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© BRAND GMBH + CO KGPM/LS

Técnicas de Pipeteo y unidad PLT

BRAND GMBH + CO KGI.Q. Verónica Nápoles- Gerente de Ventas América [email protected]


En la actualidad, requerimos de herramientas que nos ayuden a pipetear volúmenes muy pequeños, incluso en el rango de 0,1 a 1.0 microlitro.

Pipetear estos rangos de volúmenes, es una parte esencial de un AMPLIO CAMPO DE APLICACIONES.

Afortunadamente, contamos con una gama extraordinaria de sistemas de pipeteo en el mercado, incluyendo pipetas de cojín de aire y desplazamiento positivo, sistemas manuales y electrónicos, así como micropipetas monocanales multicanales. Pipeteo directo o pipeteo inverso

Sistemas de pipeteo y dosificación


Se entiende como resultado a la consecuencia final de una serie de acciones o eventos, expresados cualitativa o cuantitativamente.

El no alcanzar estos resultados, puede indicar que las acciones son ineficientes o defectuosas.

De ahí la importancia de la disciplina, hábitos y cultura al dar seguimiento a un procedimiento para obtener dichos resultados.


¿Cuál es la mejor alternativa?

¿ material esta en condiciones adecuadas para llevar a cabo mi trabajo?

¿sigo los procedimientos al pie de la letra?


La medición de volúmenes es de importancia esencial en los laboratorios.

1.- El usuario tiene que aclarar con qué exactitud han de efectuarse las mediciones individuales.

2.- El usuario puede elegir el tipo de aparato a utilizar en el caso concreto de medición.

Mediciones exactas exigen aparatos de medición exactos y un manejo correcto.

Medición de volúmenes


• Las Buenas Prácticas de Laboratorio son procedimientos de organización y trabajo, bajo las cuales los estudios se planifican, realizan, controlan, registran e informan.

• Su OBJETIVO: es asegurar la calidad e integridad de todos los datos obtenidos durante un estudio determinado y también reforzar la seguridad.

Promulgadas por OCDE (Organización de Cooperación y Desarrollo Económicos)FDA (Food and Drug Administration)


Buenas Prácticas de Laboratorio

Elemento: Aparatos, materiales y reactivos

Los aparatos deben de ser examinados, limpiados y calibrados periódicamente, siguiendo procedimientos

normalizados de trabajo, para obtener resultados confiables.


Pipetas con cojín de aire

Pipetas de desplazamiento positivo

PipetasPipetas


2. Desplazamiento positivo

El piston tiene contacto directo con el Líquido aspirado. El émbolo movible perfectamente ajustado a los capilares, deja siempre limpias las paredes de losmismos.El desplazamiento directo permite trabajar sin contaminaciones, puesto que no se forman aerosoles

2.

1. Con cojín de aire

No hay contacto directo entre el pistónY el líquido (interfase de aire).Recomendado donde no se permite ningún arrastre, como con medios infecciosos o radioactivos

1.

Pipetas con cojín de aire - Pipetas con cojín de aire - Pipetas de desplazamientoPipetas de desplazamiento


Transferpettor

Pipeta de desplazamiento directo.

Dos diferentes tipos de Transferpettor (digital y fijo)

ideal para líquidos criticos y suspensiones

Donde pipetas con cojín de aire llegan a límites naturales, destaca el valor de la pipeta Transferpettor.

densidad: 13,6 g/cm³ máx. viscosidad: 50 000 mm²/s máx. (dependiendo del tamaño de pipeta) presión de vapor: 500 mbar máx. Rango de temperatura de trabajo permitido: 15 °C a 40 °CLimitaciones de usoLa cristalización de soluciones salinas concentradas yotros líquidos que cristalicen pueden dañar el émbolo.


- Ideal para pipetear líquidos de alta viscosidad y medios de alta densidad (soluciones proteínicas, aceites, resinas, grasas, glicerina, mercurio, ácido sulfúrico).- Medios que tiendan a producir espuma (tensoactivos).- Medios de alta presión de vapor (alcoholes, éter, hidrocarburos).

No es necesario cambiar la punta después de cada pipeteado, ya que el residuo en las paredes de la punta es mínimo.

Transferpettor


HandyStep® S y puntas PD

¡Nuevo!El HandyStep® S y las puntas PD funcionan según el principio de desplazamiento directo.

Es posible dosificar líquidos de alta viscosidad, alta densidad o de alta presión de vapor con máxima precisión. El desplazamiento directo permite trabajar sin contaminaciones, puesto que no se forman aerosoles

Aplicaciones:Ideal para rutina e investigación de diagnósticos, biología molecular, análisis medioambientales, y mucho más.


Settings 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5

Steps 49 32 24 19 15 13 11 10 9

PD-tip ml

Volumen µl

0.1 2 3 4 5 6 7 8 9 100.5 10 15 20 25 30 35 40 45 501 20 30 40 50 60 70 80 90 100

1.25 25 37.5 50 62.5 75 87.5 100 112.5 1252.5 50 75 100 125 150 175 200 225 2505 100 150 200 250 300 350 400 450 500

10 200 300 400 500 600 700 800 900 100012.5 250 375 500 625 750 875 1000 1125 125025 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 250050 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000

Tabla de volúmenes Handy Step S


Dosificación (DISP) Modo estándar Una vez aspirado el líquido, éste se dosifica repetidas veces en volúmenes parciales definidos antes por el usuario

Dosificación automática (AUTO-DISP) El aparato calcula el valor medio de los intervalos entre tres pasos de dosificación y sigue trabajando automáticamente con este ritmo: ¡función patentada de aprendizaje!

Pipeteado (PIP) Se trabaja de igual manera que con una pipeta de desplazamiento directo. Ideal para pipetear líquidos viscosos o volátiles.

HandyStep® electrónico


Pipetas de cojín de airePipetas de cojín de aire


Modelos de Micropipetas con cojín de aire


Operación de una micropipeta de cojín de aire

Posición de descanso

1er tope

1er tope

2do tope

El pistón se mueve para abajo

El pistón se mueve para abajo

Soplar

Posición de descanso

Presionar tecla de expulsión

Expulsor de puntas se mueve hacia abajo

¡No colocar nunca el aparato con la punta llena en posición horizontal! Ya que introduciría el liquido en el interior del mismo y puede contaminarlo.


Técnicas de pipeteo directo

a) Presionar el botón de pipeteado hasta el primer tope. Sumergir la punta 2-3 mm en el líquido. Aspirar el líquido soltando el botón lentamente.

b). Dispensar el líquido presionando el botón de pipeteado hasta el segundo tope. La punta debe tener contacto con la pared del recipiente.

Se recomienda su uso para:Soluciones estándar como: agua, buffer, soluciones alcalinas diluidas y ácidos y bases diluidos.

Gamma de ajuste Profundidad de inmersión en mm 0,1 μl - 1 μl 1 – 2 mm > 1 μl - 100 μl 2 - 3 mm > 100 μl - 1000 μl 2 - 4 mm > 1000 μl 3 - 6 mm


a) Presionar el botón de pipeteado hasta el segundo tope. Sumergir la punta 2-3 mm en el líquido. Aspirar el líquido soltando el boton. Se aspira un volumen mayor al mostrado en el indicador de volumen.

b) Presionar el botón hasta el primer tope. Queda líquido en la punta.

Técnicas de pipeteo inverso

Se recomienda su uso para: soluciones viscosas, soluciones con una elevada presión de vapor.

Al suministrar líquidos con alta presión de vapor es preferible utilizar un sistema de desplazamiento directo en lugar de pipeteo inverso


Puntos importantes

El líquido debe ser aspirado lento y suavemente.

Presionar el primer tope siempre con la misma fuerza

Cuando el líquido sea aspirando, la punta debe sumergirse solo unos mm

igualdad de temperatura de la pipeta y del líquido

sostener la pipeta verticalmente al aspirar

usar puntas originales o adecuadas para la micropipeta

humedecer las puntas 5 veces


¿ En que casos podemos utilizar una micropipeta electrónica?

Se obtiene mayor precición ya que el primer tope es siempre igual

Reducción de fuerzasFuerza requerida para colocar la punta.Fuerzas para aspirar y dispensar el líquidoFuerza para soplar Fuerza requerida para expulsar la punta

En Biotecnología por:Reducción en el volumen de la muestraIncremento en el número de muestras procesadas

Trabajo con diversas técnicas de dosificación


Pipetear (Modo PIP) Se aspira un volumen ajustado previamente y se vuelve a soltar

Mezclar muestras (Modo PIPmix) Programa para mezclar líquidos. Una muestra se aspira y expulsa repetidamente y aparece en el display el número de ciclos.

Pipeteado inverso (Modo revPIP) Programa especial para pipetear líquidos de gran viscosidad, alta presión de vapor o medios espumosos.

Pipetear en electroforesis (Modo GEL) Programa para cargar geles en electroforesis. Un volumen de muestra variable se aspira a una gran velocidad modificable y se vuelve a soltar muy lentamente.

Dispensar (Modo DISP) Programa para dispensar líquidos. Un volumen aspirado se vuelve a soltar parcialmente en pasos.

Micropipetas electrónicas


Influencia en el ángulo de inclinación

Ejemplo:

Para una pipeta 100 µl con un ángulo de inclinación 60°

-> DV = + 0,53 µl (teoréticamente)

+ 0,54 µl (experimento)


El volumen disminuye a causa de la evaporación. Cuanto más pequeña la humedad relativa más líquido pasa a la fase vapor.

El volumen disminuye según la expansión térmica del cojín de aire.Ejemplo: Vástago arriba caliente y abajo frío – al aspirar el líquido el cojin de aire se mueve desde una región fría a una región caliente y se expande.

Factores de influencia generales

Evaporación Temperatura


4 pipetas diferentes de 200 µl (A – D)

Puntas originales (A, B, C, D) – y de otros fabricantes (X, Y, Z)

falta de hermeticidad

Influencia en el uso de puntas diferentes

Vo

lum

en

de

spe

did

o

Tipo de pipeta


Calidad de las puntas

1. Igualdad de lote a lote

2. Hermeticidad del sistema punta/pipeta

3. Calidad de la superficie

4. Calidad de la materia prima

5. Influencia de los aditivos en la materia prima

rebadas


Puntas de Pipeta

Para los laboratorios es crucial que las puntas que se utilizan para transferir muestras líquidas no generen datos que resulten ser falsos positivos o falsos negativos.

Hay una regla muy sencilla en cuanto a las técnicas de manipulación de líquidos para evitar la contaminación cruzada de un experimento a otro.

Usar puntas nuevas para cada muestra, control o reactivo. NO RECICLAR.

Utilice puntas con filtro para eliminar la posibilidad de que los aerosoles con contaminante, traspasen la punta y se introduzcan en el cuerpo de la pipeta.


Puntas de Pipeta

Rangonano-cap™ 0.1 - 20 µlPunta cristal 0.5 - 20 µlPunta neutra 1.0 – 50 µlPunta amarilla 2.0 - 200 µlPunta neutra 5.0 - 300 µlPunta azul 50 - 1000 µlPunta neutra 500 - 5000

µlPunta neutra 1000 -10000

µl


Puntas de pipeta con filtro Autoclavable

Para el empleo en la técnica PCR y para el trabajo en los campos de la microbiología y la radioactividad.

Filtro de PE-hidrofóbo que funciona como una barrera contra aerosoles que se forman durante el pipeteado.

Protegen los vástagos contra la contaminación.

Esterilizables en autoclave.


Tip-Rack S Tip-Stack Tip-Box N esteril

•La esterilización se realiza con rayos B y cumple con la norma ISO 11137•La esterilidad corresponde con las exigencias de Ph Eur y USP25.•La concentración de endotoxinas es inferior a 0,01 I.E./ml


• Todas las puntas y puntas con filtro de hasta 1.000 µl son:

libres de ADN Libres de Rnasa

Libre de endotoxinasLibre ATP

Productos BIO-CERT ® también son estériles.


Puntas de baja retención Puntas y puntas con filtro

¡Más hidrófobas que PTFE!


Comparación de líquidos residuales en puntas BRAND estándar y puntas de baja retención con diferentes líquidos (puntas de 200 µl utilizadas en una Transferpette S)



Comparción de líquido residual en puntas estandar BRAND y puntas de baja retención (liquido 60 % glicerina)



Contaminación

Tenemos 3 fuentes principales de contaminación en nuestro sistema micropipeta-punta:

De la micropipeta a la muestra

De la muestra a la micropipeta

De muestra a muestra

Contaminación vía aerosol


Limpieza y descontaminación

Autoclavable a 121 °C (2 bares) y con un tiempo de exposición de como mínimo 15 minutos según DIN EN 285.

Las micropipetas totalmente autoclavables deben:

autoclavarse sin puntafijar el control de volumen en un punto fijo, nunca entre 2 volumenesCon el protector de cambio de volumen totalmente desbloqueado (UNLOCK). Dejar que la micropipeta se enfrie y seque completamente Después del autoclavado apretar la conexión roscada entre la empuñadura y el vástago de la pipeta.


volumen lectura balanza reproducibilidad

0,1 hasta 10 µl 0,000001 g ± 0,003 mg

20 hasta 30 µl 0,00001 g ± 0,03 mg

50 hasta 250 µl 0,00001 g ± 0,02 mg

300 hasta 1000 µl 0,0001 g ± 0,1 mg

2 hasta 10 ml 0,0001 g ± 0,1 mg

20 hasta 300 ml 0,001 g ± 1 mg

500 hasta 1000 ml 0,01 g ± 10 mg

2000 hasta 5000 ml 0,01 g ± 50 mg

10 000 ml 0,1 g ± 100 mg

Balanzas


volumen nominal [µl]

E [<= ± %] CV [<= %]

1 5 510 1,2 0,820 1 150 1 0,4

100 0,8 0,3200 0,8 0,3500 0,8 0,3

1000 0,8 0,35000 0,6 0,3

Tolerancias ISO 8655


Volumen a verificar.

1. Volumen nominal

2. 50% del volumen nominal

3. 10 % del volumen nominal

• 10 mediciones•

ISO 8655


Calibración de pipetas

Condiciones de ensayo•Identificación de la pipeta•Igualdad de temperatura•Temperatura entre 15°C y 30°C•Temperatura constante ± 0,5°C•Termómetro ± 0,5°C•Balanza con una precisión diez veces mejor que la tolerancia de la pipeta•Humedad mayor de 50%

Calibración1. Acondicionar la pipeta2. Usar una punta nueva3. Tarar el recipiente de pesar4. Humedecer la punta una

vez5. Aspirar el agua sujetando

la pipeta verticalmente y sumergiendo la punta 2 - 3 mm

6. Escurrir la pipeta a lo largo de 8 - 10 mm en la

pared del recipiente7. Repetir 9 veces.Ensayo en 100%, 50 %; 10 %

Evaluación y documentación


- Usar puntas originales o puntas comprobadas (examinación de la hermeticidad)

- Acoplar la punta girándola

- Al trabajar con volumenes pequeños esperar 10 s después de acoplar la punta

- Tiempo de espera: 1 s

Calibración


42

Faktor Z [µl/mg]


Que tan frecuentemente verificamos los instrumentos de medición?

Los instrumentos de medición deben ser verificados en intervalos de tiempo regulares.

Nosotros recomendamos entre 3 y 12 meses para instrumentos de manejo de líquidos.

Control de medios de análisis :

La frecuencia depende según la ISO 10012 del tiempo de uso y de la intensidad de uso.

La periodicidad debe de adaptarse a las exigencias

individuales.


Los aparatos deben de ser examinados, limpiados y calibrados periódicamente, siguiendo procedimientos normalizados de trabajo .

La frecuencia para la calibración, revalidación y prueba, depende del instrumento en sí, de las recomendaciones de los fabricantes , de la experiencia del laboratorio y de la frecuencia de uso del aparato.

BPL


Cada certificado representa el RESULTADO de una calibración unicamente a un tiempo específico

pero….


• ¿La mayoria de las pipetas, independientemente del fabricante, fallan con el paso del tiempo?

• ~ 95 % de las fallas estan relacionadas al goteo del sistema de pipeteado, que conduce a la aspiración de volumenes menores!

• Ajustar la pipeta no resuelve el problema!

• Las fallas generalmente ocurren entre los intervalos de calibración.

Sabía Ud.?


Fallas típicas de las pipetas de cojín de aire

Sabía Ud.?


Resultados cuestionables.

Perdida de tiempo para identificar la causa del error durante la calibración y el rechazo de la pipeta al terminar la calibración.

Selección de intervalos cortos de calibración para asegurar el buen funcionamiento de las pipetas

Incremento de los costos, debido a los intervalos cortos de calibración.

Fugas no detectadas o dificiles de detectar:


Qué es la unidad PLT ?

PLT significa Pipette Leak Testing unit.

La unidad PLT de BRAND es el aparato verificador de sellado de pipetas de cojín de aire, que detecta las fugas más pequeñas en pocos segundos.

Después de generar un vacío, se mide el aumento de presión dentro de un período de tiempo. El cambio de presión en ese intervalo de tiempo, lleva a una taza de fuga, la tasa de fuga corresponde a un determinado volumen.


La unidad PLT no reemplaza la prueba gravimetrica periódica, pero asegura los períodos entre las calibraciones, mediante el control diario de las pipetas.

El aparato detecta incluso las fugas más pequeñas.

De esta forma, la seguridad operativa de las pipetas mejora decisivamente.

Unidad PLT


¿Verificación CON o SIN punta de pipeta?

Para verificar todo el sistema de pipeteado (completo), recomendamos realizar la prueba CON punta Y QUE ÉSTA SEA NUEVA .

Cuando una fuga ha sido identificada, la prueba se vuelve a realizar SIN la punta para determinar en que parte está localizada la fuga (en la zona de acoplamiento de la punta o en la punta misma)

¿Con o sin puntas?


Adaptadormonocanal

Pantalla

Tecla retroceder

Tecla de inicio/confirmación

Botón de ajuste

Indicador LED

tapón

Unidad PLT


Adaptadores

Adaptador monocanalPara pipetas con punta

Adaptador monocanal para pipetas sin punta

Adaptador multicanal para pipetas con y sin punta

Filtro PE en adaptadores mono y multicanal (para proteger el aparato contra humedad o suciedad).


Resultados

Los valores límite para la verificación , representan un límite de advertencia! • Los límites de advertencia de todas las pipetas se almacenan.

Si el límite de advertencia es alcanzado (La pantalla muestra FALLA y hay una luz roja parpadenate, el volumen faltante es detectable gravimetricamente.

Este es el caso a partir de ¼ de tolerancia de volumen según la ISO 8655-2

Cuando la pipeta esta limpia, mecanicamente libre de error y pasa la prueba en la unidad PLT significa que el aparato esta dentro de las tolerancias de la norma ISO 8655-2.

Límite


Resultados

a) La barra ha sido completada en su totalidad hasta abajo: La pipeta es hermética

b) La barra ha sido completada desde arriba, sólo hasta el sector de la marca de valor límite. Recomendamos realizar un ensayo gravimétrico.

c) El llenado de la barra finaliza claramente por arriba de la marca de valor límite: La pipeta no es hermética. Debe hacerse un ensayo gravimétrico, y de ser necesario, la pipeta se debe enviar a reparación.


Bibliografia

1.- www.brand.de2.- Catálogo Brand 8003.- http://www.onarc


Página web Brand


Descargas y soporte


Conclusiones

2.- Teniendo conocimiento de las alternativas de instrumentos así como las herramientas disponibles en el mercado, puedo realizar implementaciones y áreas de mejora en mi laboratorio.

1.- La calidad de los resultados de análisis, a través de micropipetas de cojín de aire, dependen en gran medida de: El aparato o instrumento adecuado. Optimas condiciones del aparato o instrumento. Excelente manipulación. Excelente lectura del instrumento o aparato. De la disciplina, hábitos y cultura del usuario.


Muchas gracias porSu atención!

© brand gmbh + co kg pm/ls técnicas de pipeteo y unidad plt brand gmbh + co kg i.q. verónica...

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