Diagnstico de Laboratorio de las Infecciones Virales

Justificacin de un Diagnstico EspecficoA Nivel Individual o de HatoColeccin, Empaque y Envo de Muestras Diagnstico de las Infecciones Virales por Signos Clnicos e Histopatologa Mtodos de Deteccin de Virus Deteccin de Virus por Microscopa Electrnica Deteccin de Virus por Aislamiento Deteccin de Antgenos Virales Deteccin de cidos Nucleicos Virales Secuenciacin de cidos Nucleicos Virales (Secuenciacin Genmica) Deteccin y Cuantificacin de Anticuerpos Virales Especficos (Diagnstico Serolgico) Muestras Sricas Pruebas Inmuno Enzimticas- Pruebas de Inmuno Absorbancia Ligada a Enzimas (ELISA)Pruebas de (Virus) Seroneutralizacin Pruebas de Inmunotransferencia (Transferencia Western) Pruebas de Inmunoflorescencia Indirecta Pruebas de Inhibicin de la Hemaglutinacin Pruebas de Inmunodifusin Pruebas de Anticuerpos Especficos de la Clase IgM Tecnologas de Nueva Generacin Interpretacin de Hallazgos de Laboratorio Interpretacin de hallazgos del Laboratorio de Serologa

Las pruebas para apoyar o establecer un diagnstico especfico de una i infeccin viral son de cinco tipos generales: (1) las que demuestran la presencia del virus infeccioso; (2) las que detectan antgenos virales; (3) las que detectan cidos nucleicos virales; (4) las que demuestran la presencia de la respuesta de anticuerpos (Abs) especficos del agente viral; (5) las que directamente visualizan (ven) al virus. La mayora de las pruebas de rutina son dependientes de antgeno (Ag), esto es, que estn diseadas para detectar viriones especficos y ofrecern resultados negativos an si hubiese otros virus presentes en la muestra. Por esta razn, pruebas independientes de Ag tales como aislamiento viral o microscopa electrnica an son usadas para identificar agentes no esperados o desconocidos en una muestra clnica. Los mtodos tradicionales como aislamiento viral an se usan; sin embargo son demasiado lentos para tener cualquier influencia directa en el manejo clnico de un caso ndice. Uno de los ejes principales de la evolucin en las ciencias diagnsticas contina siendo los mtodos rpidos que proporcionan una respuesta definitiva en menos de 24 horas u, ptimamente, durante el curso del examen inicial del animal. Una segunda rea de inters y en donde se ha concentrado el esfuerzo es en el desarrollo de pruebas mltiples que puedan escrutar simultneamente para varios patgenos a partir de una simple muestra. El mejor de estos mtodos debera cumplir cinco prerrequisitos: velocidad, simplicidad, especificidad diagnstica y bajo costo. Caractersticas de pruebas para algunos virus de importancia econmica: (1) estn disponibles comercialmente pruebas diagnsticas estandarizadas y con reactivos de buena calidad, (2) las pruebas se han miniaturizado para conservar reactivos y bajas costos; (3) se han desarrollado instrumentos para automatizar las pruebas, a su vez descendiendo los costos; los anlisis computarizados ayudan en la interpretacin de los resultados tan objetivo como sea posible, adems de facilitar el reporte, archivado y cobro.

Aunque es menos impresionante en medicina veterinaria en comparacin con la medicina humana (por razones de retorno sobre inversin [economa], y el rango de pruebas requeridas por las diversas especies), ha habido una expansin en el nmero de equipos (kits) de diagnstico rpido disponibles comercialmente. Estas pruebas detectan antgenos virales, permitiendo un diagnstico a partir de una muestra tomada directamente del animal durante la fase aguda de la enfermedad, o muestran la presencia de Abs virus-especficos. Las pruebas de inmuno-enzimticas de fase slida (EIAs) o pruebas de inmuno absorbancia ligada a enzimas (ELISAs), en particular, han revolucionado el diagnstico virolgico para la deteccin de Abs o Ag, y son ahora los mtodos de eleccin en muchas situaciones. Para los laboratorios de diagnstico, la tecnologa de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es ahora ampliamente usada para detectar cidos nucleicos virales en muestras clnicas, ofreciendo una muy rpida alternativa a otros mtodos de deteccin viral. Las pruebas de PCR cuantitativas, en particular, facilitan la identificacin muy rpida, sensible y especfica de muchos virus patgenos conocidos, y la automatizacin de estas pruebas permite el procesamiento de grandes cantidades de muestras en periodos cortos de tiempo (muestreo grande-rendimiento mayor). Otra ventaja importante de las pruebas cuantitativas de PCR es que proporcionan un estimado objetivo de la carga viral en la muestra clnica. Los esfuerzos en la investigacin sobre PCR continan para poder mover los ensayos del laboratorio al campo, particularmente para los agentes de graves consecuencias con los cuales la rapidez de un diagnstico es crticamente importante. La prestacin, por un laboratorio, de un servicio integral para el diagnstico de las infecciones virales de los animales domsticos representa una formidable empresa. Los virus que causan infecciones de significancia veterinaria estn en ms de 130 gneros diferentes perteneciendo a 35 familias. Adems de esas cifras, la rpida expansin de virus que pertenecen a los animales de vida silvestre y del mundo acutico, no es sorprendente que no haya un laboratorio que tenga los reactivos necesarios especficos disponibles o las habilidades y experiencia necesarias para la deteccin e identificacin de TODOS los virus de TODAS las especies animales. Por esta razn los laboratorios de diagnstico veterinario tienden a especializarse [p. ej., en enfermedades de animales para alimentos, animales de compaa, aves, peces o especies de laboratorio, o en enfermedades causadas por virus exticos (enfermedades de animales ajenas al pas)]. Contactar al laboratorio para determinar sus capacidades especficas debera ser el primer paso para enviar los muestras para anlisis. En el Cuadro 5.1 se proporciona una gua general para las pruebas diagnsticas actualmente usadas en medicina veterinaria.

Cuadro 5.1 Principios y Objetivos de los Mtodos de Diagnstico

Mtodo PrincipalMuestras/HallazgosCaractersticas

Informacin Visual que lleva a un Diagnstico Presuntivo

Revisin de la historia de la enfermedad, examen clnico, pruebas bioqumicas, hematologa, etc.El animal vivo y sus lquidos corporales/ Valores anormalesEs muy importante diferenciar para eliminar otros diagnsticos presuntivos

Patologa, histopatologa, patologa estructuralAnimales, rganos, tejidos, clulas/ Lesiones caractersticas, cuerpos de inclusinAunque es caro y lento, todava es de importancia en medicina veterinaria

Deteccin de virus por microscopa electrnicaTejidos, clulas, secreciones, excreciones contenido de las vesculas/ Partculas uniformes de morfologa caractersticaRpido, suficientemente sensible con muchas enfermedades, especialmente diarreas; caro tecnolgicamente demandante, se requiere un experto generalmente

Deteccin e Identificacin de Antgenos Virales

Mtodos inmunoenzimticos (p. ej., prueba inmuno -enzimtica de captura de antgenosTejidos, clulas, secreciones, excreciones/ Reaccin de antgenos virales con anticuerpos especficosRpido, sensible y especfico. Son los mtodos ms usados ahora

Inmunocromatografa, pruebas de anticuerpos marcados con oroSangre, secreciones, excreciones/ El antgeno viral es identificado por reaccin con un anticuerpo especficoRpido, sensible y especfico, adecuado para pruebas con muestras nicas aplicadas en la clnica

InmunofluorescenciaTejidos y clulas/ El antgeno viral es identificado in situ por reaccin con un anticuerpo especficoRpido, sensible y especfico. La localizacin del antgeno en clulas especficas aumenta la confianza del diagnstico; tcnicamente demandante

Inmunohistoqumica (tincin de inmunoperoxidasa)Tejidos y clulas/ El antgeno viral es identificado in situ por reaccin con un anticuerpo especficoLento, pero sensible y especfico. La localizacin del antgeno en clulas especficas aumenta la confianza del diagnstico. Se debe involucrar a un experto, aunque es como una extensin de histopatologa

Microscopa electrnica inmunoelectrnicaTejidos, clulas, secreciones y excreciones/ Caracteriza y agrega los virus mediante un anticuerpo especficoExtensin del diagnstico de microscopa electrnica. Rpido, sensible y especfico. Caro y demandante tcnicamente

Cuadro 5.1 (Cont) Principios y Objetivos de los Mtodos de Diagnstico

Mtodo PrincipalMuestras/HallazgosCaractersticas

Deteccin Directa e Identificacin de cidos Nucleicos Virales

Mtodos de hibridacin, incluyendo hibridacin in situ, Hibridacin por transferencia (Southern) y mtodos de hibridacin en papel filtro (transferencia de punto)Extractos de tejidos, clulas, secreciones y excreciones/ Los cidos nucleico virales son identificados por reaccin con sondas especficas de ADNLos mtodos de transferencia de punto son rpidos, simples de realizar, muy sensibles y con reactivos adecuados muy especficos. En gran parte sustituye a las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR)

PCR, PCR con transcriptasa reversa, PCR en tiempo real y amplificacin isotrmicaExtractos de tejidos, clulas, secreciones y excreciones/ Los cidos nucleicos virales son especficamente amplificados al usar pares de cebadores y luego son identificados por diversos mtodos como anlisis de tamao de segmentos, sondas de ADN marcadas, sondas de hidrlisis y secuenciacin parcialAlgunos mtodos pueden contaminarse, causando resultados falsos positivos. Sin embargo, debido a su increble sensibilidad y especificidad, son ampliamente usados bajo circunstancias en donde es requerido "el toque de artista." La automatizacin y los nuevos mtodos de identificacin de los productos amplificados estn llevando a pruebas ms rpidas, seguras y baratas.

Secuenciacin genmica y parcial de los virusExtractos de tejidos, clulas, secreciones y excreciones/ Los cidos nucleicos virales son especficamente amplificados, y generalmente por PCR y luego son sometidos a secuenciacin automtica, empleando solo 100-300 bases regiones genmicas seleccionadas.Cuando se combina con mtodos de amplificacin genmica automatizados y anlisis de resultados de bases de datos, se convierte en la prueba "estndar de oro" en la identificacin viral.

Huellas de oligonucletidos y mapeo por endonucleasas de restriccin Extractos de tejidos, clulas, secreciones y excreciones/ Los cidos nucleicos virales son amplificados generalmente por PCR o por crecer los virus en cultivos celulares, luego se digieren con enzimas de restriccin y se aplica la electroforesis en gel para determinar los caractersticos patrones de bandas (cdigo de barras viral)Muy lento, caro, difcil de automatizar y complejo para analizar. Estos mtodos estn siendo reemplazados por PCR y secuenciacin

Cuadro 5.1 (Cont) Principios y Objetivos de los Mtodos de Diagnstico

Mtodo PrincipalMuestras/HallazgosCaractersticas

Deteccin y Cuantificacin de Anticuerpos Antivirales (Diagnstico Serolgico)

Inmuno Ensayo Enzimtico (EIA) Prueba de Inmuno Absorbancia Enzimtica (ELISA)Suero/ Muestras analizadas para la presencia de anticuerpos especficos, indicando una infeccin reciente o pasadaRpida, sensible y especfica; el pilar del diagnstico retrospectivo en muchos ensayos clnicos y epidemiolgicos. En muchos casos, sueros pareados son necesarios para confirmar infeccin o vacunacin reciente.

EIA o ELISA para anticuerpos IgMSuero/ Muestras analizadas para la presencia de anticuerpos especficos IgM, indicando una infeccin recienteRpida, sensible y especfica; se ha convertido en el pilar del diagnstico serolgico de infecciones recientes en medicina humana, con desarrollo limitado en medicina veterinaria. En muchos casos una muestra de suero es suficiente.

Pruebas de suero (virus) neutralizacinSuero/ Las muestras son analizadas para la presencia de anticuerpos especficos indicando una infeccin reciente o pasadaMtodo basado en cultivos celulares; caro, lento y tcnicamente demandante. Sin embargo, es la "prueba de oro" de la serologa, porque los anticuerpos neutralizantes correlacionan bien con la proteccin inmune

Inmunotransferencia (Western blotting)Suero/ Las muestras son analizadas para la presencia de anticuerpos especficos indicando una infeccin reciente o pasadaLento, caro y tcnicamente demandante, principalmente es usada como prueba confirmatoria

Prueba de inmunofluorescencia indirectaSuero/ Las muestras son analizadas para la presencia de anticuerpos especficos indicando una infeccin reciente o pasadaRpida, sensible, pero sujeta a reacciones no especficas incontrolables

Prueba de inhibicin de la hemaglutinacinSuero/ Las muestras son analizadas para la presencia de anticuerpos especficos indicando una infeccin reciente o pasadaRpida, sensible y especfica; ampliamente utilizada para diagnstico retrospectivo para propsitos epidemiolgicos y reguladores. Contina siendo el pilar del diagnstico de enfermedades virales de las aves y de muchos virus de mamferos

InmunodifusinSuero/ Las muestras son analizadas para la presencia de anticuerpos especficos indicando una infeccin reciente o pasadaRpida, pero carece de sensibilidad y est sujeta a problemas de especificidad. Hay muy buenas pruebas para algunas enfermedades

Cuadro 5.2 Muestras apropiadas para el laboratorio de diagnstico de varios sndromes clnicos en el animal vivo

SndromeMuestra

RespiratorioHisopado nasal o traqueal; aspirado nasofarngeo, lquido del lavado traqueal

EntricoHeces fecales

GenitalHisopado genital

OjoHisopado de la conjuntiva

Piel Hisopado de la vescula o escarificacin; biopsia de la lesin slida

Sistema nervioso centralLquido cefalorraqudeo

GeneralizadoHisopado nasal a, heces fecales a, leucocitos sanguneos a, suero, orina

Biopsiargano implicado

Cualquier enfermedadSangre para serologa b

a Dependiendo de la patogenia presumida

b Permitir que la sangre coagule; al suero mantenerlo para pruebas de anticuerpos

JUSTIFICACIN DE UN DIAGNSTICO ESPECFICOPor qu molestarse en establecer un diagnstico definitivo de laboratorio, de una infeccin viral? En los primeros tiempos cuando el diagnstico de laboratorio estaba en su infancia, el diagnstico de las enfermedades relacionadas a infecciones virales se logr principalmente basndose en la historia clnica y los signos, y/o en patologa macroscpica e histopatologa; las pruebas de laboratorio fueron vistas como confirmadoras de datos. Ahora esto no es el caso, por muchas razones: (1) el reciente desarrollo de formatos de pruebas rpidas para identificacin sensible y especfica de infecciones virales; (2) muchos casos clnicos ocurren como complejos de enfermedades que no pueden ser diagnosticados basndose solamente en los signos clnicos o la patologa, por ejemplo, los complejos de enfermedad respiratoria de perros y bovinos; (3) la medicina diagnstica, especialmente lo que concierne a animales de compaa, que estn demandando diagnsticos antemortem especficos y seguros; (4) acciones legales/reguladoras para enfermedades de animales de produccin y zoonosis que requieren identificacin especfica del agente involucrado, la influenza aviar es un ejemplo relevante actual.

A nivel individual o de Hato Enfermedades en las cuales el manejo del animal o su pronstico es influenciado por el diagnstico. Enfermedades respiratorias (p. ej., en una caseta de engorde de pollos, enfermedad respiratoria aguda en un asilo de perros, fiebre de embarque en corraletas de engorde), enfermedades diarreicas de neonatos, y algunas enfermedades muco-cutneas pueden ser causadas por una amplia variedad de agentes infecciosos, incluyendo virus. La identificacin rpida y segura del agente causal puede ser la base para establecer un plan de manejo (bioseguridad, vacunacin, tratamiento antimicrobiano) para prevenir prdidas adicionales en el establo, perrera, caseta, o hato.

Certificacin de libre de infecciones especficas. Para enfermedades de larga duracin (crnicas), como infecciones por los virus de leucemias de gatos y bovinos, infecciones virales persistentes por el agente de la diarrea viral bovina y ciertas infecciones por herpesvirus, un certificado de prueba negativa o historia de una adecuada vacunacin es requerida a menudo como una condicin para la venta, para la exhibicin en una feria estatal o subasta o para competencias y/o movilizacin internacional.

Inseminacin artificial, transferencia de embriones y transfusin sangunea. Los machos empleados para la coleccin de semen y hembras usadas en los programas de transferencia de embriones, especialmente el ganado, y los donadores de sangre de todas las especies son generalmente escrutados para un rango amplio de virus para minimizar el riesgo de transmisin viral a los animales receptores.

Zoonosis. Virus como el de la rabia, fiebre del valle del Rift, influenza, encefalitis equinas del este, oeste, venezolana son TODOS zoonticos, y son de suficiente significancia en salud pblica como para requerir laboratorios de diagnstico veterinario para establecer la capacidad de una deteccin segura de estos agentes. La advertencia temprana de la epidemia potencial de influenzavirus mediante el diagnstico de infeccin y/o enfermedad de un lote de aves en particular o de cerdos afectados, permite la implementacin de programas de control para erradicar la infeccin y/o la restriccin de la movilizacin de los animales expuestos. Como un ejemplo, la identificacin de laboratorio del virus de la rabia en un perro, un zorrillo o un murcilago que haya mordido a un nio proporciona la base para la decisin del tratamiento.

A nivel Estatal, del Pas o Internacional Conciencia Epidemiolgica y econmica. La prestacin de servicios veterinarios adecuados en cualquier estado o pas depende del conocimiento de las enfermedades prevalentes, por lo tanto frecuentemente se hacen estudios epidemiolgicos para determinar la prevalencia y distribucin de infecciones virales particulares. Tales programas son tambin dirigidos contra enfermedades de virus zoonticos, o transmitidos por agua, alimentos, roedores o artrpodos. Internacionalmente, la presencia de enfermedades especficas de los animales en un pas o regin requiere la notificacin a la Oficina Internacional de Epizootias (Office International des Epizooties, la OIE, sinom., Organizacin Mundial de la Salud Animal, www.oie.int), la cual registra la ocurrencia de estas enfermedades notificables en los aproximadamente 175 pases miembros de la organizacin.

Programas de prueba y sacrificio. Para infecciones causadas por virus como el la anemia infecciosa equina, enfermedad de Marek, herpesvirus bovino-1, pseudorabia, diarrea viral bovina, es posible reducir sustancialmente la incidencia de la enfermedad o eliminar al agente causal de los hatos o casetas mediante los programas de prueba y sacrificio. La eliminacin del virus de la pseudorabia de instalaciones comerciales de cerdos en los Estados Unidos de Amrica (Mxico tambin), son ejemplos donde las pruebas de laboratorio diferenciales [la as llamada prueba de diferenciacin/discriminacin de animales infectados de los vacunados (DIVA), que discrimina entre los animales naturalmente infectados de los vacunados] fueron esenciales en los esfuerzos de erradicacin.

Programas de vigilancia epidemiolgica en apoyo a la investigacin de enfermedades endmicas y actividades de control. La vigilancia epidemiolgica de las infecciones virales basada en diagnstico de laboratorio es central en toda la investigacin epidemiolgica, sea para determinar la significancia de un virus determinado en un nuevo lugar, para revelar la historia natural y ecologa de un virus en un individuo en una poblacin animal en particular, para establecer prioridades y medios de control, o para hacer seguimiento y evaluacin de los programas de control.

Programas de vigilancia epidemiolgica en apoyo a la investigacin de enfermedades exticas y actividades de control. Los pases de Europa, Amrica del Norte, Australia y Nueva Zelandia y Japn son generalmente libres de muchas enfermedades devastadoras del ganado como fiebre aftosa, fiebre porcina clsica, peste porcina africana, influenza aviar que todava son endmicas en otras partes del mundo. Sin embargo, ocurren con alarmante regularidad incursiones peridicas de estas temidas enfermedades exticas en reas previamente libres y es muy grande el impacto econmico que provocan. Por lo tanto es de la mayor importancia que el diagnstico clnico de una infeccin viral de grandes consecuencias deba ser confirmado rpida y ciertamente. Muchos pases mantienen o participan en el uso de laboratorios especializados con biocontencin dedicados al diagnstico rpido y seguro y a la investigacin de virus altamente catastrficos que causan enfermedades animales exticas econmicamente devastadoras.

Prevencin de enfermedades virales de los animales nuevas, emergentes y re-emergentes. La continua vigilancia epidemiolgica De las poblaciones animales para evidencia de virus nuevos, enfermedades nuevas, y nuevas epidemias es esencial si las nuevas amenazas deban ser tratadas rpida y comprehensivamente. Los virus nuevos y nuevas asociaciones de virus-enfermedad continan siendo descubiertos, virtualmente cada ao. La vigilancia por clnicos veterinarios sagaces tambin como laboratoristas y epidemilogos es esencial para el pronto reconocimiento de tales eventos.

COLECCIN, EMPAQUE Y ENVO DE MUESTRASLa oportunidad para detector u virus depende de la atencin dada por el clnico en la colecta de muestras. Claramente, tales muestras deben ser tomadas del sitio exacto, del animal ms apropiado y en el momento correcto. El momento ms adecuado para la deteccin viral es tan pronto como sea posible despus de que el animal present los primeros signos clnicos, debido a cantidades mximas de virus (ttulos) estn generalmente presentes en la aparicin de los signos y a menudo decrecen en los das siguientes. Las muestras tomadas para deteccin de virus como ltimo recurso cuando por das o semanas los tratamientos empricos han fallado son casi invariablemente un esfuerzo intil y un gasto de recursos de laboratorio. Similarmente, la coleccin y conservacin incorrecta de las muestras, y un envo inadecuado de las mismas, disminuir la calidad del xito preciso del laboratorio de diagnstico.

El sitio del cual la muestra es colectada ser influenciado por los signos clnicos y el conocimiento de la patogenia del agente sospechado (Cuadro 5.2). En la infeccin respiratoria viral del ganado, por ejemplo, las muestras ms importantes que deberan ser colectadas incluyen hisopados nasales y traqueales o lquido de lavados transtraqueales de animales vivos, y tejido del pulmn y linfonodos de los animales muertos; muestras de sangre completa de este tipo de casos son a menudo de poco valor porque el agente causal (virus sincitial respiratorio bovino, herpesvirus bovino-1, coronavirus bovino, etc.) pueden no producir concentraciones detectables en ese tipo demuestra (viremia). Igualmente, para los casos entricos de rutina (diarrea) las heces seran la muestra primaria en becerros con infecciones por rotavirus, coronavirus o torovirus, la muestra de sangre completa es de mucha ayuda solamente si el virus de la diarrea viral bovina es la causa probable. El tiempo en la colecta de muestras tambin es crtico, particularmente en los casos entricos, porque la deteccin de rotavirus podra no ser posible si han pasado ms de 48 horas de la aparicin de los signos clnicos. Las pruebas de PCR pueden extender el periodo de muestreo por su alta sensibilidad analtica y su habilidad para detectar cido nucleico viral a pesar de que el virus ya est bloqueado por Abs neutralizantes, pero este largo periodo de deteccin no elimina la necesidad de intentarlo a tiempo. Adems, la deteccin de cidos nucleicos de manera tarda por la prueba del PCR, aumenta la probabilidad de resultados falsos positivos, y que el virus detectado por el PCR no sea el agente causal de enfermedad de los animales afectados.

Las muestras de tejidos deberan siempre ser tomadas del cualquier parte del cuerpo en donde sean observadas las lesiones, sean por biopsia quirrgica o en la necropsia, debido a que es crtico para que los hallazgos del laboratorio puedan conciliar con las lesiones que fueron manifiestas en el animal afectado. As las muestras separadas deberan ser partidas entre material que ser fijado (formalina u otro fijador) y material que permanecer sin fijar para las pruebas de deteccin viral como tincin por inmuno-histoqumica, tcnica directa de anticuerpos fluorescentes, pruebas de PCR, aislamiento viral.

Debido a la fragilidad de muchos virus, las muestras destinadas para el aislamiento siempre debern ser mantenidas en fro y humedad, lo cual consume algo de tiempo. En la coleccin de muestras como los hisopos, la discusin se har sobre el medio de transporte. Estos medios de transporte consisten en solucin tamponada de sales a la que se le han agregado protenas (p. ej., gelatina, albmina, o suero fetal bovino) para proteger al virus de la inactivacin y antimicrobianos para prevenir la multiplicacin de bacterias y hongos. Un medio de transporte destinado a bacterias o micoplasmas no debera ser usado para el muestreo de virus a menos que se haya demostrado que no es inhibitorio para la prueba viral. Muestras separadas debern ser tomadas para los ensayos bacterianos. En general, las muestras correctamente tomadas y mantenidas para aislamiento viral sern aceptables para pruebas de deteccin de antgenos y cidos nucleicos. Un ejemplo de un kit que contiene materiales adecuados para la colecta y transporte de muestras, se puede ver en la Figura 5.1.

Figura 5.1 Equipo para la correcta colecta y transporte de muestras para maximizar las oportunidades de obtener diagnsticos de laboratorio vlidos a partir de una muestra clnica. Los laboratorios pueden proveer de tales equipos, los cuales contienen materiales para la colecta de muestras y para un envo adecuado que cumpla los estndares de transportacin. Los artculos incluidos pueden ser: caja de envo (unicell); bolsa aislada, paquetes de refrigeracin; bolsas para muestras ziploc de 250-500 gr de capacidad; frascos con formol (pequeo y mediano); papel absorbente suficiente para capturar todo el lquido de la caja de envo; tubos para colectar suero; tubos para colectar sangre (con EDTA); agujas para sangrar; jeringas; pinzas; bistures; Solucin salina tamponada; alcohol 70%; torundas; formatos de historia clnica; etiquetas de envo; plumn de tinta indeleble; forma de declaracin del envo segn cada pas. (Courtesy of B. Thompson, Animal Health Diagnostic Center, College of Veterinary Medicine, Cornell University.)

Las muestras debern ser enviadas al laboratorio de pruebas, tan pronto como sea posible. Con los servicios de paquetera disponibles en la actualidad a travs del mundo, los servicios de transporte nocturnos han disminuido grandemente el tiempo para la deteccin de agentes, y tambin han aumentado grandemente la tasa de diagnsticos exitosos (tasa de deteccin de patgenos). Las muestras no debern ser congeladas sino solamente mantenidas en fro (temperatura de refrigeracin, 4 C), si la entrega al laboratorio ser en varios das. Mientras que la viabilidad no es muy necesaria para las pruebas de PCR y deteccin indirecta de antgenos, el mantener las muestras bajo ptimas condiciones para el aislamiento viral, aumentarn la oportunidad de deteccin tambin para esas tcnicas. Las muestras NUNCA se mandarn al laboratorio sin una detallada historia clnica del animal y/o del hato de donde se tomaron dichas muestras. Las historias clnicas ayudan al personal del laboratorio en la seleccin de las pruebas ms apropiadas para las muestras recibidas y permiten un dilogo con el clnico sobre muestras adicionales si son necesarias. Similarmente, una detallada y segura descripcin de la naturaleza y distribucin de las lesiones en los animales afectados es importante, si las muestras no son enviadas para evaluacin histopatolgica, independientemente de las muestras hayan sido tomadas por biopsia quirrgica o en la necropsia. El empacado y etiquetado e identificacin de las muestras puede ser algo banal, pero poniendo mucha atencin a estos detalles maximiza que la probabilidad de llegada de las muestras al laboratorio sea la adecuada adems de prevenir sanciones legales por el envo incorrecto de materiales peligrosos. El remitente debe conocer perfectamente las reglas de transporte local, las cuales son un reflejo de las reglas internacionales de transporte areo, en relacin al empacado de muestras para diagnstico. Aunque algunas muestras deben ser enviadas localmente por transporte terrestre, a menudo estos envos pueden ser parcialmente transportados por aire en cortas distancias, an sin el conocimiento del empleado de la oficina de paquetera. Las muestras deberan ser protegidas de fracturas durante el trnsito y deberan ser mandadas en refrigeracin (no congeladas), con paquetes fros (refrigerantes especiales). Siempre que sea posible, el muestreo debe incluir muestras que permitan el uso de varias pruebas diagnsticas, as como una sola prueba proporcionar un resultado inequvoco en todos los casos.

DIAGNSTICO DE LAS INFECCIONES VIRALES POR SIGNOLOGA, LESIONES MACROSCPICAS E HISTOPATOLOGA La evaluacin macroscpica (signos y lesiones) e histopatolgica de los tejidos de los animales con presuntivas enfermedades virales son mtodos de diagnstico importantes y de mucha ayuda. Si las muestras de la biopsia/necropsia son colectadas para diagnstico histopatolgico de infecciones virales, entonces las muestras de tejidos deben colocarse en un fijador adecuado, rutinariamente formol al 10%. Si se van a solicitar procedimientos especiales, como microscopa electrnica o cortes congelados para tincin inmuno-histoqumica, se debera consultar al laboratorio para los procedimientos y detalles para el manejo de estos materiales. Es crtico que una minuciosa, y clara historia clnica y descripcin de las lesiones en los animales afectados deba acompaar a las muestras enviadas.

El gran beneficio de la patologa es que proporciona una confirmacin inequvoca de enfermedades especficas virales, especialmente cuando se hace en paralelo con pruebas de laboratorio apropiadas para la virologa. En contraste, la mera demostracin de un virus en particular, o la seroconversin (aumento del ttulo de anticuerpos) de un animal a ese virus, no es necesariamente prueba de agente causal. As la demostracin de un virus especfico combinada con signos clnicos y lesiones compatibles en los animales afectados fuertemente refuerza la confianza en un diagnstico especfico. Similarmente, la identificacin de lesiones caractersticas en un animal sin deteccin asociada del virus relevante deber estimular a la realizacin de esfuerzos adicionales de laboratorio para confirmar o refutar el diagnstico tentativo.

MTODOS PARA LA DETECCIN DE VIRUSDeteccin de Virus por Microscopa Electrnica (ME) Quiz el mtodo ms obvio de deteccin/identificacin de virus es la visualizacin directa del mismo por ME (Figura 5.2). La morfologa de la mayora de los virus es suficientemente caracterstica para identificar la imagen como un virus y para asignar a u n virus desconocido a la familia correcta. En el contexto de un caso particular (p. ej., deteccin de parapoxvirus en una lesin ulcerosa en la teta de una vaca), el mtodo puede ofrecer un diagnstico inmediato y definitivo. Los virus no cultivables pueden tambin pueden ser detectados por ME. A finales de la dcada de 1960, la ME fue el medio para el descubrimiento de muchas nuevas familias virales de virus previamente clasificados como no cultivables, principalmente, norovirus, astrovirus y torovirus y miembros desconocidos de familias reconocidas como adenovirus y coronavirus. An ahora, los virus no cultivables como los del gnero Anellovirus (torque-tenovirus) han sido identificados por ME en muestras de humanos y una diversidad de animales.

Pueden ser aplicados dos procedimientos generales para la deteccin de virus por ME: la tincin negativa para ME y la ME de corte delgado. Para los procedimientos de tincin negativa, los viriones en una matriz lquida son colocados en un soporte slido diseado para ese propsito. Luego son aplicadas tinciones de contraste y los virus son directamente visualizados por ME. La ME de corte delgado puede ser usada directamente en las muestras de tejido fijadas de los animales afectados o de cultivos celulares infectados de un virus no identificado, que generalmente contienen inclusiones virales. La mayor limitacin de la ME es su baja sensibilidad como herramienta diagnstica, adems de la necesidad de un equipo muy caro y un microscopista altamente calificado. Para detectar las partculas por tincin negativa en la ME, la matriz lquida deber contener aproximadamente 106 (un milln) de viriones por mL. Tales concentraciones generalmente son sobrepasadas en el material clnico tales como heces y lquido de las vesculas, o en cultivos celulares infectados, pero no en el moco respiratorio, por ejemplo. La agregacin de partculas virales por Abs especficos (microscopa inmuno-electrnica, MIE) puede aumentar la sensibilidad y proporcionar identidad provisional del agente. Para la ME de corte delgado, la mayora de las clulas en el tejido de la muestra deben contener virus si estos son propensos a ser visualizados. Los procedimientos de rutina de ME han sido reemplazados por procedimientos ms sensibles y ms baratos como las pruebas de captura de antgeno y las tcnicas de inmuno-tincin, pero debido a que la ME es un procedimiento independiente del agente, todava sigue en uso en casos especializados y en instalaciones con el equipo necesario y con expertos.

Figura 5.2 Diagnstico por microscopa electrnica. La morfologa de la mayora de los virus es suficientemente caracterstica para asignar a un virus desconoci8doa su familia correcta. En el ejemplo, la tincin negativa directa de un lquido vesicular revela muchas partculas de herpesvirus, permitiendo emitir un diagnstico presuntivo de rinotraquetis infecciosa bovina. Aumento X 10,000.

Deteccin de Virus por AislamientoA pesar de la explosin de las nuevas tcnicas de diagnstico el mismo da de las enfermedades virales por demostracin del antgeno o el cido nucleico virales en las muestras, el aislamiento viral en cultivo celulares permanece como un procedimiento importante. Tericamente al menos, un solo virus viable presente en una muestra puede crecer en cultivos celulares, as para aumentarlo y de esa manera producir suficiente material (virus) para permitir una caracterizacin detallada posteriormente. El aislamiento viral contina siendo la prueba de oro estndar comparada contra cualquiera de los nuevos mtodos, pero las pruebas de deteccin de cidos nucleicos, particularmente las pruebas de PCR cuantitativas, estn retando ese paradigma.

Hay varias razones por las cuales el aislamiento viral contina como una tcnica estndar en muchos laboratorios no comerciales. Hasta hace poco era la nica tcnica que poda detectar lo inesperado, esto es, identificar a virus no sospechados, o quiz descubrir enteramente a un nuevo agente. Inclusive, an esos laboratorios bien equipados para diagnsticos rpidos pueden tambin inocular cultivos celulares para intentar aislar un virus. Las tcnicas metagenmicas (genomas de agentes ambientales) y de secuenciacin profunda pueden detectar agentes desconocidos (los llamados patgenos mineros escondidos), pero muy pocos laboratorios fue de los subsidiados para investigacin tienen recursos necesarios para la aplicacin rutinaria de esta tecnologa. El cultivo es el mtodo ms fcil de producir una gran cantidad de virus activo para exmenes ulteriores por mtodos moleculares (secuenciacin genmica, variacin antignica, etc.). Los laboratorios de investigacin y referencia, en particular, estn siempre en la bsqueda de nuevos virus en el contexto de las enfermedades emergentes; tales virus requieren una caracterizacin adecuada, como se demostr recientemente con la rpida evolucin de las cepas de influenzavirus (pandemia de 2009). Ms sin embargo, grandes cantidades de virus deben se desarrolladas en cultivos celulares para producir antgenos y reactivos de diagnstico como los anticuerpos monoclonales (MAbs). Hasta hace muy poco, el desarrollo de una vacuna ha sido dependiente de la disponibilidad de virus crecidos en cultivos, aunque esto puede rpidamente cambiar en el futuro con la sofisticacin creciente de la tecnologa de ADN recombinante.

La eleccin de la estrategia de un cultivo celular para el aislamiento primario de un virus desconocido a partir de muestras clnicas todava es muy emprica. Los cultivos primarios de tejidos fetales de la misma especie generalmente proporcionan los substratos ms sensibles para el aislamiento de virus. Las lneas celulares establecidas (cultivos de lnea) derivadas de las especies homlogas son, en la mayora de los casos, una alternativa aceptable. Conforme ha aumentado el inters en las enfermedades de los animales de vida silvestre, muchos laboratorios han tomado el reto de tener los cultivos celulares necesarios que coincidan con las especies afectadas. Las estrategias para los casos desafiantes tienden a reflejar la creatividad y los errores del virlogo en el diagnstico y del laboratorio, aunque los signos clnicos que mostraron los animales afectados sugieran cual virus podra estar presente. La mayora de los laboratorios tambin seleccionan una lnea celular que se conoce sirve para desarrollar muchos tipos de virus, en el caso de que un agente inesperado est presente. Los cultivos celulares de artrpodos son empleados frecuentemente como un sistema paralelo para el aislamiento de los arbovirus (virus transmitidos por artrpodos). An en los mejores sistemas de cultivos celulares disponibles, algunos virus como los papilomavirus no crecern en las condiciones tradicionales de las clulas cultivadas. Sistemas especiales de cultivo como el de rganos y explantes de tejido pueden ser valiosos, pero se debe contactar al laboratorio para determinar sus capacidades porque se necesitan mtodos sofisticados y personal experto.

Histricamente, cuando los mtodos estndares han fallado en lo que parece una enfermedad infecciosa, la inoculacin en el putativo animal hospedero natural se ha usado para definir la naturaleza de la infeccin problema y para ayudar al eventual aislamiento del agente. Esta prctica ha sido muy abandonada, por los costos y por las condiciones de bienestar animal. Algunos laboratorios especializados tendrn la capacidad de inocular ratones mamones, un sistema que ha sido muy valioso para el aislamiento de arbovirus que resisten el desarrollo en cultivos celulares. Los huevos embrionados de gallina se siguen empleando para el aislamiento de influenzavirus A, aunque los cultivos celulares [clulas Madin-Darby de rin de perro (MDCK)] son ahora comnmente usadas. Muchos virus aviares se replican mejor en huevos que en clulas derivadas de tejidos embrionados de pollo, y por eso hay una carencia de lneas celulares ampliamente disponibles para los procedimientos rutinarios de aislamiento viral. De acuerdo al virus de inters, la muestra ser inoculada en la cavidad amnitica, o en la cavidad alantoidea, el saco de la yema o en la membrana corioalantoidea y en raras ocasiones de manera intravenosa en los vasos de la membrana corioalantoidea y del embrin. La evidencia del crecimiento viral puede ser observado en la membrana corioalantoidea (p. ej., por lceras causas por poxvirus), pero otros medios tambin son usados para detectar tal crecimiento (p. ej., muerte del embrin, hemaglutinacin, inmunofluorescencia o tincin inmuno-histoqumica de los antgenos virales, o ELISA de captura de antgeno).En los intentos para aislar virus se requiere una gran atencin de los clnicos hacia los detalles de la colecta de las muestras y su transporte, porque el xito depende de que el laboratorio receptor tenga una muestra conteniendo un virus viable. El contacto con el labora5torio de pruebas antes de la coleccin de la muestra es fuertemente recomendado a manera de clarificar la estrategia de muestreo, asegurar los requerimientos de envo, y en alertar al laboratorio con el nmero y tipo de muestras que han sido remitidas. El tener cultivos celulares disponibles para el momento de llegada de la muestra puede aumentar el xito del aislamiento. No hay mayor cosa en una emergencia que el aislamiento del virus; cada virus posee su propio reloj biolgico y ningn tipo de preocupacin acelerar el ciclo de replicacin. Para virus como los alfaherpesvirus, un aislamiento exitoso puede ser evidente como efecto citoptico en las clulas de cultivo inoculadas en 2-3 das, mientras que para otros es considerablemente ms lento y requerirn repetir una serie de pases. En general, el tiempo de deteccin depender de los procedimientos del laboratorio para la identificacin del virus en los sistemas de cultivo. Por ejemplo, los virus no citopticos de diarrea viral bovina pueden ser detectados por aislamiento viral tan pronto como 3 das post-inoculacin o tan tarde como 3 semanas, dependiendo de cmo lo haga el laboratorio. Los procedimientos de rutina para detectar e identificar un virus en cultivos celulares inoculados incluyen la tincin de inmunofluorescencia o de inmuno-histoqumica de la monocapa infectada, ELISA de captura de antgenos, pruebas de deteccin de cidos nucleicos como PCR, hemadsorcin o quiz ME d tincin negativa para aislamientos desconocidos.

Deteccin de Antgenos ViralesLa deteccin directa de antgenos (Ags) virales en una muestra clnica puede ser logrado tan rpido como 15 minutos con algunas pruebas inmunolgicas, o el procedimiento puede llevar varios das si la preparacin de la muestra y su tincin est involucrada. Los virus viables generalmente no son requeridos en la muestra para una prueba de deteccin de antgeno positiva, pero el tiempo de colecta si es importante con las pruebas que intentan el aislamiento. La sensibilidad analtica vara entre las diversas modalidades de pruebas, que van desde la deteccin de solo una clula infectada hasta pruebas que requieren ms de 105 (cien mil) unidades de antgeno por unidad de volumen. El avance que revolucion este tipo de pruebas fue el desarrollo de los MAbs. Estos reactivos son altamente especficos en su unin al Ag y, una vez desarrollados, proporcionan un suministro prcticamente inagotable del mismo material para pruebas consistentes (seguras).

El lado oscuro de las pruebas de deteccin de Ags es que muchos de ellos estn alterados o enmascarados por la fijacin del tejido. Es ms, son agentes especficos, as una prueba para el parvovirus canino no podr detectar la presencia del coronavirus canino en la muestra, lo cual requerir un prueba especfica separada y adicional.

Tincin de InmunofluorescenciaLa inmunofluorescencia o tincin de anticuerpos fluorescentes es una prueba de deteccin de Ag que es usada primariamente en cortes de tejidos congelados, improntas celulares o cultivos de clulas, las muestras de tejidos fijadas con formol generalmente no son de ayuda con este procedimiento. El Ag es detectado mediante la unin a la muestra de Abs especficos especialmente modificados (conjugados). La modificacin es el marcaje del Ab con el fluorocromo que absorbe luz ultravioleta de una longitud de onda definida, y que emite luz en una longitud de onda mayor. La luz emitida es detectada pticamente con un microscopio especial equipado con filtros especficos para la longitud de onda de emisin del fluorocromo. Este fluorocromo puede ser unido directamente al Ab especfico (inmunofluorescencia directa) o puede estar unido a una molcula de anti-globulina un anti-anticuerpo (inmunofluorescencia indirecta) Figura 5.3 A). El mtodo indirecto aumenta la sensibilidad de la prueba, pero tambin aumenta el fondo inespecfico.

Figura 5.3 (A) Inmunofluorescencia.Izquierda: Mtodo directo.Derecha: Mtodo indirecto. (B) Inmunohistoqumica. Izquierda: Mtodo directo.Derecha: Mtodo indirectoLa tincin de inmunofluorescencia requiere de equipo especializado, incluyendo un criostato (micrtomo de congelacin) para realizar los cortes congelados junto con un microscopio fluorescente para la deteccin de los anticuerpos adheridos. La inmunofluorescencia ha probado ser de gran valor en la identificacin de Ags en las clulas infectadas tomadas de animales o cultivos celulares inoculados con muestras de los animales enfermos. Para ciertas enfermedades virales, las muestras que poseen clulas infectadas pueden ser fcilmente colectadas de la membrana mucosa del aparato respiratorio superior, del aparato genital, ojo, o piel, simplemente por pasar un hisopo o hacer una escarificacin en el rea infectada con razonable firmeza. Las clulas tambin estarn presentes en el moco aspirado de la nasofaringe o en los fluidos de otros sitios, incluyendo lavados traqueales o bronquiales, o de lquido pleural, abdominal o cefalorraqudeo. Las infecciones respiratorias con parainfluenzavirus, orthomyxovirus, adenovirus y herpesvirus son particularmente susceptibles para un rpido diagnstico (menos de tres horas) por tincin de inmunofluorescencia. El mtodo tambin puede ser aplicado a tejidospor ejemplo, biopsias para el diagnstico de enfermedades por herpesvirus, o de la necropsia del encfalo de un mapache que mostraba signos neurolgicos como resultado de una infeccin con el virus del distemper canino o del virus de la rabia (Figura 5.4).

Tincin Inmunohistoqumica (inmunoperoxidasa) En principio, la tincin inmuno-histoqumica es muy similar a la tincin de inmunofluorescencia de los Ags virales, pero con algunas diferencias importantes (Figura 5.3B). El marcador empleado en la tincin inmuno-histoqumica es una enzima, generalmente la peroxidasa de rbano. La enzima reacciona con un substrato para producir un producto final coloreado que puede ser visualizado en las clulas infectadas con un microscopio ptico ordinario. La muestra de tejido ser fijada en formol, lo cual permite analizar la muestra das o semanas despus de la colecta, sin la necesidad de bajas temperaturas de conservacin. Otra importante ventaja de esta tcnica es que implica un proceso de amplificacin en el que el producto de reaccin aumenta con la incubacin, mientras que la tincin de inmunofluorescencia genera una seal de tiempo real que no hace ms fuerte al alargar el periodo de incubacin. Es ms, los porta-objetos teidos por inmuno-histoqumica pueden ser guardados por largos periodos para varias observaciones, mientras que los de inmunofluorescencia se deterioran ms rpidamente. La inmunofluorescencia tiene la ventaja de la rapidez; la tincin por inmuno-histoqumica de los tejidos fijados con formol requiere ms de 24 horas de fijacin para dar sus resultados. Quizs el mayor beneficio de la tincin por inmuno-histoqumica es que facilita la comparacin de la distribucin del virus y su localizacin celular en los cortes de tejidos para determinar si o no la distribucin del Ag coincide con alguna lesin que est presente (Figura 5.5).

Figura 5.5 Tincin de inmuno-histoqumica de un tejido infectado con el virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDv). Una muestra de rin fijada en formol de un becerro enfermo reaccion con el anticuerpo monoclonal 15.c.5. La unin fue detectada usando un suero de cabra anti-ratn marcado con peroxidasa de rbano. El substrato para la enzima fue 3-amino-9-etilcarbazol. La tincin de clulas obscuras es positiva al antgeno BVDv. .Figura 5.4 Tincin directa de anticuerpos fluorescentes de encfalo de para el virus de la Rabia. Cortes congelados de encfalo de bovino, que mostraba signos neurolgicos anormales fueron fijados en acetona fra y teidos con un reactivo comercial que contiene tres anticuerpos monoclonales especficos para el nucleocpside del virus de la rabia. Los anticuerpos fueron marcados con fluorescena. La tincin positiva se pueden observar en las clulas de Purkinje. (Courtesy of J. Galligan, New York State Department of Health.)

Pruebas inmuno EnzimticasPruebas de Inmuno Absorbancia ligada a EnzimasLas pruebas inmunoenzimticas (EIAs) a menudo referidas como pruebas de inmuno absorbancia ligada a enzimas (ELISAs) han revolucionado los procedimientos de pruebas de diagnstico. Las pruebas pueden ser diseadas para detectar Ags o Abs. Aunque las EIAs tienen una mayor sensibilidad relativa, se requiere que las muestras tengan ms de 105 partculas virales por mL para obtener reacciones positivas con muchas pruebas. Este nivel de sensibilidad hace que estas pruebas sean altamente valiosas, particularmente cuando se analizan grupos, en donde cualquier animal positivo define el estado del hato. Las pruebas pueden ser realizadas con una simple muestra en la clnica veterinaria o con varios cientos de muestras al mismo tiempo, usando sistemas automticos en laboratorios centrales. Algunos comnmente algunos usados son para la deteccin de Ags con kits especiales para el virus de leucemia felina, parvovirus canino, diarrea viral bovina, e influenzavirus. Hay muchos tipos diferentes de pruebas EIAs que difieren en sus propiedades geomtricas, sistemas detectores, sistemas de amplificacin y sensibilidad. No es posible discutir todas las pruebas, pues los principios bsicos de ellas aplican a todas.

La mayora de EIAs son inmuno-ensayos enzimticos de fase slida; el Ab capturado est adherido a un subtrato slido, tpicamente los pozos de placas de microtitulacin de poliestireno o polivinilo. El formato ms simple es una EIA directa (Figura 5.6). el virus o Ags virales solubles de la muestra se les permite unirse a los anticuerpos capturados. Despus de la unin los comp0onentes son lavados, y un Ab antiviral marcado con la enzima conjugado (el Ab detector) es aadido, diversas enzimas pueden ser adheridas al Ab detector, pero la peroxidasa de rbano y la fosfatasa alcalina son las ms comnmente usadas. Despus de otro lavado, un substrato orgnico apropiado para la enzima en particular es aadido y la lectura se har basada en el cambio de color que enseguida aparece. El producto coloreado de la reaccin de la enzima con su substrato puede ser detectado visualmente o ledo en un espectrofotmetro para medir la cantidad de Ab unido al Ag capturado. El producto de la reaccin enzimtica puede ser modificado para producir una seal fluorescente o quimioluminiscente para aumentar la sensibilidad. Con todas esas pruebas, la validacin debe hacerse para determinar los valores de corte de la prueba, los cuales definen la sensibilidad y especificidad diagnstica de la prueba.

Las EIAs indirectas son ampliamente usadas por su gran sensibilidad analtica, pero el aumento de la sensibilidad generalmente conlleva a una prdida de especificidad. En este formato de la prueba, el Ab detector no est marcado pero si un segundo anti-anticuerpo antiglobulina (especie-especfica) es aadido como el Ab indicador (Figure 5.6). Alternativamente, una protena A de Staphylococcus spp., marcada, la cual se puede unir a la estructura Fc de la IgG de muchas especies de mamferos, puede ser usada como el indicador en pruebas de inmunoenzimticas indirectas. Los MAbs han facilitado especialmente el desarrollo de pruebas de EIAs, porque proporcionan un aporte consistente de reactivos con alta sensibilidad y especificidad para las pruebas comerciales. Sin embargo, cualquier variacin (variacin antignica del virus blanco) en los epitopos especficos reconocidos por los MAbs especficos pueden llevar a una prdida de unin y carecer la prueba de sensibilidad ofreciendo resultados falsos negativos. Las EIAs han sido adaptadas a formatos para el uso en clnicas veterinarias para muestras de un solo animal (Figura 5.7).

Figura 5.6 Prueba inmuno-enzimtica (EIA, tambin llamada de Inmuno Absorbancia Enzimtica, ELISA) para la deteccin de virus y/o antgeno viral. Izquierda: Mtodo directo. Derecha: Mtodo Indirecto usando un anticuerpo biotinilado; avidina marcada con una enzima (p. ej., peroxidasa) y el substrato de la enzima y un cromgeno para la reaccin de color.

Figura 5.7 Un artculo de prueba inmuno-enzimtica comercial para uso en la clnica en un solo animal. Este equipo es para la deteccin simultnea del virus de la leucemia felina (FeLv), prueba de antgeno (Ag) y para detectar anticuerpos (Abs) contra el virus de la inmunodeficiencia felina FIv) en el suero, plasma o sangre completa de felinos. La deteccin del antgeno FeLv grupo-especfico es un diagnstico de infeccin por el FeLv y la deteccin de anticuerpos especficos al FIv son indicadores de infeccin. La prueba utiliza un anticuerpo monoclonal para la p-27 del FeLv, un antgeno inactivado del FIv y controles positivos y negativos. Una mezcla de conjugado que contiene anticuerpo conjugado con una enzima para la p-27 y un antgeno conjugado con una enzima. Cuando el conjugado y la muestra son mezclados, el conjugado del anticuerpo monoclonal se unir al antgeno p-27 (si est presente). La mezcla muestra-conjugado es luego agregada al dispositivo y fluir por la matriz punteada. La matriz con anticuerpo anti p-27 (marca de FeLv) capturar al complejo de p-27 y anticuerpo conjugado, mientras que la matriz con el antgeno de FIv (marca de FIv) capturar al complejo de anticuerpo anti-FIv y antgeno conjugado. Entonces el dispositivo estar activado, luego es lavado, y los reactivos del substrato capturados en el dispositivo. El desarrollo de color en la muestra en el punto del antgeno FeLv indica la presencia del antgeno FeLv, mientras que el desarrollo de color en el punto de la muestra de anticuerpos anti FIv indica la presencia de anticuerpos anti-FIv. (Courtesy of Idexx Laboratories, Inc.)

InmunocromatografaLa inmunocromatografa simplemente refiere a la migracin del Ag o complejos Ag-Ab por filtros matriz o en un formato de flujo lateralpor ejemplo, usando tiras de nitrocelulosa. En la mayora de los formatos, un Ab marcado se une a un Ag de inters. Los complejos Ag-Ab son entonces inmovilizados en una matriz de soporte por un Ab no marcado unido a la matriz. Todos los controles son incluidos en la membrana (positivo y negativo), y los resultados son vistos como manchas coloreadas o bandas, porque uno de los reactivos de prueba es un conjugado con oro coloidal o substancias cromognicas. Este formato de prueba es especialmente conveniente para prueba de pacientes en cuidados intensivos, como el proceso de prueba es simple y cada unidad de prueba contiene los controles positivo y negativo para validad la seguridad de dicha prueba.

Deteccin de cidos Nucleicos Virales El desarrollo en el rea de la tecnologa de deteccin de cidos nucleicos en los ltimos aos ha relegado a algunas tcnicas a los anales de la historia con respecto a su uso en las pruebas de diagnstico. Por ejemplo, las tcnicas de hibridacin clsicas no son susceptibles de ser empleadas para pruebas de rutina, especialmente con los requerimientos rigurosos de los estndares de control. La mayora de los cambios dramticos en la tecnologa de la deteccin de cidos nucleicos ha sido la evolucin de las pruebas de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), e igualmente la importante estandarizacin de los procedimientos de extraccin de cidos nucleicos. Adems, de los rpidos avances en la tecnologa de la secuenciacin de nucletidos, sntesis de oligonucletidos, y el desarrollo de bases de datos genticos que permiten baratos anlisis de secuencias que han reemplazado procedimientos menos rigurosos para la comparacin de las cepas virales y sus aislamientos. La tecnologa actual permite la amplificacin de poblaciones de virus por PCR con la secuenciacin directa de los productos amplificados a partir de muestras clnicas sin la posible introduccin de un sesgo potencial dado por el cultivo celular. Ms recientemente el desarrollo ha permitido la deteccin y caracterizacin de agentes desconocidos (metagenmica viral). Con el desarrollo de la nanotecnologa, uno podra anticipar el futuro de la deteccin barata de unidades de cidos nucleicos que sera fiable detectar agentes infecciosos cuando sea usada en las clnicas o en el campo, sin la necesidad de personal altamente entrenado.

Los mtodos de deteccin de cidos nucleicos son invaluables cuando se trata de: (1) virus que no pueden ser cultivados fcilmente; (2) muestras que contienen virus inactivados como resultado de una prolongada conservacin, fijacin del tejido o transporte prolongado; (3) infecciones latentes en las cuales el genoma viral permanece latente y el virus infeccioso est ausente; (4) el virus ha hecho complejos con Abs como se encontrara en las fases finales de una infeccin aguda o durante algunas infecciones virales persistentes. Sin embargo, la sensibilidad aadida dada por la amplificacin del cido nucleico viral puede actualmente crear nuevos problemas. A diferencia de la situacin de las bacterias patgenas, generalmente ha sido el caso que la sola deteccin de un virus patgeno en una lesin, o de un animal clnicamente enfermo, siempre se ha considerado como evidencia de su papel etiolgico (relacin causal). Como los mtodos de deteccin han estado aumentando la sensibilidad y las pruebas incluyen ms agentes, las preguntas de agentes virales pasajeros son ahora ms pertinentes. Por lo tanto, con virus como el de la lengua azul, el cido nucleico viral puede ser detectado en la sangre de rumiantes previamente infectados varios meses despus de que el virus infeccioso se haya eliminado. Es ms, un ejemplo con el herpesvirus bovino 1, la deteccin de cidos nucleicos virales no indica si estn presentes como consecuencia de una infeccin aguda, reactivacin de una infeccin latente o por la vacunacin.

Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) La prueba de PCR es un mtodo in vitro para la sntesis enzimtica de secuencias especficas de ADN usando dos oligonucletidos iniciadores (cebadores, primers), generalmente de unos 20 residuos (20-mers), que hibridizan en las cadenas opuestas y flanquean la regin de inters del ADN blanco; la primer pareja de cebadores son algunas veces referidos como de avance y regreso (Figura 5.8). Los cebadores son necesarios para proporcionar a la polimerasa de ADN un substrato sobre el cual sern agregados nuevos nucletidos, y para dirigir la reaccin a la regin especfica del ADN para su amplificacin. Los iniciadores tambin pueden ser diseados para colocar marcas en los productos amplificados para propsitos de deteccin. Se han empleado programas de cmputo para el diseo de grupos de cebadores ptimos y para predecir los parmetros (tiempo/temperatura) para las reacciones. En donde hay desajustes conocidos de bases mal alineadas o desajustes previos entre el cebador y las secuencias blanco, los iniciadores pueden ser preparados para ser degradadosgrupos de cebadores con diferentes bases en un lugar determinado. Esto puede aumentar la sensibilidad diagnstica de la prueba, as como ms variantes genticas podran ser detectadas. Para el PCR, las reacciones son realizadas en un termociclador bajo condiciones cuidadosamente controladas de fuerzas inicas, temperatura, concentracin de cebadores y de nucletidos. Los ciclos repetitivos incluyen desnaturalizacin del molde (ADN original) por calentamiento, alineacin de cebadores y extensin por la polimerasa de ADN de los cebadores alineados, resultando en la acumulacin exponencial de segmentos de ADN especficos que son definidos por los extremos 5 de los cebadores. Los productos de la primera extensin sintetizados en un ciclo sirven como moldes en el siguiente, de esa manera el nmero de copias de ADN blanco aproximadamente se duplica en cada ciclo; unos 20 ciclos proporcionan alrededor de un milln de copias amplificadas.

Figura 5.8 Amplificacin de parte de una secuencia de ADN por la reaccin en cadena de la polimerasa. Los cebadores oligonucletidos deben primero ser hechos segn la secuencia de cualquiera de los segmentos de ADN que sern amplificados. Luego el ADN debe ser desnaturalizado por calentamiento, los cebadores pueden hibridizar a las secuencias complementarias en la banda opuesta de ADN. En la presencia de polimerasa termo-resistente y trifosfatos de desoxinucletidos dos nuevas copias de la regin deseada sern producidas. Los ciclos de fusin, alineamiento y extensin son rpidamente repetidos; cada vez, la cantidad de ADN blanco se duplicar. Despus de los primeros ciclos, virtualmente todos los moldes consisten de las regiones cortas escogidas para amplificacin. Despus de 30 ciclos, que toma unas 3 horas, la regin sealada por los cebadores habr sido amplificada varios millones de veces. (Courtesy of I. H. Holmes and R. Strugnell.)

Desde la introduccin del concepto PCR en 1983, ha habido numerosos cambios a virtualmente todas las facetas del proceso. La incorporacin de una polimerasa de ADN termoestable permiti la desnaturalizacin a altas temperaturas y la separacin de filamentos de los productos sintetizados, con lo cual se elimin la necesidad de reponer la polimerasa en cada ciclo. El uso de una polimerasa termoestable tambin increment la especificidad de la reaccin, porque los ciclos pueden ser realizados bajo condiciones ms estrictas de alineacin, especficamente, la alineacin en altas temperaturas reduce el mal acoplamiento de los pares de bases que conllevaran a resultados falsos positivos. Con la intencin de aumentar la sensibilidad de la prueba, fue desarrollado un procedimiento de PCR anidado. En este procedimiento, un grupo de cebadores se usa para una amplificacin inicial de un rea blanco y el producto de la primera reaccin se convierte en el molde para una segunda prueba de PCR en la cual nuevos iniciadores se acoplarn a una regin interna del primer par de cebadores. Esta amplificacin del producto ya amplificado aumenta grandemente la sensibilidad de la prueba, pero tambin las oportunidades de resultados falsos positivos por la contaminacin de los materiales de prueba del producto inicialmente amplificado. Posteriores desarrollos de la tecnologa del PCR cuantitativo ha reducido notablemente el uso de procedimientos de anidado.

El desarrollo del mtodo de la reaccin de la cadena de la polimerasa con la transcriptasa reversa (RT-PCR) para detectar secuencias de ARN fue un gran avance en la biologa celular y el diagnstico viral. Para el RT-PCR, el ARN primero es transcrito a ADNc (ADN complementario) usando una polimerasa de ADN capaz de usar ARN como molde, como la transcriptasa reversa de los retrovirus. Una reciente enzima de transcriptasa reversa ha sido desarrollada recientemente que permite la sntesis de una cadena de ADNc a temperaturas altas, la cual aumenta la sensibilidad y especificidad analticas de la reaccin. En las pruebas de un solo tubo de RT-PCR, todos los componentes para ambas reacciones son colocados en el tubo de reaccin al inicio de la prueba. El paso de la sntesis del ADNc es seguido inmediatamente por la reaccin de PCR. En este formato de prueba, no hay oportunidad para los productos de una reaccin que tengan contaminacin cruzada con otros, debido a que el tubo de reaccin nunca es abierto sino hasta que finaliza el protocolo del anlisis. Los avances como el de la prueba de un solo tubo incrementan grandemente la credibilidad de los resultados de prueba al virtualmente eliminar los problemas de contaminacin del laboratorio.

Mtodos para la Deteccin de Productos Amplificados Al inicio de la era de las pruebas de PCR, los productos amplificados fueron detectados por analizar los productos de reaccin por separacin en gel. Los productos amplificados de un tamao determinado eran visualizados usando substancias fluorescentes que se unen a los oligonucletidos separados en los geles de agarosa. Una banda de un tamao apropiado era tomada como una prueba positiva para la presencia del Ag en una muestra. Los mtodos se fueron desarrollando para aumentar la sensibilidad de deteccin de bandas en los geles., pero an con el aumento de la sensibilidad, este procedimiento de deteccin tuvo un gran defectoel tubo de reaccin tena que abrirse varias veces para asegurar el estado de la muestra. Muchas reas de los laboratorios se contaminaron con los productos de la reaccin amplificada, muchos falsos positivos se presentaron frecuentemente despus de que se analizaron subsecuentes muestras. Se hicieron muchos actos heroicos para evitar el problema de dichos falsos positivos, pero la sospecha de un resultado positivo permaneci prevalente y an perduran. Afortunadamente, la tecnologa proporcion una respuesta para poder dominar las pruebas de PCR: las pruebas de PCR en tiempo real (Figura 5.9). Este gran avance de la tecnologa fue realizado por el desarrollo del termociclador con un fluormetro que poda medir con seguridad (cuantificar) la acumulacin de productos del PCR (amplicones) en el tubo de reaccin como se hace hasta ahoraesto es, en tiempo real. El producto es medido por aumentos en la intensidad de la fluorescencia generada por varias molculas reporteras fluorescentes, incluyendo uniones a ADN no especfico (SYBR Green I), a sondas de TaqMan (Figura 5.9 A), y balizas moleculares como ejemplos. Una vez que los reactivos son agregados al tubo de prueba, stos no necesitan abrirse nuevamente, as se evita cualquier oportunidad para la contaminacin del laboratorio. Los sistemas de deteccin en tiempo real tambin son ms sensibles que los mtodos estndar en sistemas de geles, y la especificidad aadida es lograda mediante el uso de sondas de deteccin de la reaccin, debido a que su seal es generada solamente si la secuencia de la sonda es capaz de unirse a la secuencia blanco.

Figura 5.9 (A) El mecanismo qumico de la sonda TaqMan. Estas sondas dependen de la actividad de la actividad nucleasa 5-3 de la Taq polimerasa de ADN para escindir a una sonda doble marcada durante la hibridacin de la secuencia blanco complementaria. (B) Datos cuantitativos de la PRC de tiempo real. Las curvas de reaccin de prueba para asegurar sus condiciones, usan diluciones de un transcrito de ARN (control de nmero de copias) de un segmento clonado de pneumovirus canino. Las lneas verticales representan el valor Ct, el cual es el nmero de ciclos de PCR requeridos para que la seal fluorescente cruce un valor determinado. La sonda TaqMan fue marcada con FAM (fluorescena 6-carboxy; el reportero) en el extremo 5 y BHQ (Black Hole Quencher; el extintor) en el extremo 3.Otra ventaja del sistema de tiempo real es que el proceso puede ser cuantitativo. Bajo condiciones ptimas, la cantidad del amplicn aumenta por un factor de 10 con cada 3.3 ciclos de amplificacin (Figura 5.9B). Con estos sistemas, la generacin del producto es registrado en cada ciclo. La cantidad de producto generado en una reaccin puede ser comparado con el nmero de copias control y, con controles de extraccin adecuados en el sistema, una medida directa de la cantidad de secuencias iniciales pueden ser determinadas. En humanos, por ejemplo, esta caracterstica tiene un valor particular en las respuestas de seguimiento sobre el tiempo de tratamientos medicamentosos para infecciones con virus de hepatitis C e inmunodeficiencias (VIH). Una variacin posterior en las pruebas de PCR que est siendo muy usada es el PCR mltiple. En este mtodo, dos o ms pares de cebadores especficos para secuencias blanco diferentes son incluidos en la misma reaccin de amplificacin. De esta manera, las pruebas pueden ser hechas para varios agentes al mismo tiempo y en el mismo tubo de anlisis, por lo tanto ahorrando tiempo y costes. Con las pruebas de PCR mltiple en tiempo real, varias sondas con diferentes molculas fluorescentes pueden ser detectadas simultneamente. Este tipo de aplicacin es muy til en la evaluacin de muestras de complejos de enfermedad, como la enfermedad respiratoria aguda de los perros. Los problemas de sensibilidad de la prueba deben ser considerados en este formato, porque varias reacciones deben competir por reactivos comunes en el tubo de anlisis, de esta manera un agente puede formar un gran nmero de copias que enmascararn a otro con pocas copias.

Ventajas y Limitaciones de la Tecnologa de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa Dada la explosin en el uso y disponibilidad de las pruebas de PCR en anlisis virolgicos, debern hacerse ciertas consideraciones en relacin a los potenciales beneficios y limitaciones de estas pruebas. La prueba del PCR es especialmente til en la deteccin de virus que son difciles de crecer en cultivos, como ciertos virus entricos: adenovirus, papilomavirus, astrovirus, coronavirus, norovirus y rotavirus. El PCR puede ser usado con cualquier muestra que sea apropiada para aislamiento viral, la decisin para realizar PCR como opuesta a otro mtodo de deteccin viral estar basado en velocidad, costo y capacidad del laboratorio. Estas pruebas pueden ser preferidas para la identificacin inicial de virus zoonticos como el de la rabia, ciertos poxvirus o influenza virus, para minimizar el riesgo de exposicin del personal de laboratorio porque la amplificacin del virus infeccioso no es necesaria para la deteccin.

Una limitante del PCR o d cualquier tcnica de amplificacin de cidos nucleicos puede ser la matriz en la cual la muestra blanco est embebida. El material en la muestra matriz puede inhibir las enzimas en las cuales la prueba est basada, lo cual ha sido una fuente constante de preocupacin cuando se manejan muestras fecales y en algunos casos muestras lcteas. Es necesario incluir controles de extraccin en este tipo de muestras a manera de detectar problemas con el proceso de amplificacin por s mismo (ms que la falta de un molde especfico). Es ms, las pruebas de PCR y la simple amplificacin de cidos nucleicos son agente especficos, as ninguna seal se generar si los cebadores no concuerdan (no se alinean) con la secuencia de algn virus presente en la muestra. En las primeras pruebas directas de PCR, y especialmente con el PCR anidado, los resultados falsos positivos eran una gran preocupacin como resultado de la alta contaminacin en el laboratorio que ocurra con el producto amplificado. Con la disponibilidad de los formatos de PCR de tiempo real en un solo tubo, este problema ha sido ampliamente superado, aunque la correcta elaboracin de los protocolos de pruebas de PCR se mantiene como un proceso con grandes retos tecnolgicos. La elaboracin de pruebas de PCR de tiempo real est en continua mejora con kits de reactivos, instrumentacin actualizada, protocolos de extraccin estandarizados y definidos procedimientos de operacin de laboratorio y estos formatos de prueba para la deteccin de cidos nucleicos se ha convertido en el pilar de las pruebas de laboratorio. Sin embargo, la interpretacin de la prueba sigue requiriendo evaluacin de que un resultado particular (positivo o negativo) sea biolgicamente relevante, el cual entonces requiere una revisin global de la historia, signos clnicos y lesiones en el individuo del cual se obtuvo la muestra.

Tcnicas de Microarreglos (Microchip) Otro avance tecnolgico que est impactando el campo del diagnstico es la llegada de los microarreglos o microchips. El microchip para la deteccin de cidos nucleicos es una matriz slida sobre la cual se han impreso puntos, cada uno conteniendo varios cientos a miles de oligonucletidos. Cada vez ms, estos nucletidos pueden representar secuencias conservadas de virtualmente todos los virus representados en varias bases de datos genticas, o pueden ser personalizados para representar solo viriones de especies involucradas en un sndrome especfico, como la enfermedad respiratoria aguda de bovinos. La base de esta prueba es la captura por estos nucletidos de secuencias de cidos nucleicos conjugados (marcados) amplificados aleatoriamente a partir de muestras clnicas. La unin (pegado) de las secuencias conjugadas es detectada por una revisin con rayos laser del chip y programas de cmputo para evaluar la fuerza de unin. A partir de la posicin en el mapa (gentico) de los oligonucletidos que reaccionan, el programa identifica las especies virales en la muestra clnica. Este tipo de prueba fue usado para determinar que el virus responsable del sndrome severo agudo respiratorio (SARS) era un coronavirus. Con el conocimiento de las secuencias de oligonucletidos que se unen a un agente desconocido, los cebadores pueden sintetizarse para determinar eventualmente la secuencia de nucletidos completa de una nueva especie viral. El bajo costo de la sntesis de oligonucletidos, desarrollo de aparatos lectores con laser, las tcnicas de amplificacin de cidos nucleicos y el desarrollo de programas de cmputo han hecho que esta tecnologa est disponible en laboratorios especializados. Una variacin de esta tcnica es la re-secuenciacin de microarreglos. Estos arreglos consisten de un grupo de sondas superpuestas, las cuales pueden diferir entre ellas en una sola base. La fuerza de unin de las sondas individuales en la familia proporciona informacin de la secuencia gentica del producto amplificado. Con la tecnologa actual, la metodologa de microarreglos solamente est disponible en laboratorios de referencia especializados y esto no puede ser utilizado en los laboratorios de diagnstico de rutina. En el formato estndar, esta tcnica probablemente no detectara una nueva familia de virus de una base de datos comn no representada, porque los oligonucletidos para un nuevo agente no pueden estar incluidos en el microchip.

Amplificacin de Genes por Mtodos IsotrmicosPara la amplificacin de cidos nucleicos, es necesario desplazar continuamente al producto recin sintetizado para que otra copia de esa secuencia se pueda producir. Con el PCR, el desplazamiento de la cadena es realizado con temperatura: con una temperatura mxima de 95 C las bandas de ADN se desnaturalizan (separan), permitiendo la adhesin de nuevos cebadores. La amplificacin isotrmica es una tcnica que no requiere de ciclos de temperatura y equipo que acompaa al PCR. Dos tcnicas usando polimerasas diferentes para obtener la amplificacin de la secuencia han sido desarrolladas para la amplificacin isotrmica: Amplificacin de Secuencias-Basadas en cidos Nucleicos (nucleic acid secuence-based amplification, NASBA) y Amplificacin Isotrmicas Mediada por Asas (loop-mediated isothermal amplification, LAMP). Si estas tcnicas muestran importantes ventajas sobre el PCR, uno podra esperar de una gran disponibilidad de estas pruebas.

SECUENCIACIN DE CIDOS NUCLEICOS (GENOMAS VIRALES)Quiz ningn rea en la biologa molecular ha avanzado tan rpidamente como la secuenciacin de cidos nucleicos. Con la velocidad y la capacidad tcnica se ha logrado abaratar costes, de manera que la secuenciacin directa de genomas virales completos es ahora algo muy comn de hacer. Las viejas tcnicas como el mapeo de restriccin y las huellas de oligonucletidos que fueron usadas para detectar diferencias genticas entre los aislamientos virales han sido desplazadas por la metodologa de la secuenciacin.

En el rea del diagnstico, se han descubierto nuevos virus por tcnicas que tienen la ventaja de la amplificacin de cidos nucleicos aleatoriamente y la secuenciacin de bajo coste. Hay varias tcnicas bsicas con numerosas modificaciones que son muy detalladas para discutirlas individualmente. En general, el proceso incluye la amplificacin al azar de muestras de cido nucleico enriquecidas o muestras de cido nucleico total, seguido por la secuenciacin de todos los productos amplificados. El proceso trabaja mejor si los cidos nucleicos del la clula hospedera pueden ser eliminados de las muestras por un tratamiento con nucleasas o por substraccin de las secuencias del hospedero por hibridacin la secuencias de clulas normales inmovilizadas en estructuras (soportes) slidas. No se requiere de conocer previamente la secuencia viral, y por lo tanto no hay necesidad de aplicar reactivos para un virus determinado. El anlisis por computadora del material obtenido puede identificar secuencias que estn relacionadas a una familia viral especfica. El mtodo usado es para construir el genoma completo, si eso se desea, y ser dependiente del nmero y tamao de las secuencias identificadas, pero los mtodos estn disponibles para caminar en el genoma completo a partir de una sola secuencia viral (sentido 5-3). Con estos tipos de protocolos de deteccin de cidos nucleicos, muchos virus desconocidos pueden ser descubiertos y caracterizados sin los requerimientos que se emplearon como la propagacin en cultivos de tejidos.

DETECCIN Y CUANTIFICACIN DE ANTICUERPOS ESPECFICOS DE VIRUS (DIAGNSTICO SEROLGICO)La deteccin de una respuesta inmune a un agente infeccioso ha sido basada, principalmente, en la determinacin de la respuesta de anticuerpos (Abs) del hospedero al agente (viral) de inters. Este enfoque mide solamente una parte de la respuesta inmune adquirida (inmunidad humoral); las tcnicas para una medida eficaz de la respuesta inmune mediada por clulas no est disponible para uso rutinario o es muy cara. Para muchos problemas, la medida de las respuestas de Abs se mantiene como una medida valiosa para definir el estado infeccioso de los animales. Las pruebas serolgicas pueden ser usadas para: (1) definir si un animal ha sido infectado por un virus en particular; (2) determinar si un virus (u otro patgeno) est relacionado a cierto problema clnico; (3) determinar si un animal ha respondido a la vacunacin. Para el diagnstico serolgico de una enfermedad aguda viral en un animal, la metodologa clsica ha sido las pruebas de sueros pareadosesto es, un suero de la fase aguda y otro de la fase convaleciente del mismo animal, al observar un cambio en el ttulo (cuatro diluciones o ms) de Ab virus especficos.

El suero de la fase aguda es tomado tan pronto como sea posible durante la enfermedad; la muestra de la fase convaleciente generalmente es tomada al menos dos o ms semanas despus. Dada esta lnea de tiempo, el diagnstico basado con este enfoque se dice que es retrospectivo. En aos recientes este mtodo ha sido complementado por mtodos serolgicos para detectar Abs IgM especficosen muchas enfermedades virales un diagnstico presuntivo puede hacerse basado en la deteccin de Abs IgM con una sola muestra srica de la fase agudapor ejemplo, la infeccin de equinos con el virus del oeste del Nilo.

Para asegurar si un animal ha estado infectado con cierto virus, las pruebas serolgicas pueden ser ms adecuadas que tratar de detectar al virus por s mismo. Por ejemplo, el anlisis serolgico es usado para sealar a los caballos que han sido infectados con el virus de la anemia infecciosa equina, al ganado para el virus de la leucemia bovina y las cabras para el virus de la encefalitis artritis caprina. En estos casos, el nmero de clulas infectadas en animales crnicamente enfermos puede ser demasiado baja an para la deteccin mediante PCR, pero dicha infeccin generalmente estimula una respuesta de Abs que es fcilmente detectada por varias pruebas. Los anlisis serolgicos son tambin ampliamente usados durante los programas de erradicacin y en la certificacin de ani8males para la movilizacin y el comercio.

El uso de pruebas serolgicas para asegurar la eficacia de la vacunacin puede ser un aspecto importante en un programa de manejo de las enfermedades infecciosas. En muchos pases, la compra de la vacuna puede ser realizada por el propietario de los animales. Las pruebas de Abs de animales seleccionados pueden indicar al veterinario con mucha significacin si el programa de inmunizacin, que el productor est realizando, se ha hecho de manera correcta. Conforme los programas de erradicacin se hacen ms populares para las enfermedades de los animales de produccin, las vacunas marcadoras son ms frecuentemente usadas y las llamadas pruebas serolgicas DIVA pueden distinguir si una respuesta de Abs es causada por la vacuna o por una infeccin natural. Para las infeccione con herpesvirus como el herpesvirus bovino 1, es esencial determinar si la respuesta de Abs es el resultado de la infeccin, porque dicha infeccin invariablemente lleva a la latencia. La introduccin de animales infectados de manera latente a un hato negativo puede ser la causa de un brote de la enfermedad, por esta razn las vacunas marcadoras con delecin de genes fueron desarrolladas para facilitar la diferenciacin de los animales vacunados de los infectados.

Muestras Serolgicas para Pruebas SerolgicasPara la mayora de las prueba serolgicas, el suero sanguneo es la muestra de eleccin. Sin embargo, algunas pruebas han sido validadas usando plasma en lugar del suero. Es necesario establecer contacto con el laboratorio de diagnstico de manera que sealen la muestra adecuada, para evitar el remuestreo del animal si esa es el nico material aceptable. Los Abs en el suero son muy estables en condiciones ambientales moderadas. En los protocolos estndar el suero debe mantenerse en refrigeracin (4-6 C), el congelado no es necesario a menos de que se tarden varias semanas entre el muestreo y el anlisis. Los Abs pueden ser detectados tambin a partir de muestras de sangre seca en papel filtro y guardada por meses antes de hacer las pruebas.

Como con otros aspectos de las pruebas de diagnstico, los avances tecnolgicos continan modificando la manera de cmo son detectados los anticuerpos a virus especficos. En la mayora de los casos, las tecnologas ms recientes son aplicadas a las pruebas que tienen algn potencial comercial. En la medicina veterinaria, hay muchas pruebas para agentes (virus) que pueden ser de menor importancia pero muy tiles en ciertas situaciones. Las pruebas para estos agentes pueden ser las primeras que se desarrollaron con tecnologa vieja. Como los virus de los animales de vida silvestre estn teniendo mayor importancia en la sensibilizacin del pueblo, ser necesario desarrollar pruebas serolgicas adicionales, porque las pruebas para los animales domsticos no pueden usarse en ellos.

Pruebas Inmuno-EnzimticasPruebas de Inmuno Absorbancia Ligada a EnzimasLas pruebas inmunoenzimticas (EIAs, ELISA) son los mtodos serolgicos de eleccin para la determinacin de Abs cualitativos (positivo o negativo) o cuantitativo (mediante titulacin), porque son rpidas, relativamente baratas y pueden no requerir la produccin de viriones infecciosos si antgenos recombinantes son empleados. En las pruebas EIAs, con el formato para la deteccin de Abs, el antgeno viral est adherido a una matriz slida. El suero es agregado y, si Abs contra el antgeno estn presentes en la muestra, se pegarn a l. En las pruebas directas de EIA, la unin de los Abs es detectada por un anticuerpo anti-especie conjugado con una enzima. Al agregar el substrato de la enzima, se desarrolla una reaccin de color que puede ser determinada visualmente o con un espectrofotmetro. Los controles que se corren con la muestra definen si la prueba es aceptable y cuales muestras se sealarn como positivas. Las pruebas EIAs basadas en cintica ofrecen la ventaja que los ensayos cuantitativos pueden estar basados en una simple dilucin del suero. El producto de la reaccin enzimtica es determinado muchas veces en un corto periodo de tiempo. Hay programas de cmputo que convierten la tasa de desarrollo del producto a la cantidad de Ab adherido al antgeno.

Una de las desventajas de la EIA directa es que es especie especfica. Una prueba desarrollada para determinar Abs contra el virus del distemper canino para perros, no puede ser empleada para determinar la presencia o ausencia de Abs al mismo virus en un len. Para obviar este problema, se han desarrollado pruebas de EIA competitivas o de bloqueo. En este formato de prueba, un Ab que se une al antgeno de inters (generalmente un MAb) esta conjugado con la enzima. Los Abs no marcados (muestra de suero) se puede unir al mismo sitio del MAb compitiendo entre ambos por solo un sitio de unin. Una reduccin en la unin de MAb conjugado indica que la muestra con tena Abs especficos (Figura 5.10). en este formato de prueba, las especies animales de los anticuerpos no marcados no son un factor de error. El diagnstico de la sensibilidad y especificidad de las pruebas de EIA, sean directas o indirectas, ha sigo aumentado por el desarrollo de los MAbs y la produccin de antgenos recombinantes.

Figura 5.10 Prueba inmuno enzimtica competitiva (ELISAc) para anticuerpos contra el virus de la encefalitis artritis caprina (CAEv). Las muestras de suero no diluidas son agregadas por duplicado a pozos cubiertos de antgeno (virus) de una prueba ELISAc comercial para buscar anticuerpos anti-CAEv. Despus de la remocin del suero de prueba, un anticuerpo especfico para el antgeno CAEv acoplado con peroxidasa de rbano es agregado. El anticuerpo detector es removido despus de la incubacin, y un substrato es agregado para detectar la presencia de anticuerpos detectores pegados. Si hay anticuerpos especficos para el CAEv en el suero de prueba, estos anticuerpos se pegarn al antgeno evitando que el anticuerpo detector se una al antgeno. Una muestra positiva mostrar menos producto de la enzima (color) que los controles negativos. Los valores de corte son determinados por la lectura de la intensidad de la reaccin en un espectrofotmetro, aunque la inspeccin visual puede generalmente detectar muestras positivas. Pozos A1-2 y G11-12, controles positivos; pozos B1-2 y H11-12, controles negativos. Pozos D1-2, H1-2; B3-4, F3-4, C5-6, D5-6, A7-8, E7-8, G7-8 y B9-10 muestras positivas a anticuerpos anti-CAEv. En un formato de estas pruebas que es ampliamente usado pueden ser realizadas en el consultorio del mdico, el suero de prueba puede fluir por el papel filtro que tiene tres reas circulares impregnadas con el antgeno, dos de las cuales ya han interactuado con sueros positivos y negativos respectivamente (Figura 5.7). Una vez que el suero ha fluido por el dispositivo y se ha realizado un lavado, un Ab secundario anti-especie conjugado a una enzima es agregado y el papel filtro es enjuagado otra vez antes de la adicin del substrato de la enzima. El resultado es ledo como un cambio de color en el crculo de prueba, el cual es comparado contra el cambio de color en el control positivo y obvio en el no cambio en el negativo. As las pruebas para un solo paciente son

relativamente caras comparadas con la economa de las pruebas para los sueros de cientos de animales en una sola prueba en un laboratorio automatizado. Hay grandes ahorros en tiempo y esfuerzos para enviar muestras al laboratorio, adems del hecho de que las decisiones pueden ser hechas mientras el cliente y el paciente siguen en el consultorio, hacer pruebas a un animal son atractivas y tiles en el manejo clnico inmediato de animales con enfermedades crticas.

Pruebas de Sero (Virus) Neutralizacin As como el aislamiento es considerado la prueba de oro para la deteccin de virus comparada contra otras pruebas, la prueba de sero (virus) neutralizacin histricamente ha sido tambin la prueba de oro estndar, cuando est disponible, para la deteccin y cuantificacin de Abs especficos de virus. Los Abs neutralizantes tambin son de gran inters porque se considera que hay una correlacin directa de los Abs in vivo. Para la prueba de Abs neutralizantes, hay dos procedimientos generales disponibles: el mtodo de suero constantevirus variable y el mtodo virus constantesuero variable. Aunque el mtodo suero constantevirus variable puede ser una prueba ms sensible, es raramente usada porque utiliza relativamente grandes cantidades de suero, lo cual no puede ser realizado fcilmente. La base de las pruebas de neutralizacin es la unin del Ab al virus infeccioso, a manera de prevenir que el virus inicie una infeccin en la clula susceptible. El crecimiento del virus es detectado por su habilidad de matar a la clula (efecto citoptico) o por su habilidad de producir antgenos en las clulas infectadas que son sealados por inmunofluorescencia o inmunohistoqumica. La cantidad de Ab en la muestra es determinado por la serie de dilucin y el reto de cada una de estas diluciones con una cantidad estndar de virus (mtodo virus constantesuero variable). La ltima dilucin que muestre neutralizacin del virus es definida como el punto final y el ttulo del suero es la recproca del punto final de dilucin; por ejemplo, un punto final de 1:160 es igual a un ttulo de 160. Las desventajas de las pruebas de seroneutralizacin son muy lentas de realizar, requieren de la produccin de virus infeccioso para la prueba y tienen un costo, generalmente creciente, para el mantenimiento de las instalaciones de cultivo celular requeridas para la prueba. Estas pruebas tienen el beneficio de ser independientes de especie y, como tales, son muy empleadas en estudios de animales de vida silvestre. Con los nuevos agentes infecciosos, una prueba de seroneutralizacin puede ser operacional a las pocas semanas de haber aislado al virus, mientras que las pruebas de EIA su desarrollo requiere meses o aos para poder validarlas.

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