yogurt light

YOGURT LIGHT

ESPECIFICACIONES DEL PRODUCTO

Descripción

Es un producto lácteo, acidificado por acción biológica de bacterias lácticas específicas (Lactobacillus acidophillus y

Streptococcus thermophillus). Es elaborado con leche descremada controlada y seleccionada, estabilizantes (440 /

1400), colorantes (120 / 160b), edulcorantes (951 y 950). La mezcla es sometida a tratamientos térmicos y de

homogenización, para después inocular el cultivo láctico específico, posteriormente el producto es envasado bajo

rigurosos controles de calidad e higiene. Los sabores que presenta son Durazno y Frutilla.

Uso

Producto de consumo directo, como postre o acompañado por cereales y todas aquellas preparaciones que requieran

alimentos con bajas calorías, no requiere tratamiento especial para su consumo. Destinado especialmente para jóvenes y

adultos que requieran alimentos con bajas calorías.

Conservar el producto siempre en refrigeración de 2° C a 8° C.

Información Nutricional Promedio por 200 gramos

Nutriente Unidad Cantidad

Aporte energético kcal 88,8

Carbohidratos totales g 12,6

Proteínas g 6,0

Grasa total g 1,6

Vitamina A Ul 800,0

Vitamina D Ul 100,0

Vitamina E mg 6,6

Calcio mg 232,0

Fósforo mg 204,0

ESPECIFICACIONES DE ENTREGA

Características del Envase

El producto esta envasado en botellas de alta densidad, el envase presenta dos tapas para otorgarle hermeticidad al

producto, la primera de aluminio y polietileno y la segunda de polipropileno, todos los materiales de primer uso y grado

alimenticio. La capacidad del envase es para 1 kg de producto.

Almacenamiento y Vida Útil

El producto debe almacenarse en lugares limpios.

Debe mantenerse refrigerado de 2° C o 8° C. No romper la cadena de frío.

Existe el riesgo de que el producto absorba vapores, mantener separado de productos que emitan olores o

vapores fuertes.

El producto debe ser protegido de la lluvia, la humedad y las altas temperaturas,

La acción directa de la luz solar.

Bajo estas condiciones de almacenamiento el producto tiene un tiempo de vida útil de 60 días.

Determinación de proteínas

Procedimiento para determinar proteínas por el Método de Kjeldahl-Gunning en yogurt

1. REACTIVOS Y MATERIALES

1.1. Ácido sulfúrico (H2SO4)

1.2. Sulfato de cobre (CuSO4.5H2O)

1.3. Granalla de zinc

1.4. Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4)

1.5. Ácido Bórico (H3BO4) al 4% en agua.

1.6. Solución concentrada de hidróxido de sodio (NaOH) 1:1 m/v

1.7. Ácido clorhídrico (HC1) 0.1N

1.8. Indicador de Wesslow

1.9. a) Rojo de metileno al 0.2% en una mezcla de 60 cm3 de alcohol etílico y 40 cm3 de agua.

1.10. b) Azul de metileno al 0.2% en agua destilada.

Mezclar dos partes de (a) y una parte de (b).

Matraz de Kjeldahl de 800 cm3

Matraz Erlenmeyer de 500 cm3

Bureta de 50 cm3

Pipetas volumétricas de 5 cm3

Probeta

Cuerpos de ebullición

Material común de laboratorio

2. APARATOS E INSTRUMENTOS

-Balanza analítica de sensibilidad de 0.1 mg.

-Digestor-Destilador de Kjeldahl.

3. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Antes de proceder al análisis homogeneizar el yogurt por agitación e inversión repetida del recipiente que la

contiene, evitando la formación de espuma.

4. PROCEDIMIENTO

4.1.Medir con una pipeta volumétrica 5 cm3 de muestra y colocarlos en un matraz de Kjeldahl.

4.2.Agregar 2 g de sulfato de cobre, 10 g de sulfato de sodio anhidro, 25 cm3 de ácido sulfúrico y cuerpos de

ebullición.

4.3.Colocar el matraz en el digestor y calentar cuidadosamente a baja temperatura, hasta que todo el material

esté carbonizado; aumentar gradualmente la temperatura hasta que el contenido del matraz esté

completamente claro, dejar 15 minutos más y enfriar.

4.4.Agregar 400 cm3 de agua destilada para disolver completamente el residuo del matraz y enfriar.

4.5.Conectar al destilador un matraz Erlenmeyer de 500 cm3, que contenga 50 cm3 de ácido bórico y unas gotas

del indicador de Wesslow, la parte terminal del tubo del destilador debe estar dentro del ácido.

4.6.Agregar 6-7 granallas de zinc; estratificando y sin agitar agregar 50 cm3 de solución de hidróxido de sodio,

colocar el matraz en el destilador y agitar.

4.7.Destilar hasta aproximadamente 300 cm3.

4.8.Retirar el matraz y titular con ácido clorhídrico 0.1N

5. CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

g/1 de proteína = V x N x 0.014 x 1000 x 6.38M

En donde:

V = cm3 de ácido clorhídrico 0.1N requeridos en la titulación

N = Normalidad del ácido clorhídrico

0.014 = Mili equivalentes del nitrógeno

M = cm3 de muestra

6.38 = Factor para convertir nitrógeno a proteínas de la leche

6. BIBLIOGRAFÍA

a) Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical. AOAC 14thEdition 1984, pag. 282

(16.036).

b) Control Físico-Químico de leche pasteurizada. Series manuales técnicos. Dirección General de Epidemiología.

Laboratorio Nacional de Salud Pública. 1988.

c) NMX-Z-13. Guía para la Redacción, Estructuración y Presentación de las Normas Mexicanas. Dirección

General de Normas. SECOFI, México, 1977.

DETERMINACIÓN DE GRASAS TOTALES

METODO DE GERBER

Separar, mediante acidificación y centrifugación, la materia grasa contenida en el yogurt analizado, y determinar el

contenido de grasa mediante lectura directa en un butirómetro estandarizado

1. Instrumentos

1.1 Pipeta aforada de 10 cm3, de seguridad, para ácido sulfúrico,

1.2 Pipeta aforada de 1 cm3, para alcohol amílico.

1.3 Pipeta aforada de 10,94 cm3, para medir la muestra.

1.4 Butirómetros Gerber, para leche y derivados

1.5 Centrífuga, con velocidad de 1100 ± 100 r/min.

1.6 Baño de agua, con regulador de temperatura, ajustado a 65° ± 2° C.

1.7 Baño María.

2. Reactivos

2.1 Ácido sulfúrico, concentrado para análisis, con densidad 1,815 ± 0,003 g/cm3 a 20°C.

2.2 Alcohol amílico, compuesto principalmente de 3-metil-butanol y 2-metil-butanol y prácticamente exento de

alcoholes amílicos secundarios o terciarios y furfural; deberá tener una densidad de 0,811 ± 0,002 g/cm3 a

20°C.

2.3 Agua destilada.

3. Preparación de la muestra

3.1 Llevar la muestra a una temperatura de aproximadamente 20°C, y rnezclarla mediante agitación suave hasta

que esté homogénea, cuidando que no haya separación de grasa por efecto de la agitación

3.2 Si se forman grumos de crema y éstos no se dispersan, calentar la muestra en baño María hasta 35°- 40°C,

mezclando cuidadosamente e incorporando cualquier partícula de crema adherida al recipiente, y enfriar

rápidamente hasta 18°-20°C. Si quedan partículas blancas o grumos de grasa adheridos a las paredes del

recipiente, la determinación no dará resultados exactos.

4. Procedimiento

4.1 Para la determinación del contenido de grasa en el yogurt ) debe usarse el butirómetro Gerber para yogurt.

4.2 Verter 10 cm3, exactamente medidos, de ácido sulfúrico en el butirómetro respectivo, cuidando de no

humedecer con ácido el cuello del butirómetro.

4.3 Invertir lentamente, tres o cuatro veces, la botella que contiene la muestra preparada, y pipetear 10,94 cm3

de yogurt, de tal manera que el borde inferior del menisco coincida con la línea de calibración de la pipeta

después de limpiar con papel absorbente la parte exterior de su punta de descarga. Luego, sosteniendo la

pipeta con su punta pegada al borde inferior del cuello del butirómetro, descargar cuidadosamente la leche

en el mismo hasta que el menisco se detenga, dejar transcurrir 3 segundos y frotar la punta de la pipeta

contra la base del cuello del butirómetro.

4.4 Verter 1cm3, exactamente medido, de alcohol amílico en el butirómetro, cuidando de no humedecer con el

alcohol el cuello del butirómetro, El alcohol amílico debe añadirse siempre después de la leche.

4.5 Tapar herméticamente el cuello del butirómetro y agitar en una vitrina de protección, invirtiendo lentamente al

butirómetro dos o tres veces durante la operación, hasta que no aparezcan partículas blancas.

Inmediatamente después de la agitación, centrifugar el butirómetro con su tapa colocada hacia afuera. Si no

hay un número suficiente de butirómetros para llenar completamente la centrífuga, colocarlos

simétricamente, equilibrándolos con uno que contenga igual volumen de agua en caso de ser necesario. Una

vez que la centrífuga alcanza la velocidad necesaria, continuar la centrifugación durante un tiempo no menor

de 4 min. ni mayor de 5 min, a tal velocidad.

4.6 Retirar el butirómetro de la centrífuga y colocarlo, con la tapa hacia abajo, en el baño de agua a 65° durante

un tiempo no menor de 4 min ni mayor de 10 min, manteniendo la columna de grasa completamente

sumergida en el agua.

4.7 Realizar una primera lectura de acuerdo Luego, ajustar la tapa si es necesario e, inmediatamente. Repetir

por segunda vez la centrifugación, el calentamiento a 65° ± 2°C y la lectura. Si la segunda lectura difiere de

la primera, repetir por tercera vez la centrifugación, el calentamiento a 65° ± 2°C y la lectura; la medida válida

corresponde a la segunda o tercera lectura

4.8 Instrucciones adicionales. Si existe formación de una capa esponjosa o no definida en la base de la columna

de grasa, debe repetirse el ensayo teniendo cuidado de añadir el volumen correcto de alcohol amílico y de

disolver completamente cualquier partícula del yogurt. Si la columna de grasa presenta una coloración muy

obscura que dificulta la lectura, o hay carbonización en la interface, debe repetirse el ensayo luego de

verificar la densidad del ácido sulfúrico, El butirómetro debe lavarse perfectamente al final de la operación

METODO DE RÖSE – GOTTLIEB

Extraer con éter dietílico y éter de petróleo la grasa contenida en una solución etanólica amoniacal de yogurt; evaporar

los solventes y pesar el residuo

1. Instrumentos

1.1 Balanza analítica. Sensible al 0,1 mg.

1.2Centrífuga, provista con motor trifásico, apropiada para colocar los tubos de extracción y capaz de mantener

una velocidad de 550 ± 50 r/min. El uso de la centrífuga es opcional.

1.3 Estufa, con ventilación y regulador de temperatura, ajustada a 102° ± 2°C, o estufa al vacío, ajustada a una

temperatura de 70° a 75°C y presión menor de 66 kPa, (50 mm Hg).

1.4Matraces Erlenmeyer, de 150 a 250 cm3 de capacidad.

1.5 Tubos o matraces de extracción. Pueden usarse tubos de Rohring o matraces de Mojonnier, con tapones

herméticos de vidrio esmerilado, neopreno u otro material que no sea afectado por los solventes usados.

1.6Material para facilitar la ebullición, exento de grasa, no poroso, Pueden usarse perlas de vidrio o de otro

material adecuado.

1.7Desecador, con cloruro de calcio anhidro u otro deshidratante adecuado.

1.8 Baño María.

2. Reactivos

2.1 Solución al 25 % de amoníaco, con densidad aproximada de 0,91 g/cm3 a 20°C.

2.2 Alcohol Etílico. Solución al 94-97 % (V/V).

2.3 Éter di etílico, exento de peróxido

2.4 Éter de petróleo, con cualquier intervalo de destilación comprendido entre 30° y 60°C.

3. Preparación de la muestra

3.1 Llevar la muestra a una temperatura de aproximadamente 20°C y mezclarla mediante agitación suave hasta

que esté homogénea, cuidando que no haya separación de grasa por efectos de la agitación.

3.2 Si se forman grumos de crema y éstos no se dispersan, calentar la muestra en baño María hasta 35°-40°C,

mezclando cuidadosamente e incorporando cualquier partícula de crema adherida al recipiente, y enfriarla

rápidamente hasta 18°-20°C. Si quedan partículas o grumos de grasa adheridos a las paredes del recipiente,

la determinación no dará resultados exactos.

4. Procedimiento

4.1 La determinación debe realizarse por duplicado sobre la misma muestra preparada

4.2 Secar un matraz Erlenmeyer (que puede contener, si se desea, el material para facilitar la ebullición) en la

estufa durante 30 a 60 min. Dejarlo enfriar en el desecador y pesarlo con aproximación a 0,1 mg.

4.3 Invertir lentamente, tres o cuatro veces, la botella que contiene la muestra preparada e, inmediatamente,

transferir al matraz o tubo de extracción y pesar con aproximación a 0,1 mg, de 10 a 11 g de muestra.

4.4 Agregar a la porción de ensayo 1,5 cm3 de solución al 25 % de amoníaco y mezclar completamente. Agregar

10 cm3 de alcohol etílico y agitar el contenido del matraz o tubo de extracción, manteniéndolo abierto.

4.5 Añadir 25 cm3 de éter dietílico y, después de cerrar el matraz o tubo de extracción con el tapón humedecido,

mezclar el contenido agitándolo enérgicamente e invirtiéndolo repetidamente durante 1 minuto; si es

necesario enfriar en corriente de agua. Quitar cuidadosamente el tapón y agregar 25 cm3 de éter de

petróleo, empleando parte de colocar nuevamente el tapón y mezclar el contenido agitándolo e invirtiéndolo

repetidamente durante 30 segundos. No debe agitarse enérgicamente si no se usa centrífuga.

4.6Dejar en reposo el matraz o tubo de extracción hasta que la capa superior etérea llegue a separarse

totalmente de la capa acuosa quedando completamente límpida. Puede acelerarse la separación mediante el

uso de una centrífuga adecuada.

4.7Quitar cuidadosamente el tapón y enjuagar con unos pocos mililitros de éter de petróleo el interior del cuello

del matraz o tubo de extracción. Transferir lo más completamente posible, mediante decantación o con

ayuda de un sifón, la capa superior etérea al matraz Erlenmeyer tarado, teniendo cuidado de no arrastrar

ninguna porción de capa acuosa. A continuación, enjuagar el tapón del matraz o tubo de extracción y el sifón

con una pequeña porción de éter de petróleo, incorporando esta porción al contenido del matraz Erlenmeyer.

4.8Repetir la extracción dos veces más siguiendo el procedimiento indicado pero usando cada vez 15 cm3 de

éter dietílico y 15 cm3 de éter de petróleo y omitiendo el enjuague final en la última extracción.

4.9 Evaporar o destilar cuidadosamente los solventes contenidos en el matraz Erlenmeyer y secar el residuo en

la estufa durante una hora, colocando el matraz en posición horizontal.

4.10 Dejar enfriar el matraz Erlenmeyer en el desecador, pesarlo con aproximación a 0,1rng. Repetir el

calentamiento por períodos, de 30 a 60 min, enfriando y pesando hasta que no haya disminución en la masa.

4.11 Agregar 15 a 25 cm3 de éter de petróleo para verificar si el material extraído es completamente soluble.

Calentar suavemente y agitar hasta que toda la grasa se haya disuelto. Si el material extraído es

completamente soluble en el éter de petróleo, la masa de grasa es la diferencia entre la masa final del

matraz con el extracto y la masa original del matraz vacío

4.12 Si el material extraído no es completamente soluble en el éter de petróleo, o en caso de duda y siempre

en caso de discrepancia o litigio extraer la grasa del matraz mediante lavados sucesivos con éter de petróleo

tibio, dejando que el material insoluble se asiente antes de cada decantación. Enjuagar la parte exterior del

cuello del matraz tres veces. Calentar el matraz con el material insoluble durante una hora en la estufa,

colocándolo en posición horizontal. Enfriarlo en el desecador, pesarlo con aproximación a 0,1 mg. La masa

de grasa, en este caso, es la diferencia entre la masa del matraz con el extracto total y la masa del matraz

con el material insoluble.

4.13 Debe realizarse un solo ensayo en blanco sobre 10 cm3 de agua destilada, usando el mismo

instrumental, los mismos reactivos en las mismas cantidades y el mismo procedimiento, en igual forma que

para la muestra. Si la materia extraída excede de 0,5 rng, los reactivos deberán purificarse o desecharse y el

ensayo deberá repetirse.

5. Cálculos

El contenido de grasa en el yogurt se calcula mediante la ecuación siguiente:

G=m1+m2+m3+m4∗100

Siendo:

G = contenido de grasa, en porcentaje de masa.

m = masa de la muestra analizada, en g.

m1 = masa del Erlenmeyer con el extracto, en g.

m2 = masa del Erlenmeyer vacío, o del Erlenmeyer con el material insoluble, en g.

m3 = masa del Erlenmeyer con el extracto resultante en la determinación en blanco, en g

m4 = masa del Erlenmeyer vacío empleado en la determinación en blanco, o del

Erlenmeyer con material insoluble, en g.

Determinación de la vitamina A

1. Vitamina A

La vitamina A se utiliza como un nombre genérico para describir al retinol, sus ésteres y los correspondientes isómeros.

La vitamina A se encuentra principalmente en productos animales tales como leche, crema, mantequilla, queso, huevos,

carne, hígado, riñón y aceite de hígado de bacalao. Por lo general, se encuentra como ésteres de ácidos grasos de

cadena larga pero también se encuentra como retinol. Los alimentos son fortificados normalmente con ésteres de retinol

tales como acetato, palmitato o propionato utilizando formulaciones especiales que mejoran la estabilidad.

a) Fórmulas y propiedades

Fórmula empírica

Retinol C20H30O

(P. molecular 286,5)

Descripción

Retinol: Polvo cristalino amarillo

(P. fusión 62-64°C)

Espectro de absorción

La vitamina A y los correspondientes ésteres muestran un espectro de absorción característico, la posición del pico

máximo depende del solvente; en isopropanol es a 326 nm, en ciclohexano es a 328 nm.

El retinol tiene un coeficiente de extinción (E 1% -1cm ) = 1835 en etanol (5) y de 1826 en n-hexano; este valor es válido

sólo para el solvente mencionado; puede cambiar significativamente con otros solventes.

Estabilidad

El retinol y sus ésteres son rápidamente destruidos por la luz, el oxígeno y los ácidos. Deben almacenarse en frascos

ámbar sellados con gas inerte (por ejemplo: nitrógeno).

Unidades biológicas

Una Unidad Internacional (UI) corresponde a la actividad de 0,344 g de acetato de vitamina A puro cristalino; 0,300 μg de

retinol o 0,550 μg de palmitato de retinol corresponden a 1 UI. 1μg de retinol es equivalente a 3,333 UI de vitamina A.

b) Método

Primeramente, se determinaba la vitamina A mediante una reacción colorimétrica de retinol con tricloruro de antimonio

(reacción de Carr-Price).

El retinol obtenido después de saponificar y extraer los componentes no saponificables tenía que ser purificado utilizando

cromatografía de columna abierta con el fin de eliminar los componentes interferentes. La HPLC se ha convertido en la

actualidad en el método de elección dado que esta técnica acorta considerablemente el procedimiento del análisis y

aumenta la reproducibilidad y exactitud.

Saponificación y extracción

Generalmente 2-10 g de la muestra se saponifican preferentemente bajo nitrógeno utilizando una mezcla de hidróxido de

potasio acuoso, etanol o metanol, agua y con la adición de un antioxidante como ácido ascórbico, pirogalol o BHT. Los

antioxidantes deberían ser agregados a la muestra antes de la adición de la solución de hidróxido de potasio. El Cuadro

1 muestra la proporción de estos reactivos.

El tiempo normal de saponificación es entre 15-45 minutos con temperaturas que fluctúan de 80 a 100°C (reflujo).

La vitamina A es extraída de la solución de saponificación por medio de un solvente adecuado por ejemplo: éter dietílico,

tertbutil metil éter, n-hexano 3 a 4 veces, con volúmenes que fluctúan de 50-150 ml. Los extractos combinados son

lavados a pH neutro con agua (2-4 veces, 50-150 m1).

Evaporación y dilución

Se agregan aproximadamente 2-5mg de BHT (Butil hidroxitolueno) al extracto antes de la evaporación utilizando un

evaporador rotatorio bajo un vacío parcial y a una temperatura que no exceda 50°C Deben tomarse medidas para

remover restos de agua tales como secar con sulfato de sodio, o destilación azeotrópica con etanol o tolueno o el uso de

papel filtro para separación de fases.

El residuo es redisuelto utilizando de preferencia la fase móvil u otro solvente compatible con HPLC de tal modo de

obtener una concentración apropiada para la inyección dentro de la columna de HPLC. Esta la solución final de la

muestra.

HPLC

Principalmente, pueden utilizarse dos modos de cromatografía (fase normal y fase reversa) para la cuantificación de la

vitamina A. El Cuadro 2 muestra dos procedimientos de trabajo a partir de las múltiples posibilidades que existen para

lograr buenas separaciones.

Los estándares y soluciones estándares deberían controlarse espectrométricamente en cuanto a la pureza y la

concentración corregida debería utilizarse para el cálculo.

En algunos de los sistemas cromatográficos, se logra una separación entre el retinol "sólo trans" y el 13-cis retinol. En

estos casos, los resultados deberían informarse como equivalentes de retinol "sólo trans" lo cual es la suma del retinol

"sólo-trans" y el 13-cis retinol después de corregir considerando la menor biopotencia (75% del retinol "sólo-trans"). Es

importante indicar claramente las unidades utilizadas para informar los resultados.

c) Resumen

1. La muestra y el extracto de la muestra deben protegerse de la luz y la oxidación.

2. La saponificación bajo reflujo debería llevarse a cabo preferentemente bajo nitrógeno utilizando antioxidantes.

3. Los antioxidantes (BHT) deben agregarse antes de la evaporación de los solventes bajo un vacío parcial y sin

exceder 50°C.

4. Separar adecuadamente el retinol y sus isómeros de los otros componentes.

5. Control espectrométrico de la pureza del estándar.

6. Informar las unidades relacionadas al resultado.

7. Hacer una referencia a los análisis de carotenoides, dado que algunos tienen actividad de vitamina A tal como el

βcaroteno.

Determinación de la vitamina D

Fórmula empírica

Vitamina D C28H44O


Descripción

Polvos cristalinos blancos a amarillos Punto de fusión


Las vitaminas D D2 y D3 exhiben una absorción máxima a 265 nm en soluciones alcohólicas.

E 1%-lcm vitamina D2 475 (etanol)(9)

vitamina D3 480 (etanol)(9)

Estabilidad

La vitamina D se destruye relativamente rápido por luz, oxígeno y ácidos. Por lo tanto, deben almacenarse bajo nitrógeno

en frascos sellados. Los compuestos cristalinos son relativamente estables al calor, pero tienden a isomerizarse en

solución. El equilibrio de isomerización depende principalmente de la temperatura.

Unidades biológicas

1 Unidad Internacional (UI) de vitamina D se define como la actividad biológica correspondiente a la cantidad de 0,025 μg

de vitamina D2 o D3 puras.

Método

procedimientos de cromatografía de gas que incluían una saponificación, extracción del material no saponificable,

remoción de las interferencias mediante precipitación seguida por una cromatografía en alúmina, Sephadex y Florisil,

luego la conversión de la vitamina D a la isovitamina previa a la formación del derivado trimetilsililado y cromatografía de

gas Saponificación y extracción

la vitamina D es extraída mediante saponificación utilizando una solución alcohólica de hidróxido de potasio seguida de

una extracción del solvente. La determinación de vitamina D en una solución apropiada del extracto de la muestra se

realiza mediante HPLC de fase normal semipreparativa seguida por HPLC de fase reversa analítica. La cromatografía se

monitorea por UV y se logra la identificación de los picos de acuerdo a los tiempos de retención y la cuantificación se

realiza por el método de estándar interno utilizando las áreas o las alturas de los picos.

De 10 a 30g de la muestra se saponifican preferentemente bajo nitrógeno utilizando una mezcla de etanol o metanol,

agua, un antioxidante tal como ácido ascórbico, hidroquinona, pirogalol o BHT e, hidróxido de potasio acuoso. El

antioxidante debería agregarse a la muestra antes de la adición de la solución de hidróxido de potasio necesaria para la

saponificación. Si ha de determinarse vitamina D3, se pipetea una cantidad apropiada de estándar de vitamina D2 en la

solución alcohólica dentro del frasco de saponificación. La cantidad de estándar interno de vitamina D2 agregada deberá

ser similar a la cantidad de vitamina D3 esperada en la muestra y viceversa. En el Cuadro 5, se muestran ejemplos de la

proporción de reactivos utilizados para la saponificación. El tiempo normal de saponificación es de 20-45 minutos con

temperaturas que fluctúan de 80 a 100°C (reflujo).

La vitamina D2 y D3 son extraídas de la mezcla enfriada de saponificación por medio de un solvente adecuado, como éter

dietílico, tertbutil metil éter, n-hexano, éter de petróleo o mezclas, de 3 a 4 veces con volúmenes que fluctúan de 50-150

ml. Los extractos combinados son lavados a pH neutro con agua (2-4 veces, 50-150 ml).


Se agregan aproximadamente 2-5mg de BHT al extracto antes de la evaporación utilizando un evaporador rotatorio bajo

un vacío parcial y a una temperatura que no exceda 50°C. Deben tomarse medidas para remover restos de agua tales

como secar con sulfato de sodio, o destilación azeotrópica con etanol o tolueno o el uso de papel filtro para separación

de fases.

El residuo es redisuelto utilizando de preferencia la fase móvil del sistema HPLC semipreparativo u otro solvente

compatible con HPLC de tal modo de obtener una concentración apropiada para la inyección dentro de la columna de

HPLC.

HPLC

Sistema semipreparativo (fase normal)

Un estándar mixto de vitamina D2 y D3 es cromatografiado en el sistema HPLC semipreparativo y la condiciones

optimizadas de tal manera de obtener con un tiempo de retención reproducible un sólo pico de vitamina D y también

tener una óptima separación de otros componentes que interfieren. Esto permite una recolección precisa de la banda de

la fracción de vitamina D.

Sistema analítico (fase reversa)

Un estándar mixto de vitamina D2 y D3 deberá ser cromatografiado en el sistema analítico de HPLC ajustando las

condiciones cromatográficas hasta que la resolución de la vitamina D2 y D3 esté al menos completada en un 98% y las

vitaminas sean resueltas de todas las interferencias de matriz de los alimentos.

Condiciones y cuantificación de HPLC

Una alícuota del extracto de la muestra concentrada se inyecta en el sistema HPLC semipreparativo y la fracción de la

vitamina D es recogida vía corte de bandas. La ventana de tiempo para el corte de banda debe haberse determinado

previamente utilizando una mezcla estándar de vitamina D y debería ser lo más angosta posible.

La fracción del corte de banda obtenida en la HPLC semipreparativa debe llevarse a sequedad y redisolverse en un

solvente compatible con la fase móvil del sistema analítico de HPLC analítico. Se inyectan alícuotas de la solución

obtenida y se identifican y cuantifican los picos de vitamina D2 y D3 utilizando el método estándar interno. En el Cuadro 6

se presentan las condiciones de los dos sistemas:

Los estándares y soluciones estándares deberían controlarse espectrométrica-mente en cuanto a la pureza y utilizar la

concentración corregida para el cálculo.

Es importante mencionar claramente las unidades utilizadas para informar los resultados, por ejemplo en μg de vitamina

D3/100 g de alimento.

c) Resumen

1. Las condiciones de saponificación para la determinación de la vitamina D2 y D3 son similares a aquellas

utilizadas para la vitamina A o E.

2. Se recomienda la HPLC de fase normal semipreparativa seguida por HPLC de fase reversa analítica.

3. La vitamina D2 debería utilizarse como estándar interno para la determinación de la vitamina D3 y

viceversa para compensar las pérdidas producidas durante la preparación de la muestra.

4. Los estándares deberán examinarse y determinarse espectrométricamente utilizando los correspondientes E 1%-

1cm.

5. Los resultados deberán informarse claramente con las unidades correspondientes.

Determinación de la vitamina E

Vitamina E

La vitamina E que se encuentra en la naturaleza abarca una serie de compuestos denominados tocoferoles y

tocotrienoles. Estos compuestos tienen diferentes actividades biológicas y por lo tanto es importante que sean

cuantificados individualmente si ha de determinarse la actividad biológica de la vitamina E.

a) Fórmula y propiedades

Fórmula empírica

α-tocoferol C29H50O2



α-tocoferol

Max. a 292 nm; mín. a. 255 nm

(etanol)

Acetato de α-tocoferol

Máx. a 284 nm; mín. a. 254 nm

(etanol)

E 1%-lcm en metanol (7) para:

α-tocoferol 76 (292 nm)

β-tocoferol 89 (296 nm)

Y-tocoferol 91(298 nm)

6-tocoferol 87 (298 nm)

Método

reacción de cloruro férrico que se reducía a iones ferrosos, los que forman un complejo de color rojo con ajaMipiridina, o

batofenantrolina (4,7-difenil-1,10-fenantrolina).

reacción denominada Emmerie-Engel en extractos purificados cromatográficamente después de saponificar las muestras

y que era interferida por muchos componentes. Producía complejos más bien inestables y el tiempo de manejo

complicaba el procedimiento, el cual requería mucho trabajo.

Se utilizó la cromatografía de gas por algún tiempo pero muy pronto se reconocieron las ventajas de HPLC, también

considerando la posibilidad de separar simultáneamente a, β, y, y 5-tocoferol con esta técnica que estaba emergiendo.

Saponificación y extracción

El procedimiento más común para la determinación de tocoferoles incluye la saponificación alcalina de las muestras

seguida por la extracción del material no saponificable con un solvente orgánico apropiado. Cualquier éster de a-tocoferol

que pueda haberse agregado como un suplemento a los alimentos será convertido a αt-tocoferol por este procedimiento.

Se saponifica 2-10 g de la muestra preferentemente bajo nitrógeno utilizando una mezcla de etanol o metanol, agua, un

antioxidante tal como el ácido ascórbico, hidroquinona, piro-galol o BHT e hidróxido de potasio acuoso. Los tocoferoles

son muy sensibles al oxígeno en un ambiente alcalino. Por lo tanto, el alcohol y el antioxidante deberían agregarse a la

muestra antes de la adición de la solución de hidróxido de potasio necesario para la saponificación y tiene que tenerse

cuidado en remover todo el oxígeno del recipiente de reacción. A continuación se muestra un ejemplo de la proporción de

estos reactivos. (Cuadro 3)

El tiempo normal de saponificación es de 15-45 minutos con temperaturas que fluctúan de 80 a 100°C (reflujo).

Los tocoferoles son extraídos de la mezcla de saponificación por medio de un solvente adecuado, por ejemplo, éter

dietílico, tertbutil metil éter, n-hexano, 3 a 4 veces con volúmenes que fluctúan de 50-150 ml. Los extractos combinados

son lavados a pH neutro con agua (2-4 veces, 50-150 ml).


Se agregan aproximadamente 2-5mg de BHT al extracto antes de la evaporación utilizando un evaporador rotatorio bajo

un vacío parcial y a una temperatura que no exceda 50°C. Deben tomarse medidas para remover restos de agua tales

como secar con sulfato de sodio, o destilación azeotrópica con etanol o tolueno o el uso de papel filtro para separación

de fases.

El residuo es redisuelto utilizando de preferencia la fase móvil u otro solvente compatible con HPLC de tal modo de

obtener una concentración apropiada para la inyección dentro de la columna de HPLC. Esta la solución final de la

muestra.

HPLC

Principalmente, pueden utilizarse dos modos de cromatografía (fase normal y fase reversa) para la cuantificación de los

tocoferoles. El sistema de fase normal tiene claras ventajas dado que todos los vitámeros son separados mientras que

los sistemas de fase reversa no separan β-tocoferol de y-tocoferol.

La detección se realiza preferentemente mediante fluorescencia debido a su mayor selectividad así como también por los

menores límites de detección obtenidos si se compara con UV. A partir de las múltiples posibilidades para lograr buenas

separaciones, el Cuadro 4 muestra a continuación las condiciones de dos procedimientos de trabajo. Los estándares y

soluciones estándares deberían controlarse espectrométricamente en relación a la pureza y utilizar la concentración

corregida para el cálculo. Es importante mencionar claramente las unidades utilizadas para informar los resultados por

ejemplo, en mg α-tocoferol/100 g de alimento.

c) Resumen

1. Las condiciones de saponificación para la determinación de tocoferoles son similares a aquellas utilizadas para la

vitamina A.

2. Debe tenerse cuidado en evitar el contacto con oxígeno en las soluciones alcalinas.

3. La detección de fluorescencia tiene claras ventajas así como también la cromatografía de fase normal.

4. Los estándares deberían examinarse y determinarse espectrométricamente utilizando el correspondiente E 1%-

lcm

5. Los resultados deberían informarse claramente ya sea como mg de los tocoferoles individuales o como

equivalentes de vitamina E.

Determinación de calcio

Determinación de fosforo

yogurt light

Documents