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Michelle C. Chirinos Arias Jefa de Laboratorio Centro de Diagnóstico Molecular

GUÍA PRÁCTICA DE MANEJO Y USO DEL EQUIPO Y SOFTWARE DE HPLC Expositora: Blga. Michelle Chirinos Arias

1. EQUIPOS Y REACTIVOS REQUERIDOS EQUIPOS

• HPLC (Shimadzu) • Computadora • Software

MATERIAL Y REACTIVOS

• Metanol grado HPLC • Acetonitrilo grado HPLC • Agua grado HPLC • Estándar de inmunosupresor. • Columna C18 • Jeringas • Filtro para HPLC • Micropipetas • Tips de 10, 100 y 1000 ul.

2. Preparación de Estándares

Usar fórmula C1.V1=C2.V2 Siendo 1 inicial y 2 final

3. MANEJO DEL EQUIPO DE HPLC Y SOFTWARE • Prender la computadora • Conectar el equipo y prender el desgasificador, la bomba, el horno de la columna, el detector

y por último el controlador del sistema. (ver figura 1 con las partes del HPLC). Siempre en ese orden.

• Abrir el software LC Solution y seleccionar 1, esto debido a que en este caso la computadora solo controla 1 equipo de HPLC.


• Aparecerá una pantalla emergente pidiendo la contraseña, dar OK. En estas máquinas por default se les coloca sin contraseña.

• Se escuchará 2 timbres, el primero corresponde a la conexión y revisión del todo el sistema con la PC y el segundo a la autenticación. En otros equipos se puede escuchar hasta 3 timbres que corresponden a lo mismo.

• Luego aparecerá la pantalla en tiempo real.

• Esperar 20 minutos a que el equipo se estabilice y que la lámpara caliente. • Prender la bomba (Pump) en el software haciendo click en el icono, como se muestra en la

sgte. Figura.

• Prender el horno, haciendo click en el sgte. Botón.

• Una vez alcanzada la temperatura de 60°C, se puede correr la línea base. Haciendo click en el siguiente icono.

• Pasado los 15 minutos de la corrida de la línea base, verificar que ésta sea recta, si no volver a correrla.

• Abrir el inyector de muestra y voltear la perilla hacia la izquierda. • Inyectar la muestra, asegurándose que no exista ninguna burbuja.

• Click en el botón Single start.

• Aparecerá la pantalla Single Run donde se colocará el nombre de la muestra, su ID, el método

a usar y el Data File (colocar el nombre de la muestra) y dar OK.


• Por último aparecerá una ventana a la cual se le debe dar OK, al mismo tiempo que se gira la perilla del inyector a la derecha (ya que en nuestro caso es un HPLC con muestreador manual). Esta ventana indica que la lectura debe empezar por ello es necesario bajar la perilla ya que en ese momento la muestra estaría entrando a la columna.

• Luego de la corrida, hacer click en post-‐run

• Aparecerá la siguiente pantalla la cual muestra el resultado de la concentración del inmunosupresor, en el tiempo de retención establecido por los estándares, el cual se delimita por una línea vertical (regresión lineal).

Fig. 1 Partes del Equipo de HPLC

Desgasificador

Bomba

Detector

PC

Horno de columna

Muestreador


4. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

El área del pico del cromatograma es directamente proporcional a la concentración de la muestra. Para determinar la concentración del inmunosupresor, se debe tener una curva de calibración, donde se conozca la absorbancia y el tiempo de retención de los estándares. El analito (compuesto de interés) aparecerá en el mismo tiempo de retención que los estándares, pero su pico y por consiguiente el área variará.

5. Purgado de equipo

Una parte del mantenimiento preventivo de la bomba del HPLC es el purgado, que significa eliminar burbujas y contaminantes de las mangueras que llevan la fase móvil. Para ello es necesario abrir el método de limpieza del equipo y aumentar el flujo, considerando primero al solvente A hasta que no haya burbujas y al solvente B de la misma forma. Para ello girar la manija que se encuentra en la bomba hacia la dirección open (izquierda) se verá salir las burbujas por un tubo que conecta al desecho.

6. Mantenimiento y limpieza del equipo El método de limpieza del equipo de HPLC puede cambiarse dependiendo del operador, usualmente son 15 minutos del solvente “A” o hasta que la línea base que se está corriendo sea estable. Por ultimo hacer lo mismo con el segundo solvente o de preferencia agua grado HPLC. 7. PREGUNTAS DE ENTENDIMIENTO

1. ¿Cuál es el principal indicio que mi columna está sucia o que su tiempo de vida ya está por terminar?

2. Si el líquido es viscoso ¿qué pasa con la velocidad, la presión, la temperatura?

3. ¿Cómo establezco el tiempo de retención de la muestra?, ¿qué pico debo considerar?

8. CÁLCULOS QUÍMICOS

La curva estándar se establece de acuerdo al rango donde se espera se encuentren los resultados. Por ejemplo

si los resultados usualmente se encuentran en el rango de 30 a 50ppb. Se recomienda que la curva estándar

conste de las siguientes concentraciones 20, 30, 40, 50 y 60 ppb. Es recomendable que se usen al menos 3

puntos, obviamente si hay más puntos el sesgo es menor.

1. A partir de un STD de 1ppm preparar un nuevo STD de 500ppb

2. A partir de un STD de 100ppb preparar un STD de 10ng/mL

3. Preparar 500ml NaOH de 1M

4. Tengo un STD stock de 0.75 mg (sólido) ¿cómo preparo a partir de ello mi STD de 75ppm?

5. ¿qué significa preparar una solución al 20% (p/v)? Y al 30% (v/v)?

6. Si mi stock está a 500ng/mL como preparo los siguientes STD 20, 30, 40, 50 y 60 ppb?

7. Los valores de mi curva STD arrojan un R2 de 0.65 ¿qué puedo decir de la curva?

8. Los valores del área de la curva de la pregunta 6 son 25, 35, 45, 67 y 70 respectivamente y el valor del

área de mi muestra es de 48. Según esto ¿cuál es la concentración de mi muestra en ng/mL?


SOLUCIÓN PREGUNTAS DE ENTENDIMIENTO

1. La presión aumenta, para que el flujo se mantenga constante.

2. La velocidad debería disminuir pero para que no ocurra esto la presión aumenta y la temperatura

debería aumentarse, ya que al aumentar la temperatura, la presión disminuye. Todo está relacionado.

3. Lo establezco de acuerdo al pico del STD. A veces pueden aparecer varios picos, el que debo

considerar usualmente es el más grande y el que va disminuyendo a medida que la concentración de

los STD que coloco van disminuyendo.

CÁLCULOS QUÍMICOS

1. 1ppm= 1000ppb

C1.V1=C2.V2

1000ppb.V1= 500ppb. 10ml

V1= 5ml

Tomar 5ml del stock de 1ppm y enrazar con solvente hasta 10ml

2. 1ppb=1ng/uL

C1.V1=C2.V2

100ppb.V1= 10ppb. 10ml

V1= 1ml

Tomar 1ml del stock de 1ppb y enrazar con solvente hasta 10ml

3. NaOH peso molecular de 40g

M=(n/V)= (w/PM)/V El volumen debe estar en litros

1= (w/40)/0.5 despejo y hallo w en gramos

w= 20 g

pesar 20g de NaOH y agregarlo en 500ml de agua.

4. 1ppm=1mg/L

75ppm= (0.75mg)/xL

X= 0.01 L o 10 ml

Colocar los 0.75g del STD en 10ml de solvente.

5. 20 g del soluto A en 100ml del solvente B y 30 ml de la solución A en 100ml de la solución B.

6. 500ng/uL=500ppb

para 20; C1.V1=C2.V2; 500ppb. V1= 20ppb.2000uL; V1=80uL

Yo elijo el V2


para 30; C1.V1=C2.V2; 500.V1=30.2000uL; V1= 120uL

para 40; C1.V1=C2.V2; 500.V1= 40. 2000uL; V1= 160uL

para 50; C1.V1=C2.V2; 500.V1=50.2000uL; V1= 200uL

para 60; C1.V1=C2.V2; 500.V1=60.2000uL; V1= 240uL

7. Es mejor repetirla, la curva debe tener un R2 cercano a 1.

8. La curva al colocarla en Excel (usando el área del pico como ordenada y la concentración como

abscisa) sale como en la figura. Usando eso puedo calcular la concentración si el área es de 48. Para

ello reemplazo en la fórmula 48= 1.22x -‐0.4. Siendo x la concentración de mi muestra igual a 39.67 ppb

o 39,67 ng/mL.

y sería recomendable eliminar algún STD ¿Cuál se eliminaría?, ¿cambiaría en algo la curva?, ¿cuál de ellas es

mejor?

Se obtendría un mejor R2 si se elimina el cuarto dato, además sería más lineal. Sin embargo estadísticamente se

recomienda 5 puntos en una curva, por lo que lo mejor sería volver a procesar el cuarto estándar y medirlo

para incluirlo nuevamente.

y = 1.22x -‐ 0.4 R² = 0.95952

0 10 20 30 40 50 60 70 80

0 20 40 60 80

área del pico

Concentración

Serie1

Lineal (Serie1)

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