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TRADUCCION - Biosíntesis de Proteínas TRADUCCION - Biosíntesis de Proteínas

- 1950s- 1950s

Proteínas: arreglos de solo 20 Proteínas: arreglos de solo 20 aa en forma no azarosaaa en forma no azarosa

- Ribosomas: lugar de síntesis Ribosomas: lugar de síntesis de proteínasde proteínas

- 1960s polisomas, tRNAs1960s polisomas, tRNAs

- 1961 Jacob y Monod - 1961 Jacob y Monod

Teoría del mensajeroTeoría del mensajero

-1964s confirmación de 1964s confirmación de mRNA intermediario mRNA intermediario informacionalinformacional

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mRNA mRNA

tRNAtRNA

Aminoacil-tRNA sintetasaAminoacil-tRNA sintetasa

RibosomasRibosomas

Factores proteicosFactores proteicos

Componentes principales sistema Componentes principales sistema traduccióntraducción

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- Secuencia codificante- Secuencia codificante

- 5' - 5' leaderleader No traducible (5´UTR) No traducible (5´UTR)

- 3' - 3' trailertrailer No traducible (3´UTR) No traducible (3´UTR)

- 5' cap and 3' poly (A) tail (eucariotas)- 5' cap and 3' poly (A) tail (eucariotas)

mRNA :

4

tRNAtRNA

T

TC arm D arm

L-shaped

5

Aminoacil-tRNA sintetasasAminoacil-tRNA sintetasas

• Une los aa al correcto tRNAUne los aa al correcto tRNA• 20 enzimas diferentes20 enzimas diferentes• Requiere ATPRequiere ATP

Reconocimiento del tRNA:Reconocimiento del tRNA:

puntos de contacto entre tRNA y puntos de contacto entre tRNA y sitio activo de proteína (1–5 sitio activo de proteína (1–5 sitios, muchas veces incluye sitios, muchas veces incluye anticodon)anticodon)

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tRNAtRNA

Une un aa específico en la terminación 3´Une un aa específico en la terminación 3´

tRNAs isoaceptores con anticodones diferentes unen el mismo tRNAs isoaceptores con anticodones diferentes unen el mismo aa (varios codones para un aa)aa (varios codones para un aa)

Hay varias especies de tRNA que pueden reaccionar con el Hay varias especies de tRNA que pueden reaccionar con el mismo codonmismo codon

El anticodon hace apareamiento de bases con un codon de El anticodon hace apareamiento de bases con un codon de mRNA (o mas), la tercer base de codon con la primer base de mRNA (o mas), la tercer base de codon con la primer base de anticodon puede aparear con otras bases además del anticodon puede aparear con otras bases además del apareamiento tradicional (Wobbling)apareamiento tradicional (Wobbling)

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60S subunit

40S subunit

RibosomasRibosomas

4 sitios de binding4 sitios de binding

mRNA-binding sitemRNA-binding site

A site (aminoacyl)A site (aminoacyl)

P site (peptidyl)P site (peptidyl)

E site (exit)E site (exit)

Procariotas : Procariotas :

subunidades 30s y subunidades 30s y 50s50s

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TraducciónTraducción

3 fases3 fases

•IniciaciónIniciación

•ElongaciónElongación

•TerminaciónTerminación

y Recicladoy Reciclado

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INICIACIONINICIACION

ProcariotasProcariotas EucariotasEucariotas

Tienen en comúnTienen en común

-Disociación de ribosomas en subunidadesDisociación de ribosomas en subunidades

-Formación complejo preiniciación en subunidad Formación complejo preiniciación en subunidad menormenor

-Unión de complejo preiniciación a mRNAUnión de complejo preiniciación a mRNA

-Iniciación mediada por factoresIniciación mediada por factores

-Tanscripción- traducción acopladas -Tanscripción- traducción acopladas --Iniciación citoplasmáticaIniciación citoplasmática

Iniciación en mRNAs que se

están transcribiendo

-Reconocimiento de sitio de iniciación - Estrategias diferentes -Reconocimiento de sitio de iniciación - Estrategias diferentes para por interacción mRNA-RNAr reconocimiento de para por interacción mRNA-RNAr reconocimiento de sitio de (Secuencia Shine-Dalgarno) iniciaciónsitio de (Secuencia Shine-Dalgarno) iniciación

5´-UAAGGAGGU-3´ Traducción Cap-5´-UAAGGAGGU-3´ Traducción Cap-dependientedependiente

“ “scanning”scanning”

Traducción Cap-Traducción Cap-independiente independiente (IREs) (IREs)

-3 Factores de iniciación (IF1,IF2,IF3) - 13 factores diferentes -3 Factores de iniciación (IF1,IF2,IF3) - 13 factores diferentes

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Mecanismos de iniciaciónMecanismos de iniciación

Iniciación cap dependiente y cap Iniciación cap dependiente y cap independienteindependiente

cap-dependientecap-dependiente (Kozak, M 1978)

- Reconocimiento m7G-cap en extremo 5´

- Unión de subunidad 40s

- scanning hasta AUG iniciador

*Leaky scanning

*Ribosoma Shunting

*Reiniciación

cap-independientecap-independiente (1988-Picornavirus)

Unión directa de subunidad ribosomal 40s en sitio interno sobre mRNA denominado IRES

INICIACIONINICIACION

11

INICIACION INICIACION cap dependientecap dependiente

3 Pasos

1) Formación del complejo de preiniciación 43 S

Unión del iniciador tRNAiMet a la subunidad menor

2) Unión de complejo 43 S a mRNA

3) Localización codón de iniciación (scanning)

4) Unión de la subunidad mayor del ribosoma

Cada uno de los pasos de la iniciación de la traducción es facilitado

por por proteínas denominadas Factores de iniciación.

EUCARIOTASEUCARIOTAS

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IniciaciónIniciación

13

IniciaciónIniciación

eIF4F eIF4EeIF4F eIF4E

eIF4GeIF4G

eIF4A eIF4A

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15

Interacción entre factoresInteracción entre factores y regulación de y regulación de iniciacióniniciación

Interacción Interacción entre cap y poli entre cap y poli AA

Sinergismo que Sinergismo que estimula inicio estimula inicio de traducción- de traducción- circularización circularización de mRNAde mRNA

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Reconstitution of the eIF4E/GST-4G1f/Pab1p Complex(A) Reconstitution with Pab1p (A) Reconstitution with Pab1p immobilized on poly(A)-Sepharose immobilized on poly(A)-Sepharose resin. Pab1p bound to poly(A)-resin. Pab1p bound to poly(A)-Sepharose resin was incubated Sepharose resin was incubated with the indicated GST-4G1f with the indicated GST-4G1f proteins and eIF4E. Bound proteins proteins and eIF4E. Bound proteins were eluted with buffer containing were eluted with buffer containing SDS, resolved by SDS–PAGE, and SDS, resolved by SDS–PAGE, and visualized by Western analysis with visualized by Western analysis with the appropriate antibodies.the appropriate antibodies.(B) Reconstitution with eIF4E (B) Reconstitution with eIF4E immobilized on the cap-analog immobilized on the cap-analog resin 7mGDP-agarose. eIF4E bound resin 7mGDP-agarose. eIF4E bound to the resin was incubated with the to the resin was incubated with the indicted GST-4G1f proteins and indicted GST-4G1f proteins and Pab1p/poly(A)125 complexes. Pab1p/poly(A)125 complexes. Bound proteins were analyzed as in Bound proteins were analyzed as in (A).(A).

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If the dsRNA is incubated with GST-4G1f-459, Pab1p, and eIF4E (D), most If the dsRNA is incubated with GST-4G1f-459, Pab1p, and eIF4E (D), most of the dsRNA is linear although some circles are observed (lower left of the dsRNA is linear although some circles are observed (lower left corner). In the presence of GST-4G1f, Pab1p, and eIF4E (E and F), much of corner). In the presence of GST-4G1f, Pab1p, and eIF4E (E and F), much of the dsRNA is in athe dsRNA is in acircular conformation with a protein complex positioned where the ends circular conformation with a protein complex positioned where the ends of the RNA meet. Differences in the apparent width of the RNA result from of the RNA meet. Differences in the apparent width of the RNA result from variation in the tip and imaging force used to generate each imagevariation in the tip and imaging force used to generate each image

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Ribosome-recycling Ribosome-recycling

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CODON INICIACIONCODON INICIACION

- AUG codon iniciación predominante en eucariotas y AUG codon iniciación predominante en eucariotas y exclusivo en levadurasexclusivo en levaduras

AUG mas próximo a 5 ´es iniciación en mayoría de mRNAsAUG mas próximo a 5 ´es iniciación en mayoría de mRNAs

- - Secuencia que rodea el AUG es critica :Secuencia que rodea el AUG es critica :

Pu X X A U G Pu C C Pu X X A U G Pu C C Pu Pu C C A U G C C A U G GG

-3 +1 +4 -3 +1 +4 -3 +1 +4 -3 +1 +4

Presencia de estructura 2ª downstream AUG aumenta Presencia de estructura 2ª downstream AUG aumenta iniciación a partir de ese sitioiniciación a partir de ese sitio

- Factores eIF1, eIF5 ,eIF2 importantes en Factores eIF1, eIF5 ,eIF2 importantes en reconocimiento de AUG reconocimiento de AUG

- Estructura secundaria del 5´leader mRNA (puede Estructura secundaria del 5´leader mRNA (puede impedir unión y/o scanning de los ribosomas)impedir unión y/o scanning de los ribosomas)

ScanningScanning

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Esquema del fundamento del método de Esquema del fundamento del método de toeprinting toeprinting

EstrellaEstrella: primer de oligonucleótidos marcado : primer de oligonucleótidos marcado radiactivamente. radiactivamente. Flecha enteraFlecha entera: RNAm.: RNAm.Flecha punteadaFlecha punteada: extendido por la transcriptasa : extendido por la transcriptasa reversareversa.

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22

INICIACION INICIACION

Mecanismos no clásicos de IniciaciónMecanismos no clásicos de Iniciación

-Leaky scanningLeaky scanning ::

AUG en contexto débil , carente de Pu en –3 y G en +4

2 proteínas diferentes == N-terminal

== secuencias enteras

-Reiniciación:Reiniciación:

Comienza y termina la traducción a partir de un uORF. La subunidad 40s queda unida al mRNA se recarga de factores y comienza la traducción en el siguiente AUG.

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Leaky scanningLeaky scanning

AUG

CUG, GUG, UUG codones de iniciación rarosCUG, GUG, UUG codones de iniciación raros

Codones Codones == a AUG son usados como sitios iniciación a AUG son usados como sitios iniciación suplementariossuplementarios

CUG upstream es usado a veces, 1CUG upstream es usado a veces, 1erer AUG siempre AUG siempre

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The autoradiograms show [35S]Met-labeled proteins synthesized in vitro from capped mRNAs that encode chloramphenicol acetyltransferase. (A) Initiation at AUG#1 generates an N-terminally extended protein, labeled preCAT. A suboptimal context around AUG#1 allows some ribosomes to scan past that site and initiate instead at AUG#2. This leaky scanning produces a shorter protein, labeled CAT. (B) All mRNAs have a suboptimal context (U in position −3) around the first AUG codon and, except for the control in lane 1, a moderately stable base-paired structure between the first and second AUGs. The only variable is the distance (n) between AUG#1 and the base of the hairpin structure. When properly positioned, the downstream base-paired structure apparently suppresses leaky scanning (lane 4). A full description of these constructs and the adjustments required for the rabbit

D F

25

ReiniciaciónReiniciación

AUG

AUG

uORF

uORF: ORF presente en región 5´UTR

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Factor de Factor de transcripciótranscripciónn

C/EBPC/EBP

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cap-cap-independienteindependiente

IRESIRES

Internal ribosoma entry Internal ribosoma entry sitessites

IRES : Zonas con estructuras complejas (5´UTRs)IRES : Zonas con estructuras complejas (5´UTRs)Poca similitud en cuanto a secuencia y tamaño. Su Poca similitud en cuanto a secuencia y tamaño. Su actividad depende de integridad estructural.actividad depende de integridad estructural.

Se definen funcionalmenteSe definen funcionalmente

Inicialmente se descubrieron en VirusInicialmente se descubrieron en Virus

3-5% mRNAs celulares se traducen por mecanismo 3-5% mRNAs celulares se traducen por mecanismo cap-independientecap-independiente

IRES presentes en 5´UTRIRES presentes en 5´UTR

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29

30

GCMV IRESGCMV IRES

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RNA secondary structure model of the FGF-2, 5´-ATR

32

Ensayo plásmido bicistrónico

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FIG. 2. The BCL-2 5-UTR functions as an IRES in vitro. The DNA constructs depicted (panel A) were transcribed in vitro in the presence of the m7G cap analog, then translated in nucleased RRL, and resolved via SDS-PAGE and

autoradiography.

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Regulación de iniciación de Regulación de iniciación de traduccióntraducción

Niveles de regulaciónNiveles de regulación::

1)1) Estructura de mRNA:Estructura de mRNA:

- Accesibilidad de capAccesibilidad de cap- uORFs y ORF dentro de secuencia codificanteuORFs y ORF dentro de secuencia codificante- Contexto de AUGContexto de AUG- Estructura secundaria de mRNAEstructura secundaria de mRNA

2)2) Actividad y Fosforilación de factores de Actividad y Fosforilación de factores de iniciacióniniciación

3)3) Interacciones Proteína-RNAInteracciones Proteína-RNA

4)4) Interacciones RNA-mRNAInteracciones RNA-mRNA

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Regulación de unión de subunidad 40S al mRNARegulación de unión de subunidad 40S al mRNA

a)a) Proteínas 4E-BPsProteínas 4E-BPs::

NO Fosforiladas ………..interacción con eIF4E .................. NO Fosforiladas ………..interacción con eIF4E .................. TraducciónTraducción

Fosforiladas………… no interacción con eIF4E…………. Fosforiladas………… no interacción con eIF4E…………. TraducciónTraducción

PI3-K, Akt y FRAP/mTOR (quinasas involucradas en fosforilación)PI3-K, Akt y FRAP/mTOR (quinasas involucradas en fosforilación)

b) Disponibilidad de eIF4E y fosforilaciónb) Disponibilidad de eIF4E y fosforilación

eIF4E poco abundante y limitante. eIF4E poco abundante y limitante.

Fosforilación en Ser209 ...................................... Traducción Fosforilación en Ser209 ...................................... Traducción

Fosforilación de eIF4E en Ser 209 inhibe unión a cap si ocurre previo Fosforilación de eIF4E en Ser 209 inhibe unión a cap si ocurre previo a interacción cap-eIF4E y estimula si ocurre después de a interacción cap-eIF4E y estimula si ocurre después de interacción cap-eIF4E. MNK1 (quinasa)interacción cap-eIF4E. MNK1 (quinasa)

Actividad y Fosforilación de factores de iniciaciónActividad y Fosforilación de factores de iniciación

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c) eIF4G: Clivaje y disponibilidadc) eIF4G: Clivaje y disponibilidadEn apotosis o infecciones virales por proteasas .............. En apotosis o infecciones virales por proteasas .............. TraducciónTraducción

b) eIF2 fosforilaciónb) eIF2 fosforilación

eIF2-P (Ser51) Mayor afinidad por GDPeIF2-P (Ser51) Mayor afinidad por GDP ……………………. ……………………. TraducciónTraducción

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38

Proteínas 4E-BPsProteínas 4E-BPs

39

eIF4E fosforilacióneIF4E fosforilación

40

FIG. 1. Shutoff of host protein synthesis and cleavage of eIF4GI and eIF4GII upon poliovirus infection. (A) Pattern of protein synthesis. HeLa cells were mock-infected or infected with poliovirus (100 pfu per cell), and labeled for 30 min with [35S]methionine at the indicated times after infection, and equal amounts of cytoplasmic protein extracts (5 mg) were subjected to SDSy15% PAGE. The arrows indicate viral capsid proteins.(B and C) Analysis of eIF4GI and eIF4GII cleavage. Proteins (40 mg) of samples as in A were resolved by SDSy6% PAGE, transferred to nitrocellulose paper, and incubated with a polyclonal antibody against the N-terminal fragment of eIF4GI (B) or eIF4GII (C)

eIF4G: Clivaje y disponibilidadeIF4G: Clivaje y disponibilidad

41

Regulación traduccional durante el estrés celularRegulación traduccional durante el estrés celular

Disponibilidad del Disponibilidad del

complejo ternariocomplejo ternario

eIF2-P (Ser51)eIF2-P (Ser51)

Mayor afinidad por GDPMayor afinidad por GDP

Inhibe traducción Inhibe traducción

generalgeneral

42

43

[aa] GCN2 kinasa eIF2 P GCN4

traducción

general

Regulación de traducción de Regulación de traducción de GCN4GCN4GCN4 : activador transcripcional (biosíntesis de aa) en levaduras

44

45Reiniciación

46

Interacciones Proteína-RNAInteracciones Proteína-RNA

Regulación expresión Regulación expresión genes involucrados en genes involucrados en metabolismo de hierrometabolismo de hierro

(ALA, TfR, mitocondril (ALA, TfR, mitocondril aconitase;etc)aconitase;etc)

Proteínas (IRP) que se Proteínas (IRP) que se unen a IRE: iron unen a IRE: iron responsive elements responsive elements (hairpin) en 5´o 3´UTR(hairpin) en 5´o 3´UTR

Evita degradación

Inhibe interacción 4G-3F

Inhibe interacción 4G-3F

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ELONGACIONELONGACION

aa-tRNA:EF1A:GTP

EF1A:GDP EF1B

EF2:GTP

EF2:GDP

eEF1A y eEF1BeEF1A y eEF1B

FosfoproteínasFosfoproteínas

(CK2 yPKC)(CK2 yPKC)

eEF2 eEF2

Fosfoproteína Fosfoproteína

(eEF2 quinasa (eEF2 quinasa

Inhibe Inhibe actividad)actividad)

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TERMINACIONTERMINACION

AAAAAAAAAAA Poli(A)

eIF4G

PABPRF3RF1

stop

start

5`-cap

Complejo de iniciación

mRNA

Complejo de terminación

RF1

RF3-GTP

RF3-GDP RF1

La estructura La estructura de RF1 se de RF1 se asemeja a la asemeja a la del tRNAdel tRNA

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50

Silenciamiento génico post-transcripcional por siRNA o miRNA