Clasificación, Estructura y Replicación Viral

Dr. Jorge O. García Méndez

Instituto Nacional de Cancerología

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• Los virus son:– Agentes filtrables– Parásitos intracelulares obligados– Incapaces de hacer energía o proteínas

independientemente de una célula huésped– Su genoma puede ser de ARN o ADN pero no ambos– Pueden tener una cápside desnuda o morfología de

envoltura– Los componentes virales son ensamblados y no se

replican por “división”

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Consecuencias de las propiedades virales

• Los virus no son seres vivos• Deben ser infecciosos para durar en la

naturaleza• Deben ser capaces de usar los procesos

celulares del huésped para producir sus componentes (ARNm viral, proteínas y copias idénticas de su genoma)

• Deben codificar para cualquier proceso requerido no provisto por la célula

• Los componente virales deben ser capaces de ejecutar “auto-ensamblaje”

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Maneras de clasificación y nombrar a los virus

a. Estructura: forma, morfología y ácido nucleico (p. ej. picornavirus –pequeño ARN-, togavirus)

b. Características bioquímicas: estructura y modo de replicación

c. Enfermedad: encefalitis y virus de hepatitis

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• Modo de transmisión: arbovirus -“arthropod borne virus”- virus diseminado por insectos

• Huésped: animal (humano, ratón, ave), planta, bacteria

• Tejido u órgano: (tropismo) adenovirus, enterovirus

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• Las unidades de medición son los nanómetros (nm)

• Los virus + importantes van de 18nm (parvovirus-eritema infeccioso) a los 300 nm de los poxvirus–viruela (visibles al microscopio de luz)

• ¼ del tamaño de S. aureus• Los virus mayores, tienen un genoma mayor y

pueden codificar para más proteínas y son más complejos

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Comparación tamaño entre virus y bacterias

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• El virión (la particula viral) consiste de un genoma de ácido nucleico en una capa proteíca (cápside) o en una membrana (envoltura).

• El virión puede también contener ciertas enzimas esenciales o accesorias u otras proteínas

• La cápside o las proteínas unidas a los ácidos nucleicos pueden asociarse con el genoma para formar la núcleocápside

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Componente del virión básico

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Los virus ADN y su morfología. Las familias virales se deteminan por la estructura y la

morfología del virión

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Miembros de la familia de virus ADN

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Propiedades virus ADN

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Forma

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Los virus ARN, su estructura genética y su morfología

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Miembros de la familia de virus ARN

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Propiedades virus ARN

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• El genoma puede ser ADN o ARN• El ADN puede ser de una o doble hebra,

linear o circular.• El ARN puede ser sentido positivo (+)

(como el ARN mensajero ARNm, o negativo (-) –análogo a un negativo-, doble hebra (+/-) o bisentido (ambisense) conteniendo regiones de ARN + y –juntas por la parte final

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• El ARN puede también estar segmentado para codificar genes únicos (poliproteína)

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• La capa externa del virión es la cápside o envoltura

• Tiene como función el empaquetamiento, protección y entrada del virus de un huésped a otro y a la célula del huésped

• La remoción inactiva al virus (Ac anti-envoltura previenen la infección)

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Estructuras de virus con cápside desnuda –arriba e izquierda) y envueltos ( con una forma de la

nucleocápside icosahérdica y ribonucleocápside helical –derecha- asociado con un genoma ARN

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Ensamblaje de la cápside de picornavirus, las proteínas individuales se asocian en subunidades, que se asocian en protómeros, capsómeros y una procápside vacía. La inclusión del genoma ARN (+) dispara su conversión a

la forma final de la cápside

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Microscopía críoelectrónica

• 1. nucleocápside herpesvirus equino;

• 2. rotavirus simiano; • 3. virión reovirus tipo 1

(Lang); • 4. partícula intermedia

subviral (reovirus); • 5. partícula core (cápside

interior) (reovirus); • 6. VPH tipo 19; • 7. polyomavirus del ratón;• 8. virus del mosaico de la

coliflor. • Barra = 50 nm.

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• La cápside es una estructura rígida capaz de resistir condiciones ambientales adversas

• Los virus con cápsides desnudas son capaces de resistir la desecación, el ácido y detergentes (ácido y bilis del TGI)

• Transmisión característica: fecal-oral• Incrementa su transmisión aún en aguas

residuales

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• La envoltura es una membrana compuesta de lípidos, proteínas y glicoproteínas

• La estructura membranosa puede mantenerse sólo en soluciones acuosas

• Por ello, deben permanecer húmedos y ser transmitidos en secreciones corporales : gotillas respiratorias, sangre y tejido.

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Cápside desnuda

• Componente: proteína• Propiedades: estable al ambiente

siguiente– Temperatura– Ácido– Proteasas– Detergentes– Desecación

• Se libera de la célula por muerte

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• Consecuencias– Puede ser diseminado facilmente:

• en fomites, mano a mano, por polvo, por gotillas pequeñas

• Pueden desecarse y permanecer infectivos• Pueden sobrevivir las condiciones adversas del

intestino• Pueden ser resistentes a detergentes y pobre

tratamiento de agua residuales• Los anticuerpos pueden ser suficientes para la

inmunoprotección

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• Virus con cápisde– Se ensamblan de proteínas individuales aosicadas en

unidades progresivamente mayores– Las proteínas estructurales individuales se asocian

en subunidaes, las cuales se asocian en protómeros, capsómeros (ME), y finalmente una procápside o cápside

– En unos se forma alrededor del genoma, en otros se forma como una “concha” vacía (procápside) a ser llenada por genoma

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• Las más simples estructuras virales que pueden ser armadas paso a paso son simétricas e incluyen estructuras: helicales y icosahédricas

• Las primeras parecen como bacilos• Mientras los segundos son como esferas

ensamblados en subunidades simétricas• Las formas no simétricas son formas complejas

y se asocian con fagos (virus bacterianos)

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• La forma clásica de un virus con simetria helical:– Virus de la planta del mosaico– Sus capsómeros se autoensamblan en el

genoma ARN en “bacilos” que tienen la longitud del genoma

– Los capsómeros cubren y protegen al ARN.– Las núcleocápsides helicales se ven en la

mayoría de virus ARN de hebra (-)

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Modelo de paramyxovirus

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• Los icosahedrones son usados por pequeños virus (p. ej. picornavirus y parvovirus)

• El icosahedrón está hecho de 12 capsómeros con simetría de cinco lados (pentámero o pentón)

• Para los picornavirus cada pentámero está hecho de cinco protómeros, c/u compuesto de 3 subunidades de 4 proteínas separadas

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• En cristalografía de RX y análisis de imagen de microscopía por críoelectrones tienen definida la estructura de la cápside de los picornavirus al nivel molecular

• En éstos, se ha descrito una hendidura “como cañón” que es el sitio de “anclaje” para unirse al receptor de la superficie del huésped

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Estructura de picornavirus e interacción con ICAM-1

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• Los viriones de cápside mayores se construyen por la inserción de capsómeros estructuralmente distintos entre los pentones en sus vértices.

• Estos capsómeros tienen seis vecinos próximos (hexones)

• esto extiende el icosahedron y es llamado un icosadeltahedron

• Su tamaño está determinado por el # de hexones insertados a lo largo de sus orillas y dentro de las superficies de los pentones

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• P. ej. la nucleocápside de un herpesvirus tiene 12 pentones y 150 hexones.

• La nucleocápside herpética también se rodea por una envoltura

• La cápside del adenovirus está compueto por 252 capsómeros, 12 pentones y 240 hexones, con una larga fibra que se ancla a c/penton (proteína de anclaje viral –VAP- antígeno específico)

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• Los reovirus tienen un cápside doble icosahédrica con proteínas como fibras parcialmente extendidas de c/vértice

• La capa externa protege al virus y promueve su captura por el TGI y en células blanco, mientras que la cápside interna contiene enzimas para la síntesis del ARN

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Envoltura

• Componentes:– Membrana– Lípidos– Proteínas– Glicoproteínas

• Propiedades: en el ambiente lábil, fácilmente sufre disrupción:– Por ácido– Detergentes– Desecación– Calor

• Modifica la membrana celular durante la replicación• Se libera por gemación y lisis celular

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• Consecuencias– Debe permanecer húmedo– No puede sobrevivir el tracto GI– La diseminación en grandes gotillas, secreciones,

transplantes de órganos y transfusión– No necesita matar la célula para diseminarse– Puede necesitar anticuerpos y respuesta inmune

mediada por células para protección y control– Fomenta hipersensibilidad e inflamación para causar

inmunopatogénesis

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Virus con envoltura

• La envoltura se compone de lípidos, proteínas y glicoproteínas

• Tienen una estructura similar a las membranas celulares.

• Raramente halladas en la envoltura viral, aún cuando se obtienen de la membrana celular

• La mayoría son redondos o pleomórficos• Dos excepciones (poxvirus con estructura

externa como ladrillo y los rhabdovirus con forma de bala

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Diagrama del trímero de la glicoproteína de HA de InfA

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• > de glicoproteínas virales tienen un CHO ligado a asparagina (ligado a N) y se extiende en la envoltura como una lanza

• > de glicoprotínas actúa como VAP• VAP-eritrocitos = hemaglutininas• Otras: neuraminidasas –orthomyxovirus-• Y las glicoproteínas de VHS asociadas a los

receptores Fc y C3b o las glicoproteínas de fusión de los paramyxovirus

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• La envoltura de los togavirus rodea una nucleocápside icosahédrica conteniendo una hebra de ARN(+)

• Todos los virus ARN(-) tienen envoltura• Componentes del asociado polimerasa ARN-

dependiente de ARN de los orthomyxovirus, paramyxovirus y rhabdovirus

• Estas enzimas se requieren para la iniciación de la replicación viral

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• Las proteínas de matriz a lo largo del interior de la envoltura facilitan el ensamblaje de la ribonucleocápside en el virión

• Influenza A (orthomyxovirus) es un ej. de ARN(-) con un genoma segmentado

• La envoltura (InfA) está alineada con proteínas de matriz y tiene 2 glicoproteínas (H –VAP- y NA)

• Los bunyavirus no tienen proteínas de matriz

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• La envoltura de los VHS tiene una estructura como de bolsa que rodea la nucleocápside icosadeltahédrica

• Dependiendo del VHS específico, la envoltura puede contener tanto como 11 glicoproteínas

• El espacio intersticial entre la nuclecápside y la envoltura = tegumento (contiene enzimas, proteínas y aún ARNm

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• Los poxvirus son virus envueltos con formas de ladrillo, la envoltura tiene una forma de mancuerna

• La estructura de la nucleocápside conteniendo ADN

• Cuerpos laterales• Fibrillas• Un # grande enzimas y proteínas, incluyendo la

requeridas para la síntesis del ARNm

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Replicación viral

• La célula actúa como fábrica, provee el sustrato, energía y maquinaria

• Los procesos no provistos por la célula son codificados por el genoma viral

• La manera en la que c/virus lleva a cabo estos pasos y sobrepasa las limitaciones bioquímicas de la célula está determinado por la estructura del genoma y del virión

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Esquema general de replicación viral. Virus con envoltura tienen vías alternativas de entrada (3),

ensamblaje y salida de la célula (8’ y 9’)

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• Puede dividirse en varias fases:– Fase temprana, el virus debe reconocer el

blanco apropiado, anclarse a la célula, penetrar la membrana plasmática y se tomado por la célula, liberar (desenrollar) el genoma en el citoplasma y si es necesario liberar el genoma al núcleo

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Curva de crecimiento de un ciclo de un virus que es liberado con lisis celular

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– Fase tardía: que inicia con el arranque de la replicación viral y la síntesis viral macromolecular, procede a lo largo del ensamblaje viral y liberación

– La liberación –uncoating- del genoma abole su infectividad iniciando el período de eclipse

– Este finaliza con la aparición de nuevos viriones luego del ensamblaje viral

– El período latente es durante el cual los virus infecciosos extracelulares son indetectables

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– c/célula puede producir tanto como 100k partículas (sin embargo sólo 1-10% son infectivas, el resto son no infectivas = defectuosas)

– Esto último por la mutaciones y errores en la manufactura

– El alcance de los virus infecciosos por célula y el tiempo requerido para un ciclo único de la reproducción viral está determinado por las propiedades virales y la célula blanco

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Ejemplos de VAP

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• La unión de VAP a los receptores de la célula determina inicialmente cuáles celulas serán infectadas

• Pueden ser proteínas o CHO en glicoproteínas o glicolípidos

• Los virus que se unen a receptores expresados en tipos celulares específicos pueden estar restringidos a ciertas especies (rango de huésped –p. ej. ratón-) o tipos celulares específicos

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• Las células blanco susceptibles determinan el tropismo específico (EBV-receptor C3d (CR2) de células B humanas

• El parvovirus B19 se une a globósido (antigéno P del grupo sanguíneo) expresado en precursores eritrocitarios

• La estructura de anclaje viral para una cápside viral puede ser parte de la cápside o una proteína que se extiende a partir de la misma

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• Un cañón en la superficie de los picornavirus (rhinovirus 14) sirve como el agujero de una chapa para la inserción de una porción de la molécula ICAM-1 de la superficie celular

• Las fibras de los adenovirus y las proteínas σ-1 de los reovirus y flavivirus en los vértices de las nucleocápsides interactúan con receptores expresados en las células blanco específicas

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• Las VAP son glicoproteínas específicas de virus envueltos (HA InfA se une a ácido siálico expresado en muchs células distintas y tiene un amplio rango además de tropismo celular)

• Los α-togavirus y los flavivirus se unen a receptores de muchas especies animales permitiendo la diseminación por éstos

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Ejemplos de receptores virales

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Penetración

• VAP-receptores celulares inicia con la internalización de los virus en la célula

• Depende de cada estructura viral y tipo celular• > virus no envueltos entran a la célula por

endocitosis mediado por receptor o por viropexis• Picornavirus y papovavirus entran por viropexis:

las estructuras hidrofóbicas pueden estar expuestas luego de la unión viral a las células y estas estructuras ayudar al virus o genoma viral a deslizarse a través de la célula (penetración directa)

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• Los virus envueltos fusionan sus membranas a la membrana celular para liberar la nucleocápside o genoma directamente al citoplasma

• El pH óptimo para la fusión determina si la penetración ocurre en la superficie celula en pH neutral o si el virus debe ser internalizado por endocitosis y fusionarse en un endosoma a pH ácido

• La actividad de fusión puede ser provista por VAP u otra proteína

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• La HA InfA se une a los receptores de ácido siálico en la célula blanco

• Bajo las conciones acídicas del endosoma, la HA sufre un cambio conformacional para exponer porciones hidrofóbicas capaces de de promever la fusión de membrana

• Los paramyxovirus tienen una membrana de fusión que es activa a pH neutral para promover la fusión célula-célula y forma células gigantes multinucleadas (sincicio), algunos VHS y retrovirus se fusionan con células a un pH neutral e inducen sincicios luego de la replicación

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• Desenrollamiento:– Una vez internalizado la nucleocápside debe ser

liberado al sitio de replicación dentro de la célula y la cápside o envoltura removida

– El genoma de los virus ADN excepto poxvirus debe ser liberado al núcleomientras que la > de ARN permanecen en el citoplasma

– El proceso inicia por anclaje a los receptores o bien promovido por el ambiente ácido o proteasas localizadas en el endosoma o lisosoma

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• Las cápsides de picornavirus son debilitadas por la liberación de proteína de capside VP4

• Los virus envueltos son denudados a la fusión de la membrana celular (la fusión de VHS con la membrana plasmática libera su nucleocápside que se ancla a la membrana nuclear para liberar su genoma ADN directamente al sitio de replicación

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• La libración de la nucleocápside de Inf de su matriz y envoltura es facilitado por el paso de protones de adentro del endosoma a través del poro de iones formado por la proteína de matriz M2 para acidificar el medio ambiente

• Los reovirus y los poxvirus están sólo parcialmente cubiertos a la entrada

• La membrana externa de los primeros se remueve pero el genoma permanece en la cápsula interna, la cual contiene las polimerasas necesarias para la síntesis del ARN

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• El desenrollamiento inicial de los poxvirus expone una subpartícula viral al citoplasma permitiendo la síntesis de ARNm por enzimas contenidas en el virión

• Una enzima desenvuelta puede luego ser sintetizada para liberar el core conteniendo el ADN en el citoplasma

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Síntesis macromolecular

• Una vez adentro de la célula, el genoma debe dirigir la síntesis de ARNm, proteínas y generar copias idénticas

• La transcripción, traducción y replicación del genoma son por ello los pasos más importante en la multiplicación viral

• El genoma es inútil si no puede ser transcrito en ARNm funcional capaz de unirse a ribosomas y ser traducido a proteínas

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Etapas de síntesis macromolecular viral

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• La maquinaria celular para la transcripción y procesos del ARNm se encuentra en el núcleo.

• La mayoría de virus ADN usan la ARN polimerasa II dependiente de ADN de la célula y otras enzimas para hacer ARNm

• P. ej. los ARNm eucariotas adquieren una cola 3’poliadelinada (poliA) y un extremo 5’metilado (para unirse al ribosoma), para liberar intrones antes de ser exportados al citoplasma

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• Los virus que se replican en el citoplasma deben proveer estas funciones o una alternativa

• Aunque los poxvirus son ADN se replican en el citoplasma y codifican enzimas para estas funciones.

• Los virus ARN se replican y producen ARNm en el citoplasma, excepto por los orthomyxovirus y los retrovirus.

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• Los virus ARN deben codificar las enzimas necesarias para la transcripción y replicación porque la célula no tiene medios para replicar ARNm

• Los ARNm pueden o no adquirir un extremo 5’ o una cola poliA

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• El genoma desnudo de virus ADN (excepto poxvirus) y virus en sentido + (excepto retrovirus) son algunas veces llamados ácidos nucleicos infecciosos porque son suficientes para iniciar replicación al ser inyectados en la célula

• Pueden interactuar directamente con la maquinaria del huésped para promover ARNm o síntesis proteica o ambas

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• Por lo general el ARNm para estructuras no proteicas se transcribe primero

• Los genes de productos tempranos (proteínas no estructurales) son a menudo proteínas que se unen al ADN y enzimas, incluyendo polimerasas codificadas por el virus

• Estas proteínas son catalíticas y sólo unas cuantas son requeridas

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• La replicación del genoma usualmente inicia la transición a la transcripción de genes de productos tardíos

• Estos codifican para proteínas estructurales, muchas copias de estos productos son requeridas para empacar el virus pero generalmente no son requeridos antes que el genoma se replique

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• Diferentes virus ADN y ARN controlan el tiempo y cantidad de genes virales y síntesis proteicas en diferentes vías

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• Replicación virus ADN– Requiere una polimerasa de ADN

dependiente de ADN, otras enzimas y trifosfatos desoxiribonucleótidos, especialmente timidina

– La transcripción del genoma del virus ADN (excepto poxvirus) ocurre en el núcleo, usando las polimerasas del huésped y otras enzimas para la síntesis del ARNm viral

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– La transcripción de los genes virales es regulada por la interacción de proteínas unidas a ADN específicas y promotores y aumentadores que son similares en secuencia a aquellos de la célula que permiten la unión de la de la activación de la transcripción celular y ARN polimerasa dependiente de DNA

• P. ej. las neuronas sólo transcriben un gen para el VHS, a menos que la célula se vea activada por estrés y como resultado el virus permanece en estado latente.

– La transcripción por ello es un factor en determinar el tropismo celular y el rango de huésped del virus

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• Los diferentes virus ADN controlan la duración, tiempo, y cantidad de genes virales y síntesis proteica en diferentes vías:– A + complejo el virus > codificación de sus

propios activadores transcripcionales• VHS codifica para proteínas que regulan las

cinéticas de la expresión del gen viral.• Los genes pueden ser transcritos ya sea de hebra

de ADN del genoma y en direcciones opuestas84

– Los genes tardíos de los papovavirus y adenovirus son inicialmente transcritos como un gran ARN de un simple promotor y luego procesado para producir varios ARNm luego de la remoción de varias secuencias entre exones (intrones)

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• La replicación de ADN viral siguen las misma reglas bioquímicas que el ADN celular

• La replicación se inicia en una secuencia de ADN única en el genoma, llamado el origin (ori) este sitio reconocido por factores nucleares virales o del huésped y por la polimerasa de ADN dependiente de ADN.

• La síntesis del ADN viral es semiconservativa y las polimerasas de ADN celular y viral requieren un primer para iniciar la síntesis de la cadena de ADN

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• Los parvovirus tienen secuencias de ADN que son invertidas y repetidas para permitir al ADN a doblarse e hibridarse consigo mismo para proveer un primer (secuencia de OligoNT)

• La replicación del genoma de adenovirus es (primed) por el monofosfato de desoxicitidina pegado a una porción terminal.

• Una enzima celular (primasa) sintetiza el primer ARN que inicia la replicación del genoma de papovavirus mientras el VHS codifica una primasa

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• La replicación del genoma de virus ADN simples (parvovirus, papovavirus) usa las polimerasas ADN dependientes de ADN del huésped, mientras que los virus > complejos (adenovirus, VHS, poxvirus) codifican sus propias polimerasas

• Las polimerasas virales usualmente son + rápidas pero menos precisas que las del huésped, causando una mayor tasa de mutaciones en virus y por ello provee un blanco para los análogos de nucleótidos como antivirales

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• La replicación de los hepadnavirus es única en que un intermediario ARN circular de sentido (+) es primeramente sintetizado por la polimerasa ARN dependiente de ADN celular.

• Las proteínas virales rodean al ARN, una polimerasa ADN dependiente de ARN (transcriptasa reversa) en este virión hace una hebra ADN (-) y luego el ARN es degradado.

• La síntesis de ADN hebra (+) se inicia pero para cuando el genoma y el core están envueltos, dejando un genoma ADN circular doble hebra

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• Las mayores limitaciones para la replicación del virus ADN incluyen la disponibilidad de la polimerasa de ADN y sustratos de desoxiribonucleótidos

• La mayoría de células en la fase de reposo y no desarrollan síntesis de ADN porque las enzimas necesarias no están presentes y el pool de desoxitimidina está limitado

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• A + pequeño el virus ADN, + la dependencia del virus en la célula

• Los parvovirus son los > pequeños y se replican únicamente en células que crecen (precursores eritroides o tejido fetal)

• El acelerar el crecimiento de la célula puede aumentar el ADN viral y la síntesis de ARNm

• El Ag T de SV40 y E6/E7 del papilomavirus y la proteína E1a de adenovirus se une y previenen la función de proteínas inhibidoras del crecimiento (p53 y producto del gen de retinoblastoma) resultando en crecimiento celular y promoción de la replicación viral

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• Los virus ADN > pueden codificar una polimerasa ADN y otras proteínas para facilitar la síntesis de ADN y son + independientes

• VHS codifica una polimerasa ADN y enzimas oxidantes (desoxirribonucleasa, ribonucleótido reductasa y timidín cinasa), p/generar los sustratos desoxirribonucleótidos necesarios para replicar su genoma

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Virus ARN

• La replicación y transcripción de los virus ARN son procesos similares

• Los genomas virales son usualmente un ARNm (ARN hebra +) o una copia de ARNm (ARN hebra -)

• Durante la replicación y transcripción, una réplica ARN doble hebra intermediario es formado (una estructura normalmente no hallada en las células no infectadas)

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Replicación de Picornavirus. Un virus ARN (+) simple

1. Interacción de picornavirus con receptor en la superficie celular define el blanco y debilita la cápside

2. El genoma es inyectado a través del virión y cruza la membrana celular

3. El genoma es usado como ARNm para la síntesis proteica, una gran poliproteína se produce

4. La poliproteína es rota proteolíticamente en proteínas individuales incluyendo una polimerasa ARN dependiente de ARN

5. La polimerasa hace una copia de hebra (-) y replica el genoma. Una proteína VPg es agregada de manera covalente al extremo 5’ del genoma viral

6. Las proteínas estructurales se asocian en la estructura de la cápside, el genoma se inserta y los viriones son librados en lisis celular

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Propiedades de los virus ARN

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• El genoma del virus ARN debe codificar para polimerasas ARN dependiente de ARN (replicasas y transcriptasas) ya que la célula no tiene medios de replicar ARN

• Ya que el ARN es degrado rápidamente las polimerasas deben ser sintetizadas pronto para generar + ARN viral o la infección se aborta

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• La mayoría de las polimerasas virales trabaja rápido y por ello puede cometer errores, causando mutaciones

• La replicación del genoma provee nuevas copias para la producción de + ARNm lo cual amplifica y acelera la replicación viral

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• Los genomas virales ARN hebra (+) de los picornavirus, norovirus, coronavirus, flavivirus y togavirus actúan como ARNm, se unen a ribosomas y dirigen la síntesis proteica

• El genoma ARN sentido (+) desnudo por sí solo puede iniciar la infección

• Luego que la polimerasa ARN dependiente de ARN es producida, una copia hebra (-) es sintetizada

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• La copia puede ser usada luego para generar + ARNm replicar el genoma

• Para los togavirus y norovirus la copia (-) también se usa para producir un ARN + pequeño para las proteínas estructurales (genes tardíos)

• El ARNm de éstos no está limitado en el extremo 5’, pero el genoma codifica una secuencia corta poliA

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• La transcripción y replicación de los coronavirus comparten muchas de estos aspectos pero son más complejos

• Los genomas de los virus ARN (-), de los rhabdovirus, orthomyxovirus, paramyxovirus, filovirus y bunyavirus son las copias para la producción de su ARNm

• La hebra (-) no es infecciosa en sí y una polimerasa debe ser acarreada en la célula con el genoma (asociado con el genoma como parte de la nucleocápside) para hacer ARNm individual de las diferentes proteínas virales

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• Como resultado, una hebra de ARN (+) debe ser producida por la polimerasa viral para actuar como copia para generar más copias del genoma

• El genoma es un negativo: cada marco codifica para una foto/ARNm pero una copia de longitud completa se requiera para replicar el “rollo”

• Excepto para virus INF, la transcripción y replicación de los virus hebra (-) ocurre en el citoplasma

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• La transcriptasa de los INF requiere de un primer para producir ARNm

• Usa los extremos 5’ del ARNm celular en el núcleo como “primers” para su polimerasa y en el proceso “roba” el extremo 5’ del ARNm celular

• El genoma de INF se replica en el núcleo

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• Los reovirus tienen un genoma doble hebra segmentado y se someten a formas + complejas de replicación y transcripción

• La polimerasa ARN es parte del core interior de la cápside

• Las unidades de ARNm son transcritos de cada uno de los 10 o + segmentos del genoma mientras todavía están en el core

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• Las hebras negativas de segmentos del genoma se usan como copias para el ARNm de manera similar a las de los virus ARN hebra (-)

• Las enzimas codificadas por los reovirus contenidas en el core interior de la cápside agregan el límite 5’ al ARNm viral.

• El ARNm no tiene poliA• Los ARNm son liberados al citoplasma donde dirigen la

síntesis proteica o son secuestrados en nuevos core• El ARN (+) en los nuevos core actúa como una copia

para el ARN (-) y la polimerasa del core produce la progenie con ARN doble hebra

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• Los arenavirus tienen un genoma ambisense con secuencias (+) adyacentes a secuencias (-)

• Los genes tempranos del virus son transcritos de la porción sentido (-) y los tardíos de la réplica intermedia de longitud completa

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• Aunque los retrovirus tienen un genoma sentido (+), el virus no tiene medios de replicar el ARN en el citoplasma. En lugar de ello llevan 2 copias de su genoma, 2 moléculas de ARNt y una polimerasa ADN ARN dependiente (transcriptasa reversa) en el virión

• El ARNt es usado como un “primer” para la síntesis de la copia de ADN circular complementario (ADNc) del genoma

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• Este se sintetiza en el citoplasma, viaja al núcleo y luego se integra a la cromatina del huésped

• El genoma viral se convierte en un gen celular• Promotores al final del genoma viral integrado

aumentan la transcripción de las secuencias del ADN viral por la célula

• Los transcritos completos son usados como nuevos genomas y ARNm individual son generados por ruputra difrencial de este ARN

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• El modo inusual de replicación es el de los deltavirus (semejante a un viroide)

• El genoma es circular, baciliforme, ARN de una hebra el cual es hibridizado extensamente a sí mismo

• Como excepción, el genoma ARN del deltavirus se replica por la ARN polimerasa II ADN-dependiente de la célula huésped en el núcleo

• Una porción del genoma forma una estructura ARN llamada un ribozima el cual rompe el círculo ARN para producir un ARNm

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Síntesis de proteínas virales

• Todos los virus dependen de los ribosomas, ARNt y mecanismos para la modificación postraduccional de la célula huésped para producir sus proteínas

• La unión al ribosoma está mediado por una estructura 5’ limítrofe (cap) de guanosina metilada a una estructura especial en rizo de ARN (secuencia interna de entrada al ribosoma –IRES-) el cual se une dentro del ribosoma para iniciar la síntesis proteica

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• Esta estructura fue descrita inicialmente en el genoma de los picornavirus y luego en ARNm celulares selectos

• La mayoría pero no todos los ARNm virales tienen una cola poliA, como los ARNm eucariotas

• A diferencia de ribosomas bacterianos que pueden unirse a ARNm policistrónico y traducir varias secuencias de genes en proteínas separadas, el ribosoma eucariota sólo hace una proteína continua

113

• Los virus tienen que lidiar con ello• P. ej. el genoma entero de un virus ARN (+) es

leído por el ribosoma y traducido en una poliproteína gigante que luego es rota por proteasas virales y celulares en proteínas funcionales

• Virus ADN, retrovirus y la mayoría de ARN(-) transcriben ARNm separados para poliproteínas más pequeñas o bien proteínas individuales

• Los genomas de los orthomyxovirus y los reovirus son segmentados y la mayoría de los segmentos codifican una proteína única

114

• Los virus se valen de tácticas distintas para promover traducción preferencial de su ARNm

en lugar de ARNm celular• En muchos casos los hacen porque ocupan la

mayoría de los ribosomas previniendo la traducción celular

• Adenovirus bloquea la salida de ARNm celular del núcleo

• VHS inhiben la síntesis macromolecular e inducen degradación del ADN celular y ARNm

115

• Los poliovirus usan una proteasa codificada por el virus para inactivar la proteína de 200,000Da de unión al cap del ribosoma previniendo la unión y traducción del ARNm celular 5’ capped

• Los togavirus y otros virus incrementan la permeabilidad de la membrana celular, así se disminuye la afinidad ribosoma para su respectivo ARNm

• Todo ello conlleva a la citopatogénesis viral

116

• Algunas proteínas virales requieren modificaciones post-traduccionales (fosforilacion, glicosilación, acilación o sulfación)

• La fosforilación proteica se lleva a cabo por proteín cinasas virales o celulares y es un medio de modular, activar o inactivar proteínas.

• Varios VHS codifican su propia proteín cinasa• Las glicoproteínas virales son sintetizadas en

los ribosomas unidos a la membrana y tienen secuencias de AA que les permiten inserción al REG y la glicosilación ligada a N

117

• La forma del precursor rico en manosa de las glicoproteínas progresa del RE a través de transporte vesicular en la célula y es procesado en el aparato de Golgi (AG)

• La presencia de las glicoproteínas determina si el virión se ensambla

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Ensamblaje

• Es análogo a un rompecabeza tridimensional

• C/parte del virión tiene estructuras de reconocimiento necesarias para ensamblar la estructura final

• Este proceso inicia con la síntesis de piezas necesarias y la [proteínas estructurales] es suficiente para llevar al proceso termodinámicamente

119

• El proceso puede facilitarse por proteínas de andamiaje que son activadas o liberan energía en proteolisis

• P. ej. la ruptura (cleavage) de la proteínas VP0 del poliovirus libera el péptido VP4 que solidifica la cápside

• El ensamblaje de los virus ADN (aparte de los poxvirus) ocurre en el núcleo y requiere del transporte de proteínas del virión al núcleo.

• Los virus ARN y poxvirus en el citoplasma

120

• Los virus de cápside pueden ensamblarse como estructuras vacías (procápsides) y ser llenada por el genoma (picornavirus) o ser ensambladas alrededor del genoma

• Nucleocápsides de retrovirus, togavirus y virus ARN (-) se ensamblan alrededor y subsecuentemente en una envoltura

• La nucleocápside helical de los virus ARN (-) incluye la ARN polimerasa ARN dependiente necesaria para la síntesis de ARNm en la célula blanco

121

• En los virus con envoltura, las glicoproteínas virales son liberadas a la membrana celular por transporte vesicular

• La adquisición de la envoltura ocurre luego de la asociación de la nucleocápside con las regiones conteniendo glicoproteínas virales de la membrana celular huésped (gemación)

• Las proteínas de matriz para virus ARN(-) se alinean y promueven la adhesión de nucleocápsides con la membrana modificada de glicoproteínas, la membrana rodea la nucleocápsdide, llevando a la gemación del virus

122

• El tipo de genoma y secuencia proteica de las glicoproteínas determina el sitio de gemación

• La mayoría de los virus ARN gema de la membrana plasmática el virus es liberado de la célula al mismo tiempo

• Flavivirus, coronavirus, bunyavirus adquieren su envoltura al gemar en membranas del RE y AG y pueden permanecer asociados a la célula en estos órganos

123

• La nucleocápside de VHS se ensambla en el núcleo y gema en y del RE

• La nucleocápside es descargada en el citoplasma, proteínas virales se asocian con la cápside y luego la envoltura se adquiere por gemación en una membrana de Golgi decorada con las 10 glicoproteínas virales

• El virión se transporta a la superficie celular y es liberado por exocitosis o lisis celular o transmitida por puentes célula-célula

124

• Los virus usan diferentes trucos para asegurarse que tosas las partes se ensamblen en viriones ocmpletos

• La ARN polimerasa rquerida para infección de los virus ARN (-) es llevada en el genoma como una nucleocápside helica

125

• El VIH (y otros retrovirus) son empacados en una procápside consistente en una poliproteína conteniendo la proteasa, polimerasa, integrasa y proteínas estructurales

• Esta procápside se une memranas modificas con glicoproteínas virales y el virión emerge de la membrana

• La proteasa codificada por el virus es activada dentro del virión y rompe una la poliproteína para producir al final la nucleocápside infecciosa y las proteínas requeridas dentro de la envoltura

126

• El ensamblaje de un virus Influenza o reovirus requiere la acumulación de al menos una copia de cada segmento de gen

• Aunque Inf requiere 8 segmentos únicos de genoma, lo viriones pueden empacar al azar 10 a 11 segmentos

• Estadísticamente esto equivale a un set completo de genomas (y virus funcionales) por cada 20 virus defectuosos

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• Se hacen errores durante el ensamblaje. (viriones vacíos y viriones conteniendo genomas defectuosos)

• El radio partícula:virus infecioso es alto, usualmente > 10 y durante la replicación rápida viral puede ser 104

• Los virus derectuosos pueden ocupar la maquinaria requierida para la replicación normal viral para interferir con la producción viral (partículas interferentes defectuosas)

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Liberación

• Los virus pueden liberarse luego de lisis, por exocitosis, gemación de la membrana plasmática

• Los virus de cápside desnuda generalmente por lisis

• La liberación de muchos virus con envoltura ocurre luego la gemación de la membrana plasmática sin matar la célula

• Lisis y gemación son métodos eficientes

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• Virus que geman o adquieren sus membranas en el citoplasma (flavivirus, poxvirus) permanecen asociados a la célula y son liberados por exocitosis o lisis celular

• Los virus que se unen a los receptores del ácido siálico (orthomyxovirus, algunos paramyxovirus) pueden tener una NA

• Ésta remueve los receptores potenciales de ácido siálico en las glicoproteínas del virión y la célula para prevenir el agrupamiento y permitir la liberación

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Reinicio del ciclo de replicación

• Los virus liberados al medio EC, usualmente son responsables de iniciar nuevas infeccines

• Sin embargo puentes célula-célula, fusión célula-célula inducida por virus o transmisión vertical del genoma a células hijas puede diseminar la infección

• Esto evita la detección por Ac

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• Algunos VHS, retrovirus, paramyxovirus inducen la fusión célula-célula para unir las células en células gigantes multinucleadas (sincicios) los cuales se convierten en gigantescas fábricas de virus

• Los retrovirus y algunos ADN pueden transmitir su copia integrada del genoma a la células hijas en división celular

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Genética viral

• Las mutaciones espontáneamente y fácilmente ocurren en genomas virales creando nuevas cepas distintas a la “cepa salvaje”

• Estas variantes se identifican por las secuencias de nucleótidos, diferencias antigénicas o propiedades estructurales o funcionales

• La > de mutaciones no tienen efectos o inciden en el virus

• La mutaciones en genes esenciales lo inactivan

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• Pero mutaciones en otros genes, les hacen tener resistencia antiviral o alterar su antigenicidad o patogenicidad

• Los errores son producto de la pobre fidelidad de la polimerasa viral y la rápida tasa de replicación del genoma

• Además los virus ARN no tienen un mecanismo genético que examine errores

• Mutaciones + comunes ARN > ADN

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• Mutaciones en genes esenciales: letales• Una mutante de deleción: pérdida o

remoción selectiva de una porción del genoma y la función que codifica

• Otras mutaciones producen mutantes de placa, difieren del WT en tamaño o apariencia de las células infectadas

• Mutantes de rango de huésped: difieren en el tejido o especies afectadas

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• Mutantes atenuadas: variantes que causan menos enferemedad

• Mutantes condicionales (sensibles a temperatura, mutantes sensibles al frío) tienen una mutación en un gen para una proteína esencial que permite al virus producirse sólo a ciertas temperaturas. Cepas mutantes crecen mejor a 30º a 35ºC mientras que la proteína codificada es inactiva a 38º -40º previniendo la infección viral

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• Las nuevas cepas de virus pueden generarse por interacciones genéticas entre virus o entre virus y las células

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• El intercambio genético intermolecular entre los virus o el virus y el huésped es llamado recombinación

• La recombinación puede ocurrir entre dos virus ADN relacionados (VHS 1 y 2)

• La integración del retrovirisu con la cromatina del huésped es una forma de recombinación

• La recombinación de 2 virus ARN relacionados: Sindbis + EEEV= WEEV (otro togavirus)

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• Los virus con genoma segmentado (Inf/reovirus) forman cepas híbridas en infección de una célula con más de una cepa viral

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• En algunos casos una cepa defectuosa puede ser rescatada por la replicación de otra mutante (WT o por una línea celular que lleve un gen viral de reemplazo)

• La replicación del otro virus o la expresión del gen en la célula provee la función faltante requerida por un mutante: complementación

• El rescate de una mutante o una condicón letal con una secuencia definida (p. ej. un fragmento de endonucleasa de restricción de ADN ) se llama marcador de rescate

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• El marcador de rescate se usa para mapear los genomas de los virus (VHS p. ej.)

• Los virus producidos de células infectadas con diferentes cepas viralespueden ser fenotípicamente mezclados y tener las proteínas de una cepa pero el genoma de otra (transcapsidación)

• Los Pseudotipos son generados cuando la transcapsidación ocurren entre diferentes tipos de virus

• Las cepas virales individuales son seleccionada por su habilidad de usar la maquinaria del huésped y resistir condiciones adversas

141

• Presiones de selección: velocidad de crecimiento celular, la expresión tejido específica requerida por el virus

• Las condiciones del cuerpo, su temperatura elevada, defensas innatas e inmunes y estructura de tejido son presiones de selección

• Una pequeña ventaja selectiva en virus mutantes puede llevar a que se vuelva la cepa predominante. La alta tasa de mutación del VIH promueve un cambio en el tropismo de la célula blanco de macrófagos a células T, el desarrollo de resistencia a ARV y la generación de variantes antigénicas en el curso de tratamiento

• La ausencia de éstos en condiciones de laboratorio logra cepas atenuadas para su uso en vacunas

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Vectores virales para terapia

• Los virus genéticamente manipulados son excelentes sistemas para genes ajenos

• Pueden proveer– Terapia de reemplazo– Usados en vacunas para promover inmunidad a

cáncer u otros agentes– Pueden actuar como asesinos con blanco definido de

tumores• La ventaja es que pueden ser amplificados por

replicación en células apropiadas y pueden llegar a tejidos específicos y liberar ADN o ARN en la célula

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• Virus que se desarrollan como vectores:– Adenovirus– Retrovirus– VHS– Virus adeno-asociado (parvovirus)– Poxvirus (vaccinia y canarypox)– Algunos togavirus

• Los vectores virales usualmente son defectuosos o atenuados en el que el ADN ajeno reemplaza un gen virulento o no esencial

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• El gen puede estar bajo el control de un promotor viral o bien un promotor tejido específico

• Los vectores virales defectuosos son crecidos en líneas celulares que expresan las funciones virales faltantes complementando el virus

• La progenie libera el ácido nucleico pero no virus infecciosos

• Retrovirus y virus adeno-asociados pueden integrarse a células y liberar permanentemente genes al cromosoma celular

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• Los adenovirus y VHS promueven la liberación dirigida del gen ajeno a las células que contienen los receptores

• VHS genéticamente atenuado es capaz de desarrollar específicamente la muerte de células en crecimiento de glioblastomas respetando tejidos circundantes

• El virus vaccinia lleva un gen para la glicoproteína de la rabia (ya utilizada en mapaches, zorros y zorrillos salvajes)

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