2 cromatografia - cuantificacion e instrumentacion b

Apuntes Cromatografia – IA 2012B 16

III. MÉTODOS DE IDENTIFICACION Y CUANTIFICACIÓN

Análisis cualitativo

Es importante apreciar que la cromatografía no identifica en forma automática los diversos picos que se obtienen en una curva de elución. El método más simple para identificar un pico cromatográfico consiste en comparar su tiempo de retención con el de una muestra conocida del compuesto cuya presencia se sospecha. Para un conjunto de condiciones experimentales fijas, si un compuesto tiene el mismo tiempo de retención que el estándar, entonces ambos son el mismo compuesto. Los procedimientos para identificación de los picos cromatográficos podemos dividirlos en dos categorías:

• Identificación Cromatográfica o Por Datos de Retención o Por Serie Homólogas (Índices de Retención de Kovats)

• Identificación No Cromatográfica

o Identificación por: � Adición de Estándar � Formación de Derivados � Sustracción de un Componente � Identificación con Técnicas Auxiliares: UV, IR, MS, RMN

Índice de retención de Kovats.

El índice de Kovats relaciona el volumen de retención Vr (ó el tiempo de retención tr) de un compuesto desconocido con otro que contiene n-hidrocarburos y que eluye antes y después que él. Para cada serie de parafinas existe un índice dado por:

I = 100 n

n = número de moles de átomos de carbono de una parafina dada.

El índice de retención de un compuesto desconocido es calculado de:

x = número de carbonos del compuesto eluido antes que el desconocido;

Vnu = volumen de retención corregido del desconocido (u);

Vnx = volumen de retención corregido del hidrocarburo eluído antes del desconocido;

Vnx+1 = volumen de retención corregido del hidrocarburo eluído después del desconocido;

x + 1 = número de carbonos del compuesto eluído después que el desconocido;


EJEMPLO Una serie de alcoholes de cadena recta se alimentó a una columna de carbowax. Se encontraron los siguientes tiempos de retención:

Substancia tr, segundos butanol 42 hexanol 73 octanol 135 decanol 250

Una substancia desconocida que se sabe es un alcohol de cadena recta se inyecta en la misma columna en condiciones idénticas a los estándares. Su tiempo de retención es de 100 s. ¿Qué es la muestra desconocida? SOLUCION Se construye una gráfica de log(tr) vs. Número de átomos de carbono en el alcohol. En la gráfica se observa que la muestra desconocida es heptanol.

Análisis Cuantitativo

Los métodos cuantitativos en cromatografía se basan en el hecho de que, manteniendo constantes las condiciones del experimento, el área bajo un pico cromatográfico es proporcional a la concentración del componente que representa. Nosotros discutiremos 4 métodos, en orden creciente de complejidad y exactitud:

• Normalización de Área • Normalización de Área con Factores de Respuesta • Estandarización Externa • Estandarización Interna

La aplicación de estos métodos es indistinta para cromatografía de líquidos o de gases. Para la cuantificación de compuestos en un cromatograma, se considera de forma general que el área de bajo de un pico es proporcional a su concentración. Existen varias técnicas para la determinación del Área de un Pico Cromatográfico:

1.6

1.7

1.8

1.9

2.0

2.1

2.2

2.3

2.4

3 4 5 6 7 8 9 10 11

Alcoholes de cadena recta

log(

tr)

No. átomos C

La muestra desconocidaes heptanol


INTEGRACIÓN MANUAL

A) Métodos Geométricos

• Triangulación: En esta técnica se trazan líneas tangentes a cada lado del pico. La altura se mide desde la línea base hasta la intersección de las dos tangentes. El ancho se mide tomando la intersección de las dos líneas tangentes con la línea base. Luego se utiliza la fórmula A=1/2*Altura del Pico* Base del Pico. Las limitaciones de esta técnica están en el trazado de las líneas tangentes, un pequeño error al trazar las tangentes puede afectar la medida de la altura.

• Altura por ancho a la mitad de la Altura:

B) Métodos Mecánicos

• Planimétricos o Corte y Pesada: Esta técnica requiere recortar el pico del cromatograma, luego pesarlo en una

balanza analítica. El recorte y pesada depende mucho de la habilidad del operdor. Pueden introducirse errores por cambios en la humedad del papel, la grasa de las manos del operador, homogeneidad del papel. Generalmente se recomienda utilizar una fotocopia del cromatograma para no destruir el original.

INTEGRACIÓN AUTOMÁTICA A) Electromecánica B) Electrónica

1. NORMALIZACIÓN DE ÁREAS Este es un método aproximado que debe usarse solo cuando no se requiera de mucha exactitud o cuando no sea posible utilizar otro método. El método tiene las siguientes características:

a) Supone que el área de un pico es proporcional a la concentración del componente. b) Supone que el detector responde por igual a todos los compuestos. c) Todos los componentes deben eluir para tener una exactitud aceptable. d) Se utiliza cuando no se tienen estándares o cuando la muestra es desconocida.

Si aceptamos que el área de un pico es directamente proporcional a la concentración del componente que produjo ese pico, entonces estamos aceptando que el porcentaje de área es también igual al porcentaje de concentración: EJEMPLO: Una muestra que contenía únicamente hexano, heptano, undecano y tetradecano fue inyectada a un cromatógrafo obteniéndose los resultados que se muestran en la tabla:

Sustancia Hexano heptano undecano tetradecano Area del pico, cm2 32.6 46.8 73.8 84.9

Calcule el % en peso para cada componente

% Componente i = Á ��∑ Á �� ×100


ACTIVIDAD 4.1.

SOLUCION ∑ áreas = 32.6 + 46.8 + 73.8 + 84.9 = 238.1 % hexano = (área hexano/∑ áreas)x100 = (32.6/238.1)x100 = 13.7 % heptano = 19.6 % undecano = 31.0 % tetradecano = 35.7

Una muestra se analiza por cromatografía de líquidos con la finalidad de cuantificar los componentes que la forman. Después de inyectar una serie de estándares se encontraron los siguientes compuestos en la muestra:

Pico Compuesto Área, u.a. % 1 Ácido láctico 654 2 Ácido acético 533 3 Ácido cítrico 205 4 Ácido fumárico 268 5 Ácido succínico 918 6 Ácido fórmico 488

2. ESTÁNDAR EXTERNO En este método se inyecta primero un estándar conocido al cromatógrafo, para poder obtener el tiempo de retención de la sustancia que se desea identificar y el área del estándar. Luego, en una segunda inyección se introduce la muestra al cromatógrafo. Relacionando el área del estándar (ÁreaSTD) con el área del problema (ÁreaPROB) se puede obtener la concentración del problema (ConcPROB), no olvidando que la concentración del estándar se conocerá desde el principio. • Primera inyección: Estándar puro. Sirve para obtener tr y el área del estándar • Segunda inyección: Problema El orden de las inyecciones no importa, simplemente se necesitan tener ambos cromatogramas, para el estándar y para la muestra problema. Las características del método son:

a) Es importante notar que el estándar y el problema deben ser la misma sustancia. b) Para cada sustancia, se necesita inyectar un estándar diferente. c) Se debe tomar en cuenta el volumen de inyección en cada corrida.

Para calcular la concentración del problema, la cual siempre será nuestra incógnita, partiremos del siguiente principio:

STD

STD

PROB

PROB

ÁreaConc

ÁreaConc = a)

Definiendo el Factor de Respuesta Absoluto (FRA), se tiene: b) STD

STDSTD RA Área

ConcF =


ACTIVIDAD 4.2.

Esta ecuación está relacionada al estándar. Ahora relacionando la ecuación a) y b) obtenemos la siguiente ecuación: EJEMPLO: Se inyectan 2 µg de benceno puro en un cromatógrafo de gases, y se produce un pico de 25 cm2 de área. Cuando se inyectan 1.36 µg de muestra desconocida al mismo cromatógrafo en las mismas condiciones, el área del pico de benceno es 5 cm2. ¿Cuántos µg de benceno hay en la muestra? ¿Qué porcentaje de benceno tiene? SOLUCION

(STD) RAF=estándar del obencen áreaestándar la en benceno µg

0.4muestra) la de )(área080cm 25

µ 22

=⇒= RAF(.

El porcentaje de benceno en la muestra se calcula simplemente como:

% benceno =

µgbenceno

µg muestra× 100 =

0.4

1.36× 100 = 29 .41 %

Para determinar la cantidad de cocaína presente en una “grapa” decomisada a un sujeto, se preparó primero un estándar pesando 0.050g de cocaína pura y diluyendo hasta 100 mL en un solvente apropiado (HCl diluido). Se tomaron 5 mL de esta solución, se diluyeron nuevamente hasta 50 mL y se inyectaron 20 µL de esta última dilución al cromatógrafo, obteniéndose un área de 9705 UA. Posteriormente se preparó la muestra pesando 605 mg de cocaína decomisada y diluyendo a 100 mL. Se tomaron 10 mL de esta solución y se llevaron a 100 mL, luego se tomaron 10 mL de esta solución y se llevaron nuevamente a 100 mL. Al inyectar 10 µL de la última dilución al cromatógrafo se obtuvo un área de 3065 UA para el pico de cocaína. ¿Cuál es el porcentaje de pureza en la “grapa” decomisada? R= 52.2 % 3. ESTÁNDAR INTERNO Este método es más exacto que los anteriores, porque la muestra y el estándar se corren juntos en una sola inyección. El área de los picos desconocidos se compara con el área del pico estándar y esto nos permite calcular la composición de la muestra desconocida. Las características para éste método son:

a) El estándar debe ser una sustancia distinta a la que se desea determinar.

Si los detectores empleados en cromatografía fueran igualmente sensibles a todos los solutos, las áreas relativas de los picos serían iguales a las concentraciones relativas de cada componente. Sin embargo, la sensibilidad del

Concprob=�FRA��ÁreaProb!


detector difiere de un compuesto a otro. Una forma de expresar esto es utilizando un factor de respuesta relativo (FRR). (con los estándares puros) (con la muestra adicionada) Notar que la ecuación anterior es idéntica a la empleada en el método del estándar externo, solamente que ahora aparece el factor FRR para compensar el hecho de que el detector no responde por igual a todos los componentes. Para entender cómo funciona el factor de respuesta, supongamos que por el detector pasan dos solutos, A y B, que están presentes en la misma concentración. Al soluto A le llamaremos estándar y el soluto B será el problema. Si el detector respondiera por igual tanto a A como a B, las dos áreas deberían ser iguales. Sin embargo, vamos a suponer que, por alguna razón, el detector es menos sensible para B que para A. Entonces, aunque pase la misma cantidad de B por el detector, el área del pico de B será menor. Esto se ejemplifica en la figura 24. Si nosotros no consideramos esta diferente sensibilidad del detector, vamos a incurrir en un error de cálculo muy grave.

Figura 24. Cromatogramas de un estándar A y de un soluto problema B, presentes en la misma concentración. El cromatograma de la derecha muestra lo que ocurre cuando el detector es menos sensible a B que a A.

Continuando con nuestro ejemplo, quiere decir que el cromatógrafo siempre reportará para B áreas más pequeñas de lo que realmente debería obtenerse. Para convertir esta área pequeña en un valor más grande (el real) necesitamos multiplicarla por un número mayor que la unidad. Este número es precisamente el factor de respuesta FRR. Por el contrario, si el detector respondiera exageradamente a B, produciría un área que no corresponde al valor real de B, sino que es demasiado grande. Entonces, tendríamos que corregir esa desviación multiplicando el área exagerada por un número más pequeño que la unidad. Este número, otra vez, es FRR. En resumen: Si FRR > 1 el detector responde más al estándar que al problema Si FRR < 1 el detector responde más al problema que al estándar

b) En el método del ESTANDAR INTERNO se requieren dos inyecciones: • Primera inyección: Estándares puros. Sirve para calcular el factor de respuesta FRR. • Segunda inyección: Problema + estándar (¡juntos!).

Concprob=�FRR��ÁreaProb! "ConcSTDASTD

&

FRR= FRA ProblemaFRA Estándar =

ConcprobAprob

ConcSTDASTD


ACTIVIDAD 4.3.

El método se llama así porque en la segunda inyección se inyectan juntos tanto el estándar como el problema. Por cierto, el estándar debe ser una sustancia diferente a la que se desea cuantificar en el problema. El método quedará más claro resolviendo un ejemplo.

c) El volumen entre ambas inyecciones no es importante (pues se cancelan) EJEMPLO: Un estándar que contiene yoduro 8x10-8 M y p-diclorobenceno 6.4x10-8 M se introduce a un cromatógrafo. Se encuentra que la respuesta del detector es la siguiente:

Componente Concentración, mol/lt Area I- 8x10-8 1065

p-DB 6.4x10-8 1500 Luego, se inyecta una muestra problema que se sabe contiene yoduro. Junto con la muestra se inyecta una cantidad conocida de p-DB (9.3X10-7 M) y se corre el cromatograma. Se obtienen los siguientes datos:

Componente Concentración, mol/lt Area I- ? 3181.09

p-DB 9.3x10-7 2629 Calcular la concentración de yoduro en el problema. SOLUCIÓN Observamos que hay dos inyecciones, y que en la segunda de ellas se introdujo el problema junto con un estándar. Esto nos da la pista de que se trata de un problema de estándar interno. El primer paso es calcular el factor de respuesta FRR con los datos de la primera inyección:

DB-p

DB-pRR

I

I

Área

Conc)(F=

Área

Conc 1500

10×6.4)(F=

106510×8 -8

RR

-8

Resolviendo FRR = 1.76 Obsérvese que el detector responde 1.76 veces más al p-DB que al yoduro. El segundo paso es simplemente calcular la concentración del problema, con los datos de la segunda inyección, por supuesto: El p – diclorobenceno es el “estándar interno”

262910×9.3

(1.76)=3181.09

Conc -7I-

Resolviendo, Conc. I- = 1.98 x 10 -6 M

La determinación de herbicidas e insecticidas clorados en alimentos, agua potable, suelo, etc. pueden ser determinados empleando cromatografía de gases con un detector de captura de electrones. El 4,4-DDT fue determinado en una muestra de 5.0 gr del suelo de una granja donde se empleo el insecticida, la muestra se coloca


dentro de un extractor y se reflujarón 50 ml de hexano para extraer el plaguicida durante 1 hr. A 1.0 mL del extracto se le añade 1.0 ml de una solución de Adrin (0.001µg/ml), de esta solución se inyecta 1.0 µL en el cromatógrafo y las áreas resultantes para cada insecticida fueron de: 4,4-DDT= 13454 y Adrin= 2335682 U.A. Una mezcla estándar comercial que contiene 100 pg/ml de Adrin y 400 pg/mL de 4,4'-DDT fue inyectada en el mismo cromatógrafo empleando las mismas condiciones que para la extracción, para esta solución se reporta una área de 1273 para el Aldrin y 23455 U.A. para el 4,4'-DDT. Calcule la concentración del 4,4'-DDT en la muestra de suelo (en pg/gr de suelo) R= 12.5 pg/g


IV. INSTRUMENTACIÓN EN CROMATOGRAFIA

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS

En la cromatografía de líquidos, los componentes de una mezcla se separan debido a que existen equilibrios líquido-líquido (equilibrios de reparto) para cada soluto. La fase móvil es un líquido, mientras que la fase estacionaria es un líquido fijado sobre un soporte sólido. Se acostumbra distinguir dos tipos de cromatografía líquido-líquido: • Cromatografía de fase normal Fase móvil orgánica (no polar), fase estacionaria acuosa (polar) • Cromatografía de fase inversa Fase móvil acuosa (polar), fase estacionaria orgánica. Es la más empleada. Cromatografía de líquidos clásica En esta técnica el analito y el eluyente se alimentan a la parte superior de una columna que funciona por gravedad. La columna es simplemente un tubo de vidrio de 10-30 cm de longitud y 1 cm o más de diámetro, empacado con la fase estacionaria. Un tapón de lana de vidrio evita que el empaque caiga, mientras que una llave regula el flujo de eluyente. Generalmente los solutos se recogen en forma manual al salir de la columna, o por medio de un colector automático de fracciones. La cantidad de soluto en cada fracción se determina por titulación, espectrofotometría o algún método de análisis. La técnica es apropiada para separar grandes cantidades de muestra (mg o g) y es muy importante porque permite separar compuestos que no son volátiles (no podría usarse GC) o que se destruyen fácilmente con el calor. Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) Es la técnica cromatográfica más empleada actualmente en la que la fase móvil es un líquido. Las siglas en inglés provienen de high performance liquid chromatography. En HPLC, el eluyente se hace pasar a gran velocidad a través de una columna empacada utilizando una bomba. La figura 16 es un diagrama esquemático de las partes que componen a un cromatógrafo de líquidos de alta resolución.

Figura 16. Esquema de un aparato de HPLC. La bomba Las bombas impulsan la fase móvil hacia el inyector. Es el módulo que entrega el solvente de una manera exacta (±0.5%a ±1.0%) y precisa (±0.075%a ±0.3%) al resto del cromatógrafo. La calidad de las bombas empleadas en HPLC es muy importante para garantizar la estabilidad en el flujo de eluyente. Generalmente se utilizan bombas de pistón, que producen un flujo constante (0.01 a 0.5 mL/min, 0.1 mL/min y mayores) y presiones muy elevadas, de hasta 400 atm (aproximadamente 6000 psi). Es común trabajar con dos bombas reciprocantes, lo que mejora la estabilidad del flujo. Su funcionamiento se basa en que mediante el movimiento de un pistón y un sistema de válvulas que alternativamente se abren y se cierran, es posible enviar al sistema cromatográfico de forma continua un determinado volumen de líquido. Ajustando la distancia de desplazamiento del pistón, se puede ajustar a voluntad el volumen de líquido que envía la bomba. Son hechas de: Acero Inoxidable, Titanio, Zafiro, rubí y Teflón.


Figura 17. Esquema de una y dos bombas reciprocantes El inyector Es el dispositivo que permite introducir la muestra en solución sin interrumpir el flujo de solvente a través del sistema:

• Debe ser fácil de operar. • Inerte al ataque químico y soportar altas presiones. • Preciso en cuanto a la cantidad de muestra introducida en el sistema. • No debe provocar dilución importante de la solución inyectada. • En casos especiales operar con altas temperaturas y ser biocompatible.

La muestra debe inyectarse con una jeringa dentro de una válvula sin derramar líquido. Antes de entrar a la columna, la muestra pasa por un filtro muy fino para remover el polvo y las partículas que podrían contaminar a la columna o dañar la bomba. Las válvulas de inyección generalmente se diseñan de modo que entreguen un volumen constante de muestra (20-50 µL) independientemente de la cantidad inyectada. La válvula tiene un bucle o lazo de volumen conocido, que al llenarse de muestra proporciona la cantidad deseada al cromatógrafo.


Figura 18. Válvula de inyección

Los inyectores automáticos tienen como características principales: • Volumen de Inyección 1 µL a 2000 µL. • No existe contaminación cruzada con muestras inyectadas anteriormente. • Capaz de soportar altas presiones y en ocasiones temperatura. • Baja dispersión de la muestra. • Inyecciones programadas en secuencia. • Fácil de operar. • Inerte. • Preciso. • No provoca dilución de muestra. Fases móviles El orden de elución de los solutos en HPLC depende de la polaridad. En una separación de fase normal el soluto menos polar pasa proporcionalmente menos tiempo en la fase estacionaria polar y es el primero que eluye de la columna. En una separación de fase inversa, el orden de elución es el inverso, y e soluto que primero sale es el mas polar. Una característica importante de los aparatos HPLC es la presencia de varios depósitos de disolvente, lo cual permite variar de forma rápida y fácil la composición y la polaridad de la fase móvil. • Elución en gradiente: Uso de una fase móvil cuya composición cambia de forma sistemática de un disolvente más débil a otro más fuerte durante la separación. • Elución isocrática: Uso de una fase móvil cuya composición permanece constante durante la separación.

Figura 19. Tipos de elución en CL.

El reservorio de fase móvil (depósito del disolvente) es un frasco de laboratorio de buena calidad. Está hecho de vidrio o un polímero resistente con tapa y un filtro de acero de 2 a 10 µm de porosidad. Propiedades de los Solventes: Solvente apropiado para HPLC: • Alto poder de solubilización de las muestras. • No usar solventes con alto grado de reactividad. • Compatibilidad con el Detector Utilizado.


• Libre de Impurezas. • Se prefieren solventes de punto de ebullición intermedio. • Evitar solventes que por sus características representen un riesgo para el operador. Dependerá de lo siguiente: • El método cromatográfico. • Longitud de onda seleccionada para los componentes en la mezcla. • La longitud de onda de corte.

Disolvente Longitud de onda de corte,

nm Uso

Tolueno 285 No se emplean en HPLC con detector UV Acetona 330

Acetonitrilo 210 Altamente utilizados en HPLC con detector UV Metanol 210

Preparación de Fase móvil: � Empleo de materiales volumétricos limpios. � Tener en cuenta la posible contracción de volúmen al mezclar agua y solvente orgánico (no es correcto aforar). � Ajuste de pH, parámetro crítico en la retención de solutos ionizables (medir antes de adicionar modificador

orgánico): o El pH de la solución aumenta con la incorporación de un modificador orgánico o A valores de pH > de 7.5 disolución de sílice base de columnas o A pH menor de 2 se hidroliza la unión entre la sílice y la fase enlazada

� Filtración: filtros de 0.45 o 0.22 micras. o Las partículas presentes pueden ocasionar:

• Filtros y tuberías del instrumento. • Acelerar desgaste de sellos y rotores del inyector. • Afectar el movimiento normal de válvulas de entrada y salida de bombas. • Material de relleno de columnas (entre 3 y 10 micras) filtro perfecto para todo material introducido en

suspensión. � La selección de la membrana depende de su compatibilidad con el solvente. � Se recomienda al filtrar, descartar los primeros mL que suelen arrastrar componentes de las membranas

(plastificantes y antioxidantes). � Soluciones a inyectar también deben filtrarse: � Debe considerarse posible contaminación debida a componentes del filtro. � Posible pérdida de analito por adsorción. � Si la cantidad es muy pequeña puede reemplazarse filtración por centrifugación en tubos adecuados.

Membrana Tipo de disolvente

Acuoso Acuoso/Orgánico Orgánico Celulosa regenerada R

Éster de celulosa R NR NR Nitrato de celulosa R * NR

Floururo de polivilideno R R R Nylon R R R PTFE NR NR R Teflón NR NR R NR = No recomendable R = Recomendable

* Usar como máximo con 30 % de solvente orgánico


Antes de ser utilizados, los disolventes de la fase móvil deben ser tratados para eliminar los gases disueltos, tales como N2 y O2, y las pequeñas partículas de polvo, ya que estos producen burbujas cuando la fase móvil penetra en el detector, distorsionando la señal de este. Una de las formas más frecuentes para desgasificar es burbujeando un gas inerte, como He, de baja solubilidad en la fase móvil. � Los gases disueltos en la fase móvil pueden provocar inconvenientes:

• Liberación de burbujas en el cabezal de la bomba, caudal irregular, si es muy grave, al trabajar en vacío la bomba, pueden dañarse sellos y pistones

• Liberación y formación de burbujas en la celda del detector, por descompresión de la fase móvil, provocan oscilación en la línea base y aparición de picos fantasma. Precaución: Usar restrictores que evitan la caída de presión y evitan formación de burbujas a la salida del detector

� Oxígeno disuelto puede provocar: • Pérdida de sensibilidad en los detectores de fluorescencia, el oxígeno contribuye con el proceso de

decaimiento de la eficiencia fluorescente de la molécula por colisión con las moléculas excitadas del analito. Este efecto varía con el tipo de compuesto.

• Alta corriente residual en detectores electroquímicos, trabajando en forma reductiva el oxígeno consume parte del potencial aplicado incrementando el ruído de línea base.

• Oxidación de analitos. • Aumento en la línea base de los detectores UV. El incremento es notorio a bajas longitudes de onda y

prácticamente deja de tener importancia a longitudes de onda mayores a 250 nm. • Este incremento de absorción depende del tipo de solvente:

� El oxígeno interactúa de dos modos: • Por absorción de oxígeno molecular. • Por formación de complejos inestables con el solvente.

� La cantidad de gas disuelto depende de: • Temperatura, presión y Afinidad, por tanto, se puede desgasificar por:

� Temperatura. � Burbujeo de un gas inerte. � Ultrasonido. � Vacío.

La columna Debe estar construida en acero inoxidable para resistir la presión. La columna es un tubo de acero de 10 a 30 cm de largo y 2 a 5 mm de diámetro interior, empacada con la fase estacionaria. Algunos cromatógrafos tienen la columna en posición vertical, otros horizontal, y generalmente se encuentra en el exterior del aparato, a temperatura ambiente.

Figura 20. Ejemplos de columnas cromatográficas para HPLC


Duración de las columnas: � Muestras limpias: 1000 – 2000 inyecciones/columna � Muestras complejas, “sucias”: 200 – 500 inyecciones/columna � Muestras muy complejas: 50 – 200 inyecciones/columna Cuidado de la columna: � Empleo de columnas bien empacadas. � Evitar variaciones súbitas de presión y temperatura. � Usar precolumnas y filtros en línea. � Realizar pretratamiento de muestras. � Manejar temperaturas menores a 60ºC. � Usar pH de fase móvil 3-7 (sílica). � Eliminar sales. � Almacenar con bajas concentraciones de solventes orgánicos (5-15%). Fallas comunes en columnas: � Vacío, cuando la fase estacionaria con colapsos del lecho que forman espacios vacíos dentro de la columna.

Esto resulta en “coleo”, un número de platos bajo y una resolución pobre. � Presión elevada, cuando el flujo de líquido a través de la columna es altamente restringido o detenido debido a

obstrucción de filtros y/o lecho empacado. La fase estacionaria y el soporte sólido En la cromatografía líquido-líquido, la fase estacionaria es un líquido que se encuentra inmovilizado sobre un soporte sólido. Un soporte muy utilizado es la sílice en forma de partículas microporosas irregulares o esféricas. Las partículas deben ser muy finas (5-10 µm de díametro) ya que la resolución del equipo mejora al disminuir el tamaño de partícula. También pueden usarse partículas de un material inerte (vidrio o plástico) recubiertas con material adsorbente. Estas últimas son llamadas partículas peliculares, ver figura 21

Figura 21. Tipos de partículas empleadas en HPLC como soporte sólido. Existen muchas combinaciones posibles entre la fase móvil y la fase estacionaria. Para ayudarnos a elegir qué tipo de líquidos debemos utilizar, se sugiere consultar la bibliografía especializada. El detector Los detectores para HPLC normalmente se basan en alguna de las propiedades físicas del líquido eluyente (densidad, índice de refracción, etc.) o en alguna de las propiedades del analito (absorción de luz UV, detector electroquímico, etc.).


Características: • Fácil uso y mantenimiento y diagnósticos de arranque. • Amplio rango dinámico de respuesta. • Poseer una respuesta lineal y reproducible. • No contribuir a ensanchamiento de banda extracolumnar. • Responder a todos los solutos. • Tener la sensibilidad apropiada (alta). • Poseer una buena relación señal ruído. • No destruír la muestra. • Tener una constante de tiempo baja.

El detector más comúnmente empleado es el detector de UV. La solución que sale de la columna pasa por una celda en forma de Z, donde un rayo de luz ultravioleta atraviesa 1 cm de solución (figura 22). Muchos compuestos orgánicos y algunos inorgánicos, así como todos los aromáticos, absorben la radiación UV. La absorbancia del soluto se convierte en una señal eléctrica que después se grafica. Este tipo de detector es muy sensible.

Figura 22. Detectores típicos para HPLC. Izquierda: UV Derecha: Fluorescencia Otros tipos de detectores empleados en cromatografía líquido-líquido son: • Detector de índice de refracción: poco sensible, pero puede emplearse para compuestos que no absorben luz

UV. • Detector electroquímico: muy sensible, solo puede emplearse para solutos que se pueden oxidar o reducir, por

lo que es muy selectivo. El solvente debe ser polar y contener electrolitos disueltos. • Detector de calor de adsorción: Se basa en la detección de los cambios de temperatura que acompañan a la

interacción de la muestra y la fase móvil con el medio de separación de la columna. A medida que las moléculas de la muestra van sustituyendo a las del disolvente sobre la superficie del adsorbente, el intercambio va acompañado de un cambio local de temperatura.


Figura 23. Detectores de Índice de refracción y Electroquímico TAREA (Moodle). Completar cuadros que aparecen en el link “Tarea 7” en la plataforma Moodle.

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