04 - principales metodos y tecnicas de estudio de los
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PRINCIPALES MÉTODOS Y TÉCNICAS DE ESTUDIO DE LOS HONGOS.
COLECTA
HONGOS MICROSCÓPICOS HONGOS MACROSCÓPICOS
AISLAMIENTO.
Transferencia directa. Dilución en placa. Esterilización superficial. Utilización de carnadas. Cámaras húmedas.
CULTIVO DE MICROORGANISMOS.
Proceso de inducir su crecimiento.
El cultivo in vitro necesita la preparación de sustancias que el hongo pueda utilizar como alimento: MEDIOS DE CULTIVO.
CULTIVO DE MICROORGANISMOS.
Los primeros medios de cultivo que se utilizaron fueron naturales:
Leche, orina, sangre diluida, jugos de verduras.
!TORTILLAS!!!
MEDIOS DE CULTIVO
No existe un medio de cultivo universal.
El crecimiento y desarrollo dependen de varios factores: disponibilidad de nutrimentos, pH, temperatura, humedad.
MEDIOS DE CULTIVO.
Complejos (sustratos naturales).
Sintéticos (Czapek).
Semi-sintéticos (PDA).
Selectivos.
No se sabe su composición química
Sales inorgánicas y compuestos orgánicos
Tienen un grupo de sustancias conocidas y otro de sustancias
naturales
Son usados principalmente para aislar a grupos de
hongos específicos.
COMPOSICIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.
Fuente de carbono
Fuente de nitrógeno
Vitaminas.
Factores de crecimiento.
Glucosa, sucrosa, fructuosa, manitol, etc.
Peptonas, aminoácidos, compuestos de amonio y nitratos.
Tiamina, biotina.
Cualquier sustancia requerida en cantidades muy pequeñas.
TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVOS
Sólidos.
cuando se necesita una gran cantidad de esporas.
Agar.
• Líquidos cuando se necesita calcular biomasa u obtener grandes cantidades de micelio.
ANTIBIÓTICOS USADOS EN MEDIOS DE CULTIVO.
Penicilina (Gram +).
Estreptomicina (Gram +-)
Cloranfenicol (Gram +-).
Garamicina (Gram +-).
MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN.
Por calor.
• Calor húmedo (121º 15’).
• Calor seco.
• Incineración. Por agentes químicos. Por filtración. Por radiación.
Desnaturalizan proteínas y ácidos nucleicos
Material de vidrio y metal. (180ºC por 1.5 o 2 horas).Material de metal y de vidrio. 1. Se utiliza para materiales
termolábiles.2. Circulación de gases tóxicos
(óxido de etileno, formaldehído, glutaraldehído, etc.) durante 10 horas.
Las sustancias termolábiles se pasan a través de filtros especiales.
Radiación no ionizante: luz UV (100-400nm). Se usa para esterilizar superficies en áreas de trabajo.Radiación ionizante: Rayos X, gamma. Se usa para esterilizar equipo pre-empaquetado y otros equipos quirúrgicos.
REGISTRO DE CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS.
Color del anverso y reverso.
Aspecto (liso, rugosos, polvoso, etc.)
Tamaño. Producción de exudado. Velocidad de
crecimiento.
ELABORACIÓN DE PREPARACIONES.
Agua. Lactofenol. Ácido láctico. Alcohol polivinílico. Floxina. Azul de algodón.
MICROSCOPÍA
Una de las principales herramientas de la microbiología, es el microscopio de luz.
MANEJO
El revólver se usa para rotar los objetivos
MANEJO DE MICROSCOPIOS.
El microscopio nunca se carga con una mano. NO ARRASTRAR SOBRE LA MESA!!!!!!!!!
MANEJO DE MICROSCOPIOS.
La distancia de trabajo disminuye conforme la magnificación se aumenta
USAR UNICAMENTE LA PERILLA MICROMÉTRICA
MANEJO DE MICROSCOPIOS.
• El objetivo de 100X se limpia con papel cera y con movimiento circulares suaves
El aceite de inmersión tiene el mismo índice de refracción del vidrio por lo que funciona como otro lente
RARA VEZ UTILIZAREMOS EL OBJETIVO DE 100X
MÉTODOS DE PRESERVACIÓN.
No existe un método universal.
El objetivo es preservar la viabilidad y la estabilidad genética de los cultivos.
MÉTODOS DE PRESERVACIÓN.
No existe un método universal.
El objetivo es preservar la viabilidad y la estabilidad genética de los cultivos.
Transferencia periódica (3 meses a 2 años).
Ventajas:Simple, barato
Desventajas:Tardado, laborioso, se contamina fácilmente, la morfología y fisiología puede cambiar con el tiempo.
MÉTODOS DE PRESERVACIÓN.
Aceite mineral estéril (1-10 años).
Ventajas:Los cultivos se pueden mantener por varios años y reduce la infestación de ácaros.
Desventajas:El hongo continúa creciendo y existe la selección de mutantes que puedan crecer bajo condiciones desfavorables. Es difícil drenar el aceite y en ese proceso el hongo es susceptible de contaminación.
MÉTODOS DE PRESERVACIÓN.
Agua destilada y estéril (1-10 años).
Ventajas:No influye en la tasa de crecimiento ni en la viabilidad del cultivo, la estabilidad genética es mayor, se suprimen los cambios morfológicos.
Desventajas:Preservación a mediano plazo.
MÉTODOS DE PRESERVACIÓN.
Sílica gel (8 años)
Se colocan cristales de sílica en tubos y se esterilizan con calor seco.
Las esporas se suspenden en una solución al 10% de leche deslactosada.
La solución de esporas se vierte en la sílica y se mantienen a temperatura ambiente durante 1 o 2 semanas.
Se evalúa la viabilidad y si responden bien se sellan los tubos y se mantienen a 4ºC
MÉTODOS DE PRESERVACIÓN.
Liofilización.
Es un proceso de deshidratación en el cual las suspensiones de esporas son congeladas.
Se seca al vacío para sublimar el hielo.
No todos los hongos resisten el proceso.
El crioprotector se usa para evitar la deshidratación total los más usados son glutamato de sodio, peptona, varios azucares o mezclas de azucares y leche deslactosada.
MÉTODOS DE PRESERVACIÓN.
Nitrógeno líquido (-196ºC/ 25 años).
El material se suspende en glicerol 10%, se enfría gradualmente y se coloca dentro de un tanque con N líquido a -196ºC (el vapor de N líquido está a -150ºC). Si soportan la temperatura pueden conservarse indefinidamente. Hay un cese completo de la división celular y el arresto total del metabolismo. Ventajas: Prevención de variabilidad genética aumentada, no requieren mucho tiempo, no es laborioso, no se contamina.Desventajas:El aparato y el nitrógeno líquido son muy caros y este último debe reemplazarse cada 2 días.
HONGOS MACROSCÓPICOS
TOMA DE DATOS EN EL CAMPO.
Substrato. Color. Sabor (OJO ). Olor. Consistencia. Reacciones químicas.
HERBORIZACIÓN.
Deshidratación de material fresco.
Sirven para comparar, identificar y conservar registros.
ELABORACIÓN DE PREPARACIONES.
Reactivo de Melzer. (azul a negro = amiloide; rojo a violeta = dextrinoides).
KOH.
MÉTODOS DE PRESERVACIÓN.
Los macromicetos se conservan herborizados y se etiquetan correctamente.• Número de especímenes colectados.
• Nombre científico completo.
• Descripción del sustrato.
• Localidad exacta.
• Nombre del colector.
• Fecha de colección.
• Nombre de la persona que determinó.
ORIGEN DE LA TECNICA DE CULTIVOS PUROS.
1872 Schroeter: Los cultivos se pueden mantener puros sobre superficies nutritivas sólidas (rebanadas de papa).
1880 Koch: usó una solución de gelatina al 5 a 10% sobre piezas planas de vidrio.
La gelatina tenía las siguientes desventajas:• Se derrite a temperaturas relativamente bajas.
• Es digerida por una gran cantidad de microorganismos.
• Acumulaba una gran cantidad de polvo y microorganismos del aire.
1881 Hesse: propuso la utilización del agar como sustituto de laGelatina (polisacárido de Gelidium sp.)• No es digerida fácilmente y no es una fuente de nutrimentos.
• Se disuelve cerca del punto de ebullición del agua y se licua a 39ºC Petri: vació el medio de cultivo en platos circulares y los tapó.