia y
Sudáfrica se consume normalmente y es fuente de ingresos y aprovechamiento de la palma de
coco (Velázquez-Monreal, 2011). Los estudios que se han hecho en el vino de palma como el de
Ouoba et al., (2012) registran la presencia de Saccharomyces cerevisiae y a especies de los
géneros Arthroascus, Candida Galactomyces, Hanseniaspora, Issatchenkia, Kodamaea,
Schizosaccharomyces, Trichosporon, y Trigonopsis. Mientras que Amoa-Awua et al., (2007)
reportan que de 188 muestras aisladas solo cinco de ellas no corresponden a la especie
Saccharomyces cerevisiae, de entre estas cinco fueron Candida krusei y Kloechera apiculata las
otras tres no pudieron ser identificadas. En el presente estudio se identificaron dos especies
diferentes de levaduras en la muestra de tuba con diferentes prevalencias, Candida boidinii con 28
% y Cryptococcus skinneri con 72 %.
Con la caracterización genética molecular de las cepas de levaduras aisladas de tuba se
comprobó que la diversidad de especies y cepas de levaduras es baja. Asimismo, Stringini et al.,
(2009) también reportan un bajo nivel de diversidad a nivel de especies dentro de las cepas de
levadura de vino de palma de Elaeis guinneesis, pero tampoco reportan las dos especies
reportadas en esta investigación. De acuerdo a Ouoba et al., (2012), ellos no reportan estas dos
especies registradas en este trabajo, pero si el género Candida. Aunque Jolly et al., (2006)
reportaron que las levaduras que no son del género Saccharomyces crecen de forma natural en la
fermentación de los vinos, son metabólicamente activas y pueden contribuir positivamente a la
fermentación. Amoa-Awua et al., (2007) y Stringini et al., (2009) mencionan que Saccharomyces
cerevisiae en la fermentación del vino de palma ha sido responsable de la fermentación y el
aroma del vino de palma.
De acuerdo a Skiner et al. (1980) y a Phaff (1990), la microbiota natural de las frutas está
compuesta comúnmente de levaduras y hongos levaduriformes de los géneros Aureobasidium,
Rhodotorula, Sporobolomyces, Cryptococcus, Candida, Pichia, Hanseniaspora y raramente
Saccharomyces y Schizosaccharomyces. Estos autores aclaran que en las mismas frutas y
plantas se encuentran las levaduras que llevan a cabo la fermentación mencionando los dos
géneros que se encontraron en el presente trabajo. Otra posible respuesta a la presencia de
Cryptococcus skinneri en la tuba puede ser un género de árboles con el nombre Populus que
23
según Hutchison y Hiratska (1994) esta especie se ha reportado en la madera de esta familia de
árboles los cuales están presentes en Jalisco y colima según mencionan Martínez y Gonzales
(2002) esto podría explicar la presencia de esta levadura en la tuba, ya que mientras se fermenta
la tuba posiblemente por medio de insectos vectores provenientes de dichos árboles da lugar al
transporte de la levadura, tal como es el caso de Drosophila melanogaster (Kurtzman,1998),
mientras que Candida boidinii se ha reportado en el tepache artesanal hecho en México (Herrera y
Ulloa, 1978) también se confirma que se encuentra en la sabia de los árboles y palmas alrededor
de todo el mundo, su vector más común de transporte es la mosca Drosophila melanogaster
(Kurtzman,1998).
Se han hecho estudios de diversidad en vinos de palma, el más actual es el de Santiago-Urbina et
al., (2014) el cual consiste en una recopilación de vinos de palma de todo el mundo (anexo 1),
tampoco hacen mención de las especies reportadas en esta investigación, pero como orden
dominante se menciona a Candida.
Finalmente Atputharajah (1986) identificó un total de 166 aislamientos de levaduras. Se
registraron 17 especies de levaduras pertenecientes a ocho géneros. El mayor número de
aislamientos (72 %) pertenecían a los géneros Candida, Pichia y Saccharomyces. Saccharomyces
chevalieri fue la especie de levadura más dominante y representó el 35 % del total de los
aislamientos, esta investigación solo nos dice una vez más que el género Candida en vinos de
palma es el más común en todo el mundo. En ningún estudio publicado hasta el momento se ha
reportado la presencia de Candida boidinii y Cryptococcus skinneri en vinos de palma, que fueron
las levaduras dominantes en la tuba. Lo anterior sugiere que las dos especies de levaduras de la
tuba son específicas en la fermentación de la savia de la palma (Cocos nucifera) en la región de
colima.
24
CONCLUSIÓN
Se lograron aislar, preservar e identificar a las cepas de levaduras presentes en la savia de coco
para la producción de tuba registrándose una diversidad de especies baja, ya que solo se aislaron
e identificaron dos especies.
Se determinó que las especies presentes en una fermentación de tuba son Cryptococcus skinneri
y Candida boidinii, con una frecuencia de 72 % y 28 %, respectivamente.
La savia de coco para la producción de tuba es fermentada por cepas de levaduras del grupo
no-Saccharomyces.
25
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32
ANEXO
ANEXO 1.
Anexo 1. Microorganismos identificados en varios tipos de vinos de palma alrededor del mundo (Santiago-Urbina, 2014).