1. esquema general. 2 las proteínas son polímeros lineales de -aminoácidos con amplia...

1

BIOQUÍMICA ESTRUCTURALLAS PROTEÍNAS

2

Esquema general.

3

Las proteínas son polímeros lineales de a-aminoácidos con amplia variabilidad estructural y funciones biológicas muy diversas. La variedad de proteínas es muy grande, y en su clasificación se suele recurrir a:

1. criterios físicos

2. criterios químicos

3. criterios estructurales

4. criterios funcionales

Clasificación de las proteínas.

Es difícil hacer una clasificación más descriptiva o conceptual. Sin embargo, los criterios que hemos descrito son muy útiles desde el punto de vista práctico, y nos permiten definir al colágeno como una proteína simple, fibrosa y oligomérica, y al citocromo c como una proteína conjugada, globular y monomérica.

4

El criterio físico más utilizado es la solubilidad. Así se distinguen

1. albúminas: proteínas que son solubles en agua o en disoluciones salinas diluídas,

2. globulinas: requieren concentraciones salinas más elevadas para permanecer en disolución,

3. prolaminas: solubles en alcohol,

4. glutelinas: sólo se disuelven en disoluciones ácidas o básicas,

5. escleroproteínas: son insolubles en la gran mayoría de los disolventes.

Clasificación de las proteínas atendiendo a criterios físicos.

5

Desde un punto de vista químico, existen dos grandes grupos de proteínas:

Proteínas Simples: formadas exclusivamente por a-aminoácidos, como es el caso de la ubiquitina, una proteasa intracelular formada por 53 AA.

Proteínas Conjugadas: que contienen además de la cadena polipeptídica un componente no aminoacídico llamado grupo prostético, que puede ser un azúcar, un lípido, un ácido nucleico o simplemente un ión inorgánico. La proteína en ausencia de su grupo prostético no es funcional, y se llama apoproteína. La proteína unida a su grupo prostético es funcional, y se llama holoproteína (holoproteína = apoproteína + grupo prostético). Son proteínas conjugadas la hemoglobina, la mioglobina, los citocromos, etc.

Clasificación de las proteínas atendiendo a criterios químicos.

En la figura inferior derecha se representa el citocromo c, donde el grupo prostético (representado en color verde) es el grupo hemo.

6

Desde un punto de vista funcional se distinguen:

proteínas monoméricas: constan de una sola cadena polipeptídica, como la mioglobina,

proteínas oligoméricas: constan de varias cadenas polipeptídicas. Las distintas cadenas polipeptídicas que componen una proteína oligomérica se llaman subunidades, y pueden ser iguales o distintas entre sí. Un ejemplo es la hemoglobina, formada por 4 subunidades, cada una representada de distinto color en la figura de la derecha.

Clasificación de las proteínas atendiendo a criterios funcionales.

7

En cuanto a su forma molecular, podemos distinguir:

proteínas globulares: la cadena polipeptídica aparece enrollada sobre sí misma dando lugar a una estructura más o menos esférica y compacta.

proteínas fibrosas: si hay una dimensión que predomina sobre las demás, se dice que la proteína es fibrosa. Las proteínas fibrosas, por lo general, tienen funciones estructurales.

Clasificación de las proteínas atendiendo a criterios morfológicos.

8

Desde el punto de vista bioquímico, las propiedades de las proteínas son: 1. precipitación selectiva

2. capacidad amortiguadora

3. propiedades osmóticas

Propiedades de las proteínas.

9

El agua es el disolvente biológico por excelencia.

En disolución acuosa, los residuos hidrofóbicos de las proteínas se acumulan en el interior de la estructura, mientras que en la superficie aparecen diversos grupos con carga eléctrica, en función del pH del medio.

Precipitación selectiva de las proteínas.

10

En torno a los grupos cargados, los dipolos del agua se orientan conforme a la carga eléctrica de cada grupo, de tal manera que la proteína presenta una capa de solvatación formada por el agua de hidratación, que es el agua retenida por las cargas eléctricas de la superficie de las proteínas (En color rojo en la Figura derecha).

Los AA polares sin carga también se disponen en la superficie, donde interaccionan con el agua mediante puentes de hidrógeno.


11

Cualquier factor que modifique la interacción de la proteína con el disolvente disminuirá su estabilidad en disolución y provocará la precipitación.

Así, la desaparición total o parcial de la envoltura acuosa, la neutralización de las cargas eléctricas de tipo repulsivo o la ruptura de los puentes de hidrógeno facilitará la agregación intermolecular y provocará la precipitación.

La precipitación suele ser consecuencia del fenómeno llamado desnaturalización.


12

Se llama desnaturalización de las proteínas a la pérdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptídica reducida a un polímero estadístico sin ninguna estructura tridimensional fija.Cuando la proteína no ha sufrido ningún cambio en su interacción con el disolvente, se dice que presenta una estructura nativa.

Cualquier factor que modifique la interacción de la proteína con el disolvente disminuirá su estabilidad en disolución y provocará la precipitación. Así, la desaparición total o parcial de la envoltura acuosa, la neutralización de las cargas eléctricas de tipo repulsivo o la ruptura de los puentes de hidrógeno facilitará la agregación intermolecular y provocará la precipitación.

Desnaturalización de las proteínas.

13

En una proteína cualquiera, la estructura nativa y la desnaturalizada tan sólo tienen en común la estructura primaria, es decir, la secuencia de AA que la componen. Los demás niveles de organización estructural desaparecen en la estructura desnaturalizada.

La desnaturalización provoca diversos efectos en la proteína:

1. cambios en las propiedades hidrodinámicas de la proteína: aumenta la viscosidad y disminuye el coeficiente de difusión

2. una drástica disminución de su solubilidad, ya que los residuos hidrofóbicos del interior aparecen en la superficie

3. pérdida de las propiedades biológicas.


14

Una proteína desnaturalizada mantiene únicamente su estructura primaria. Por este motivo, en algunos casos, la desnaturalización es reversible ya que es la estructura primaria la que contiene la información necesaria y suficiente para adoptar niveles superiores de estructuración.

El proceso mediante el cual la proteína desnaturalizada recupera su estructura nativa se llama renaturalización.

En muchos casos, la desnaturalización conduce a la pérdida total de la solubilidad, con lo que la proteína precipita. La formación de agregados fuertemente hidrofóbicos impide su renaturalización, y hacen que el proceso sea irreversible.


15

Plegamiento asistido por otras proteínas.

16

Plegamiento asistido por otras proteínas.

17

Los agentes que provocan la desnaturalización de una proteína se llaman agentes desnaturalizantes.

Se distinguen agentes físicos (calor) y químicos (detergentes, disolventes orgánicos, pH, fuerza iónica).

Como en algunos casos el fenómeno de la desnaturalización es reversible, es posible precipitar proteínas de manera selectiva mediante cambios en:

la polaridad del disolvente la fuerza iónica el pH la temperatura


18

La polaridad del disolvente disminuye cuando se le añaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona.

Con ello disminuye el grado de hidratación de los grupos iónicos superficiales de la molécula proteica, provocando la agregación y precipitación.

Los disolventes orgánicos interaccionan con el interior hidrofóbico de las proteínas y desorganizan la estructura terciaria, provocando su desnaturalización y precipitación.

La acción de los detergentes es similar a la de los disolventes orgánicos.

Efecto de la polaridad del disolvente sobre la estructura de las proteínas.

19

Un aumento de la fuerza iónica del medio (por adición de sulfato amónico, urea o hidrocloruro de guanidinio, por ejemplo) también provoca una disminución en el grado de hidratación de los grupos iónicos superficiales de la proteína, ya que estos solutos

(1) compiten por el agua y

(2) rompen los puentes de hidrógeno o las interacciones electrostáticas, de forma que las moléculas proteicas se agregan y precipitan.

En muchos casos, la precipitación provocada por el aumento de la fuerza iónica es reversible. Mediante una simple diálisis se puede eliminar el exceso de soluto y recuperar tanto la estructura como la función original. A veces es una disminución en la fuerza iónica la que provoca la precipitación. Así, las proteínas que se disuelven en medios salinos pueden desnaturalizarse al dializarlas frente a agua destilada, y se renaturalizan cuando se restaura la fuerza iónica original.

Efecto de la fuerza iónica sobre la estructura de las proteínas.

20

Los iones H+ y OH- del agua provocan efectos parecidos, pero además de afectar a la envoltura acuosa de las proteínas también afectan a la carga eléctrica de los grupos ácidos y básicos de las cadenas laterales de los aminoácidos.

Esta alteración de la carga superficial de las proteínas elimina las interacciones electrostáticas que estabilizan la estructura terciaria y a menudo provoca su precipitación.

La solubilidad de una proteína es mínima en su punto isoeléctrico, ya que su carga neta es cero y desaparece cualquier fuerza de repulsión electrostática que pudiera dificultar la formación de agregados.

Efecto del pH sobre la estructura de las proteínas.

21

Cuando la temperatura es elevada aumenta la energía cinética de las moléculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de las proteínas, y se desnaturalizan.

Asimismo, un aumento de la temperatura destruye las interacciones débiles y desorganiza la estructura de la proteína, de forma que el interior hidrofóbico interacciona con el medio acuoso y se produce la agregación y precipitación de la proteína desnaturalizada.

Las proteínas suelen tener una temperatura crítica de transición entre un estado plegado y otro desplegado o desnaturalizado, y en ocasiones, en este camino pueden detectarse intermediarios estables.

Efecto de la temperatura sobre la estructura de las proteínas.

22

Esta propiedad se debe a la existencia de:

Grupos ionizables de las cadenas laterales de los aminoácidos Asp, Glu, Lys, Arg, His, Tyr, Cys.

Grupos COOH y NH2 terminales (Tabla de la derecha).

Por este motivo, las proteínas poseen un considerable poder amortiguador en una amplia zona de pH.

Aunque cada AA tiene unos grupos ionizables con unas constantes de ionización (pKa) características, el valor de dichas constantes puede verse ligeramente modificado por el entorno proteico.

El grupo imidazol del AA histidina es el principal responsable del poder amortiguador de las proteínas a pH fisiológico, ya que su pKa está próximo a 7.

Capacidad amortiguadora de las proteínas.

23

Cuando el pH es bajo, los grupos ionizables están protonados, y la carga neta de la proteína es de signo positivo. Cuando el pH es alto, los grupos ionizables están desprotonados, y la carga neta es de signo negativo. Entre ambas zonas, habrá un pH en el cual la carga neta de la proteína es nula. Es el pH isoeléctrico o punto isoeléctrico, y es característico de cada proteína (Tabla de la izquierda).

A valores de pH por debajo del pH isoeléctrico la carga neta de la proteína es positiva, y a valores de pH por encima del pH isoeléctrico, la carga neta de la proteína es negativa. La mayoría de las proteínas intracelulares tienen carga negativa, ya que su pH isoeléctrico es menor que el pH fisiológico (que está proximo a 7).

Se llaman proteínas ácidas a aquellas que tienen un punto isoeléctrico bajo (como la pepsina), y proteínas básicas a las que tienen un punto isoeléctrico alto (como las histonas).

Capacidad amortiguadora de las proteínas.

24

Como todo soluto molecular o iónico, las proteínas ejercen un efecto osmótico cuando existen barreras que limitan su libre difusión, como puede ser una membrana semipermeable (Figura superior), que permite el paso del agua, pero no de los solutos. Si tenemos dos compartimentos acuosos separados por una membrana semipermeable y uno de ellos contiene proteínas, éstas tienden a captar agua del compartimento vecino (Figura inferior).

Este efecto osmótico es proporcional al número de partículas dispersas. El valor de la presión osmótica se puede calcular mediante la fórmula de Van't Hoff: p = cRT, donde p es la presión osmótica, c es la concentración, R es la constante de los gases y T es la temperatura absoluta.

Propiedades osmóticas de las proteínas.

25

En el caso de las proteínas, el efecto osmótico se ve amplificado por otros dos factores.

Por un lado, el agua de hidratación que forma la envoltura acuosa de las proteínas también contribuye a la presión osmótica (Figura de la derecha).


26

Por otro lado, las proteínas se comportan como polianiones, cuyas cargas están neutralizadas por iones Na+ o K+ (Figura superior). Las membranas biológicas son permeables a estos iones y a sus contraiones, con lo cual su concentración a ambos lados de la membrana se equilibra.

Sin embargo, la existencia de proteínas en sólo uno de los compartimentos provoca la retención permanente de iones difusibles en ese lado de la membrana (efecto Donnan), lo que incrementa el efecto osmótico (Figura inferior).


27

Se denomina presión coloidosmótica o presión oncótica al efecto osmótico conjunto de las proteínas, que es el resultado de:

(1) la presión osmótica (que sólo depende del número de partículas)

(2) la presión provocada por el agua de hidratación

(3) la presión provocada por el exceso de iones debido al efecto Donnan

La mayor parte del agua en el sistema circulatorio está retenida por el efecto osmótico de las proteínas del plasma. Cuando por cualquier circunstancia patológica disminuye la concentración de proteínas en el plasma, el agua puede fluir libremente hacia los tejidos, provocando un edema (Figura de la derecha).


28

Las proteínas asumen funciones muy variadas gracias a su gran hetereogeneidad estructural. Describir las funciones de las proteínas equivale a describir en términos moleculares todos los fenómenos biológicos. Podemos destacar las siguientes:

función enzimática

función hormonal

función de reconocimiento de señales

función de transporte

función estructural

función de defensa

función de movimiento

función de reserva

transducción de señales

función reguladora

Muchas proteínas ejercen a la vez más de una de las funciones enumeradas. Algunas proteínas de membrana tienen tanto función estructural como enzimática; la ferritina es una proteína que transporta y, a la vez, almacena el hierro; la miosina interviene en la contracción muscular, pero también funciona como un enzima capaz de hidrolizar el ATP, y así se podrían poner muchos ejemplos más.

FUNCIONES BIOLÓGICAS de las proteínas.

29

La gran mayoría de las reacciones metabólicas tienen lugar gracias a la presencia de un catalizador de naturaleza proteica específico para cada reacción.

Estos biocatalizadores reciben el nombre de enzimas. La gran mayoría de las proteínas son enzimas.

Proteínas con función enzimática.

http://www.ehu.es/biomoleculas/ENZ/ENZ.htm

30

Las hormonas son sustancias producidas por una célula y que una vez secretadas ejercen su acción sobre otras células dotadas de un receptor adecuado.

Algunas hormonas son de naturaleza proteica, como la insulina y el glucagón (que regulan los niveles de glucosa en sangre) o las hormonas segregadas por la hipófisis como la hormona del crecimiento, o la calcitonina (que regula el metabolismo del calcio).

Proteínas con función hormonal.

31

La superficie celular alberga un gran número de proteínas encargadas del reconocimiento de señales químicas de muy diverso tipo (figura de la izquierda).

Existen receptores hormonales, de neurotransmisores, de anticuerpos, de virus, de bacterias, etc.

En muchos casos, los ligandos que reconoce el receptor (hormonas y neurotransmisores) son, a su vez, de naturaleza proteica.

Proteínas con función de reconocimiento de señales químicas.

32

En los seres vivos son esenciales los fenómenos de transporte, bien para llevar una molécula hidrofóbica a través de un medio acuoso (transporte de oxígeno o lípidos a través de la sangre) o bien para transportar moléculas polares a través de barreras hidrofóbicas (transporte a través de la membrana plasmática).

Los transportadores biológicos son siempre proteínas.

Proteínas con función de transporte.

33

Las células poseen un citoesqueleto de naturaleza proteica que constituye un armazón alrededor del cual se organizan todos sus componentes, y que dirige fenómenos tan importantes como el transporte intracelular o la división celular. En los tejidos de sostén (conjuntivo, óseo, cartilaginoso) de los vertebrados, las fibras de colágeno forman parte importante de la matriz extracelular (de color claro en la Figura) y son las encargadas de conferir resistencia mecánica tanto a la tracción como a la compresión.

Proteínas con función estructural.

34

La propiedad fundamental de los mecanismos de defensa es la de discriminar lo propio de lo extraño.

En bacterias, una serie de proteínas llamadas endonucleasas de restricción se encargan de identificar y destruir aquellas moléculas de DNA que no identifica como propias (en color blanco en la figura de la derecha).

En los vertebrados superiores, las inmunoglobulinas se encargan de reconocer moléculas u organismos extraños y se unen a ellos para facilitar su destrucción por las células del sistema inmunitario.

Proteínas con función defensiva.

35

Todas las funciones de motilidad de los seres vivos están relacionadas con las proteínas. Así, la contracción del músculo resulta de la interacción entre dos proteínas, la actina y la miosina.

El movimiento de la célula mediante cilios y flagelos está relacionado con las proteínas que forman los microtúbulos.

Proteínas con función de en el movimiento.

36

La ovoalbúmina de la clara de huevo, la lactoalbúmina de la leche, la gliadina del grano de trigo y la hordeína de la cebada, constituyen una reserva de aminoácidos para el futuro desarrollo del embrión.

Proteínas con función de reserva.

37

Los fenómenos de transducción (cambio en la naturaleza físico-química de señales) están mediados por proteínas. Así, durante el proceso de la visión, la rodopsina de la retina convierte (o mejor dicho, transduce) un fotón luminoso (una señal física) en un impulso nervioso (una señal eléctrica), y un receptor hormonal convierte una señal química (una hormona) en una serie de modificaciones en el estado funcional de la célula.

Proteínas con función de transducción de señales químicas.

38

Muchas proteínas se unen al DNA y de esta forma controlan la transcripción génica (Figura de la izquierda). De esta forma el organismo se asegura de que la célula, en todo momento, tenga todas las proteínas necesarias para desempeñar normalmente sus funciones.

Las distintas fases del ciclo celular son el resultado de un complejo mecanismo de regulación desempeñado por proteínas como la ciclina.

Proteínas con función reguladora.

39

Estructura de proteínas

40

A primera vista podría pensarse en las proteínas como polímeros lineales de AA unidos entre sí por medio de enlaces peptídicos. Sin embargo, la secuencia lineal de AA puede adoptar múltiples conformaciones en el espacio. La estructura primaria viene determinada por la secuencia de AA en la cadena proteica, es decir, el número de AA presentes y el orden en que están enlazados. La conformación espacial de una proteína se analiza en términos de estructura secundaria y estructura terciaria. La asociación de varias cadenas polipeptídicas origina un nivel superior de organización, la llamada estructura cuaternaria. Por último, la asociación de proteínas con otros tipos de biomoléculas para formar asociaciones supramoleculares con carácter permanente da lugar a la estructura quinaria.

Por tanto, podemos distinguir cinco niveles de estructuración en las proteínas:

estructura primaria , estructura secundaria , estructura terciaria , estructura cuaternaria

estructura quinaria (asociaciones supramoleculares)

Los enlaces que determinan la estructura primaria son covalentes (enlace amida o enlace peptídico), mientras que la mayoría de los enlaces que determinan la conformación (estructuras secundaria y terciaria) y la asociación (estructura cuaternaria y quinaria) son de tipo no covalente.

Niveles de estructura en proteínas.

41

La estructura primaria viene determinada por la secuencia de AA en la cadena proteica, es decir, el número de AA presentes y el orden en que están enlazados (Figura de la derecha). Las posibilidades de estructuración a nivel primario son prácticamente ilimitadas. Como en casi todas las proteínas existen 20 AA diferentes, el número de estructuras posibles viene dado por las variaciones con repetición de 20 elementos tomados de n en n, siendo n el número de AA que componen la molécula proteica.


42

Generalmente, el número de AA que forman una proteína oscila entre 80 y 300. Los enlaces que participan en la estructura primaria de una proteína son covalentes: son los enlaces peptídicos. El enlace peptídico (Figura de la izquierda) es un enlace amida que se forma entre el grupo carboxilo de una AA con el grupo amino de otro, con eliminación de una molécula de agua. Independientemente de la longitud de la cadena polipeptídica, siempre hay un extremo amino terminal y un extremo carboxilo terminal que permanecen intactos. Por convención, la secuencia de una proteína se lee siempre a partir de su extremo amino.


43

Como consecuencia del establecimiento de enlaces peptídicos entre los distintos AA que forman la proteína se origina una cadena principal o "esqueleto" a partir del cual emergen las cadenas laterales de los AA (Átomos sombreados en la Figura de la derecha).

Los átomos que componen la cadena principal de la proteína son el N del grupo amino (condensado con el AA precedente), el Ca (a partir del cual emerge la cadena lateral) y el C del grupo carboxilo (que se condensa con el AA siguiente). Por lo tanto, la unidad repetitiva básica que aparece en la cadena principal de una proteína es:

(-NH-Ca-CO-).


44

Como la estructura primaria es la que determina los niveles superiores de organización, el conocimiento de la secuencia de AA es del mayor interés para el estudio de la estructura y función de una proteína. Clásicamente, la secuenciación de una proteína se realiza mediante métodos químicos. El método más utilizado es el de Edman, que utiliza el fenilisotiocianato para marcar la proteína (representado en la Figura de la izquierda como un triángulo) e iniciar una serie de reacciones cíclicas que permiten identificar cada AA de la secuencia empezando por el extremo amino. Hoy en día esta serie de reacciones las realiza de forma automática un aparato llamado secuenciador de AA.


45

Los avances de la Biología Molecular permiten conocer la secuencia de un gen mucho antes de que se haya podido purificar la proteína que codifica. El análisis de la secuencia del DNA permite secuenciar una proteína sin que se haya purificado previamente, ya que cada grupo de tres bases de la secuencia del DNA especifica un aminoácido. El Código Genético establece para cada grupo de tres nucleótidos (codón) el AA que codifica. En la Tabla de la derecha, la letra sobre fondo rosáceo corresponde a la primera base del codón, la letra sobre fondo morado a la segunda, y la letra sobre fondo amarillo a la tercera. El Código Genético es de validez universal, ya que es el mismo para todos los seres vivos.


46

La comparación de la estructura primaria de una misma proteína en especies diversas tiene un enorme interés desde los puntos de vista funcional y filogenético. Cuanto más alejadas estén las especies analizadas en el árbol filogenético, más diferencias se podrán observar en la estructura primaria de proteínas análogas. Así, si comparamos las secuencias del citocromo c de diversas especies, y determinamos cuántos AA son distintos entre cada pareja, se puede construir una matriz como la de la Figura inferior, a partir de la cual se podrá establecer el árbol filogenético que nos indica para el caso de la proteína citocromo c, cómo ha ido evolucionando a medida que aparecen nuevas especies.


47

Sin embargo, a menudo se encuentra que el mismo aminoácido aparece siempre en idéntica posición en todas las especies estudiadas. Estos AA reciben el nombre de AA invariantes o AA conservados, y suelen ser indispensables para la función y estructura correcta de la proteína. Cualquier mutación en estas posiciones es letal para el organismo, y por tanto hay una fortísima selección en contra. En la Figura inferior se muestra la comparación de las secuencias de los primeros 50AA de la proteína Troponina C. Los AA conservados están sombreados en negro.


48

La estructura secundaria es el plegamiento que la cadena polipeptídica adopta gracias a la formación de puentes de hidrógeno entre los átomos que forman el enlace peptídico. Los puentes de hidrógeno (en color verde en la figura inferior) se establecen entre los grupos -CO- y -NH- del enlace peptídico (el primero como aceptor de H, y el segundo como donador de H). De esta forma, la cadena polipeptídica es capaz de adoptar conformaciones de menor energía libre, y por tanto, más estables.

Estructura SECUNDARIA de las proteínas.

Se pueden distinguir varios tipos de conformaciones que determinan la estructura secundaria de una proteína:

CONFORMACIÓN AL AZAR

HÉLICE a

HOJA b

GIROS b

CONFORMACIÓN DEL COLÁGENO

ESTRUCTURAS SUPERSECUNDARIAS

49

En algunas proteínas, o en ciertas regiones de la misma, no existen interacciones de suficiente consideración como para que se pueda distinguir un nivel de organización superior a la estructura primaria. En estos casos se habla de conformación al azar.

La figura de la derecha representa el motivo estructural denominado dedo de zinc, muy común en proteínas que interaccionan con el DNA.

Estructura SECUNDARIA: conformación al azar.

50

Cuando la cadena principal o esqueleto de un polipéptido se pliega en el espacio en forma de helicoide dextrógiro se adopta una conformación denominada hélice a (Figura de la izquierda, en verde). Esta estructura es periódica y en ella cada enlace peptídico puede establecer dos puentes de hidrógeno (Figura de la derecha, líneas punteadas). Un puente de hidrógeno se forma entre el grupo -NH- del enlace peptídico del AA en posición n y el grupo -CO- del enlace peptídico del AA situado en posición n-4. El otro puente de hidrógeno se forma entre el grupo -CO- del enlace peptídico del AA en posición n y el grupo -NH- del enlace peptídico del AA situado en posición n+4.

Estructura SECUNDARIA: hélice a.

Cada vuelta de la hélice implica 3,6 AA, con una translación media por residuo de 0,15 nm, lo que indica que la hélice tiene un paso de rosca de 0,54 nm. Dicho con otras palabras, una vuelta completa de la hélice a representa una distancia de 0,54 nm y contiene 3,6 residuos de AA.

51

Las cadenas laterales de los AA se sitúan en la parte externa del helicoide, lo que evita problemas de impedimentos estéricos (Figura de la izquierda). En consecuencia, esta estructura puede albergar a cualquier AA, a excepción de la prolina, cuyo Ca no tiene libertad de giro, por estar integrado en un heterociclo. Por este motivo, la prolina suele determinar una interrupción en la conformación en hélice a (Figura de la derecha).

Estructura SECUNDARIA: hélice a.

Los AA muy polares (Lys, Glu) también desestabilizan la hélice a porque los enlaces de hidrógeno pierden importancia frente a las interacciones electrostáticas de atracción o repulsión. Por este motivo, la estructura en hélice a es la que predomina a valores de pH en los que los grupos ionizables no están cargados. En caso contrario, adoptan la conformación al azar.

http://www.ehu.es/biomoleculas/PROT/PROT42A.htm

52

Cuando la cadena principal de un polipéptido (de color verde en la figura de la izquierda) se estira al máximo que permiten sus enlaces covalentes se adopta una configuración espacial denominada estructura b (Figura de la izquierda), que suele representarse como una flecha.

En esta estructura las cadenas laterales de los aminoácidos se sitúan de forma alternante a la derecha y a la izquierda del esqueleto de la cadena polipeptídica.

Estructura SECUNDARIA: hoja b.

Las estructuras b de distintas cadenas polipeptídicas o bien las estructuras b de distintas zonas de una misma cadena polipeptídica pueden interaccionar entre sí mediante puentes de hidrógeno, dando lugar a estructuras laminares llamadas por su forma hojas plegadas u hojas b (Figura de la derecha, con los puentes de hidrógeno representados de color verde).

53

Cuando las estructuras b tienen el mismo sentido N C, la hoja b resultante es paralela (Figura izquierda), y si las estructuras b tienen sentidos opuestos, la hoja plegada resultante es antiparalela (Figura derecha).


54

Esta conformación es típica de proteínas fibrosas como la fibroína de la seda (Figura de la izquierda), donde numerosas estructuras b antiparalelas dan lugar a varias hojas b, pero también aparece en proteínas globlulares como las inmunoglobulinas.


55

Secuencias de la cadena polipeptídica con estructura a o b a menudo están conectadas entre sí por medio de los llamados giros b (Figura de la derecha, en color blanco). Son secuencias cortas, con una conformación característica que impone un brusco giro de 180o a la cadena principal de un polipéptido.

Estructura SECUNDARIA: giros b.

AA como Asn, Gly y Pro (que se acomodan mal en estructuras de tipo a o b) aparecen con frecuencia en este tipo de estructura (Figura de la derecha).

La conformación de los giros b está estabilizada generalmente por medio de un puente de hidrógeno entre los residuos 1 y 4 del giro b (En color verde en las Figuras derecha e izquierda).

56

El colágeno (Figura de la derecha) es una importante proteína fibrosa, con función estructural. Presenta una secuencia típica compuesta por la repetición periódica de grupos de tres AA. El primer AA de cada grupo es Gly, y los otros dos son Pro (o hidroxiprolina) y un AA cualquiera: -(G-P-X)-.

Conformación del colágeno.

La frecuencia periódica de la Prolina condiciona el enrollamiento peculiar del colágeno en forma de hélice levógira. La glicina, sin cadena lateral, permite la aproximación entre distintas hélices, de forma que tres hélices levógiras se asocian para formar un helicoide dextrógiro.

57

En proteínas con estructura terciaria globular es frecuente encontrar combinaciones de estructuras al azar, a y b, con una disposición característica que se repite en distintos tipos de proteínas. Son los llamados motivos estructurales o estructuras supersecundarias.

Algunos están formados por a-hélices, otros por estructuras b, y otros por combinaciones de las dos. De entre las más abundantes, podemos destacar:

Estructuras SUPERSECUNDARIAS.

58

Formada por dos a-hélices cortas, conectadas entre sí mediante un tramo sin estructura secundaria (o a veces un giro b). Es característico de proteínas que interaccionan con el DNA.

Estructuras SUPERSECUNDARIAS: hélice-giro-hélice.

59

Es un motivo estructural formado por dos a-hélices yuxtapuestas (Figura de la izquierda). A menudo, estas dos hélices interaccionan entre sí mediante cadenas laterales de leucina (Figura de la derecha, en color azul), originando una estructura llamada "cremallera de leucina" que aparece frecuentemente en proteínas que interaccionan con el DNA.

Estructuras SUPERSECUNDARIAS: Coiled-coil.

60

Formada por dos a-hélices conectadas entre sí por un giro. Está presente en proteínas que se unen a calcio como la calmodulina o la troponina-C. La unión al Ca++ (átomo de color verde en la Figura superior y de color naranja en la Figura inferior) se lleva a cabo gracias a las tres cadenas laterales de Asp localizadas en la secuencia que conecta las dos hélices.

Estructuras SUPERSECUNDARIAS: Mano E-F.

61

En este motivo, cuatro a-hélices se asocian a lo largo de su eje longitudinal. Los residuos hidrofóbicos se apiñan en el interior de una forma tan compacta que el agua queda totalmente excluída. El centro activo de proteínas como el citocromo b562 o la miohemeritrina está localizado uno de los extremos de la zona hidrofóbica de esta estructura supersecundaria. Los residuos hidrofílicos se localizan en la superficie.

Estructuras SUPERSECUNDARIAS: 4 hélices empaquetadas.

62

Es un motivo estructural muy sencillo en el cual dos estructuras b adyacentes se orientan de forma antiparalela (en color rojo en la Figura), y están conectadas por medio de un segmento con estructura al azar (en color blanco). Se encuentra con mucha frecuencia en las proteínas y no se le relaciona con ninguna función concreta.

Estructuras SUPERSECUNDARIAS: horquilla b.

63

Formado por varias hojas b antiparalelas conectadas por segmentos con conformación al azar.

Estructuras SUPERSECUNDARIAS: meandro b.

64

En esta estructura supersecundaria, numerosas estructuras b orientadas de forma antiparalela se entrecruzan entre sí dando lugar a una especie de canasta o barril, donde los residuos hidrofóbicos se acumulan en el interior. Este motivo estructural aparece en la proteína que une retinol, donde 8 estructuras b adoptan esta configuración y la molécula de retinol se acomoda en el interior, dejando fuera únicamente su grupo OH.

Estructuras SUPERSECUNDARIAS: barril b.

65

Este es un motivo estructural poco frecuente, que aparece en la proteína UDP N-Acetilglucosamina O-Aciltransferasa de E. coli. Se puede apreciar una hélice levógira formada por el enrollamiento de varias estructuras b orientadas de forma paralela. En el interior de la b-hélice se acumulan las cadenas laterales hidrofóbicas, lo que da estabilidad a la estructura.

Estructuras SUPERSECUNDARIAS: hélice b.

66

Motivo estructural mediante el cual dos estructuras b se orientan de forma paralela (en rojo en la figura) mediante un segmento que contiene una hélice a (en color verde) y dos segmentos con estructura al azar (de color blanco).

Estructuras SUPERSECUNDARIAS: - -b a b.

67

Consta de hélices a y hojas b en disposición paralela y alternante. Es frecuente en proteínas que se unen a nucleótidos.

Estructuras SUPERSECUNDARIAS: estructura de Rossmann.

68

Se llama estructura terciaria a la disposición tridimensional de todos los átomos que componen la proteína, concepto equiparable al de conformación absoluta en otras moléculas. La estructura terciaria de una proteína es la responsable directa de sus propiedades biológicas, ya que la disposición espacial de los distintos grupos funcionales determina su interacción con los diversos ligandos. Para las proteínas que constan de una sola cadena polipeptídica (carecen de estructura cuaternaria), la estructura terciaria es la máxima información estructural que se puede obtener. La Figura de la derecha corresponde a la proteína triosafosfato isomerasa. La estructura terciaria es una disposición precisa y única en el espacio, y surge a medida que se sintetiza la proteína. En otras palabras, la estructura terciaria está determinada por la secuencia de AA (estructura primaria).

Estructuras terciaria de las proteínas.

69

Se distinguen dos tipos de estructura terciaria:

Proteínas con estructura terciaria de tipo fibroso en las que una de las dimensiones es mucho mayor que las otras dos. Son ejemplos el colágeno (Figura superior), la queratina del cabello o la fibroína de la seda). En este caso, los elementos de estructura secundaria (hélices a u hojas b) pueden mantener su ordenamiento sin recurrir a grandes modificaciones, tan sólo introduciendo ligeras torsiones longitudinales, como en las hebras de una cuerda.

Proteínas con estructura terciaria de tipo globular, más frecuentes, en las que no existe una dimensión que predomine sobre las demás, y su forma es aproximadamente esférica. En este tipo de estructuras se suceden regiones con estructuras al azar, hélice a hoja b, acodamientos y estructuras supersecundarias. La figura inferior corresponde a la mioglobina.


70

Las fuerzas que estabilizan la estructura terciaria de una proteína se establecen entre las distintas cadenas laterales de los AA que la componen. Los enlaces propios de la estructura terciaria pueden ser de dos tipos: covalentes y no covalentes (Figura de la derecha).

Los enlaces covalentes pueden deberse a (1) la formación de un puente disulfuro entre dos cadenas laterales de Cys, o a (2) la formación de un enlace amida (-CO-NH-) entre las cadenas laterales de la Lys y un AA dicarboxílico (Glu o Asp).

Los enlaces no covalentes pueden ser de cuatro tipos: (1) fuerzas electrostáticas entre cadenas laterales ionizadas, con cargas de signo opuesto, (2) puentes de hidrógeno, entre las cadenas laterales de AA polares (3) interacciones hidrofóbicas entre cadenas laterales apolares y (4) fuerzas de polaridad debidas a interacciones dipolo-dipolo.


71

Como resultado de estas interacciones, en las proteínas con estructura terciaria globular:

las cadenas laterales con carácter apolar se orientan hacia el interior de la molécula evitando las interacciones con el disolvente, y forman un núcleo compacto con carácter hidrofóbico (en color azul en la figura de la derecha).

las cadenas laterales de los aminoácidos polares se localizan en la superficie de la molécula, interaccionando con el agua y permitiendo que la proteína permanezca en disolución (en color blanco en la figura de la derecha).


No todas estas interacciones contribuyen por igual al mantenimiento de la estructura terciaria. Obviamente, el enlace que aporta más estabilidad es el de tipo covalente, y entre los no covalentes, las interacciones más importantes son las de tipo hidrofóbico, ya que exigen una gran proximidad entre los grupo apolares de los AA.

Cuando desaparecen estas interacciones la estructura terciaria de una proteína se desestabiliza y pierde su estructura tridimensional característica de manera que pierde su función y, a menudo precipita. Este fenómeno se conoce con el nombre de desnaturalización.

72

Existen regiones diferenciadas dentro de la estructura terciaria de las proteínas que actúan como unidades autónomas de plegamiento y/o desnaturalización de las proteínas. Estas regiones constituyen un nivel estructural intermedio entre las estructuras secundaria y terciaria reciben el nombre de dominios. Los dominios se pliegan por separado a medida que se sintetiza la cadena polipeptídica. Es la asociación de los distintos dominios la que origina la estructura terciaria. La Figura de la derecha corresponde a la proteína piruvato quinasa, que consta de 4 dominios, cada uno representado de un color. La pérdida total o parcial de los niveles de estructuración superiores al primario recibe el nombre de desnaturalización, que puede ser reversible o irreversible.

Estructuras terciaria de las proteínas: concepto de DOMINIO.

73

Cuando una proteína consta de más de una cadena polipeptídica, es decir, cuando se trata de una proteína oligomérica, decimos que tiene estructura cuaternaria. La estructura cuaternaria debe considerar: (1) el número y la naturaleza de las distintas subunidades o monómeros que integran el oligómero y (2) la forma en que se asocian en el espacio para dar lugar al oligómero. La figura de la derecha corresponde a la hemoglobina.

Estructuras CUATERNARIA de las proteínas.

74

En proteínas con estructura terciaria de tipo fibroso, la estructura cuaternaria resulta de la asociación de varias hebras para formar una fibra. La miosina o la tropomiosina constan de dos hebras con estructura de hélice a enrolladas en una fibra levógira. La a-queratina del cabello y el fibrinógeno de la sangre presentan tres hebras en cada fibra levógira. El colágeno consta de tres hebras helicoidales levógiras que forman una fibra dextrógira. La fibroína de la seda presenta varias hebras con estructura de hoja b orientadas de forma antiparalela.


75

Cuando varias proteínas con estructura terciaria de tipo globular se asocian para formar una estructura de tipo cuaternario, los monómeros pueden ser: Exactamente iguales, como en el caso de la fosfoglucoisomerasa o de la hexoquinasa.

Muy parecidos, como en el caso de la lactato deshidrogenasa.

Con estructura distinta pero con una misma función, como en el caso de la hemoglobina.

Estructural y funcionalmente distintos, que una vez asociados forman una unidad funcional,como en el caso de la aspartato transcarbamilasa, un enzima alostérico con 6 subunidades con actividad catalítica y 6 con actividad reguladora.


76

La estructura cuaternaria modula la actividad biológica de la proteína y la separación de sus subunidades, a menudo, conduce a la pérdida de funcionalidad.

Las fuerzas que mantienen unidas las distintas cadenas polipeptídicas son, en líneas generales, las mismas que estabilizan la estructura terciaria.

Las más abundantes son las interacciones débiles (hidrofóbicas, polares, electrostáticas y puentes de hidrógeno), aunque en algunos casos, como en las inmunoglobulinas, la estructura cuaternaria se mantiene mediante puentes disulfuro.

El ensamblaje de los monómeros se realiza de forma espontánea, lo que indica que el oligómero presenta un mínimo de energía libre con respecto a los monómeros.


77

En muchos casos, las proteínas se agrupan bien entre sí, bien con otros grupos de biomoléculas para formar estructuras supramoleculares de orden superior y que tienen un carácter permanente. Este nivel de asociación recibe el nombre de estructura quinaria:1. ASOCIACIONES ENTRE

PROTEÍNAS 2. ASOCIACIONES ENTRE

PROTEÍNAS Y OTRAS BIOMOLÉCULAS

ASOCIACIONES SUPRAMOLECULARES de las proteínas.

78

Las proteínas a y b-tubulina (en color azul y verde en la figura inferior) forman unos dímeros que se ensamblan formando filamentos huecos enormemente largos llamados microtúbulos, cuya función es fundamentalmente estructural, ya que forman parte del citoesqueleto de las células (que contribuyen a dar forma a las células), del centriolo (que participa en la mitosis), y de los cilios y flagelos (que participan en la motilidad celular).

Asociaciones quinarias entre proteínas.

79

La fibrina es otra proteína que forma una asociación supramolecular. Los monómeros de fibrina se unen mediante enlaces covalentes para formar la malla tridimensional característica del trombo o coágulo sanguíneo.

Asociaciones quinarias entre proteínas.

80

Las proteínas se pueden asociar:1. Con azúcares 2. Con lípidos 3. Con ácidos

nucleicos

ASOCIACIONES ENTRE PROTEÍNAS Y OTRAS BIOMOLÉCULAS.

81

Cuando las proteínas se asocian con azúcares pueden originar asociaciones supramoleculares como los proteoglicanos o los peptidoglicanos.

ASOCIACIONES ENTRE PROTEÍNAS Y GLÚCIDOS.

http://www.ehu.es/biomoleculas/HC/SUGAR35A.htm

http://www.ehu.es/biomoleculas/HC/SUGAR35B.htm

82

Cuando las proteínas se asocian con lípidos pueden originar asociaciones supramoleculares como las lipoproteínas del plasma sanguíneo y las membranas biológicas.

ASOCIACIONES ENTRE PROTEÍNAS Y LÍPIDOS.

83

Cuando las proteínas se asocian con ácidos nucleicos pueden originar asociaciones supramoleculares como los ribosomas, nucleosomas o virus.

ASOCIACIONES ENTRE PROTEÍNAS Y ÁCIDOS NICLEICOS.

84

Los elementos típidos de una cromatografía en columna incluyen un material poroso sólido en el interior de una columna de cristal o plástico. Esta matriz sólida hace de fase estacionaria a cuyo través fluye la disolución proteíca tamponada, que constituye la fase móvil. Constantemente está pasando tampón a través de la columna, lo que permite el avance diferencial de las proteínas, a una velocidad relacionada con grado de interacción con la matriz de la fase estacionaria.

Recogiendo alícuotas de similar volumen, en tubos de ensayo diferentes se pueden llegar a separar las distintas proteínas (A, B, y C) de la mezcla de la figura de la derecha.

Métodos de purificación de proteínas. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA.

85

Ion-exchange chromatography exploits differences in the sign and magnitude of the net electric charges of proteins at a given pH. The column matrix is a synthetic polymer containing bound charged groups; those with bound anionic groups are called cation exchangers, and those with bound cationic groups are called anion exchangers. Ion-exchange chromatography on a cation exchanger is shown here. The affinity of each protein for the charged groups on the column is affected by the pH (which determines the ionization state of the molecule) and the concentration of competing free salt ions in the surrounding solution. Separation can be optimized by gradually changing the pH and/or salt concentration of the mobile phase so as to create a pH or salt gradient.

Métodos de purificación de proteínas. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO.

86

Size-exclusion chromatography, also called gel filtration, separates proteins according to size. The column matrix is a cross-linked polymer with pores of selected size.

Larger proteins migrate faster than smaller ones, because they are too large to enter the pores in the beads and hence take a more direct route through the column. The smaller proteins enter the pores and are slowed by their more labyrinthine path through the column.

Métodos de purificación de proteínas. CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO.

87

Affinity chromatography separates proteins by their binding specificities. The proteins retained on the column are those that bind specifically to a ligand cross-linked to the beads. (In biochemistry, the term “ligand” is used to refer to a group or molecule that binds to a macromolecule such as a protein.) After proteins that do not bind to the ligand are washed through the column, the bound protein of particular interest is eluted (washed out of the column) by a solution containing free ligand.

Métodos de purificación de proteínas. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD.

88

Different samples are loaded in wells or depressions at the top of the polyacrylamide gel. The proteins move into the gel when an electric field is applied. The gel minimizes convection currents caused by small temperature gradients, as well as protein movements other than those induced by the electric field.

Proteins can be visualized after electrophoresis by treating the gel with a stain such as Coomassie blue, which binds to the proteins but not to the gel itself. Each band on the gel represents a different protein (or protein subunit); smaller proteins move through the gel more rapidly than larger proteins and therefore are found nearer the bottom of the gel. This gel illustrates the purification of the enzyme RNA polymerase from E. coli. The first lane shows the proteins present in the crude cellular extract. Successive lanes (left to right) show the proteins present after each purification step. The purified protein contains four subunits, as seen in the last lane on the right.

Métodos de purificación de proteínas. Electroforesis en gel de poliacrilamida.

89

Estimating the molecular weight of a protein. The electrophoretic mobility of a protein on an SDS polyacrylamide gel is related to its molecular weight, Mr. (a) Standard proteins of known molecular weight are subjected to electrophoresis (lane 1).

These marker proteins can be used to estimate the molecular weight of an unknown protein (lane 2). (b) A plot of log Mr of the marker proteins versus relative migration during electrophoresis is linear, which allows the molecular weight of the unknown protein to be read from the graph.

Métodos de purificación de proteínas. Electroforesis en gel de poliacrilamida.

90

Isoelectric focusing. This technique separates proteins according to their isoelectric points. A stable pH gradient is established in the gel by the addition of appropriate ampholytes. A protein mixture is placed in a well on the gel. With an applied electric field, proteins enter the gel and migrate until each reaches a pH equivalent to its pI. Remember that when pH pI, the net charge of a protein is zero.

Métodos de purificación de proteínas. Isoelectroenfoque.

91

Two-dimensional electrophoresis. (a) Proteins are first separated by isoelectric focusing in a cylindrical gel. The gel is then laid horizontally on a second, slab-shaped gel, and the proteins are separated by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. Horizontal separation reflects differences in pI; vertical separation reflects differences in molecular weight. (b) More than 1,000 different proteins from E. coli can be resolved using this technique.

Métodos de purificación de proteínas. Electroforesis bidimensional.

1. esquema general. 2 las proteínas son polímeros lineales de -aminoácidos con amplia...

Documents