Espectrofotometra

TM Dr. Alfonso Hernndez Monsalves

Mayo 2013

Escuela de Ciencias de la SaludTecnologa Mdica

Espectrofotometria

Espectrofotometria

Proceso de Absorcin

La energa de excitacin a una molculaproveniente de un fotn durante el proceso deabsorcin se representa as:

A + hn A* A + calordonde:A es el absorbente en su estado de energa bajo,A* es el absorbente en su nuevo estado deexcitacin energticahn representan a la constante de Planck y lafrecuencia respectivamente

La energa del fotn incidente posee unalongitud de onda ( )

A* es inestable y rpidamente revierte asu estado energtico ms bajo, perdiendoas la energa trmica correspondiente.

La absorcin de determinadas longitudesde onda depende de la estructura de lamolcula absorbente (absortividad, a)

Luz incidente (I0) Luz absorbida Luz emergente (I)

Longitud del medioabsorbente o ancho de lacelda

I0c = concentracin.(nmero de partculas porcm3)

I

a = absortividad

Cuando un rayo de luz monocromtica con una intensidad I0 pasa a travs de unasolucin, parte de la luz es absorbida resultando que la luz emergente I es menorque I0

b

a

Absortividad (a)

a es una constante de proporcionalidadque comprende las caractersticasqumicas de cada compuesto, omolcula y su magnitud depende de lasunidades utilizadas para b y c.

Cuando se expresa la concentracin en molespor litro y la trayectoria a travs de la celdaen centmetros, la absortividad se denominaabsortividad molar y se representa con elsmbolo e .

En consecuencia cuando b se expresa encentmetros y c en moles por litro.

A = e bc

Donde A representa la absorbancia delcompuesto

Ley de LAMBERT y BEER

Para una determinada sustancia, lacantidad de luz absorbida en determinadalongitud de onda depende de laconcentracin de la sustancia y delespesor del medio.

Ley de Lambert: cuando un rayo de luzmonocromtica (I0) pasa a travs de un medioabsorbente, su intensidad disminuyeexponencialmente (I) a medida que la longitud delmedio absorbente aumenta

I = I0e-ab

1 cm. 2 cm. 3 cm.

I0 I I0 I0I I

Ancho de la celda

Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromtica pasa a travs de un medioabsorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que laconcentracin del medio absorbente aumenta

I = I0e-ac

I0 I0 I0I I I

Concentracin

Lo que significa que combinando ambas leyes se crea la Ley de Lambert-Beerdonde la fraccin de luz incidente que es absorbida por una solucin esproporcional a la concentracin de soluto y al espesor de la sustancia atravesadapor la luz. La relacin entre la luz incidente (I0) y la reflejada (I) dar una ideade la cantidad de radiacin que ha sido absorbida por la muestra.

Ley de Lambert Beer:

I = I0e-abc

Si despejamos: I/I0 = e-abc

Al cociente de las intensidades se denominaTransmitancia

T = I/I0 = e-abcSacando logaritmos:

Loge I/I0 = abc

Convirtiendo a log10:

Log10 I/I0 = 2.303 abc

Log10 I/I0 = abc

Absorbancia = Log10 I/I0 = abc

La Transmitancia (T) es la relacin entre laintensidad de luz transmitida por unamuestra problema (I) con la intensidad deluz incidente sobre la muestra (Io):

T = I / I0

Se expresa como % T

La absorbancia es directamente proporcionala la longitud del recorrido b a travs de lasolucin y la concentracin c del colorabsorbente. Estas relaciones se dan como:

A = abc

A menudo b es dada en trminos de cm. y c en gramos por litro, entonces laabsortividad tiene unidades de lg1cm1.

I0 I

LUZABSORBIDA

Luz transmitida

Qu relacin guardan la transmitancia y laabsorbancia?

De acuerdo a las caractersticas de la sustanciaanalizada, la luz que no se absorbe atraviesa lasolucin

T = I/I0

Por lo tanto la absorbancia es reciproca dela transmitancia

Absorbancia contra concentracin (comportamiento lineal)

% Transmitancia contra concentracin (pendiente con signo negativo ycomportamiento exponencial)

Concentracin

Absorbancia

Concentracin

% Transmitancia

De lo anterior se desprende que la Absorbancia (A) o luzque es absorbida por la muestra es igual al logaritmo enbase diez del recproco de la transmitancia (T) o bien al -log10 de la transmitancia, en el que el disolvente puro o(blanco) es el material de referencia; esto es:

A = log10 1/T = log101- log10 T = 0 log10 T = log10 T

mg

A

Absorbancia

La representacin grfica correspondiente a absorbancia ytransmitancia en un gradiente de concentraciones es la siguiente:

Concentracin

Obtencin de TRANSMITANCIA utilizando valores de Absorbancia

Con base en la relacin: T = 10-abc

y considerando que T se menciona en porcentaje (%)

%T = 10-abc x 100.

Aplicando logaritmos a la expresin anterior

log10 %T = -abc log 10 10 + log10 100

Invirtiendo trminos

log %T = log10 100 -abc log 10 10 = 2 abc * 1

log10 %T = 2 abc

Como abc = Absorbancia = A

log10 %T = 2 A.

log10 %T = 2 A.

Ejemplo:

Una absorbancia de 0.6 a que equivale en % T?

Log10 % T = 2 0.6 = 1.4

Log10 % T = 1.4

%T = 1 / Log10101.4

Aplicando antilog. a

1.4 = 15 % de transmitancia

Obtencin de absorbancia a partir de un valor de% de transmitancia

RECORDANDO:

A = log10 1/TEjemplo de clculo

%T = 30

T = 0.30

Sustituyendo (1/T) 1/0.30 = 3.33

Log10 3.33 = 0.523 de absorbancia

Uso de pipetas en Laboratorioclnico

Introduccin

Objetivo:conocer el uso depipetas usadas en ellaboratorio

Qu es una pipeta?

Instrumento imprescindible para nuestralabor en el laboratorio

Instrumento volumtrico de laboratorioque permite medir alcuotas de lquido conbastante precisin.

Esquema general de lasmicropipetas marca BioRad

A1: botn pulsadorA2: tornillo del botn pulsadorB: rueda dentada degraduacin del volumenC: cono de la pipetaD: expulsor de puntaE: punta o tip descartable.Tomado del manual de manejo

de micropipetas Biorad,BR/06/05

Pasos para un correcto usoPara absorber el lquido, el pistn es presionado hastauna primera posicin, el tip es puesto en contacto conel lquido y luego, lentamente, se permite que elpistn vuelva a su posicin original. Este paso permiteel llenado del tip con el volumen correspondiente. Eltip de plstico generalmente no se seca por fuera yaque se considera que su superficie no absorbe lquido.A continuacin se describen las instruccionesespecficas para los modelos de micropipetas.1. Seleccin de la micropipeta a utilizar segn elvolumen a dispensar. Para este paso, se aplican lasmismas reglas que se utilizan para el manejo delas pipetas. La mayora de la micropipetas indican enel botn pulsador el rango o volumen mximo quepueden pipetear. Para prevenir un dao en elmecanismo interno de la micropipeta recuerde nuncaSobrepasar los volmenes mximos permitidos paracada micropipeta.

2. Debido a que la micropipeta tiene un rango devolumen ajustable, es necesario seleccionar elvolumen a medir. Para ello se debe localizar elindicador de volumen, compuesto de tres dgitos quese deben leer de arriba hacia abajo. En la parte msbaja del indicador hay una escala que permite elajuste del volumen al ltimo dgito o decimalpermitido segn el caso. En las micropipetas de 2 hasta200 l, los dgitos negros indican microlitros y losdgitos rojos representan dcimas de microlitro.3. Ajustar el volumen de la pipeta con el tornillo delbotn pulsador o la rueda de graduacin del volumen,hasta llegar a 1/3 por encima del valor deseado.Luego, lentamente, girando el tornillo o la rueda,disminuir el ajuste hasta el valor deseado prestandoatencin para no excederlo. Si se excede, esaconsejable repetir el procedimiento de ajuste.Siempre se debe ajustar el volumen deseado desdeun volumen ms altodisminuyendo las indicaciones del indicador.

4. Seleccionar la punta o tip plstico apropiado para lamicropipeta: la punta debe ajustarse al cono de lamicropipeta. Al insertar la punta en el cuerpo de lapipeta hay que aplicar una fuerte presin conMovimiento giratorio para asegurar la hermeticidad.Nunca usar la pipeta con lquidos sin la puntacolocada. Es posible que la punta plsticase encuentre en una caja tambin plstica que facilitasu uso. Si la punta no queda bien ajustada o no esten caja, deber ajustarse con la mano sin tocar lasuperficie que estar en contacto con la solucin aextraer.5. Aspiracin: apretar el botn pulsador hasta el primertope.6. Con la pipeta en posicin vertical, sumergir la puntaentre 1 mm y 3 mm en la muestra.7. Lentamente se aspira el lquido al relajar la presindel dedo sobre el botn pulsador . Si este paso no serealiza con atencin, puede entraraire en la punta y la cantidad de muestra aspirada noes la adecuada.

8. Esperar un segundo y retirar la punta del lquido.9. Dosificacin: colocar la parte inferior de la puntacontra la pared interior del recipiente donde sedepositar el lquido, con un ngulo entre 10o y 40 o.10. Apretar el botn pulsador suavemente hasta elprimer tope y esperar un segundo.11. Apretar el botn pulsador hasta el segundo topepara vaciar el resto del lquido .12. Manteniendo apretado el botn pulsador en elsegundo tope, retirar la pipeta deslizando la punta porla pared del recipiente. Soltar luego el botn pulsador .13. Expulsar la punta apretando el botn del expulsor.

Para no daar el sistema interno de pistones que posee la micropipeta: -el lquido nunca debe entrar en contacto con el cono de la micropipeta -nunca vuelque la micropipeta con la parte de arriba hacia abajo -nunca coloque la micropipeta en forma horizontal si la punta tiene lquido -nunca ajuste el volumen fuera del rango de la micropipeta

Con respecto a la micropipeta multicanal, stas tienen la ventaja de que sepuede pipetear el mismo volumen al mismo tiempo en varios recipientes a la vez.Estas micropipetas. Las micropipetas multicanal son dispositivos ms complejos quelas micropipetas unicanal ya que bsicamente pueden repetir varias veces la funcinque realiza esta ltima en un solo momento.Para ello, poseen un solo mango, botn pulsador, etc. pero un cono que permite lainsercin de 4 hasta 12 puntas al mismo tiempo.

Posiciones de la micropipeta para medir un volumen especfico.

A: Botn pulsador en el primer topeB: la punta de la micropipeta es sumergida entre 1 mm y 3 mm en la muestra para luego liberar el botn pulsadorsuavemente hasta su posicin originalC: Forma correcta de dispensar el lquido medido en el recipiente correspondienteD: Posicin de la micropipeta al apretar el botn pulsador hasta el segundo topeE: Vuelta a la posicin inicial, F: Expulsin de la punta, la cual debe ser descartada en un recipiente apropiado.Tomado del manual de manejo de micropipetas Biorad, BR/06/05

Rango 0.1-2 l.

Utiliza puntas cristalde 0-10 l.

Rango 0.5-10 l.

Utiliza puntas cristalde 0-10

Rango 1-10 l.

Utiliza puntas cristalde 0-10 l.

Rango 10-100 l.

Exactitud 1.6-0.8%.Repetibilidad0.8-0.3%. Utilizapuntas amarillasde 5-100 l.

Rango 20-200 l

Utiliza puntasamarillas de 5-100 L

Rango 100-1000 l. Utiliza puntas

azules de 101-1000 l.

Rango 1000-5000 l. Utiliza puntas

azules de 101-1000 l.

Rango 1000-10000 l.

Utiliza puntasde 1000-10000 l.

Bibliografa

http://www.labnet.es/shop/catalog/index.php?cPath=189_232&osCsid=f5807d241ba9b076450f298b942bfce5

www.marienfeld-superior.com/2007/espanol/puntas_para_pipetas.htm

http://www.medvet.una.ac.cr/carrera/mva505_Practica1.pdf

http://www.labnet.es/shop/catalog/index.phwww.marienfeld-http://www.medvet.una.ac.cr/carrera/mva5