Índice

PRÓLOGO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1. OCEANOGRAFÍA FÍSICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .– Medidas de conductividad, temperatura y presión . . . . . .– Adquisición y control de datos LADCP . . . . . . . . . . . . . .– Análisis de muestras de salinidad. Salinómetro de labora-

torio Autosal 8400B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2. BIOGEOQUÍMICA DEL OCÉANO: CARBONO, NUTRIENTES YGASES TRAZA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Muestreo y análisis de oxígeno disuelto (O2) en agua demar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Determinación espectrofotométrica del pH mediante eluso de púrpura de m-cresol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Determinación de la alcalinidad mediante valoración rápida a doble punto final . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Muestreo de nutrientes inorgánicos disueltos (DIN), ni-trógeno (TN) y fósforo (TP) totales . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Muestreo y análisis de nutrientes inorgánicos disueltos enagua de mar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Análisis de amonio en aguas marinas y aguas dulces porfluorimetría . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Filtración en rampa con presión positiva para el análisisdel carbono, nitrógeno, fósforo particulado (C/N y P) yde los isótopos estables de carbono (13C/12C) y nitrógeno(15N/14N) del material en suspensión . . . . . . . . . . . . . . .

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– Determinación de carbono y nitrógeno orgánico particu-lados mediante analizador elemental . . . . . . . . . . . . . . .

– Determinación de nitrógeno total (TN) por el método dela oxidación con persulfato en medio alcalino . . . . . . . .

– Análisis manual de la concentración de fósforo reactivosoluble (SRP) por el método espectrofotométrico de laformación del complejo azul de fosfomolibdato . . . . . . .

– Determinación de fósforo total (TP) y particulado (Ppart)por el método de la oxidación con persulfato en medioácido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Muestreo de carbono orgánico total (TOC) y nitrógeno to-tal (TN) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Muestreo de carbono y nitrógeno orgánico volátil . . . . . .– Recogida de muestras de materia orgánica particulada

(POM) y disuelta ultrafiltrada (UDOM) en el océano pro-fundo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Recogida y análisis a bordo de muestras de materiaorgánica disuelta cromófora: absorbancia (aDOM) y fluo-rescencia (FDOM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Determinación del consumo de 15NO3-, 15NH4

+, 15N-urea yfijación de 15N2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Determinación manual de urea en agua de mar . . . . . . .– Muestreo de metales y vitaminas disueltas . . . . . . . . . . .– Muestreo de agua de mar para el análisis de dimetilsul-

furo (DMS) y dimetilsulfoniopropionato (DMSP) por cro-matografía de gases (GC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Análisis de DMS con cromatografía de gases (GC)acoplada a un detector fotométrico de llama (FPD) selec-tivo para azufre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Sistema para el análisis en continuo de la razón 13C/12C yconcentraciones del CO2 atmosférico y del DIC marino . .

– Extracción de gases disueltos y su almacenamiento paraanálisis isotópico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Composición isotópica del vapor atmosférico . . . . . . . . .– Medidas de tasas de disipación de energía cinética turbu-

lenta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3. CONTAMINANTES Y DEPOSICIÓN ATMOSFÉRICA . . . . . . . . .

– Muestreo de partículas marinas superficiales (5 m) paraposterior análisis de compuestos orgánicos . . . . . . . . . . .

– Muestreo de compuestos orgánicos en la fase disuelta yen partículas marinas superficiales (5 m) . . . . . . . . . . . .

– Muestreo de compuestos orgánicos en el agua de lluvia(deposición húmeda) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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– Muestreo de compuestos orgánicos en la atmósfera y es-tudio de su difusividad en agua marina (deposición seca).

– Muestreo de compuestos orgánicos fluorados en la fasedisuelta y en partículas marinas superficiales (3 m y má -ximo profundo de clorofila) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Muestreo de aerosoles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .– Muestreo de aerosoles PM 2.5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .– Muestreo de aerosoles (TSP) y compuestos semi-volátiles

en la fase gas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .– Toma de muestras de bioaerosoles . . . . . . . . . . . . . . . . .– Muestreo de compuestos orgánicos en el fitoplancton/

zooplancton de la zona fótica de la columna de agua(hasta el DCM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Muestreo de fitoplancton en la zona fótica (3 m, DCM yDCM + 40) para el estudio de la expresión génica influen-ciada por contaminantes orgánicos persistentes . . . . . . .

– Muestreo de plancton en la vertical de la zona fótica(hasta DCM + 20) para el estudio de la expresión génicainfluenciada por contaminantes orgánicos persistentes . .

4. ÓPTICA, FITOPLANCTON Y METABOLISMO DEL OCÉANO . .

– Espectros de absorción de la luz por el material disuelto .– Determinación de los espectros de absorción de la luz

por las partículas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .– Determinación de la abundancia de nano y picofitoplanc-

ton mediante citometría de flujo . . . . . . . . . . . . . . . . . . .– Toma de muestras de fitoplancton mayor de 20 mm para

análisis de imagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .– Cuantificación de la abundancia de células vivas y muer-

tas de las comunidades de picoplancton . . . . . . . . . . . . .– Determinación fluorimétrica de la concentración de cloro-

fila a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .– Análisis de pigmentos fotosintéticos del fitoplancton me-

diante HPLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .– Muestreo de cocolitóforos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .– Muestreo de fitoplancton por medio de redes . . . . . . . . .– Muestreo de fitoplancton desde las botellas Niskin . . . . .– Cuantificación del metabolismo de la comunidad pelágica

mediante el método Winkler . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .– Cuantificación de la producción primaria bruta mediante

18O (GPP-18O) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .– Determinación de la producción primaria fraccionada por

tamaños . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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– Determinación de la producción fotosintética de carbonoorgánico disuelto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Determinación de la producción primaria en presencia deradiación ultravioleta solar (UVR) . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Determinación de la tasa de calcificación (PICp) . . . . . . .– Tasas de lisis celular del fitoplancton . . . . . . . . . . . . . . .– Estimación de la tasa bruta de crecimiento del pico-fito-

plancton mediante análisis del índice mitótico . . . . . . . .– Toxicidad de contaminantes orgánicos para las pobla-

ciones de fitoplancton oceánico . . . . . . . . . . . . . . . . . . .– Tasas de predación y crecimiento del fitoplancton medi-

ante técnicas de dilución . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5. BIODIVERSIDAD MICROBIANA Y FUNCIÓN ECOLÓGICA . . .

– Muestreo para recuentos de microorganismos por epi -fluorescencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Determinación de la abundancia y la actividad individualde bacterias y arqueas mediante citometría de flujo . . . .

– Muestreo para recuentos de flagelados heterotróficos porcitometría de flujo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Determinación de abundancia de virus por citometría deflujo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Determinación de la abundancia y contenido de pigmentode las bacterias fototróficas aeróbicas anoxigénicas . . . . .

– Medida de Partículas Exopoliméricas Transparentes (TEP)en agua marina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Concentración de biomasa de picoeucariotas, bacterias yvirus marinos para la extracción de ácidos nucleicos . . . .

– Incorporación de bromodeoxiuridina en ADN microbianopara la detección de filotipos activos . . . . . . . . . . . . . . .

– Muestreo para el estudio de la diversidad del planctonmicrobiano a partir de sondas específicas . . . . . . . . . . . .

– Obtención de muestras para la determinación de la com-posición de la comunidad vírica . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Determinación de la diversidad funcional del bacterio-plancton marino . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Determinación de la actividad bacteriana mediante la in-corporación de leucina radiactiva . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Medida de la respiración mediante cambios in vitro de laconcentración de O2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Estudio de la cuantificación de CID por el plancton pro-cariota mesopelágico (≥ 200 m) . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Actividad enzimática de los procariotas planctónicos . . . .

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– Estudio de la actividad del plancton procariota profundo(≥ 100 m) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Determinación de la depredación bacteriana debida aprotistas, mediante la desaparición en el tiempo detrazadores (bacterias marcadas con un compuesto fluo-rescente, FLB: fluorescent labeled bacteria) . . . . . . . . . . .

– Determinación de la producción de virus como conse-cuencia de la lisis bacteriana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6. DISTRIBUCIÓN Y FUNCIÓN DEL ZOOPLANCTON EN ELOCÉANO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

– Muestreo de microzooplancton profundo (> 2000 m) . . .– Muestreo de microplancton superficial . . . . . . . . . . . . . .– Procesado de muestras de plancton para el análisis de

isótopos estables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .– Procesado de muestras de zooplancton gelatinoso para

taxonomía, barcoding y análisis del contenido en carbono.– Procesado de muestras de zooplancton para análisis de

actividad enzimática . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .– Muestreo de zooplancton neustónico . . . . . . . . . . . . . . .– Descripción de procedimientos para trabajos de acústica

con sonda EK60 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .– Muestreo de fitoplancton para extracción de PUAs (alde-

hídos volátiles poliinsaturados) . . . . . . . . . . . . . . . . . . .– Procesado de muestras de zooplancton para el análisis

fisio lógico y bioquímico de la respiración y excreción deamonio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Medida de Partículas Exopoliméricas Transparentes (TEP)en agua marina

1Mazuecos, I. P.; 2Ortega-Retuerta, E.; 1Reche, I. 1 Departamento de Ecología, Universidad de Granada

2 Laboratoire d’Oceanographie Microbienne, Banyuls sur mer, France.

Finalidad. Campo de aplicación

Protocolo de recogida de muestras de agua marina para el análisis deTEP. Las concentraciones de TEP se determinarán usando el método colori-métrico propuesto por Passow y Alldredge (1995). Los TEP se analizaránen muestras in vivo, aunque también pueden ser analizados en muestras fi-jadas con formol (~ 1% final).

Conceptos generales

Dentro de las substancias exopoliméricas, las partículas exopoliméricastransparentes (TEP) son partículas de naturaleza adhesiva, y susceptiblesde ser teñidas con azul alcian (Alldredge et ál. 1993). Estas partículas seforman predominantemente por la polimerización abiótica de precursoresdisueltos, principalmente mono– y polisacáridos de naturaleza acídica. LasTEP son excretadas por microorganismos y tradicionalmente se han aso-ciado a blooms de fitoplancton (Passow y Alldredge, 1994; Passow, 2000).Sin embargo, las bacterias también producen TEP, aunque a su vez puedenconsumirlas.

De este modo, las TEP contribuyen de forma significativa al flujo descen-dente de materia orgánica en sistemas marinos, ya que debido a su alta ad-herencia actúan como una matriz intersticial generando agregados macroscó-picos, formados por compuestos orgánicos e inorgánicos que son conocidoscomo nieve marina. La formación y sedimentación de nieve marina es unaruta principal de retirada de carbono de la superficie del océano hacia aguasprofundas (Alldredge et ál. 1993, Passow et ál. 2001; Passow, 2002).

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Equipamiento necesario

– Tubo de silicona.– Botellas Nalgene 2 l (de polipropileno).– Bomba de vacío.– Rampa de filtración.– Kitasato de seguridad (de polipropileno) con tapón perforado para

conectar a la bomba.– Filtros de policarbonato de 0.4 mm de tamaño de poro (Ø 25 mm).– Pinzas para filtros.– Pipetas de 1 y 5 ml.– Botes de vidrio de 20 ml o algo similar para la extracción.– Espectrofotómetro.– Cubetas desechables de 1 cm.– Botes de polipropileno para preparar disoluciones de azul alcián.– Balanza de alta precisión para la preparación de la curva de calibra-

ción (precisión de 0.0001 mg).– Ionizador.– Vasos de precipitado 500 ml.– Probeta de 200-500 ml.– Filtros de jeringa de 0.2 mm de tamaño de poro.– Jeringas (10 y 20 ml).– Frasco lavador para el agua ultrapura (Milli-Q).– Guantes.– Viales para introducir los filtros.– Cajas de plástico para almacenar los viales en el congelador.– Estadillo de recogida de muestras.– Material de papelería (rotuladores, bolígrafos, lápices…).– Bandeja.– Homogeneizador de tejidos para preparar la solución de calibración

de goma de xantano.

Reactivos u otro material fungible

a) Tinción: las TEP se tiñen con azul alcian (conjunto de colorantesbásicos polivalentes derivados de la “ftalocianina” que son solublesen agua). En una solución con ácido acético (pH = 2.5), el azul al-cian tiñe a los grupos carboxílicos y éster-sulfato de los mucopolisa-cáridos ácidos, para los cuales es uno de los colorantes catiónicosmás ampliamente usado. Las partes teñidas son de color azuladodebido a la presencia de cobre en la molécula.

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Reactivos:

● Solución de azul alcian para la tinción de TEP:a. Azul alcian (0.02 %).b. Ácido acético (0.06 %).

Preparación de la solución stock de azul alcian para 50 ml de esta so-lución: en botes de polipropileno (PET) añadir 0.5 g de azul alcian, segui-damente 1,5 ml de ácido acético y el resto se completa con agua ultrapurahasta 50 ml.

Preparación de la solución de trabajo de azul alcian: se diluye la solu-ción anterior 1: 50. Ejemplo: 20 ml de stock + 980 ml de agua ultrapura. Fi-nalmente, con una jeringuilla a través de filtros de 0.2 mm desechables sefiltrará la solución de trabajo.

b) Extracción del azul alcian de los filtros teñidos:

Reactivos:

● Ácido sulfúrico (80%).

c) Solución patrón para realizar la curva de calibración:

Reactivos:

● Goma de xantano (0.1 mg ml-1) o ácido algínico, ya que generanpartículas similares a las TEP y dan buenos resultados colorimé-tricos.

Preparación de la solución de goma de xantano: pesar aproximada-mente 15 – 20 mg de goma de xantano y añadir 200 ml de agua ultrapura.A continuación se pasa la solución por el homogeneizador (con tres o cua-tro pasadas de pistón se obtendrá una disolución homogénea de la gomade xantano). Se deja reposar a ~ 4 oC, y se vuelve a pasar otra vez por elhomogeneizador.

Calibración

Curva de calibración de goma de xantano (y/o ácido algínico): Con lasolución de goma de xantano (y/o ácido algínico) se calculará la concen-tración exacta filtrando volúmenes conocidos (e. g. 1, 2, 4, y 8 ml) a travésde filtros de policarbonato de 0.4 mm de tamaño de poro, que se pesaránantes y después (al menos 3 veces) de la filtración. De igual modo, se fil-trarán volúmenes semejantes (e. g. 1, 2, 4, y 8 ml) de solución patrón degoma de xantano para teñir los filtros con azul alcian y se leerá la absor-bancia del extracto obtenido a 787 nm. Por último, con la relación de la ab-

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sorbancia a 787 nm y los mg de goma de xantano (obtenidos con la dife-rencia de pesadas antes y después de filtrar) se realizará la curva de cali-bración.

Descripción de la técnica

Pasos a seguir: a. Preparación de solución de trabajo de azul alcian. b. Recoger el agua en botellas Nalgene de 2 l para cada muestra.c. Filtrar 200-1000 ml de muestra (según saturación del filtro) a través

de filtros de policarbonato de 0,4 mm de tamaño de poro. Tres filtros(réplicas) por profundidad. Usar una presión no muy alta (~ 150 mmde Hg) con ritmo constante.

d. Tinción: Teñir el filtro con 0,5 – 1 ml de solución de trabajo de azulalcian (que lo cubra completamente). Dejar unos 5 segundos. Filtrarla solución de azul alcian y enjuagar con agua ultrapura filtrada por0.2 mm.Nota: en este paso los filtros podrían ser congelados durante más de6 meses a -20 oC o -80 oC (Passow y Alldredge, 1995).

Por último, los filtros teñidos con azul alcian se colocarán en tubos deensayo y se añadirá 5 ml de H2SO4 al 80% para la extracción. El extracto seagitará al menos un par de veces para facilitar la extracción. Y después de2-3 h se leerá la absorbancia de dicho extracto a 787 nm usando cubetasdesechables.

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Figura 1. Ejemplo de curva de calibración absorbancia 787 nm vs mg de gomade xantano.

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Esquema y cuadro sinóptico de la técnica

Cálculo de los resultados

La curva de calibración nos permite calcular el factor de calibración(que es la inversa de la pendiente de la curva que obtuvimos en el apar-tado de calibración). Con este factor de calibración junto con el volumen(L) filtrado de muestra y los datos de absorbancia (a 787 nm) obtenidos an-teriormente podremos calcular la concentración de partículas exopoliméri-cas transparentes (CTEP) expresadas como mg de equivalentes de goma dexantano (XG)por litro (mg XG eq L-1):

CTEP = (Amuestra – Ablanco) V-1 F

Donde Amuestra es la absorbancia de la muestra, Ablanco es la absorbanciadel blanco, V el volumen filtrado de muestra y F es el factor de calibración.El factor de calibración F se calcula de la siguiente forma:

F = W x [(A787 – C787) x V-1] -1

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Donde F es el factor de calibración, W es la concentración de la solu-ción de goma de xantano en mg l-1, A787 es la absorbancia del extracto a787 nm, C787 es la absorbancia del blanco y V es el volumen filtrado en l.

Control de calidad

Al inicio de cada grupo de muestras hacer un blanco filtrando agua ul-trapura y tiñendo igual que el resto de las muestras. El valor de absorban-cia (787 nm) de los blancos será sustraído al valor total de la absorbanciade las muestras, para eliminar la capacidad del azul alcian de teñir el filtrovacío. Después de un mes de uso de la solución de azul alcian, prepararotra solución nueva debido a que podría haber perdido parte de su capaci-dad de tinción. El límite de detección del método es de 2.2 mg XG eq l-1 yel coeficiente de variación es de 13 %.

Referencias

ALLDREDGE, A. L., U. PASSOW, B. E. LOGAN. 1993. «The abundance and signifi-cance of a class of large, transparent organic particles in the ocean».Deep-sea Res. I. 40: 1131-1140.

PASSOW, U., A. L. ALLDREDGE. 1995. «A dye-binding assay for the spectropho-tometric measurement of transparent exopolymer particles (TEP)». Lim-nol. Oceanogr. 40: 1326-1335.

Passow, U., A. L. Alldredge. 1994. «Distribution, size and bacterial coloniza-tion of transparent exopolymer particles (TEP) in the ocean». Mar. Ecol.Progr. Ser. 113: 185-198.

Passow, U. 2000. Formation of transparent exopolymer particles, TEP, fromdissolved precursor material. Mar. Ecol. Progr. Ser: 192: 1-11.

Passow, U. 2002a. Production of transparent exopolymer particles (TEP) byphyto– and bacterioplankton. Mar. Ecol. Progr. Ser. 236: 1-12.

Passow, U. 2002b. Transparent exopolymer particles (TEP) in aquatic envi-ronments. Progr. Oceanogr. 55: 287-333.

PASSOW, U., R. F. SHIPE, A. MURRAY, D. K. PAK, M. A. BRZEZINSKI, A. L. ALLDREDGE.2001. «The origin of transparent exopolymer particles (TEP) and their rolein the sedimentation of particulate matter». Cont. Shelf Res. 21: 327-346.

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