2§ relat¢riobcmi

7/31/2019 2§ Relat¢rioBCMI

http://slidepdf.com/reader/full/2-relatriobcmi 1/5

FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DO PORTO

Relatório Científico

Extração de DNA genómicoAmplificação de DNA por PCR e

Análise por Electroforese

Biologia Molecular e Celular I

Ana Gomes

Ana Pinheiro

Daniela Oliveira

Maria Machado

TURMA 15



Objetivo do trabalho

A primeira atividade laboratorial teve como principal objetivo efetuar a

extração do DNA genómico de fígado de ratinho, com vista a numa segunda

aula amplificar esses fragmentos de DNA e por eletroforese determinar o

genótipo dos ratinhos descendentes de um cruzamento entre progenitores

heterozigóticos (+/-) relativamente ao gene Drg11.

Resultados

Na primeira atividade laboratorial efetuou-se a extração do DNAgenómico de uma porção de fígado de ratinho. Na segunda aula, os

fragmentos de DNA correspondentes ao gene Drg11 (300 pb) e LacZ (200 pb)

foram amplificados através de polymerase chain reaction (PCR) . O DNA

molde utilizado foi portanto o DNA genómico da primeira aula e cujo genótipo

relativamente ao gene Drg11 era desconhecido. Sabe-se que estes ratinhos

são descendentes do cruzamento entre progenitores heterozigóticos (+/-) que

têm um dos alelos com o gene Drg11 normal (alelo +) e outro alelo em que o

gene Drg11 foi removido e substituído por um gene LacZ (alelo -). Destaforma, em electroforese pretendeu-se estimar o tamanho das bandas,

comparando com o padrão de peso molecular e determinar o genótipo do

ratinho. Na eletroforese poderia-se esperar uma de três hipóteses: presença

de uma banda ao nível das 300 pb (mix Drg 11) e outra ao nível das 200 pb

(mix LacZ) em que o ratinho seria heterozigótico; presença de duas bandas

de 200 pb (mixLacZ) em que o ratinho seria homozigótico mutado; presença

de duas bandas de 300 pb (mixDrg11) em que o ratinho seria homozigótico

normal. O resultado esperado para o DNA genómico era ao nível dos 1000 pb.

Na imagem de eletroforese abaixo, o D+ corresponde ao controlo

+Drg11, o L+ ao controlo +LacZ , o 1 ao DNA genómico, o 2 ao mix Drg11 e o

3 ao mix LacZ . Pela observação desta imagem de eletroforese (em G4- azul),

verifica-se uma banda pesada de 1000 pb que corresponde ao DNA genómico

(1). Esta banda apesar de ser de difícil visualização devido ao facto de ser

muito clara, encontra-se no local esperado (1000 pb). Em 1, ao nível das 100

pb verifica-se ainda uma banda muito leve que parece uma “nuvem esbatida”

4



e que provavelmente corresponderá a RNA. Em 2 e 3 deveria ser possível

observar bandas (tendo em conta as hipóteses enunciadas anteriormente),

mas apenas é visível uma “mancha” negra que não nos permite extrair os

resultados.

Devido ao facto do grupo (G4) não ter obtido resultados efetivos,

iremos utilizar também os dados do grupo 1 (G1-vermelho) para podermos

analisar resultados conclusivos, contribuindo para o nosso processo de

aprendizagem. Em G1 verifica-se que, em 1, existe também uma banda mais

pesada ao nível das 1000 pb (DNA genómico) com um certo arrastamento e

uma banda mais leve e esbatida, como se fosse uma “nuvem” (ao nível das

100 pb correspondente ao RNA). Além disso, verificam-se outras duas

bandas: uma ao nível das 300 pb (mix Drg11) e outra ao nível das 200 pb

(mixLac Z). Ambas as bandas são muito claras, principalmente a

correspondente ao mixLacZ.

Figura 1 : Imagem da Electroforese obtida(G4-azul corresponde aos resultados do grupo em questão e G1-vermelho corresponde aos resultados

que o grupo optou por discutir)

Discussão

A concretização do objetivo inicial só foi possível graças às técnicas de

PCR (polymerase chain reaction) e de electroforese. Através da primeira

conseguimos replicar os genes Drg11 e LacZ, dado que esta é uma técnica

que visa amplificar uma sequência precisa de DNA e que consiste em 3passos: desnaturação do DNA molde, ligação dos primers (annealing) e

4



elongação através de uma DNA polimerase (1). A segunda técnica revelou-se

extremamente útil no mapeamento físico do DNA e determinação do genótipo

deste ratinho (2).

Centrando-nos, nos resultados observados em G4, mais propriamenteem 1, verificou-se uma banda que devido ao seu elevado peso pouco se

moveu. Tal como previsto, esta banda corresponde ao DNA genómico do

ratinho (1000 pb). Esta banda é muito clara, o que se deve, muito

provavelmente, a erros de pipetagem. Compreende-se então que a

quantidade de DNA genómico transferida para o respetivo eppendorf foi

inferior ao estipulado no protocolo experimental. A “núvem” que se verifica

ao nível das 100 pb de G4 em 1 deverá constituir uma mistura de RNA

associada a primers (numa concentração consideravelmente inferior), pois ao

extrair DNA também recuperamos RNA.

A “mancha” negra, que se observa na imagem, demonstra a adição de

corante em excesso durante a realização desta atividade experimental. No

decorrer da aula, o grupo compreendeu, de imediato, pela constatação da

existência de um volume anómalo no eppendorf após a adição do corante,

que a pipetagem tinha sido efetuada erronicamente ( verificou-se que tinham

sido adicionados 5 µl de loading buffer , ao invés de 2 µl, como constava noprotocolo). Este erro foi significativo, acabando por condicionar de forma

evidente todas as possíveis conclusões relativamente ao genótipo do ratinho.

Desta forma, os resultados obtidos pelo grupo revelaram-se inconclusivos.

Perante esta situação, vimo-nos obrigadas a recorrer aos resultados de

um outro grupo, de forma a podermos retirar resultados conclusivos desta

experiência laboratorial, (ainda que estes possam ou não coincidir com os

resultados que supostamente iriamos obter). Assim sendo, debruçamo-nos

sobre os resultados do Grupo 1. Neste caso também se obteve uma banda

mais pesada correspondente ao DNA genómico (1000 pb). Note-se que esta

banda surge-nos com algum arrastamento que se deve à danificação do DNA,

quer devido à agitação violenta do eppendorf, quer devido à acção de alguma

DNAase que tenha permanecido ativa (apesar do EDTA). No entanto,

contrariamente ao nosso grupo (G4), as duas bandas restantes são evidentes

e distintas, verificando-se que uma se encontra ao nível das 300 pb (mix

Drg11) e outra ao nível das 200 pb (mixLac Z). Considerando que o ratinho

4



possui dois alelos distintos, concluimos que este possui um genótipo

heterozigótico. A claridade verificada nas referidas bandas pode ser atribuida

a um erro de pipetagem, nomeadamente, a uma quantidade inferior de DNA

pipetada relativamente ao que era estipulado no protocolo experimental.

Referências Bibliográficas

1. Ou, C.-Y., & Jones, W. K. (1988). Polymerase Chain Reaction Gerald

Schochetman. The Journal of Infectious Diseases, 158(6), 1154-1157

2. Roberts RJ. How restriction enzymes became the workhorses of

molecular biology. Proceedings of the National Academy of Sciences.

2005 April 26, 2005;102(17):5905-8

4

2§ relat¢riobcmi

Documents