1 asignatura: anÁlisis quÍmico grado: ciencia y tecnología de los alimentos curso académico:...

1

Asignatura: ANÁLISIS QUÍMICOGrado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos

Curso académico: 2012/13

1. Introducción- Fluorescencia, Fosforescencia, Quimioluminiscencia

- Características analíticas

2. Teoría de la Fluorescencia y Fosforescencia

3. Tipo de espectros

4. Variables que afectan a la Fluorescencia– Fluorescencia y estructura

– Fluorescencia y entorno químico

– Fluorescencia y concentración

5. Instrumentación

6. Aplicaciones al análisis de alimentos

2



CONTENIDOS



1. Introducción

Métodos luminiscentes moleculares

Fluorescencia Fosforescencia Quimioluminiscencia

A A* A + hδ

Espectro de emisión

Análisis cualitativo

Análisis Cuantitativo

Absorción de fotones (hδ )

Reacción química

• Basados en la emisión de radiación electromagnética por moléculas que previamente han sido excitadas.• Cada especie A emite radiaciones de λ características Análisis cualitativo• La intensidad de la radiación IF es proporcional a la [A] Análisis cuantitativo

3



1. Introducción

• La fluorescencia es un fenómeno que fue conocido en el siglo XIX por Stoke: observó fluorescencia en el mineral de fluorita .

Bajo luz del sol Bajo luz ultravioleta

Agua tónica

• El agua tónica es un refresco carbonatado aromatizado con quinina. La quinina es un alcaloide de sabor amargo que se extrae de la corteza del árbol de la quina, y tiene propiedades antipiréticas, analgésicas y contra la malaria.La quinina es una sustancia fluorescente

Luz UV Luz λ mayor

Excitación Emisión

Fig. 1

4

Fig. 2



CaracterísticasCaracterísticas

• Sensibilidad (ppb)Sensibilidad (ppb)

• Gran intervalo linealGran intervalo lineal

• SelectividadSelectividad

• Menor aplicabilidad que los métodos Menor aplicabilidad que los métodos de absorciónde absorción

•Mayor interferencia ambientalMayor interferencia ambiental

Características analíticas

5

1. Introducción



2. Teoría de la fluorescencia y de la fosforescencia

A + hδexcitación A* A + hδemisión hδexcitación hδemisión

λexcitación λemisión

E0

E1

hδexcitación hδemisión

Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia.

•Estado electrónico molecular singlete: los espines de los e- están apareados

•Estado electrónico molecular triplete: los espines de los e- están desapareadosEstado

singletefundamental

Estado singleteexcitado

Estado tripleteexcitado

Fluorescencia Fosforescencia 6



Diagrama parcial de energía para un sistema fotoluminiscente2. Teoría de la fluorescencia y de la fosforescencia

Estados singletes excitados Estados tripletes

excitados

Cruce entre sistemas

Fosforescencia

T1

Fluorescencia

Relajación vibracional

Conversión interna

S2

S1

Absorciónexcitación

S0

Estado fundamental

Ener

gia

Conversión interna

Relajación vibracional

λ2 λ1 λFλP



La velocidad a la que un fotón de radiación es absorbido es grande: el proceso requiere del orden de 10-14 a 10-15 s

La emisión fluorescente, tiene lugar a una velocidad relativamente más lenta, entre 10-9 a 10-5 s, y depende inversamente de la absortividad molar del pico de absorción correspondiente al proceso de excitación

La emisión fosforescente requiere tiempos del orden de 10-4 a 10 s ó más.

Velocidad de absorción y de emisión

8




El camino más probable hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el tiempo de vida del estado excitado

FLUORESCENCIA: emisión de FLUORESCENCIA: emisión de un fotón de radiaciónun fotón de radiación

RELAJACIÓN VIBRACIONAL: no radianteRELAJACIÓN VIBRACIONAL: no radiante

CONVERSIÓN INTERNA: no radianteCONVERSIÓN INTERNA: no radiante

CONVERSIÓN EXTERNA: no radianteCONVERSIÓN EXTERNA: no radiante

CRUZAMIENTO ENTRE SISTEMAS: no radianteCRUZAMIENTO ENTRE SISTEMAS: no radiante

FOSFORESCENCIA: emisión de un fotón de FOSFORESCENCIA: emisión de un fotón de radiaciónradiación

Procesos de desactivación

Estado excitado

Estado fundamental

La fotoluminiscencia sólo la presentan un número relativamente pequeño de sistemas con características estructurales y ambientales que hacen que la velocidad de los procesos de desactivación no radiantes sean mas lentos que los de emisión.

9




• Espectro de excitación: Se obtiene al registrar la intensidad de fluorescencia, manteniendo fija la λemisión y variando la λexcitación

• Espectro de emisión : Se obtiene al registrar la intensidad de fluorescencia manteniendo fija la λexcitación y variando la λemisión.

• Los análisis se efectúan seleccionando λexcitación y λemisión máximas.

FenantrenoFenantreno

Excitación Emisión Fluorescente

Emisión Fosforescente

Espectros de excitación y emisión de fluorescencia y fosforescencia

10

3. Tipos de espectros de fluorescencia y fosforescencia



Espectros de excitación y emisión de fluorescencia

Cada uno es una imagen especular del otro.Las emisión son mayores que excitación

11




Antracenoa) espectro excitaciónb) espectro fluorescente

Cada uno es una imagen especular del otro

Espectros de excitación y emisión de fluorescencia

12




4. Variables que afectan a la fluorescencia

Estructura química

Entorno químico

Sustancia fluorescente

Intensidad de emisión fluorescente

13



= nº moléculas que emiten fluorescencia/nº total de moléculas excitadas = nº fotones emitidos/nº fotones absorbidos

KF, Kpd, Kd Estructura química

Kces, Kce, Kci Entorno químico

Rendimiento cuántico de fluorescencia:

K = las constantes de velocidad de los diversos procesos de desactivación posibles: fluorescencia (KF), cruce entre sistemas (Kces), conversión externa (Kce), conversión interna (Kci), predisociación (Kpd) y disociación (Kd ). Las variables que conducen a valores altos de KF y valores bajos del resto de velocidades exaltan la fluorescencia

= KF / KF + Kces + Kce + Kci + Kpd + Kd

Rendimiento cuántico y tipo de transición:La eficacia cuántica es mayor para las transiciones -*

14




Fluorescencia y estructura

Pueden presentar fluorescencia:• Compuestos con estructuras con dobles enlaces altamente conjugados.

• Compuestos que contienen grupos carbonilo en estructuras alifáticas

• La fluorescencia más intensa es la que presentan los compuestos que contienen grupos funcionales aromáticos con transiciones π → π* de baja energía

• La mayoría de los hidrocarburos aromáticos no sustituidos son fluorescentes en disolución.• La eficacia cuántica normalmente aumenta con el número de anillos y con su grado de condensación

15


Fig. 1 Fig. 2

Antraceno

Fenantreno



NN

N O S

N

H

N

H

Piridina Furano Tiofeno Pirrol

Quinoleina Isoquinoleina Indol

Heterociclos sencillos no fluorescentes

Fusionados con anillos bencénicos sí presentanfluroescencia

Fluorescencia y estructura

16




La sustitución en el anillo bencénico produce:• Desplazamientos de la de los máximos de excitación y emisión• Un aumento o disminución de la intensidad de fluorescencia según el sustituyente

Efecto de la sustitución en la fluorescencia del benceno

Compuesto

Fórmula

Longitud de onda de la fluorescencia, nm

Intensidad relativa de la fluorescencia

Benceno C6H6 270-310 10 Tolueno C6H5CH3 270-320 17 Propilbenceno C6H5C3H7 270-320 17 Fluorobenceno C6H5F 270-320 10 Clorobenceno C6H5Cl 275-345 7 Bromobenceno C6H5Br 290-380 5 Iodobenceno C6H5I - 0 Fenol C6H5OH 285-365 18 Ión fenolato C6H5O

- 310-400 10 Anisol C6H5OCH3 285-345 20 Anilina C6H5NH2 310-405 20 Ión anilinio C6H5NH3

+ - 0 Ácido benzóico C6H5COOH 310-390 3 Benzonitrilo C6H5CN 280-360 20 Nitrobenceno C6H5NO2 - 0

Fluorescencia y estructura. Efecto de los sustituyentes

17


Los electrodonadores: -NH2, -NHR, -NR2, -OH, y –OR, aumentan la eficacia de la fluorescencia desplazándola a mayores

Los electroaceptores: -COOH,-COOR, -CHO, -COR y –NO2,reducen la eficacia de la fluorescencia al introducir una transición n- *.

Los halógenos producen efecto de átomo pesado interno

Los grupos sulfónicos no modifican significativamente la fluorescencia

18



Fluorescencia y estructura. Efecto de los sustituyentes




CH HFluoreno Bifenilo

= 1 = 0,2

• La fluorescencia aumenta con la rigidez molecular. • La emisión fluorescente aumenta cuando los colorantes fluorescentes se adsorben en una superficie sólida ya que aumenta su rigidez: Indicadores de adsorción

• La influencia de la rigidez también explica el aumento de la fluorescencia de ciertos agentes quelantes orgánicos cuando forman complejos con iones metálicos. • Por ejemplo, la intensidad de fluorescencia de la 8-hidroxiquinoleína es mucho menor que la de su complejo de zinc

Fluorescencia y estructura. Efecto de la rigidez estructural

19


• TemperaturaUn aumento de temperatura provoca disminución de I F

Fluorescencia y entorno químico



IF Temperatura ºC

• DisolventeLa fluorescencia de una molécula disminuye en presencia de disolventes que contengan átomos pesados: tetrabromuro de carbono, yoduro de etilo

20


• pHInfluye en la fluorescencia de compuestos aromáticos con sustituyentes ácidos o básicos en el anillo.

N

H H+

N

H H

: N

H H+

N

H H H+

Anilina Ión anilinio

Fluorescencia y entorno químico



IF = 0If = 20

• Oxígeno disueltoReduce la intensidad de fluorescencia de una disolución

21


Fluorescencia y concentración



• La intensidad de emisión fluorescente (IF) es proporcional a la potencia radiante de la luz incidente (P0) y a la concentración de la especie fluorescente (c), si la absorbancia de la disolución es pequeña a las longitudes de onda de excitación y de emisión .

IF = k P0 cIF = K c

Relación entre la intensidad de fluorescencia y la concentración

Al aumentar P0 aumenta IF Análisis de trazas

Para concentraciones de analito altas, IF deja de ser proporcional a c

Análisis cuantitativo

22




5. Instrumentación

Esquema de un espectrofluorímetro

en ángulo recto

23

Fuente deradiación

Monocromadorde excitación

Cubeta de muestra

Monocromadorde emisión

Detector

Registradoro PC

Muchaslongitudes de onda

Una longitud de onda

λexc

λemUna longitud de onda

Luminiscencia a muchaslongitudes de onda



Detectores

• De mayor potencia que las que se utilizan en absorción. • La energía radiante emitida en fluorescencia es directamente proporcional a la intensidad de la fuente. • Lámpara de arco de mercurio, • Lámpara de arco de xenón,• Láseres de N2 o de Ar

Cubetas

Selección ex y em • Filtros: fluorímetro• Monocromadores : espectrofluorímetro

Fuente de luz

•Vidrio o cuarzo

•Rectangulares, con las cuatro caras pulimentadas

Tubos fotomultiplicadores.

24

5. Instrumentación



6. Aplicaciones

Análisis cualitativo• Poca aplicación.• la fluorescencia es valiosa en la identificación de derrames de petroleros.

Análisis cuantitativoLa aplicación más importante de la fluorimetría corresponde al análisis de productos alimenticios, sustancias farmacéuticas, muestras clínicas y productos naturales

• Los métodos fluorescentes son :• Aplicables a intervalos de concentración más bajos los de absorción • Tienen sensibilidades mayores que los métodos de absorción. •Tienen una precisión y exactitud menor que las de los de absorción.•Muy selectivos, con una selectividad mayor que los métodos de absorción.

25

•Los basados en la reacción del analito con un agente de complejación para formar un complejo fluorescente. Se utilizan para cationes




Determinación de especies inorgánicas

Se han desarrollado métodos cuantitativos basados en fluorescencia para especies inorgánicas, orgánicas y bioquímicas.

Los indirectos, basados en la disminución de la fluorescencia, quenching, como resultado de la interacción del analito con un reactivo fluorescente. Se utilizan para aniones y determinación de oxígeno en disolución.

• Determinación de Al (III)El granate de alizarina R permite detectar Al3+ a niveles de 0,007 µg/mL.GAR + Al (III) GAR - Al (III)

Determinación de anión F-, se basa en la desactivación de la fluorescencia del complejo GAR - Al (III)GAR - Al (III) + F- GAR + Al(III)-F

26

6. Aplicaciones

Determinación de sustancias orgánicas y bioquímicas




•El número de aplicaciones de los métodos fluorimétricos a problemas orgánicos es muy elevado •Pueden determinarse por fluorescencia los aminoácidos, proteínas, coenzimas, vitaminas, ácidos nucleicos, alcaloides, porfirinas, esteroides, flavonoides, la adenina, ácido antranílico, hidrocarburos policíclicos aromáticos, cisteína, guanina, isoniazida, naftoles, ácido salicílico, triptófano, ácido úrico y numerosos metabolitos.

• También muchos agentes medicinales pueden determinarse por fluorimetría, como la adrenalina, morfina, penicilina, fenobarbital, procaína, reserpina y dietilamida del ácido lisérgico (LSD).

• La aplicación más importante de la fluorimetría corresponde al análisis de productos alimenticios, sustancias farmacéuticas, muestras clínicas y productos naturales.

27

6. Aplicaciones

• Determinación de cationes y aniones• Determinación de quinina• Determinación de colorantes• Determinación de pesticidas• Determinación de vitaminas



Aplicaciones al análisis de alimentos

28

6. Aplicaciones

29

-Logo encabezado páginas OCW-UM. Autor: Universidad de Murcia. Dirección web: http://ocw.um.es..-Página 4. Fig. 1. Dirección web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:FluoriteBerbes.jpg. Author: Didier Descouens.-Página 4. Fig. 2. Dirección web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Tonic_water_uv.jpg. Author: User:Splarka from en:wp-Página 15, Fig. 1. Dirección web: http://commons.wikimedia.org/w/index.php?title=File:Anthracene_acsv.svg&page=1. Author: Calvero.-Página 15, Fig. 2. Dirección web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Fenantrene.PNG.



CRÉDITOS DE LAS ILUSTRACIONES – PICTURES COPYRIGHTS

http://ocw.um.es/

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:FluoriteBerbes.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Tonic_water_uv.jpg

http://commons.wikimedia.org/w/index.php?title=File:Anthracene_acsv.svg&page=1

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Fenantrene.PNG

1 asignatura: anÁlisis quÍmico grado: ciencia y tecnología de los alimentos curso académico:...

Documents