14. análisis químico de la caseína presente en leche descremada (1)

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PRÁCTICAS DE LABORATORIO

PROCESO: GESTIÓN DE RECURSOS, INFRAESTRUCTURA Y LABORATORIOS

GRL-F-005 Versión: 5 Fecha: 2015-05-05 Página 1 de 17

INFORMACIÓN BÁSICA

NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Análisis químico de la caseína presente en leche descremada-deslactosada.

PRÁCTICA No.

14 ASIGNATURA: Bioquímica.

TEMA DE LA PRÁCTICA: Extracción, purificación y cuantificación de proteínas.

LABORATORIO A UTILIZAR: Laboratorio de Química y Bioquímica.

CONTENIDO DE LA GUÍA

OBJETIVOS Extraer y purificar la proteína caseína presente en una muestra de leche de vaca descremada-deslactosada, llevándola a su punto de menor solubilidad (punto isoeléctrico); para cuantificarla por un método espectrofotométrico que utiliza el reactivo de Biuret.

INTRODUCCIÓN

La caseína es una fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteínas son un grupo de proteínas que están químicamente unidas a una sustancia que contiene ácido fosfórico; por lo tanto, su molécula contiene el elemento fósforo. La caseína representa cerca del 74 al 82% de las proteínas presentes en la leche y el número de aminoácidos en la caseína de la leche varía entre 199 y 209.

Cuando se coagula la caseína de la leche empleando quimosina (rennina), es llamada paracaseína, y cuando coagula a través de la reducción del pH es llamada caseína ácida. Cuando no está coagulada se le llama caseinógeno. La caseína es un sólido blanco-amarillento, sin sabor ni olor, insoluble en agua.

En esta práctica de Laboratorio se precipitará la caseína por acidificación con una solución diluida de ácido acético. El producto obtenido, se disolverá en una solución tampón pH 8, luego se determinará el contenido de caseína por medio de un método espectrofotométrico empleando Biuret y se comparará el porcentaje encontrado experimentalmente con el reportado en la literatura.

MARCO TEÓRICO

1. LA LECHE

La leche es un fluido de origen biológico que posee una alta complejidad y que está constituido principalmente por agua en la que se encuentran compuestos inorgánicos, lactosa y proteínas séricas que son totalmente solubles; pero también se encuentran dispersas moléculas insolubles que son: proteínas caseínicas y grasas (Veloso, Teixeira, & Ferreira, 2002). Estas dos últimas son las responsables del color blanco de la leche y se encuentran formando un sistema coloidal, caracterizados por presentar dos fases, una continua y otra dispersa, en dónde las partículas de la fase dispersa tienen un tamaño de partícula entre 1nm y 10 µm; Estas partículas se encuentran diseminadas de forma estable y homogénea en la fase continua, debido en gran parte a que su superficie se encuentra uniformemente cargada, lo que causa que se repelan entre sí evitando que se aglomeren unas con otras formando partículas de mayor tamaño que pueden ser decantadas por la gravedad (Universidad Autónoma de Madrid, 2009).

2. PROTEÍNAS DE LA LECHE Como se mencionó anteriormente, uno de los componentes principales de la leche son las proteínas, compuestos orgánicos constituidos por aminoácidos dispuestos en una cadena lineal y unidos entre sí por enlaces peptídicos, como se muestra en la figura 1.

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Figura 1: Formación de un Enlace Peptídico.

La secuencia de aminoácidos en una proteína está definida por la secuencia de un gen, que está contenido dentro del material genético en el núcleo de la célula. Los aminoácidos que componen las proteínas, son codificados en el ADN, en el que una secuencia de tres bases nitrogenadas específicas codifica para un aminoácido. En los eucariotas, normalmente se encuentran 20 aminoácidos que forman la mayoría de las proteínas conocidas, sin embargo en algunos organismos el código genético puede incluir selenocistina y pirrolisina que hacen parte de los aminoácidos no convencionales. Las proteínas cumplen múltiples funciones, de tipo enzimático donde catalizan reacciones bioquímicas que son vitales para el metabolismo, de tipo estructural o mecánico, como la actina y la miosina en los músculos o las proteínas del citoesqueleto. Otras proteínas son importantes en la señalización celular, la respuesta inmune, la adhesión celular y el ciclo celular. Las proteínas son también necesarias en la dieta de los animales ya que estos no pueden sintetizar todos los aminoácidos que necesitan y deben obtener los aminoácidos esenciales de los alimentos; a través del proceso de la digestión, los animales descomponen las proteínas en aminoácidos libres que se utilizan en el metabolismo (Bohinski, 1991).

2.1. CASEÍNA

La caseína, como todas las proteínas, está compuesta por la unión de aminoácidos individuales, cada uno de los cuales está cargado positiva y negativamente y cuya carga neta depende de los residuos que acompañen la estructura básica de los aminoácidos (cadenas laterales). Por lo tanto, las proteínas también tendrán una carga positiva o negativa que dependerá de los aminoácidos que la conformen y del pH al que se encuentre en sistema. El pH en el cual que la proteína posee carga neta igual a cero y precipita se conoce como punto isoeléctrico. En casi todas las proteínas, los residuos son débilmente ácidos, por lo que éstas suelen tener una carga positiva por debajo del pH del punto isoeléctrico y una carga negativa por encima, por lo tanto a pH neutro tienen una carga neta negativa. A nivel bioquímico, el punto isoeléctrico es una herramienta muy empleada para la purificación de proteínas, ya que el pH al que la proteína no tiene carga neta suele ser el mismo al que la solubilidad es la más baja (Murray et al., 2005). Para la caseína el punto isoeléctrico es aproximadamente de 4,6 y es el valor al que ésta precipita. La leche tiene un pH cercano a 6,6, en el cual las micelas de caseína tienen una carga neta negativa y se encuentran dispersas muy establemente. Cuando se le adiciona ácido a la leche, las cargas negativas de la superficie externa de las micelas se neutralizan entre si (los grupos fosfato se protonan), provocando que haya una atracción entre las superficies de las micelas con cargas opuestas propiciando la formación de partículas más grandes que precipiten (Virtual Amrita laboratories Universalizing Education, 2013), este proceso es mostrado en la figura 2.

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Figura 2: Dependencia de la solubilidad de la caseína respecto al pH

Muchos alimentos son fuente de proteína y aminoácidos esenciales. Una de las principales fuentes de estos es la leche la cual; además, también es fuente de vitaminas (principalmente tiamina, riboflavina, ácido pantotéico y vitaminas A, D y K), minerales (calcio, potasio, sodio, fósforo y metales en pequeñas cantidades), carbohidratos (lactosa) y lípidos. Los únicos nutrientes importantes de los que carece la leche son el hierro y la vitamina C. En cuanto a las proteínas que contiene la leche su concentración total varía de 3.0 a 4.0% (30-40 gramos por litro), cuyo porcentaje varía con la especie de la vaca y con la cantidad de grasa en la leche; estas proteínas se pueden clasificar de manera general en proteínas globulares y fibrosas. Particularmente en la leche, hay tres clases de proteínas: caseína, lactoalbúminas y lactoglobulinas. En la siguiente tabla se puede observar una clasificación más específica de las proteínas que contiene la leche (Agrobit, 2012):

PORCENTAJE DE PROTEÍNA EN LA LECHE _g Proteína_

Kg leche p/p de

Nitrógeno

Caseína

Alfa-s1-caseína 10,0 30,6

Alfa-s2-caseína 2,6 8,0

Beta-caseína 10,1 30,8

Gamma-caseína 3,3 10,1

Caseína total 26,0 79,5

PROTEÍNAS DEL SUERO DE LA LECHE

Beta-lactoalbúmina 1,2 3,7

Beta-lactoglobulina 3,2 9,8

Albúminas del suero de leche 0,4 1,2

Inmunoglobulinas 0,7 2,1

Misceláneos 0,8 2,4

Proteínas totales del suero de la leche 6,3 19,3

PROTEÍNAS DE LAS MEMBRANAS DE LOS GLÓBULOS GRASOS

0,4 1,2

PROTEÍNAS TOTALES 32,7 100

Tabla 1: Composición protéica de la leche de vaca tomado de (Agrobit, 2012)

La Caseína se dispersa bien en un medio alcalino, como una solución acuosa de hidróxido de sodio (NaOH), formando caseinatos de sodio, o un buffer básico. Dentro de las principales aplicaciones que tiene la caseína,

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están la fabricación de pinturas especiales (usadas desde la antigüedad por los egipcios) y de tejidos, clarificación de vino, elaboración de preparados farmacéuticos, fabricación de plásticos (botonería, peines y mangos de utensilios), pegamento en relojería, carpintería (recomendadas para maderas terciadas), papel, vidrio y porcelana (Murray et al., 2005).

3. LA ESPECTROFOTOMETRÍA

La espectrofotometría es uno de los métodos de análisis instrumental más empleado en las investigaciones químicas y biológicas. Se caracteriza principalmente por su precisión, sensibilidad y aplicabilidad a moléculas de diversa naturaleza química (Metales, contaminantes, biomoléculas, etc.) y estado de agregación (sólido, líquido, gas). El fundamento de este método analítico se basa en la propiedad que tienen las sustancias para absorber energía radiante (por ejemplo, en forma de luz visible), la cual permite ser utilizada para su identificación y cuantificación.

Todas las sustancias absorben energía en alguna región del espectro electromagnético, ya sea en la región Visible (400nm a 760nm), en la región del Ultravioleta (UV) lejano o cercano (4nm a 400nm), o el Infrarrojo (IR) (0,7 μm a 100 μm), etc. La absorción de energía depende de la estructura química del compuesto a analizar, y en especial ciertos grupos funcionales presentes en las moléculas, de modo que es posible identificar un compuesto por medio de las características de su espectro de absorción.

3.1. LEY DE BEER-LAMBERT

Esta ley postula que la absorbancia, definida como la medida de la disminución en la potencia de una fuente radiante después de incidir en una sustancia (skoog, 2005), es directamente proporcional su concentración, la longitud del paso de luz (espesor de la solución) y una constante denominada coeficiente de extinción o coeficiente de absorción, el cual es característico de cada sustancia a una longitud de onda determinada.

La ecuación simplificada de esta ley se muestra en la figura 3.

l es la longitud atravesada por la luz en un medio (espesor de la solución)

l c c es la concentración de la muestra.

Donde: A es la Absorbacia de la muestra

es el coeficiente de extinción o coeficiente de absorción.

Es característica para cada sustancia a una longitud de onda () determinada.

Figura 3: Ecuación simplificada de la ley de Beer-Lambert.

Todo método espectrofotométrico está basado en la comparación entre la absorbancia de una sustancia de concentración desconocida y la de una solución de la misma sustancia cuya concentración es conocida, denominada solución patrón o estándar.

La absorbancia de una solución es la resultante de la sumatoria de la absorbancia del soluto cuya concentración se desea conocer y la de los otros componentes del sistema (solventes, reactivos) que absorben también a esa longitud de onda. Estos otros compuestos se denominan interferencias, y deben ser descartadas sus absorbancias. Para ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga todos los componentes del sistema menos aquel que se desea medir; Esta muestra se llama blanco y la absorbancia de éste debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien, realizar la calibración del instrumento con el blanco para asegurar que su absorbancia sea igual a 0, o sea 100% en el caso de trabajar en términos de transmitancia.

3.2. EL ESPECTROFOTÓMETRO

Es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. Posee

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la capacidad de manejar un haz de radiación electromagnética (REM), comúnmente denominado luz, separándolo para facilitar la identificación, calificación y cuantificación de su energía. Su eficiencia, resolución, sensibilidad y rango espectral, dependerán de las variables de diseño y de la selección de los componentes ópticos que lo conforman. A continuación se presentan los componentes generales del equipo.

3.2.1. FUENTE DE LUZ

Una fuente apropiada para estudios espectrofotométricos debe generar un haz de radiación suficientemente energético para que su detección y medida sean fáciles de realizar. Además, el voltaje de salida debe ser estable durante periodos de tiempo razonables. Las fuentes espectrofotométricas son de dos tipos: Fuentes continuas que emiten radiaciones constantes y Fuentes pulsantes que emiten radiación interrumpida a modo de ráfagas (Skoog, 2005).

3.2.2. MONOCROMADOR

Es un dispositivo que contiene una rendija de entrada y una rendija de salida. Esta última se utiliza para separar y aislar el haz de luz en pequeñas rangos de longitudes de onda, es decir, aísla las radiaciones de longitud de onda deseada que inciden o se reflejan desde el conjunto total. (Skoog, 2005).

3.2.3. COMPARTIMIENTO DE MUESTRA

Es donde tiene lugar la interacción de la radiación electromagnética (REM) con la materia, es decir con la muestra que se quiere medir. Es importante destacar, que durante este proceso, se aplica la ley de Beer-Lambert en su máxima expresión, basada en las leyes de absorción en el cual se presenta el paso de la molécula de un estado de baja energía (fundamental) a un estado de mayor energía (excitado).

3.2.4. FOTODETECTORES

Son los encargados de recibir la luz que ha sido emitida por la fuente de luz y que ha atravesado la muestra. El fotodetector convierte la intensidad lumínica en señales eléctricas que después pueden ser amplificadas, manipuladas y convertidas finalmente en números proporcionales a la magnitud de la cantidad original (Skoog, 2005).

3.3. CURVA DE CALIBRACIÓN

La curva de calibración se obtiene midiendo la absorbancia de una serie de soluciones de concentraciones conocidas (patrones) de una misma sustancia, las cuales son realizadas bajo las mismas condiciones e instrumento (espectrofotómetro). Para determinar la concentración de los patrones y las muestras a analizar, por lo general, se define la longitud de onda de máxima absorción para la sustancia de interés, denominada longitud de onda analítica.

El resultado se expresa en una gráfica donde la absorbancia (A) está en función de la concentración (C). Si el sistema sigue la ley de Beer-Lambert se obtiene una línea recta que pasa cerca del origen; de cuya pendiente se puede obtener el coeficiente de extinción (α). Es posible determinar gráficamente la concentración de una muestra desconocida (cx) midiendo la absorbancia de la muestra (Ax) e interpolando en la curva de calibración como se muestra en la figura 4.

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Figura 4: Interpolación de una muestra desconocida en una Curva de Calibración.

Sin embargo, la concentración se estima con mayor exactitud, a partir de la ecuación que describe la curva de calibración, que es la ecuación que representa una línea recta, esto se muestra en la figura 5.

m es la pendiente de la recta.Y mx + b

x es la variable controlada (concentración de la muestra problema).

Donde: Y es la variable dependiente (Absorbacia de la muestra problema).

b es el intercepto.

Figura 5: Ecuación de la Recta descrita para una curva de calibración.

4. MÉTODO DE BIURET

Existen diversos métodos que permiten cuantificar la concentración de proteína presente en muestras biológicas, los cuales están basados en las propiedades que muestran las proteínas en solución. Entre estos métodos se encuentra el método espectrofotométrico basado en la reacción con el reactivo de Biuret. El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la condensación de dos moléculas de urea con eliminación de amoníaco, como se muestra en la figura 6.

Figura 6: Reacción del Biuret.

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El Reactivo del Biuret se prepara con hidróxido de sodio (NaOH), sulfato del cobre (II) (CuSO4) y tartrato de sodio y de potasio (KNaC4H4O6·4H2O). Este método se fundamenta en la formación de un complejo coloreado (Púrpura – Violeta) entre el ión cúprico (Cu+2) del reactivo y los Nitrógenos Amídicos de los enlaces peptídicos de las proteínas, como se muestra en la figura 7. Por lo tanto, este reactivo reconoce específicamente la presencia de enlaces peptídicos.

El ensayo de Biuret se usa usualmente con métodos colorimétrico, ya que permite determinar la concentración de proteínas de una muestra problema mediante la espectroscopia ultravioleta-visible a una longitud de onda de 540nm (donde se detecta el ión Cu2+).

Figura 7: Complejo Púrpura

CONSULTA PREVIA

1. Para determinar la concentración de colágeno en un tejido capilar, se prepararon 4 soluciones a partir mediante disoluciones realizadas de una solución patrón de colágeno al 0,05% m/v (0,05g/100ml). Teniendo en cuenta el siguiente diagrama, calcule la concentración de cada uno de los patrones de colágeno en mg/L (ppm). (1,0/5,0)

2. A 1 mL de cada una de las soluciones del punto anterior, se le adicionó 1 mL del reactivo de Biuret, pasados

20 minutos se procedió a realizar la determinaron de las medidas de absorbancia en el espectrofotómetro a 540nm, obteniéndose los siguientes resultados.(1,5/5,0)

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Celda Concentración *** (ppm) Absorbancia

Patrón 1 0,967

Patrón 2 0,755

Patrón 3 0,696

Patrón 4 0,589

Patrón 5 0,446

***Debe colocar la concentración de los patrones que halló en el punto anterior.

Realice la regresión lineal de los datos (Concentración en X y Absorbancia en Y) Puede observar alguno de los siguientes videos para hacer este procedimiento con su calculadora: https://www.youtube.com/watch?v=_lOalXduXGE https://www.youtube.com/watch?v=r_fbbIQ_Xk0 Ahora complete la siguiente tabla:

RESULTADOS DE LA REGRESIÓN LINEAL

ECUACIÓN DE LA RECTA

COEFICIENTE DE REGRESIÓN LINEAL (R2)

3. Siguiendo los parámetros del punto anterior, se determinó la absorbancia de una muestra desconocida

piel que contiene colágeno y cuyo valor de absorbancia obtenida fue 0,843. Calcule la concentración (en ppm) de la muestra problema, mediante el despeje de la ecuación de la recta. (1,0/5,0)

4. En una ocasión dos grupos de trabajo realizaron un proceso muy parecido al anterior obteniendo cada uno

un resultado diferente en su coeficiente de regresión. El primer grupo obtuvo un coeficiente igual a 0,977, mientras que el segundo grupo obtuvo un coeficiente de 0,936. Acorde con los resultados obtenidos cuál de los dos grupos obtuvo un mejor valor en la correlación en su proceso, cómo se puede explicar que ese valor sea mejor (0,5/5,0) ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

RIESGOS Y SEGURIDAD (1,0/5,0)

Ácido Acético H226-H314 P280-P301+P330+P331-P305+P351+P338

Ácido Cítrico (Presente en el buffer pH 8,0)

H390 P305+P351+P338

https://www.youtube.com/watch?v=_lOalXduXGE

https://www.youtube.com/watch?v=r_fbbIQ_Xk0

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Hidróxido de Sodio (Presente en el buffer pH 8,0)

H314-H290 P280-P301+P330+P331-P305+P351+P338

Hidróxido de Potasio (Presente en reactivo de Biuret)

H314-H302-H290 P280-P301+P330+P331-P305+P351+P338

Sulfato de Cobre II (Presente en reactivo de Biuret)

H302-H319-H315-H410 P273-P302+P352-P305+P351+P338

Acetona H225-H319-H336-EUH066 P210-P233-P305+P351+P338

Frases H

H225:____________________________________________________________________________________ H226:____________________________________________________________________________________ H290:____________________________________________________________________________________ H302:____________________________________________________________________________________ H314:____________________________________________________________________________________ H315:____________________________________________________________________________________ H319:____________________________________________________________________________________ H336:____________________________________________________________________________________ H410:____________________________________________________________________________________ EUH066:__________________________________________________________________________________

Frases P

P210:____________________________________________________________________________________ P233:____________________________________________________________________________________ P273:____________________________________________________________________________________ P280:____________________________________________________________________________________ P302+P352:_______________________________________________________________________________ P301+P330+P331:__________________________________________________________________________ P305+P351+P338:__________________________________________________________________________

METODOLOGÍA

1. Ingreso de los estudiantes a la práctica (Cada uno debe tener sus elementos de bioseguridad: Guantes, Tapabocas y Bata).

2. Entrega y revisión de la consulta previa. 3. Presentación de Quiz sobre los objetivos, introducción, el marco teórico y la consulta previa. 4. Retroalimentación de consulta previa, la cual incluye aclaración de las posibles dudas que tengan los

estudiantes. 5. Explicación del procedimiento de la práctica por parte del docente. 6. Entrega del material de laboratorio. 7. Desarrollo de la práctica. 8. Puesta en común de los resultados obtenidos, posibles causas de error y conclusiones. 9. Realización y entrega del Informe de Laboratorio. 10. Entrega y revisión del material de Laboratorio.

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS A UTILIZAR

MATERIALES Y EQUIPOS REACTIVOS MATERIALES ESTUDIANTE

1 Beaker de 250 mL 0,5 mL Ácido Acético 10% Elementos de Bioseguridad

3 Tubos de centrifuga de 2mL con tapa (eppendorf)

0,5 mL Acetato de sodio 1M 3 Paños absorbentes

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1 Micropipeta de 100-1000uL 2 mL Acetona 1 Marcador Sharpie

6 Puntas azules 15 mL Reactivo de Biuret 1 Calculadora o computador

1 Baño termostático 30 mL Buffer pH 8,0 1 Regla

1 Probeta de 25mL 5 mL

Patrón caseína 1% en Buffer pH 8,0

1 Lápiz

1 Micro centrífuga 5 mL

*** Leche DESCREMADA y DESLACTOSADA 1 Balón aforado de 25mL 20 mL Agua Destilada

1 Gradilla Lápices de Colores

7 Tubos de Ensayo

1 Balanza

1 Termómetro

4 Pipetas Pasteur

1 espectrofotómetro

7 Celdas para espectrofotómetro

*** La muestra de leche debe cumplir con las 2 condiciones a la vez.

PRECAUCIONES Y MANEJO DE MATERIALES Y EQUIPOS. CONSULTA DE EQUIPO ESPECIALIZADO.

Usar elementos de protección bata, tapabocas, guantes y gafas como requisitos mínimos de seguridad al ingresar al laboratorio.

NUNCA escriba ni raye sobre las celdas espectrofotométricas.

Al manipular la centrifuga, verifique que ésta se encuentre bien nivelada, con las muestras distribuidas uniformemente y tapada antes de iniciar la centrifugación.

NUNCA corra o juegue en el Laboratorio, puede ocasionar un accidente.

No utilizar la misma pipeta para varios reactivos ya que los contamina.

Dejar el lugar de trabajo limpio, seco y organizado.

Lavar cuidadosamente todo el material al iniciar y al finalizar la práctica.

Al emplear la plancha de calentamiento tenga precaución de que el cable NO toque superficies calientes.

No coloque sustancias directamente sobre el plato de la balanza, utilice un vidrio de reloj o el material indicado. Antes de pesar verifique que la balanza esté en gramos. No olvide TARAR.

NUNCA cambie de lugar la balanza, esto la descalibra. Al utilizarla verifique primero la toma donde debe conectarse.

Disponga los residuos en los frascos de correspondientes y NUNCA cuando estén calientes.

PROCEDIMIENTO A UTILIZAR

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3 Tubos Centrifuga 2ml con tapa

Pesar vacíos

Pesar

Adicionar 1,0 mL de leche descremada Y deslactosada en cada tubo

Adicionar 300 µL de ácido acético 10%

Calentar durante 10 min entre 38 y 40˚C

Adicionar 300 µL de acetato de sodio 1M

Centrifugar a 7000 RPM por 10 min.

Lavar caseína con 500 µL de acetona 2 veces

Descartar el sobrenadante

Centrifugar a 7000 RPM por 5 min.

Dispersar la caseína en Buffer pH 8,0

Descartar el sobrenadante

1

2

3

PRIMERA SESIÓN: AISLAMIENTO DE CASEÍNA

1

2

Puede invertir el tubo para retirar el sobrenadante.

3

Después de cada lavado siga con la centrifugación.

Reúna la caseína de los tres tubos de centrifuga y dispérsela en el buffer pH 8,0 y llévela a 25 mL en un balón aforado, completando el volumen con el buffer.

1

3

1

2

Dejar hasta formación de complejo coloreado.

Pasar el contenido de cada tubo a una celda. NO CONFUNDA las celdas. Ni las marque.

SEGUNDA SESIÓN: DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE CASEÍNA

0,0mL Patrón

1mL Buffer

2mL Biuret

1,0mL Patrón

0,0 mL Buffer

2mL Biuret

0,8mL Patrón

0,2mL Buffer

2mL Biuret

0,6mL Patrón

0,4mL Buffer

2mL Biuret

0,4mL Patrón

0,6mL Buffer

2mL Biuret

0,2mL Patrón

0,8mL Buffer

2mL Biuret

1mL muestra

2mL Biuret

Tubo 1BLANCO

Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6Tubo 7

MUESTRA

Agitar

Dejar en Reposo 20 min.

Llenar Celdas

Espectrofotómetro

Medir y Ajustar BLANCO

Leer Absorbancia a 540nm

2

4

3

4

El BLANCO es el TUBO 1, en él están todos los componentes menos la solución patrón (Sln de caseína al 1%).

Leer TODOS los patrones y la MUESTRA PROBLEMA (tubo 7).

0,0 mL Buffer

BIBLIOGRAFÍA.

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Agrobit. (2012). Composición de la Leche y Valor Nutritivo. Recuperado el 28/01/2013 de: http://www.agrobit.com/Info_tecnica/Ganaderia/prod_lechera/GA000002pr.htm Bohinski, R. C. (1991). Bioquímica. Quinta Edición. Pearson Educación. Murray, R. M., Mayes, P., Granner, D., Rodwell, V. Bioquímica ilustrada Harper (14ª Edición ed.). México: Manual Moderno. (2005). Skoog, West, Holler, Crouch. Fundamentos de Química Analítica. 8ª Edición. Editorial Thomson, México. (2005) Universidad Autónoma de Madrid. Coloides. (2009) Recuperado el 25 de enero de 2013 de: http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/evelasco/Coloides.pdf Veloso, A., Teixeira, N. & Ferreira, I. Separation and quantification of the major casein fractions by reverse-phase high-performance liquid chromatography and urea–polyacrylamide gel electrophoresis: Detection of milk adulterations. Journal of Chromatography A, 967, 209–218. (2002) recuperado de http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021967302007872

ELABORÓ REVISÓ APROBÓ

Firma: Firma: Firma: Nombre: Profesores de Laboratorio de Química y Bioquímica

Nombre: Lic. César Andrés Gutiérrez Zapata.

Nombre: Ing. Claudia Patricia Fernández

Fecha: Julio de 2015 Fecha: Julio de 2015 Fecha: Julio de 2015

http://www.agrobit.com/Info_tecnica/Ganaderia/prod_lechera/GA000002pr.htm

http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/evelasco/Coloides.pdf

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INFORME DE LABORATORIO

ESTUDIANTES:

GRUPO:

NOTA:

CARRERA:

Formule tres objetivos que desee cumplir con la Práctica de Laboratorio (0,5/5,0). 1. ______________________________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________________________

2. ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

3. ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Mapa conceptual (0,5/5,0) Elabore un mapa conceptual sobre esta práctica de laboratorio.

PRIMERA SESIÓN

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TABLA DE RESULTADOS (0,6/5,0)

MASA (g)

1 2 3

MASA DE TUBO CENTRIFUGA VACÍO

MASA DE TUBO CENTRIFUGA LLENO DE LECHE

MASA DE LA LECHE

CUESTIONARIO 1. ¿Para qué emplea el concepto de punto isoeléctrico en esta práctica? Explique su respuesta (0,85/5,0)

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2. ¿Por qué se emplea leche descremada para la extracción de caseína? Explique su respuesta (0,85/5,0)

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

3. ¿Por qué la caseína se dispersa en un buffer de pH básico? Explique su respuesta (0,85/5,0)

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4. ¿Qué sucede si la muestra dispersa en buffer pH 8,0 no se refrigera? Explique su respuesta (0,85/5,0)

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

SEGUNDA SESIÓN TABLA DE RESULTADOS (0,8/5,0)

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TUBO PATRÓN (mL) BUFFER pH 8,0 (mL) BIURET (mL) CONCENTRACIÓN DE

PROTEÍNA (g/mL) ABSORBANCIA

1 0,0 1,0 2,0 0,0 0,000

2 1,0 0,0 2,0

3 0,8 0,2 2,0

4 0,6 0,4 2,0

5 0,4 0,6 2,0

6 0,2 0,8 2,0

Muestra 1,0 0,0 2,0

RESULTADOS DE LA REGRESIÓN LINEAL

ECUACIÓN DE LA RECTA

COEFICIENTE DE REGRESIÓN (R2)

CONCENTRACIÓN DE LA MUESTRA

CUESTIONARIO

1. Calcular la concentración en g/mL de las diluciones realizadas a la solución estándar de caseína en cada tubo patrón (0,7/5,0). Tenga en cuenta que la solución estándar de caseína está al 1%, (es decir 1g/100mL), a. Concentración en g/mL de la solución estándar. Este es el Patrón en el tubo 2.

b. Concentración en g/mL de la solución patrón en cada tubo. Puede utilizar la siguiente ecuación.

C1 V1 C2 V2

PATRÓN EN EL TUBO 3 PATRÓN EN EL TUBO 4

PATRÓN EN EL TUBO 5 PATRÓN EN EL TUBO 6

2. Con los datos obtenidos, construir sobre papel milimetrado una gráfica de Absorbancia vs. Concentración.

La gráfica debe incluir: (0,7/5,0) a. Tabla con los datos de las concentraciones y las absorbancias.

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b. Título de la gráfica. c. La concentración aproximada de la muestra problema interpolando el dato de la absorbancia.

3. Determine la concentración de la Muestra Problema empleando la ecuación de la recta (0,5/5,0).

m es la pendiente de la recta.Y mx + b x es la variable controlada (concentración de la muestra problema).

Donde: Y es la variable dependiente (Absorbacia de la muestra problema).

b es el intercepto.

4. Analizando el valor del coeficiente de regresión lineal (R2), establezcan si deben o no descartar algún punto de la curva de calibración. Justifiquen la razón que tienen para hacerlo o para no hacerlo. En caso de descarte de datos mencionen qué punto fue. (0,5/5,0) ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5. Calcule el valor de caseína presente en la muestra de leche analizada en g caseína/Kg de Leche (0,5/5,0).

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CAUSAS DE ERROR Y ACCIONES PARA OBTENER MEJORES RESULTADOS: (0,3/5,0) Explique una posible causa de error en la cantidad de caseína obtenida experimentalmente para la muestra de leche y lo reportado en la literatura. Causa 1:___________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

CONCLUSIONES (0,5/5,0)

1. ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2. ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

3. ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

APLICACIÓN PROFESIONAL DE LA PRÁCTICA REALIZADA (0,25/5,0) __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA (0,25/5,0) ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

14. análisis químico de la caseína presente en leche descremada (1)

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