UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA IZTAPALAPA

CBS I

v & urs r¿0 El presente trabajo f u b m e d e k a d m por:

JACINTO ECHEVARRIA FUENTES ERNESTO FAVELA TORRES

JESUS ANTONIO CORDOVA LOPEZ

TITULO DEL PROYECTO

SERVICIO SOCIAL Y REPORTE ELABORADO POR:

JESUS ANTONIO CORDOVA LOPEZ d-,/

ASESOR: Dr. ERNESTO FAVELA TORRES .

a

AGRADECIMIENTOS:

COMO UN RECONOCIMIENTO A LA PROFESIONALIDAD Y CALIDAD HUMCINA DE ERNESTO.

TE AGRADEZCO POR EL APOYO, EL ESTIMULO, EL RESPETO A MI INDIVIDUALIDAD, LA OPURTUNIDAD.......

ESPECIALMENTE POR PERMITIR Y CONTRIBUIR A LA CONCLUSION DE MI SERVICIO SOCIAL EN TAN BREVE LAPSO DE T I EMPO .

PATENTIZO MI GRATITUD A AGUSTIN Y VICTOR POR LA AMISTAD Y REVISION EN LA PRESENTACION DEL REPORTE.

I ,

INDICE

Pagina i

I Justificacikr

. I1 Objetivos

I11 Objetivos y metas alcanzados

1

2

3

4

5

6

7

8

Actividades realizadas

Introduccibr

Antecedentes

Metodologia

Resultados

Discusiones

Conclusiones

Recomendaciones

Referencias

ApQndice I

Aphdice I1

i

i1

111

1

4

9

23

25

33

35

37

39

48

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JUSTIFICACION

Lars ventajas de la fermentacibn sblida con respecto a los cultivos sumer-gidos han sido puntualizadas por varios autores en la produccidn de: Acid05 citric0 y giberdlico, proteinas, antibidticos y enzimas; encontrandose que su5 principales limitaciones para el escalamiento a nivel industrial son: el control de la humedad y la remocidn de calor metabdl ico.

En affos recientes se ha llegado a la comprensibn de los procesos bioquimicos de los microorganismos involucrados en la fermentacidn scjlida; y sobre este tbpico ha sido abundante la publicacidn de divulgaciones cientificas. Sin embargo, se ha soslayado la investigacidn sobre aspectos bioingenieriles. E5 poca la informacidn que se dispone en la literatura acerca de las interacciones ambientales de humedad, temperatura, pH, aireacidn etc.; y como consecuencia, en 105 estudios relativos a la transferencia de calor.

El diseflo d e nuc?vos procesos para la produccidn de enzimas amdrita esta informacibn y en ese sentido es necessario aunar esfuerzos que conlleven a desarrollar esta at-ea de la biotecnologia.

Los materiales agroindustriales son un excelente sustrato pat-a la fermentacibn en sustrato scilido, siendo fuentes renovables de bajo valor adquisitivo y disponibles en grandes volumenes; que al no set' utilizados representan fuertes problemas ecolbgicos.

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I 1 ! I

OBJETIVOS GENERAWS

1.-Caracterizar las condiciones f isicas en el abastecimiento de aire, para un control eficaz de la temperatura y de la humedad en el transcurso de una fermentacidn sdlida, empleando un bioreactor a nivel semipi loto.

2-Estudiar la transferencia de calor en sistemas de fermentacidn sejlida, utilizando un bioreactor a nivel semipiloto.

Objetivos especificas

1 Disetrar el sistema de aireacibn.

2 Construir el sistema de aireaciejn.

3 Caracterizar la temperatura y humedad del aire que abastece el equipo de aireacibn .

4 Caracterizar el comportamiento del sistema de air-eaciejn en el desarrollo de las fermentaciones srjlidas.

5 Realizar estudios basicos concernientes a la transferencia de calor axial y radia1,y sus repercusiones en el producto en fermentaciones sblidas.

6 Caracterizar las condiciones bajo la5 cuales es m6s eficiente la remocirjn de calor metab6lico en fermentaciones s b l idas aisladas.

I 1 1

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADESS

1.-Se diseffcj e l s i s t e m a de aireacibn.

2.-Se construyb el sistema de aireacibn.

3 . - S e c a r a c t e r i z 6 l a temperatura y humedad d e l a i r e que abastace el equipo de aireacibn.

4 . - Se c a r a c t e r i z b e l comportamiento del sistema de aireacibn en e l d e s a r r o l l o de las fermentaciones sblidas.

5.-Se realizaron estudios basicos concernientes a l a transferencia de c a l o r a x i a l y r a d i a l , y sus repercusiones en el producto de las fermentaciones s6lidas.

6.-Se caracterizaron las condiciones bajo las cuales se ef ic ientizcj la remocibn d e c a l o r metabcjl i c o en fermentaciones sdlidas aisladas.

ACTIVIDADES REALIZADAS

DISEMO, CONSTRUCCION Y CARACTERIZACION DEL SISTEMA DE ACONDICIONAMIENTO DE AIRE

ESTUDIOS BASICOS EN LA TRANSFERENCIA DE CALOR EN FERMENTACIONES DE SUSTRATO SOLIDO.

1

1 INTRODUCCION

1.1 Tipos de fermentacibn

Llentt-o de l contes to de las fermentaciones , estas son clasi f icadas en: Fermentacidn de Sustrato Sdl ido (FSS) y Fermentaci6n en Cult ivo Sumergido (FCS). La principal d i f e r e n c i a en e l l a s e s t r i b a en e l e s t a d o f i s i c o en que e l medio fermentat ivo se presenta (sbl ido o l i q u i d o ) í .

Las ventajas y desventajas c i tadas por Moo-Young e t a l z d e l FSS comparadas con e l c u l t i v o FCS son planteadas a cont inuaci6n.

Ventajas:

- requ iere menor energ fa -reduce e l volumen de l reacto r -p r-oduce concentrados que f ac i 1 i tan su e:.: t racc i 6n -genera escasos ef luentes - t iene rend imientos a l tos

Desventajas:

-existen problemas en l a t r a n s f e r e n c i a de ca lo r y masa - requ iere p ret ratamiento de l sust rato - requ iere mucha mano de obra - requiere una a l ta proporcibn de indculo - a l t a p o s i b i l i d a d de contaminacibn - d i f i c u l t a d en e l c o n t r o l

Un aspecto negativo m25 a considerar es que estos procesos son mds lentos que las fermentaciones l iquidas debido a l a b a r r e r a a d i c i o n a l que c o n f i e r e e l s 6 1 i d o .

Ot ra venta ja es que la fermentacibn na requiere de l a e s t e r i l i z a c i d n d e l m e d i o d e c u l t i v o n i d e l b i o r e a c t o r , n i a h de medidas as&pticass.

l. 2 Conceptos en FSS

La fermentacidn en s u s t r a t o s b l i d o (FSS) 'es e l proceso pot- e l cual los microorganismos crecen en conjunci6n con l a reaccibn de sus enzimas e x t r a c e l u l a r e ~ ~ . Ocurre en sistemas en t o t a l o p a r c i a l a u s e n c i a d e l i q u i d o l i b r e ; en un sus t ra to con humedad apropiada, e l cual est& aparentemente en estado sejlido y e s i n s o l u b l e en aqua6-'.

2

Con una adecuada selecciein del sustrato y de l i nbcu lo (axgnico o mixto), la fermentaci6n puede ser ot- ientada hacia l a s i n t e s i s d e p r o d u c t o s p a r t i c u l a r m e n t e h t i l e s p a r a e l s e r humano=.

Dado que l a a c t i v i d a d b i o l b g i c a c e s a a contenidos ba jos de humedad i n f e r i o r e s a l 12%, este hecho establece el l imi te in fet - io t - en ' l a c u a l l a FSS toma l u g a r . E l l i m i t e s u p e r i o r p a r a l a FSS es una fctncion de la absorbencia de l mate r ia l y por consiguiente del contenido de humedad inherente a cada t i p o de sustrato . Para la mayor ia de los materiales empleados en FSS l o s v a l o r e s en e l conten ido de humedad osci lan a l rededot - de l

Un s i s tema rep resenta t i vo pa ra l a FSS incluye':

* Un sustrato se i l ido e l cual puede o no contener todos los nu t r ien tes requer idos po r e l m ic roorgan ismo pa ra su act iv idad metabbl ica, como es e l caso de una gran variedad de mater iales crudos como e l bagazo de cafia, pulpa de cafg, res iduos c i t t - icos , res iduos de cereales , etc .

* La cantidad de agua s u f i c i e n t e p a r a una ac t i v idad metabeilica rapida, en e l s e n t i d o de que e l c rec imiento no sea l imi tado por e l agua .

,

* Dependiendo del t ipo de proceso puede requerirse de un c u l t i v o a:.:t$nico o de uno mixto-

1.3.Microorganismos utilizados en FSS

Una gran variedad de microot-ganismos son capaces de crecer en sustratos sb l idos, pero so lamente los hongos f i lamentosos pueden hacerlo en ausencia de agua l i b r e ; son por- t a n t o p r e f e r i d o s en los s istemas de FSS. Aunque es conveniente sefialar que en composteo y e l ens i lado c recen a lgunas bacter ias y levaduras a n i v e l e s de humedad de l 40 a l 70%=.

Los hongos usados en FSS son seleccionados en consideracibn a las s igu ien tes ca racte r i s t icas"

- incapacidad para producir compuestos tbxicos. -crecimiento a pH Azido pat-a evitar contaminaciones. - f a c i l i d a d de esporular para la pt -opayacibn del incSculo. -alta produccibn de compuestos de inter&ss.

3

Los hongos con aplicaciones practicas en l a FSS son: Phicomycetes (Mucor y Rh izopus) , Ascomycetes ( A s p e r o i l l u s Y Pen ic i l l um) y Basidiomycetes".

A var ias especies de Mucor.Rhizopus y especialmente AsDercri 1 lus , at r ibuyendoseles una reelevante a p l i c a b i l i d a d " .

1.4.Control de la temperatura durante la FSS

La temperatura es uno de los par6metros mas d i f i c i l e s de controlat- en FSS. Debido a .que dsta es determinante para e l crecimiento microbiano, debe min imizarse las osci laciones a l rededor- de la temperatura bpt ima de crecimiento.

A l p r i n c i p i o d e l c u l t i v o , e l hongo requ ie re de 8 a 12 horas pat-a germinar siempre y cuando se cubran adecuadamente sus necesidades de temperatura, aereacibn, nutrientes y humedad Pr incipalmente. Durante este per iodo, la temperatura debe mantenerse en l a dptima, que e5 dependiente de cada microorganismo, s iendo senci l lo en es ta e tapa e l cont ro l , puesto que no hay contribuciones ,termicas pot- p a r t e d e l hongo . El cont ro l se compl ica p r inc ipa lmente pot- e l c a l o r generado como consecuencia del metabolismo microbiano. Durante la 6 l t ima e tapa , en l a que e l hongo cesa de crecer, e l contro l de nueva cuenta se t o r n a s e n c i l l o . En o t r a s palabr-as, en e l desar ro l l o de l a f e rmentac ibn f 6ng ica se presentan dos eventos' relativos a l a t r a n s f e r e n c i a de c a l o r , e l pt-imer-o re lac ionado con sumin is t ro de ca lor y e l segundo con l a remocibn de calor-.

1-4-Tipos de bioreactores y mecanismos de transferencia de calor en FSS

Los bioreactores en FSS son c las i f i cados como estktticos y dinktmicos, nombre que adoptan dependiendo de si e l m a t e r i a l fer-mentando se encuentra o no en movimiento'.

En reactores estAticos existen dos formas por l a s cuales e l ca lor puede set- t r a n s f e r i d o :

For conveccibn: Consistiendo en un f l u j o de a i r e que pasa a t r a v i s d e l b i o r e a c t o r de fermentacibn, cediendo o aceptando energid, que se traduce en e l e n f r i a m i e n t o o calentamiento del sistema de FSS.

I

4

2.ANTECEDENTES.

2.1 Generalidades de la FSS

Los procesos de FSS con antecedentes hist6ricos mas importantes y remotos son : alimentos fermentados, quesos y composteo=.

Con el advenimiento de la segunda guerra mundial y ante la necesidad imperante de grandes volumenes de antibibticos hace su aparicibn la FCS. De tal forma que en los paises' occidentales la FSS empirica hasta ese momento f u l considerablemente reemplazada por la FCS7.

La justificacibn de que la FCS sea mas practicada, radica en la facilidad del control de las condiciones ambientales.

Pese a lo mencionado, se ha vislumbrado que la FSS puede ser la mejot- opcibn pat-a la obtencibn productos tales como enzimas industriales, tan es asi, que recientemente muchos grupos de investigadores de todo el mundo han canalizado sus esfuerzos hacia la b6squeda de nuevas metodologias, llegando a divulgar y publicat- la informacidn de este tbpicoe.

2.2 Clspectos bioingenieriles en FSS

Lonzanee hizo un diagn6stico que revela la escasez de aportaciones cientificas en el campo bioingeneril de la FSS; asi mismo realizb una importante recopilaci6n de publicaciones donde la bioingenerfa es aplicada y la subdivide en: Eioreactores, monitoreo y control de pat-&metros y automatizacibn de fermentaciones.

2.2.1 Bioreactores

Los bioreactores han sido disefiados en gran medida empiricamente como consecuencia de los austeros datos experimentalmente reproducibles y de la ausencia de sensores adecuados para la FSS. Los bioreactores actualmente disponibles son:

5

a) De tambor- rotatot-io. b)De celda de madera. c)De celda de incubacibn vertical. d)De celda de incubacibn inclinada. e) De bandeja. f ) De canyi lones. g)De tipo miscelaneo. h)De columna.

2.2.2 Control y monitoreo de parametros fisicos

'En la literatura cientifica actual es escasa la informacibn referente al control de los par&imetros fisicos. Es reelevante la informacih en esta sentido para eficientiaar el sistema de FSS.

2.2.2.1 Humedad

El nivel de humedad del sustrato es uno de los factores clave que afectan significativamente el resultado de una FSS y dicho efecto depende de la naturaleza del sustrato, el tipo de producto final y las necesidades del microorganismo. Un nivel alto de humedad tiene como consecuencias: la disminucibn de la porosidad, baja difusidn de oxigeno, incremento en las posibilidades de contaminacibn bacteriana, aumento en la formacicjn de micelio abreo, reduccibn en el volumen del gas, disminucibn del intercambio gaseoso y cambios en la velocidad de degradacibn de la lic~nina"-~-l*. Los bajos niveles de humedad pt-ovocan un crecimiento subbptimo, poca dilatacibn del sustrato y tensibn de agua alta9.

Las p4t-didas de agua en el transcurso de una fermentacidn pueden set- compensadas manteniendo al bioreactot- con una atmbsfera entre un 90 a 97% de humedad relativa. Esto se logra haciendo pasar continuamente aire hQmedo por el bioreactor, o bien, pot- adicidn de agua estCri.1 al sistema en intervalos necesarios para reestablecer la humedad requeridal l. Ademas, la baja humedad del medio establece condiciones dificiles pat-a la transferencia de calor- y e5 m6s compleja a6n, en procesos a CJ ran esta 1 a.

6

2.2.2.2 pH

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A pesat- de que e l pH es uno de l os f ac to res c r i t i co l s , su monitorneo y cont ro l duran te la fe rmentac ibn no es usual en FSS. La buena capacidad de amortiguamiento de algunos sus t ra tos usados en FSS permi te e l im inar la neces idad de un c o n t r o l de pH. Esta ventaja, es por consiguiente aprovechada a l a j u s t a t - i n i c i a l m e n t e

a lcanzar c ie r - to n ive l de 51.a. *x , a l a g r e g a r l e s

O t r a nueva a c i d i f i c a c i b n d e l medio fuente de n i trbgeno una urea en una proporc ibn n i t rbgeno) . Esto ademri\s

2.2.2.3 Airecikr

La a i reac ic jn de l

e l - pH de l os s ib l idos en t re 4.5 y agua previamente a justada para

humec tac i bn.

p ropuesta para con t ra r res tar la de c u l t i v o c o n s i s t e en usar como combinacibn de sa les de amonio y d e l 40 a l 50% ( e n r e l a c i b n a l

es t imu la e l c rec imien to f6ng icoa4.

c u l t i v o t a n t o a n i v e l l a b o r a t o r i o como a gt-an escala se l l e v a a cabo con e l s u m i n i s t r o de a i r e comprimido. Normalmente e l ox igeno requer ido para la ac t i v idad metabb l ica es pt-ovisto por air-e atmosferico, debiendo set- previamente humectado p a r a e v i t a r e l secado.

Las velocidades de a i reac ibn se establecen en r e l a c i b con: e l c a l o r m e t a b b l i c o a remover, e l reque'rimiento de ox igeno por par te de l microorganismo, los datfos a estructuras microbianas, la formacic jn del producto deseado, e l i n te rcamb io de COZ producido en la t -esp i rac ibn microbiana, l a pot-osidad del sustrato, l a compactacicjn d e l material fermentando, e l secado de 105 s b l i d o s y l a economia de 1 p t-oceso.

2.2.2.4 Transferencia de oxigeno

La mayoria de los sistemas de FSS son a i r o b i o s con excepcidn del composteo y algunos de los procesos de produccibn de alimentos fermentados. E l mecanismo de l a t rans fe renc ia de oxigeno es probab lemente s im i la r a l que ocut-re durante l a ferm$ntacion de hidrocarburos*=$- *&, pudiendo ocurrir- directamente de l a f a s e gaseosa y d e l ox igeno d isue l to en e l agua que mantiene hdmedo a l s u s t r a t o s61 ido.

" . . . . - .

7

Se han reportado h ipbtesis re lacionadas con l a d i f i c u l t a d que t iene e l microorganismo pat-a abastecerse de ox iyeno ta les como: Una b a r r e r a d i f u s i v a de l a t r a n s f e r e n c i a de osigeno desde la capa l imite que recubre y humecta a l sust ratos , for-macibn de aglomerados de masas compactas deb ido a l c rec imiento o a l espesor de l sust rato i7 , la masa de los s61 idoss , l a abundancia de agua y la presencia de f inos provenientes del sustrato s61 ido i7 .

2.2.2.5 Agitacidn

La ayitaci6n del material fermentando puede tener e f e c t o s p o s f t i v o s como son: homogeneizar e l medio, o r i e n t a r e l c r e c i m i e n t o en p a r t i c u l a s i n d i v i d u a l e s de sustrato , p reven i r l a f o rmac ibn de agregados, exponer las particulas hac ia l a a tmbs fe ra de l b io reacto r , promover- l a t r a n s f e r e n c i a gaseosa , f ac i l i ta r e l i n tecambio de calor- , prevenir los cambios localizados y una e fect iva d is t t - ibuc ion de l inbcu lo . La velocidad de agitacibn se determina en gran medida pot- l o s mismos factores que r igen la ve loc idad de a i reac i6n .

2.2.2.6 Pretratamiento del sustrato

Los sLtstt-atos s b l i d o s empleados en l a FSS, t a l e s como los ce rea les y subproductos de tlstos, leguminosas, l i ynoce lu losas y almidones; presentan la cat -acter ist ica de estat- conformados por estructuras polim&t-icas insolubles en

est ructuras . Los s u s t r a t o s p o r s i s o l o s o adic ionandoles unos cuantos nutrientes son capaces de proveer todos los nutr ientes aprovechables desde e l punto de v i s ta b ioqu imico pot- e l microorganismo en cuestibns.

aq Ud . Los microorganismos no pueden penetrar estas

El pretr -atamiento quimico o mccln ico del sustrato s d l i d o es usado pat-a mejorar su asequ ib i l i dad en l a modif icaciein microbiana, a l formar moltlculas pet-meables mds pequeffas; c o n f e r i r s i t i o s a c t i v o s s u s c e p t i b l e s a ‘ l x penetraci6n microbiana, impart i r le una estt -uctura mas f i b r o s a ; o causar g e l a t i n i z a c i 6 n e hinchazbn.

Los mecanismos por los cuales los microorganismos obtienen sus n u t r i e n t e s han sido ampliamente investigados en FCS, y no pueden 5et- a p l i c a b l e s a la FSS (por sus d i f e r e n t e s factbres f i s icoqu imicos) , respecto a l o s c u a l e s , l a d i s p o n i b i l i d a d de informaci6n es escasa.

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2.2.2.7 Temperatura

Raimbault (1980) estimd que cerca del 35% del total de los atacares consumidos son dirigidos hacia la respiracidn microbiana, liberando 673 kcal/mol de glucosa. Mientras que los estudios realizados pot- Finger (1976) y Lontane (1985) sePlalan que se libet-an 3200 kcal/kg de materia seca para sistemas de composteo. Este calor generado es consecuencia de la actividad metabdlica y debe set- disipado inmediatamente para evitar que se afecte el crecimiento, la formacidn de producto y la esporulaci6n1e.

MCtodos usados en la remocidn de calor: 1) Suministro de grandes flujos de aire forzado".', 2 ) mantenimiento del bioreactor en un cuarto con temperatura controlada =, 3) circulacidn de agua alrededor del bioreactor e 4 ) inmersidn del bioreactor en un batí0 de agua con temperatura controlada.

El rango de temperaturas frecuentemente empleado en FSS esta entre 25' a 32 O C L - = C D - = ~ ~ = = .

2.2.3 Automatizacikr de fermentaciones

Actualmente no existen articulos de divulgacidn donde se describan los detalles tCcnicos de la automatizacidn, manteniendose en hermeticidad por parte de Japdn y otros paises orientales que van a la vanguardia de esta materia.

2.2.4 Aplicacikr d e la bioingeneria

En su tesis, SaucedoZs realizd investigaciones dandole un matiz bioingeneril, llegando a interesantes propuestas, dentro de las que destaca, un modelo matemitico que al aplicarlo se considera un mecanismo de calor esencialmente conductivo.

2.3 Diagndstico de las FSS

En la actualidad, el interCs de la FSS se ha encausado hacia la produccidn de alimentos enriquecidos con proteina a pat-ti r de sustratos ami laceos, produccidn de cClulas proteicas, entiman y etanol principalmente; a partir de una gran variedad de desperdicios, t-dices y tub&rculos.

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CAPITULO 3. METODOLOGIA Y DESCRIPCION DE EXPERIMENTOS

3.1 DisePlo del sistema de acondicionamiento de a i r e

El sistema montado es una autoclave adaptada, que es esquematizada en l a f i g u r a 3.1 y se diseffib para proporcionar 5 se rv ic io s :

3.1.1 Aire saturado-caliente

aebido a que l a mayoria de l a s FSS requieren de a i r e saturado para evitar el secado del sustrato s ibl ido, se implement6 e l s i s tema de modo que en la se lecc i6n de este set-vicio, todas las v&lvulas permanecian cerradas a exepcicin de '1'.

E l aire pasaba a trav6s de un serpentin donde se precalentaba, este se encontraba conectado a otro serpentin que en e l extremo d i sponia de un dispersor que burbujeaba el a i r e desde el fondo hasta la superf ic ie del l iquido. A l entrar en contacto el a i r e con e l agua, se humidificaba y terminaba de calentarse; pat-a posteriormente s a l i r h a c i a e l bioreactor.

3.1.2 Aire .seco-caliente

El a i re seco es 6 t i l en l a s FSS por la rap idez con que remueve el calor metabblico en forma de humedad. Ademas d.e

'que es deseado que el mismo equipo sea uti l izado para secar un producto de l a fermentacibn.

Fara ta l efecto se cerraban las vAlvulas '1' y t .-b* L , y se abrian '3 ' y ' 4 ' . A l i ng resar e l a i re a l a autoc lave so lo SI permitid BU recorr ido por el pr imer serpentin, de manera que no ex i s t id contacto de l a i re con e l agua, considerandose como a i re ' seco ' a l a i re p roven iente de l medio ambiente.

3.1.3 Mezclas de aire hQmedo y seco

En FSS es importante mantener un control en l a humedad del a i re, en e l que se ev i te secat- o humectar el material que fermenta. Con este propbsito, se mantenian ab iertas todas las v i lvu las , exceptuando l a ' 2 ' .

10

E l aire t iene preferencia pat-a circulat- en el sent ido descr i to en 3.1.2 con respecto al 3.1.2, esto es debido a l a pres idn confer ida por la a ltura del l iquido que debe vencerse.

La relacion a ire seco-aire humedo era regulada por el rot8mett-o, el cual proporcionaba la humedad re l a t i va requerida medida po r e l psict-dmetro ubicado a l a s a l i d a de la autoclave.

3.1.4 Enfriado de la autoclave

Eventualmente se presentan incrementos no deseados en e l i n ter io r de la autoclave como consecuencia de descuidos, pat-a contrat-t-estar ta l efecto se prec i sa de un sistema de enfriamiento.

Fat-a proporcionar el enfriamiento, se abr id parc ia l o completamente l a vd l vu l a ' 2 ' y se alimentaba un f l u jo a l t o a la autoc lave que SR dejaba posteriormente escapar a l a atm6sfet-a.

3.1.5 Entrada de agua

Se cerraba e l f lu jo de a i r e y se abt-ia l a va lvu la '2'.

3.2 Tuberia, accesorios y equipos del sistema

3.2.1 4 la entrada de la autoclave

En orden, se disponia de una v i l v u l a de aguja (regulacibn gruesa del a ire comprimido d i recto) , un t-equlador de a i re ( regulac ibn f ina) , un tramo de manguera de 0.7 i n de di6mett-o, un regulador de aire (adyacente a l a autoclave) y un t-ot6mett-o ( f l u jo medido: de O a 100 l/min)

3.2.2 En la autoclave

Espec i f icac iones de la autoclave: AESA Mod. CV30C) 3 Colores 127 v o l t s C.A. Temp. apt-ox. a 1.5 K. 119 OC 18 Amps. 60 CIC. 2400 watts.

1 1

222185

I n t e r i o r : Se i n s t a l a r o n 2 serpent ines de cobre. Exter ior - : Se f i jat-on: 3 v i l v u l a s d e l t o d o o nada, 1

. vA lvu la de aguja , 4 codos, 3 T, 40 cm de tuber ia , 30 cm de manguera (conectat- r o t a m e t r o ) , r o t a m e t r o ( 6 t i l en un f l u j o de 0 a 30 l / m i n ) . Se emple6 un aislamiento con f ibra de v i d r i o p a r a e v i t a r p e r d i d a s de c a l o r .

3.2.3 A la entrada del bioreactor

A p a r t i r de la autoc lave , se insta laron 1 m de tuberia de 0 . 5 i n . de di6mett-o, 2 codos, 25 cm de manguera (para c o n f e r i t - f l e x i b i l i d a d a l e q u i p o ) , 1 tuerca uni6n (para desprendet- l a a u t o c l a v e d e l b i o r e a c t o r ) , 1 f i l t t - o de coalescencia, 1 man6mett-o (tubo en ' u ' con mercurio) 1 p s i c r d m e t r o d e v i d r i o con dos termopares para l a l e c t u r a de lastemperaturas de bu lbo h6medo y bulbo seco, 1 recept6culo (para condensados formados en l a t u b e r i a ) .

La tuber ia y accesorios fueron ais lados con f i b r a de v i d r i o p a r a e v i t a r p & t - d i d a s de c a l o r .

3.2.4 En el bioreactor

El b ioreactor es const i tu ido por dos mbdulos y dos tapas de acr i l ico , empaques de hule, una placa dispersot-a y An i l l os Rash ing .

Las dimensiones de cada mbdulos fueron: DiAmetro=9.5 cm, a l tu ra=39 cm, como se muestra en l a f i g . 3 .2 . En l a s paredes del m6dulo t iene accesorios donde son introducidos los termopares.

La p laca d ispersora cons is te en una l imina de acero inoxidable de 9 .5 cm de diametr-o con hoyos.

Cuando se ha montado e l b io reactor , se in t roducen anillos Rashing formando una capa de 5 cm de espesor, y encima de l a capa se s i tda la p laca d ispersot -a

E l espac io vac io , ub icado po r a r r i ba de l sus t ra to sb l ido (una vez insta lado dent ro de l b io reactor ) es l lenado con algodbn pet-a ev i ta r escur r im ientos de l o s condensados fot-mados en l a pat-ad de l a columna.

3.2.5 A la salida del bioreactor

Se coloc6 un psicr6mett-o, un tramo de manguera y cm recipiente conteniendo aqua 6cida.

12

3.2.6 Medidor y controlador de temperatura (MCT)

Disefiado y const ru ido en l a UNAM, maneja un rango de temperaturas de O a 200 OC. Se programan sus l imites super io r e i n f e r i o r e n t r e l o s c u a l e s 5 e p e r m i t i r & l a osci lacihn de la temperatura que se precisa constante. Posee dos sa l idas para contro l de la temperatura (suministra y desprovee de energ id e lect r ica ) . T iene una s a l i d a p a r a enviar seflales anal6gicas que son interpretadas por una computadora mediante e l uso del programa ADCSLAE. .

3.2.7 Medidor de temperatura (COLE-PARMER)

E l medidor posee 12 canales y f u i u t i l i z a d o en l a cuant i f icac i6n de la temperatura en d iversos puntos de l biot-eactor-, en los psict-6metros y circunstancialmente dentro de l a a u t o c l a v e .

3.3 Caracterizacih del sistema de calentamiento de aire

El acond ic ionamiento de l a i re se logt-6 mediante las acciones enl istadas a continuacibn:

1)Suministt-o de agua a l a au toc lave ( 3.1.5) hasta 2 / 3

2)Encendido d i recto de la autoclave a un intensidad

3)Manipulacibn de vAlvulas de acuerdo con e l t i p o de

' 4 ) U b i c a c i h d e l termopar del medidot- y controlador de

3 )Encend ido e l MCT. 6 ) Frog t-amac i 6n de 1 MCT 7 ) R e y u l a c i b n d e l f l u j o de a i r e r e q u e r i d o . 8)Cuando la temperatura se aproximcj a l a pragramada,

entonces se conect6 l a a u t o c l a v e a l MCT, en su n i v e l minimo de calor (puesto que e l v o l t a j e con e l que funciona e l MCT es muy pequeflo comparado con e l v o l t a j e de l a a u t o c l a v e ) .

de su capacidad.

media.

s e r v i c i o deseado (3.1).

temperatura.

9)Encendido de la computadora y corr ido del programa.

3.3.1 Verificacidn del funcionamiento del equipo

En l a v e r i f i c a c i d n d e l s i s t e m a se emprendieron las s iguientes acciones.

13

*Se agreg6 agua destilada a la autoclave. *Se abrieron las valvulas correspondientes en la

autoclave para acceder al servicio de aire saturado y se regul6 el flujo de aire a 77 l/min.

*Se introdujeron en la autoclave, via valvula ‘ 2 ’ , un termopar en contacto con el agua y otro ubicado en la atmcjsfera de la autoclave. La valvula ‘2’ fub sellada con un tap6n de hule.

*@I la salida de la tuberia que corresponde a la entrada del bioreactor se coloc6 el tet-mopar del MCT.

*Se program6 el MCT estableciendose los limites superior e inferior en 95.0 y SS. 1.

*Se cort-ici el programa de captura de datos.

3.3.2 Verificacibr del funcionamiento en la marcha de FSS

Estas fermentaciones estuvieron fundamentalmente orientadas a compr-obar el funcionamiento del ,sistema disefiado en el acandicionamiento de aire pat-a FSS.

3.3.2.1 Fermentaci6n en arroz

3.3.2.1.1 Absorbencia d e agua y grado de gelatinizacion del material.

3.3.2.1.2 Composicikr del medio de cultivo

El diseffo del medio de cultivo se extrajo de la tesis de Raimbault (1980) par-a sustratos amilaceos y se presenta en el apbndice I.

3.3.2.1.3 Pretratamiento termico

I

Se pesaron 1120~~ de arrbz, adicionandole la soluci6n con sales (9.9.2.1.2) conteniendo 44439 de agua. La mezcla se colocd en un reciente metalico cerrado y se calentd a 14 PSI durante aproximadamente 3:) min, corroborando la dureza, hichazbn y absot-bencia total del liquido en el arr6z.

14

3.3.2.1.4 Indculacikr del sustrato

A l arrcjz pt-etratado termicamente, se inoculcj l a cepa A. n i s e r No. 10, seleccionandola pot- su a l t a produccicjn de enz imas ami lo l i t icas, se agt-eg6 100 m1 de una suspenciejn conteniendo 2 . 8 EXP 1 0 esporas (2 EXP 7 esporas/g m.s. ) y se mid id su humedad.

3.3.2.1.5 Puesta a punto d e l sistema

Se maniobrcj como en 3.3.1 con un f l u j o de 100 l /min , se insertaron en e l ps icrbmetro sus respect ivos tet-mopat-es y se pr-oqramb la temperatura en 34 .0 OC y 34.1 OC.

Una ve t que l a temperatura se e s t a b i l i z d en 34 OC, se c a q 6 e l arr-cjz en e l b io reactor , a lcanzando una a l tu ra de 45.6 cm s i n empacar.

Se i n t r o d u j e r o n l o s 3 termopares restantes a 2, 28.5 y 45.3 cm de a l t u r a .

3.3.2.1.6 Desarrollo de l a f e r m e n t a c i h

En e l momento en que l o s g r a d i e n t e s a x i a l e s de temperatura se minimizaron, lograndose una temperatura o s c i l a n t e en 35 OC, se dirsminuyd e l f l u j o a 27 l /min y se f i j 6 e l t i empo ce ro ( i n ic ib de la fermentacien) .

Fueron tomadas lecturas seg6n l a evolucicjn de l a fermentacihn y eventualmente efectuando observaciones a l mict-osccjpio estereoscdpico para dar seguimiento a las etapas de crecimiento del hongo.

E l proceso fermentat ivo fud detenido pot- secado despu&s de 30 horas de in iciado, tomando como c r i t e r i o no p e r m i t i r a l hongo alcanzar su fase de esporulacibn.

3.3.2.1 . 7 Secado

Para suspender la fermentaribn se calentcj el agua de la au toc lave has ta apr-ox. 93 OC y se aument6 e l f l u j o a 95 l /min , logrando calentar el a i r e a aprox. 60 OC a l a eckrada del b ioreactor . Se tomb lecturas durante.- . l a s p!-irnet-a5 5 horas (cuando las pdt-didas de humedad eran ap rec iab les ) . B a j o l a s mismas condiciones 5e d e j 6 a l transcurso de l a noche (8 h o r a s ) , pat-a posteriomente desmontar- el sistema, medir humedad y obser-var- a l micrnscnpio.

3.3.2.2 Fermentacidn en cascara de naranja I

3.3.2.2.1 Hongo seleccionado

E l hongo seleccionada pat-a l a f e r m e n t a c i b n d e l c i t r i c 0 es: A s p e r s i l l u s n i a e r C H 4 , e l c u a l es una cepa mutada proven iente de l inst i tu to de invest igac iones b iom6dicas de l a UNAM.

A . n i q e r CH, es capaz de p roduc i r una a l ta propot -c ibn de enz imas pect ino l i t i cas , y pot- ende, de ct-ecet- adecuadamente en un sustrato como l a c6sjcat-a c i t r i c a , que cont iene p r inc ipa lmente , azCtcares de f a c i l a s i m i l a c i b n y p e r t i n a .

3.3.2.2.2 Medio de conservacickr y propagacidn

La preparacibn del medio, y l a pt-epat-acj.611 y pt-upaqacibn de cepas son detalladas en e l apendice I

3.3.2.2.3 Suspensidn de esporas

A 100 m 1 de agua des t i l ada se l e ad ic iona e l ( 2 . 1% de Twen 80. La so luc ibn se deposi ta en e l ( l o s ) r e c i p i e n t e ( S )

que cont iene en cul t ivo esporulado, s iendo desprendidas con agitadot. maqnetico.

3.3.2.2.4 Conteo de esporas

Con pipeta Pasteur- se coloca una gota de suspensibn de esporas en l a c6mat-a de NeuEauet-. Se contabi 1 i z a n l a s espor-as local. izadas en 1 0 cuadri tos seleccionado's, considerando que e l nctmet-o de esporas debe incurrir en un rango de Ill0 a 40 pot- cuadro.

3.3.2.2.5 Diseno de medio de cultivo para sustratos ,que contienen pectina

E l medio de c u l t i v o se diseflo en la p l a n t a p i l o t o de fermentaciones de l a LJAMI. Est& se muestt-a en e l apbndice I .

3.3.2.2.6 Condiciones iniciales de la fermentacidn

Las condiciones que a continuaci6n se puntual izan son l a s que invar iablemente se ejecutaron en e l ar ranque de las FSS (en el. caso d e l c i t r i c o ) .

16

* Recoleccibn de l a cascara

L a 5 c6scaras se r e c a g i e r o n c o n v e n d e d o r e s d e j u g o d e n a r a n j a aledaflos a l a UQMI.

* Secado

E l secado d e l a cdscara htimeda se logrcj al e x t e n d e r l a y e x p o n e r l a a l sol d u r a n t e u n a s e m a n a . P r e s e n t a n d o u n a humedad f i n a l d e l 8%.

* Molienda y tamizado

L a c&scat-a se t r i t u t - 6 e n un m o l i n o d e mar t i l los y se s e l . e c c i o n a r o n c o n t a m i k l o s tamafios d e p a t - t i c u l a a t raba jar .

* Inoculacibrr

Se i n o c u l d e l v o l u m e n s u f i c i e n t e d e l a s u s p e n s i b n d e esporas pat-a a l c a n z a t - u n a c o n c e n t r a c i d n d e 2 EXP 7 esporas / g d e materia seca.

*Temperatura de fermentacidn

La temperatura q u e se p r e t e n d i a m e n t e n e r c o n s t a n t e es d e 35 OC, que es l a dptima d e c r e c i m i e n t o d e A. n i a e r . Pero, . .

l a temperatura se p r o g r a m 6 e n 34 "C p o r l a i n e r c i a t 4 r m i c a d e l a a u t o c l a v e .

* Tiempo cero

Cuando se carga el material a f e r m e n t a r - e n e l b i o r e a c t o r , se espera a que l a temperatura se u n i f o r m e a l rededor- de los 34 OC. L o g r a n d o este p u n t o , es c u a n d o t i e n e lugar- e l t i e m p o cero (o d e i n i c i o )

* Psicrtrmetros

A e x o p c i e i n de l a f e r m e n t a c i 6 n I ( c o n u n s o l o p s i c r b m e t r o ) , las r e s t a n t e s f u e r o n p r o v i s t a s d e d o s psicrbmetros, cada u n o c o n sus r e s p e c t i v o s termopares ( p a r a t e m p e r a t u r a d e b u l b o seca y b u l b o hCtmedo).

*Humedad relativa del aire

L a h u m e d a d r e l a t i v a empleada e n todos l o s e x p e r i m e n t o s f u C d e l 1 0 0 .

. . . . . . . - ..._ " - " ". . . . " "

17

3.3.2.2.7 Preparacidn del s u s t r a t o

En la primera fermentacidn de una serie de experimentos empleando c6scat-a c i t r ~ i c a como sustrato, no se preestablecid el tamaPlo de par t i cu la a manejar, es decir, se empleo l a ca s ca ra t a l como resulta despues de l a molienda, con una heterogeneidad en la d i s t r ibuc idn de tamafioc, pasando desde finos hasta fragmentos de aprox. 0 . 5 cm=.

Se optd por f i jar una humedad i n i c i a l de l 50%, elaborando los cA lcu los respect ivos para 206Og en base hQrneda. E l agua se agregd a l a cascar-a pot- v ia so luc i6n de nutr ientes, suspensi6n de esporas (1 EXP 1 0 esporas) y agua destilada. Posteriormente se determind su humedad y pH.

3.3.2.2.8 Disposicidn del sistema

Se operd como en 3.3.1 con un f l u j o i n i c i a l de 100 l / m i n , cargandose e l c i t r ic0 y compactando ligeramente, alcanzando una altura de 60 cm y una densidad aparente de 0. 479 /m 1 m

Mient ras l a temperatura se uniformaba se i n ser t6 un ter-mopar- a 2, 28.5 y 49 cm de a l tura( , para cuant i f icar los gradientes axidles

LL-egado e l tiempo cero, se disminuyb gradualmente el f l u j o (100-73-50-25 l/min) para evitat- aumentos bruscos en l a temperatura, como consecuencia del incremento en e l tiempo de res idencia del a ire dentro de los serpentines de l a autnclave.

E l f l u j o de aire durante el tt-anscurso de l a fet-mentaci6n fucS variable, capturando eventualmente lecturas de temperatura axiales. Estos cambios son presentados en l a tabla 3.3.2.1

3.3.2.2.9 CIndlisis del producto

Antes de desmontar, se al iment6 a ire seto para enfr iar e l fermentado durante 29 min.

El pt-aducto se secciond en 3 pot-ciones y se ana l i zd por- sepat-ado, determinando l a humedad y act iv idad de agua ( A w l "

18

TABLA 3 . 3 . 2 . 1 T I EMPO (HORAS 1 FLUJO ( l / m i n )

0 - 2 1 (:I(:) 2 -14 14-16 30 16-26 50 26-44 90

c)c Ld

3 - 3 . 2 . 3 Fermentacikr I1

3 . 3 . 2 . 3 . 1 Preparacidn del sustrato

Se u t i l i z c j u n tamaffo de p a r t i c u l a l i m i t a n d o l o a un rango de 0 . 1 a 0 . 5 cma, procediendo en analogia con 3 . 3 . 2 . 2 . 7 p a r a un peso i n i c i a l de 17889.

3 - 3 . 2 . 3 . 2 Disposicickr del sistema

Se cargb l a cascara a l b io reactor como se h.izo en 3 . 3 . 2 . 2 . 8 , con las s igu ientes modi f icac iones :

E l f l u j o s e mantuvo constante durante todo e l proceso fermentat ivo .

Se o b t u v o u n a a l t u r d a l empacar de 3 3 cm y una densidad aparente de 0.303 g/ml.

E l d l t i m o termopat- que se venia mane,iando (43 cm), se reemplazd por un ps icrdmetro que mid iera la humedad r e l a t i v a d e l a i r e a l a s a l i d a .

Se inc luyeron 2 termopares m6s, ubicados en d i s t i n t a s p o s i c i o n e s r a d i a l e s (uno a l centr-o y otro adyacente a l a pared) y a l a misma a l t u r a (36.5 cm).

En en d e s a r r o l l o de la fermentacidn 5e r e g i s t r a r o n lectut-as de temperatura y caidas de presicjn.

3 . 3 . 2 . 3 . 3 Analisis del producto

E l c i t r i c o f e r m e n t a d o s e d i v i d i d en 5 pa r tes . A l a5 que se a n a l i z d : humedad, pH, Aw y Activ idad enzimatica.

3.4 FSS en bagazo de caKa-cAscara citrica

3.4 .1 Generalidades de las fermentaciones empleando relaciones bagazo-citric0

Las siguientes fermentaciones pertenecen a una s e r i e de experimentos m&s estructurados y encausados hacia l a generac ibn de i n fo rmac ih bas ica de l os fenomenos de transporte empleandn bioreactot-es a n i v e l s e m i p i l o t o , con las impl icac iones que t iene t raba jar a escalas relativamente grandes, en donde la complej idad de los eventos se incrementa.

L a a l t u r a de l a columna es rep resenta t i va de l a que se podt - ia u t i l i zat - en camas de fermentacibn a n i v e l i n d u s t r i a l , en donde l o que se ampl ia r ia e5 e l diAmett-o de l a columna.

3 . 4 . 1 . 1 TamaCTo de particula

La cAscar-a se tamiz6 hasta un tamaPlo d e p a r t i c u l a dent ro en un rango entre 2.36 a 0 . 5 cm.

3 .4 .1 .2 Humedad inicial

La humedad i n i c i a l d e l s u s t r a t o 5 6 l i d o e5 mantenida en todas las FSS a l 7 0 % , de acuerdo a l a s c a r a c t e r i s t i c a s intr insecas de absorcicjn de la c&scara c i t r i c a y que l a mayor praduccibn de pect inasas ocurre a esta humedad.

E l c i t r i c 0 y .el bagazo son humectados independientemente, el primero con la so lucibn da nutt - ientes y la suspensi6n de esporas, y e l segundo con aqua des t i l ada .

Finalmente ambos son mezclados.

Las humedades de ambos antes de a d i c i o n a r l e s e l agua, fueron del 8%.

3 .4 .1 .3 Relacidn bagazo-citrico

Para las p r imeras 4 fer-mentaciones se empleo una re lac ibn bagazo -c i t r ic0 de l 15% (1:5.66), y p a r a l a Ctltima una re lac ibn de l 17.5 % (1: 4 . 7 ) .

20

3 . 4 . 1 . 4 Calculo de medio de cultivo

Los calculos de medio de cult ivo pueden set- rev isados en e l apkndice I .

3.4.1.5 Criterio de llenado de la columna

A l a columna se afladia e l m a t e r i a l a fermentar hasta a lcanzar un n i ve l 5 cm por encima de l a s a l i d a a l psicr6mett-o ( a 50 cm de l a base de la co lumna) , empacando l igeramente.

3 . 4 . 1 . 6 Ubicacih de termopares

En l a s 4 primer-as fermentaciones se colocaron 4 termopares local izados a: 2 cm, 28.5 y 36.5 cm. En e l n i v e l mas a l to f ue ron puestos 2 termopares a d i fe rentes pos ic iones r a d i a l e s ( c e n t r o y p e r i f e r i a de la co lumna) .

En la Ql t ima fermentacibn se ub icaron 6 termopares, dos a cada n i v e l a x i a l p a r a c u a n t i f i c a r g t - a d i e n t e s r a d i a l e s (cent ro y p e r i f e r i a ) . N i v e l e s a x i a l e s : 6 , 2 2 y 47 cm.

3 . 4 . 1 . 7 Manknetros

En todas l as co r r idas se usaron dos tubos en ' U ' conteniendo mercurio, para medir las caidas de prcsidn i n t e r n a s , i n t r o d u c i e n d o v a r i l l a s d e v i d r i o en e l b i o r e a c t o r que eran conectadas a su man6metro correspondiente, ubicadas a l c e n t r o y adyacente a l a pared de l b io reactor .

3 . 4 . 1 . 8 Investigacih en el desarrollo del Proceso fermentativo

Nuestros estudios son encaminados a a n a l i z a r - l a transferencia de calot - a d i s t i n t o s n i v e l e s a x i a l e s y r a d i a l e s en l a columna y sus repercus iones re f le jadas en e l pr-oducto y e l crecimiento aparente del hongo. Se l l e v d a cabo un seguimiento de l a FSS con toma de lecturas de temperatura y caidas de presibn.

3 - 4 - 1 . 9 Aislamiento del bioreactor

S610 en l as exper ienc ias I V y V , el b io reacto r se a i s l b de su entorno con 4 capas de bajo-alfombra a su a l r-ededot-.

21

222185

3.4 .1 .10 Formas de remocik, de calor metabblico

Para la remoci6n de calor metabcjlico se emplearon dos metodos: Aumento de f l u j o de a i r e s a t u r a d o e intercambiando a i r e s e c o p o r a i r e h6medo.

3 .4 .1 .11 anal isis del producto

Los a n 6 l i s i s p r a c t i c a d o s a l p r o d u c t o en todas las FSS son: Humedad, pH, Aw y A c t i v i d a d e n z i m 6 t i c a ( l a s t k n i c a s ana l i t i cas son rev isadas en e l apendice I ) P a r a t a l e f e c t o a l fermentado se l e c o r t a r o n a cada extremo, 3 cm que se desecharon. Posteriormente fm& seccionado en 6 porciones. Cada una de &stas se d iv id ic j a su vez en dos partes, una que c o n t e n i a e l c e n t r o y ott-a l a p e r i f e r i a . Pot- consiguiente , las muestras a anal izat . fueron 12.

3 .4 .2 Fermentacion I

Se m i d i 6 e l pH y l a humedad i n i c i a l , a r r o j a n d o un valor- de 4.03 y 67% respectivamente.

E l f l u j o se mantuvo constante en l a e v o l u c i 6 n de la FSS en 15 l /m in .

C r i t e r i o de enfr iamiento: Var iacibn de a i r e saturado a aire seco. Estos cambias pueden evidenciarse en l a t a b I a 3 .1 del apCndice 11.

3 . 4 . 3 Fermentacikr I1

Peso i n i c i a l : 1387g pH i n i c i a l : 4 . 2 8 9 Humedad in ic ia l (med ida ) : 66 .5% A l tu ra : 46 .5 cm Densidad de empaque: O. 4Z!g/m1 F lu jo cons tante : 40 l /m in C r i t e r i o de enfriamiento: Manteniendo el f lur io

constante

22

3 . 4 . 4 Fermentacidn I11

P e s o i n i c i a l : 15009 pH i n i c i a l : 4.32 Humedad i n i c i a l ( m e d i d a ) : 68.5% A l t u r a : 50 cm D e n s i d a d a p a r e n t e : O. 423 g/ml F l u j o c o n s t a n t e : 28 l / m i n C r i t e r i o d e e n f r i a m i e n t o : C o n so lo el f l u j o .

3 .4 .5 Fermentacidn I V

Peso i n i c a l : 150Oy pH i n i c i a l : 4.23 Humedad i n i c i a l ( m e d i d a ) : 68.5% A l t u r a : 50 c m D e n s i d a d d e empaque: 0.423 g/ml F l u j o c o n s t a n t e : 28 l/min C t - i t e r - i o d e e n f r i a m i e n t o : V a r i a c i b n d e a i r e saturado a

ait-e seco ( l o s cambios s o n p r e s e n t a d o s e n l a tab la 3.2 d e l a p C n d i c e 11)

3 . 4 . 6 Fermentacidn V

Fesa i n i c i a l : 1350y pH: 4.32 Humedad i n i c i a l (medida) : 65% A l t u r a : 50 cm D e n s i d a d d e empaque: 0.423 g/ml F l u j o v a r i a b l e ( v e r m o d i f i c a c i o n e s e n los f l u j o s e n l a

Cr i ter io d e e n f r i a m i e n t o : &.\mento g r a d u a l e n e l f l u j o tab la 3.3 d e l a p g n d i c e 1 1 )

d e a ire .

Nota: A l bioreactor se l e p r a c t i c a r o n h o r a d a c i o n e s pat-a l a i n s e r c i b n d e n u e v o s termopares q u e c u a n t i f i c a r a n los g r a d i e n t e s radia les .

.

39 cn\

*

b 9.5 cm

L

e

I 23 ,

4 RESULTADOS

4.1 Caracterizacikr del sistema de calentamiento

4.1.1 El equipo solo, sin control de la FSS

. .

Los f l u j o s manejados en esta caracterizacibn se ubican dentro de un rango de 15 a 1 0 0 l/min.

Para abastecer el a ire a 35 OC, es necesar io mantener e l aqua dentro de la autoc lave a 41 T. El control es capan de mantener la temperatura en 35 W . 1 OC (sin fermentac ih) .

El a i r e hctmedo puede ser entregado al 100% de l a saturacidn o a l a justar e l rot imetro, sumin is t rar un a i r e con l a humedad r e l a t i v a deseada.

4.1.2 Control de las FSS de prueba

4.1.2.1 Fermentacidn en arroz

Control de temperatura: 35 + 1 OC Tiempo de c u l t i va: 50 horas Crecimiento aparente: Abundante Humedad f ina l : 2.5% Compactacibn: Baja C r i t e r i o de enfriamiento: E l f l u j o de a i r e f u B

su f i c iente para l a remoci6n de calor metab6lico.

4.1.2.2 Fermentacibn en citric0 I

Cant601 de temperatura: 35 + 5 OC Tiempo de cu l t i vo : 44 horas

Po r c i bn Crecimiento Humedad f i n a l (X) AW I n fe r i o r Abundan te 33" 4 o .) 904 Intermedia Escaso 41.4 o. 935 Superior Nu 1 o 5 3 , 5 o. 937

Compactacibn: A l ta Caidas de presibn: Fuertes (no cuantif icadas) Causes preferenciales de a i re: S i C r i t e r i o de enfriamiento: Con f lu jo va r iab le ( tab la

3.5.2.1.)

4.1.2.3 Fermentacidn en c i t r i c o I1

Cont ro l de la temperatura: 0-26.3 horas: 35 + 1 OC 26.5-40 horas: 42 + 6 OC

Tiempo de c u l t i v o : 4 0 horas

Porcibn (cm) Crecimiento Humedad f i n a l AW PH 10 Abundante 58% 0.922 3.3 20 Abundan te 40 .9% 0. 926 3.53 30 Abundan te 41 .9% 0 .942 3.2 4 (3 Regu 1 at- 62.5% 0. 951 5.09 5 o Escaso 69.4% 0.985 3.1

Compactaci6n: Alta Caidas de presi6n'mAxima: 2 .6 cm Cuases p r e f e r e n c i a l e s de a i r e : S i C r i t e r i o de enfr iamiento: Con f l u jo cons tante . A c t i v i d a d p e c t i n o l i t i c a

de la5 5 primeras porciones: 0.316 UD/g min.

Nota: UD e s d e f i n i d a en e l apclndice I

4.2 FSS en bagazo-citric0

Los resu l tados que a continuacibn se exponen son los promedios del comportamiento global de los g r $ f i c o s presentados en esta seccibn, despucls de 41 hot-as de f ermen tac i 6n.

RESULTADOS DEL CONJUNTO DE FERMENTACIONES BAGAZO-CITRIC0

Anklisis FSS I FSS II FSSlll FSS IV FSS V

Tminima 32 33 34 30 34.5 Tpromedio 35 35 35.5 33 36 Tmdxima 38.5 37.5 37 39 38.5

H centro 57.7 53.3 55.4 51.4 53 H pared 76.2 76 7 7.4 63.8 63.7

- Aw centro 0.975 0.967 0.963 0.954 0.956 Aw pared 0.990 I 0.997 0.994 0.979 0.98

AE centro 2.56 1.79 3.55 3.32 2.69 A€ pared 2.62 0.84 0.9 1 3.2 1.18

Peso final 1360 1407 1597 964 93 1

pH centro 3.7 3.7 3.4 4.4 3.8 pH pared 2.9 3.9 3.4 3.9 3.7

caída de P 1.6 3.4 2.5 I 1 4.4 (mkxima) H.R.A 98 97 97 93 98 (entrada) H.R.A 98 98 98 98 97 (salida)

T =temperatura en grados centígrados H =humedad en % Aw =actividad de agua AEIactividad enzimktica en UD/g P Ipresion en cmHg Peso[ = lgramos H.R.A=Humedad relativa del aire en- %

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HUMEDAD RELATIVA FERMENTAMONII

HUREDAD RELATIVA FERMENT- I

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5 DISCUSIONES

E l d i s e P l o d e l sistema d e a c o n c i o n a m i e n t o d e a i r e se e f e c t u 6 con la idea o r i g i n a l d e a d e c u a r un aire q u e p u d i e r a ser u t i l i z a d o e n FSS, c o n caracteristicas d e humedad y t e m p e r a t u r a p r o p i c i a s para g a r a n t i z a r l a t r a n s f e r e n c i a d e calor. AdemAs d e f u n c i o n a r - como abastecedor d e o x i g e n o a l c u l t i v o .

En l o s sistemas d e FSS, l a a i r e a c i b n d e b e ser c o n t r o l a d a a una humedad t a l q u e n o s e q u e n i h u m e c t e e n demacia a l s u s t r a t o s b l i d o , a u n c u a n d o este compromiso n o sea t a n e v i d e n t e , p u e s t o q u e u n a d e las c o n s e c u e n c i a s establecida e n t r e e l a i r e y el c u l t i v o a l cedet- o aceptar e n e r g f a ca lor i f i ca , se d a con e l arrastre o d e p d s i t o d e a q u a . En r e l a c i b n a esta c o n c e p c i b n , e l sistema d e aireacibn f u e p r o v i s t o d e l c o n t r o l d e l a humedad re la t iva c o n l a m a n i p u l a c i b n d e v & l v u l a s e x p r o f e s a s .

E l c o n t r o l d e l a t e m p e r a t u r a se l o g r 6 a l p r o v e e r a l sistema d e c a l e n t a m i e n t o , d e un r - e q u l a d o r e n e l s u m i n i s t r o d e e n e r g i d electrica a s u s r e s i s t e n c i a s .

Se o p t 6 p o r a l i m e n t a r c o n a q u a a 213 d e l a c a p a c i d a d d e la a u t o c l a v e , p e n s a n d o e n q u e l o s s e r p e n t i n e s d e b e r i a n d e t e n e t - u n a g r a n area d e c o n t a c t o con el a g u a p a r a g a r a n t i z a r u n a mejor transferencia d e calot-, d i c h a e f ic iencia p u e d e c u a n t i f i c a r s e e n a p r o x i m a d a m e n t e 97% d e l a c a n t i d a d d e calot- transferida d e l a q u a a l a ire .

Los f l u j o s u t i l i z a d o s e n e l t r a n s c u r s o d e estas e x p e r i e n c i a s i n c u r r i e r o n e n un r a n g o d e 15 a 100 l / m i n . E l limite i n f e r i o r se d i 6 e n f u n c i d n d e l a s r e s t r i c c i o n e s d e l sistema, es decir , q u e un f l u j o m&s p e q u e r k adolece d e p r o b l e m a s ta les como l a d i s i p a c i b n p r o n u n c i a d a d e calot- pot- t u b e r i a s y accesorios, con e l c o n s e c u e n t e a u m e n t o c o n t i n u o d e l a t e m p e r a t u r a l l evado a cabo e n l a a u t o c l a v e p o r r e g u l a c i d n d e l control , p a r a contrarrestar t a l efecto. Ademds d e q u e l o s psicrbmetros no p u e d e n emplearse a v e l o c i d a d e s d e a i t - e a c i b n menores. E l limite s u p e r i o r se f i j b tomando como c r i t e r i o q u e las FSS e n c o n d i c i o n e s n o r m a l e s n o r e q u i e r e n d e f l u j o s mayores, q u e t - e d u n d e n e n un i n c r e m e n t o d e costos a l i n t e n t a r l l e v a r a g r a n d e s escalas.

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La temperatura en la autoclave se f i j6 en su minima intensidad para disminuir las inerc ia s tit-micas. Para l a s FSS se program6 l a s temperaturas en 34.0 y 34.1 OC, puesto que por la inerc ia termica, la temperatura era ligeramente aumentada a alrededot- de l o s 35 OC.

e . , . .

El control de l a temperatura en l a fermentacibn del arroz se realizcj de manera senc i l l a , no ' ocurriendo ningun problema. Es to se deriva de dos caractacter ist icas pr inc ipa les: tamaflo de particula grande y homogeneo; y baja humedad del arroz, que se traduce como disminucibn en l a actividad metabblica del hongo.

Para la fermentacibn con clscara citrica, se empleb l a cepa A. n iper CHI, seleccionada pot- produc i r a l tas concentraciones de enzimas pectinolit icas. Y por set- este, un hongo del cual SE! tienen amplios conocimientos,, f i s i o l b g i c o s y bioquimicos por el grupo de investigadores del area de microbiologia de l a UAMI.

El disefio del medio de cu l t i vo no puede ser considerado como e l p rop ic io pat-a adic ionarse a l a c l scara . Debe de rea l izarse invest igac ibn para este sustrato en particular, considerando que es de composicibn quimica var iab le y que pot- ende, no puede ser disefiado un medio de cu l t i vo bptimo

En l a s fermentaciones efectuadas, se paten t i zb l a necesidad de tener un control sobre el tamafio de part icu la, primordialmente evitando los f inos que afectan la porosidad del medio, trayendo consigo dif icultades en la t rans ferenc ia de calot- y zonas de anaerobiosis.

En l a f a se i n i c i a l de l cu l t i vo , se encontt-b que si bien es c ie r to , que la uniformidad de l a temperatura en todo el material fermentativo es dependiente del' flujo, a medida que e l f l u j o se aumenta, comienzan a presentarse problemas s e r i o s de compactacibn. F o r t an to l o s f l u jo s a l t o s i n i c i a l e s que en las primeras fermentaciones se aplicaron, se suspendieron para las posteriores.

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En l a s d o s f e r m e n t a c i o n e s p r u e b a e n c i t r ico , se detectat-on p r o b l e m a s g r a v e s e n l a r e m o c i 6 n d e calor metabblico p o r l a . c o m p a c t a c i d n de l a .masa f e r m e n t a n d o , r e f l e j a n d o s e e n un a u s t e r o c r e c i m i e n t o d e l a s f r a c c l o n e s superiores y l a f o r m a c i 6 n d e c a u s e s p r e f e r e n c i a l e ; d e aire. E l c r e c i m i e n t o e n la p a r t e i n f e r i o r f u e o s t e n c i b l e m e n t e a b u n d a n t e , p r o b a b l e m e n t e p o r ser la d n i c a z o n a ' f a v o r e c i d a p o r es tos c a u s e s p r e f e r e n c i a l e s d e a i r e , c o n v i r t i e n d o s e e n e n l a z o n a mejor aireada.

P a r a p e r m i t i r e l l ibre acceso d e l a i re por los espacios i n t e r p a r t i c u l a , se p r o p u s i e r o n d o s a l t e r n a t i v a s : c o n t r o l a r e l tamaffo d e p a r t i c u l a ; y f u n d a m e n t a l m e n t e , i n c l u i t - b a g a z o d e caPla.

Lo primero a b o r d a d o e n estos e s t u d i o s fuc3 el c o n t r o l d e t e m p e r a t u r a e n e l c u l t i v o . Con este p r o p b s i t o se e m p r e n d i e r o n 3 f e r m e n t a c i o n e s :

E l t i e m p o d e f e r m e n t a c i 6 n (41 horas) , se estableci6 en f u n c i d n d e l d e c r e m e n t o e n l a p r o d u c c i c j n d e calor metab6lic0, i n d i c a t i v o d e l a Qltima fase d e c r e c i m i e n t o ; y d e l g r a d o d e e s p o r u l a c i 6 n d e l h o n g o .

Se c o m e n z 6 pot- probar- un f l u j o b a j o (15 l / r n i n ) , t o p a n d o s e c o n c o m p l i c a c i o n e s e n l a r e m o c i d n d e calot- y d i f i c i l m e n t e r e s u e l t o s por l as v a r i a c i o n e s d e aire hbmedo a a i re seco.

En un s e g u n d o e x p e r i m e n t o , e l f l u j o f u d i n c r e m e n t a d o a un n i v e l q u e se p r o n o s t i c a b a como s u f i c i e n t e para l a d i s i p a c i c j n d e calot- metab6lico (40 l / m i n ) . I n i c i a l m e n t e , el f l u j o removid a d e c u a d a m e n t e e l calot-. En l a s h o r a s postt-eras d e l c u l t i v o , se e v i d e n c i 6 u n a c o m p a c t a c i 6 n a l e l e v a r s e l a cama ( a p r o x . 3 cm) y o b s e r v a r s e corrientes p t - e f e n c i a l e s d e a i re. S. R e v a h e n c o n t t - 6 , que l a c o m p a c t a c i 6 n esta r e l a c i o n a d a d i r e c t a m e n t e c o n e l c r e c i m i e n t o f d n g i c o ( c o m u n i c a c i d n d i r e c t a ) , pero es complicada p o r l o s f l u j o s d e air-e a l tos .

En l a s i g u i e n t e b b s q u e d a , se o p t 6 p o r un f l u j o i n t e r m e d i o d e 28 l / m i n . E l f l u j o f u e c a p a z d e t r a n s f e r i r e f i c a z m e n t e el ca lor metabdlico y f u & b a j o esas c o n d i c i o n e s , c o n s i d e r a d o como el mejor- f l u j o para loqt-at- e l c i t a d o at- r a s t re .

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En los esperimentos anteriores, evidentemente se logt-6 un abundante crecimiento aparente y una aceptable actividad p e c t i n o l i t i c a g l o b a l . P e r o fu& n o t o r i o e l y r a d i e n t e r a d i a l de humedades (alrededor de 20%), y como consecuencia, una d is t r ibuc i6n heterogenea de l c rec imiento , act iv idad de agua y ac t i v idad enz imat ica en t re e l cent ro y p e r i f e r i a de l a columna de FSS.

Los gt-adientes de humedad eran provocados por la formacion de condensados en la pared de la columna, que a su vez: e r a n o r i g i n a d o s p o r l a d i s i p a c i b n de c a l o r a t rav4s de las paredes. Pensando en este fenbmeno, y en l a p r e t e n s i 6 n de s imular las condic iones que se tendr ian en un lecho fermentat ivo a n i v e l i n d u s t r i a l , en e l que e l Area de e x p o s i c i b n d e l s u s t r a t o s b l i d o a la pared es reducido con r e s p e c t o a l t o t a l d e l a masa fermentando, se decid ib a is lar e l b i o r e a c t o r .

Es importante mencionar que en las fet-mentaciones con a is lamiento, e l crecimiento (generacibn de ca lor metabbl ico) continuaba aun despubs de t ranscurr ido el t iempo de cult ivo preestablecido, pero la fermentacidn era detenida para guardar concordancia con los exper imentos anter iores .

E l f l u j o que con anter io r idad hab ia s ido se f ia lado como el mejor , cat -eci6 de va l idez para las cond ic iones de l a pr imera FSS a i s l a d a ( fermentacibn I V ) . Recurr iendo a l intercambio continuo de a i r e h6medo por a i re seco , para e n f r i a r a l c u l t i v o .

L a f i n a l i d a d de l a segunda fermentacibn aislada (U) era de nueva cuenta, encontr-ar el mejor f lujo de a i r e que cons igu iera por si solo l a t-emocibn de c a l o r . En esta meta, se contaba con experiencias anteriores, que indicaban que no era posib le incrementar demasiado e l f lu jo , puesto que a 40 l l m i n l a columna fermentativa comenzaba a tener problemas de compactaci6n. Para tal efecto, se pensb en aumentar aun mas la porosidad del medio , mediante la ad ic ibn de mas bagazo cafia y ese sent ido permi t i r un aumento en e l f l u j o suministrado.

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For otro lado, en experiencias llevadas a cabo en Cuba (ICIDCh), se tenian reportes de que un aumento del 20% de la relacibn bagazo-citrico, repercutia notablemente en el menoscabo de los rendimientos en actividad pectinolitica y crecimiento.

Manejando a esta Qltima relacibn como limite superior, se determinb emplear una relacibn intermedia de 17.5 %.

A medida que la remocicjn de calor se complicaba, se aumentb paulatinamente el flujo para afrontar este efecto, resultando en un buen control de la temperatura y sin que se presentaran problemas originados por la compactacibn.

La meta planteada fue conseguida, al practicarle los andlisis de humedad y corroborar que en las fermentaciones aisladas el gradiente de humedad se redujo en aproximadamente un 50% en relacion al que se presentaba sin aislar (del 20% en los gradientes de humedad, se disminuycj al 10%). Obteniendose, no exclusivamente un sistema mas homogeneo en cuanto a humedad se refiere, sino tambien en torno al producto (enzimas pectinoliticas).

En la fermentacibn 111 , fu& notoria la contaminaciein, resultando en un marcado decremento en la actividad pectinolitica en la periferia de la columna, lugar que coincidid con el mayor contenido en humedad que favorece la contaminacicjn por bacterias y10 levaduras que desplazan al crecimiento fhgico y por tanto merman la produccibn de enzimas.

En la fermentacibn IV, en la que la disipacibn de calor metabblico se logrcj con las continuas modificaciones de la humedad del aire a la entrada del bioreactor, pudo apreciarse una disminuci6n en la actividad enrimatica en la parte inferior de la columna que fu& la mas expuesta a dichas modificaciones, llegando hasta temperaturas de IS OC.

fil aumentar la relacibn bagazo-citrico, no disminuyb la actividad pectinolitica global, este efecto puede ser considerado como un enmascaramiento originado por dos causas equilibradas entre si: 1 ) Al establecerse las mejores condiciones ambientales, estas inciden en un incremento en el rendimiento del producto. 2 ) El aumento en la relacibn baqazo-citric0 tiene necesariamente una influencia negativa en la praduccibn de pectinasas.

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A l parecer, la maxima produccidn de pect inasas se l l eva a cabo en condiciones de baja humedad (caracter i s t i ca del centro de l a columna) y hubiera que pensarse en d i sm inu i r l a humedad i n i c i a l de la relaci6n bagazo-citr ico, con las impl icac iones que trae consigo, puesto que con e l decremento de l a humedad inic ial del sustrato, se incrementa l a complejidad del control en la transferencia de ca lor . Otra consideraci6n se desprende de l a p o s i b i l i d ad de contaminaci6n favorecida por los altos niveles de agua l i b r e loca l izados en l a p e r i f e r i a de l a columna.

Pretendimos relacionar la actividad enzimatica con la Aw que indicaran alguna dependencia, no encontrando algo importante digno de mencibn..

La actividad enzimatica no parece ser afectada por los n ive les ax ia le s en ' l a columna, teniendo valores que no sugieren relaci6n alguna.

Los resu l tados de la act iv idad enzimatica no son representat ivos de l a maxima productividad que puede alcanzarse en estos s i stemas de FSS. Para conseguir este dato se requiere de rea l i za r c inCt icas de produccidn de pectinasas en l a relacicjn bagazo-citric0 ensayado y encontrar. e l tiempo de fermentacibn en que l a produccidn de enzima5 sea l a maxima.

El a i r e s e mantuvo saturado en todas las fermentaciones. Esto result6 conveniente, por quc) en l a s FSS' s i n a i s l ado , a l e fec tua r l e s un balance de masa, no fueron aprec iables las var iac iones entre la masa i n i c i a l y l a f i na l ; y en l a s FSS a i s ladas , aun con e l a i r e a saturacidn, los cu l t ivos perd ieron a l rededor de l 35% de humedad.

En los yr6. f icos de act iv idad de aqua VI humedad, se constat6 la est recha re lac idn que guardan entre si, observandose tres etapas en e l comportamiento de . la curva:

1) En l o s n i ve le s ba jo s de humedad, menores de 57%, l a Aw no t iene var iaciones, a pesar que l a humedad aumente. E s to probablemente es a t r ibu ida a que e l agua no se encuentra en forma l ibre, s ino inc lu ida dentro de l a s estructuras celulares.

2) A n i ve les de humedad entre 57 y 75%, se presentan relaciones 1 ineales,

3) A n i ve les de humedad superiores a 75% , l a A w no experimenta cambios con l a va r i ac i 6n da l a humedad.

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222185 !

Una observacibn que se considera pert inente sef lalar , es que el bioreactot- siempre se encontt-d en estado presur-izado, no s o l o p o r l a s c o n t r i b u c i o n e s d e l a i r e " a 1 p t r a v e s a r p o r l o s e s p a c i o s i n t r a p a r t i c u l a d e l - - s u ~ t r a t o , ~ s 6 l ~ d o , , s i n o pot- que l a s a l i d a en e l b i o r e a c t o r e r a muy estrecha, .y e r a f u e r t e l a pt-esidn que debia vencerse, conferida por la altura del agua del colector de esporas. Las repercusiones que se suscitan son :

1) Los man6metros ubiCados a un mismo n i v e l a x i a l ( u n o a l c e n t r o y o t r o a l a p e r i f e r i a ) siempt-e d i e r o n s i m i l a r e s caidas de presibn, cuando el objeto de colocar los mandmetros, era conocer s i dent ro de l reacto r se tenian d i f e r e n t e s c o r r i e n t e s r a d i a l e s d e a i r e , e s t a i n f o r m a c i h n o fuC conseguida.

2 ) En un ambiente presurizado, la t ransferencia de ca lo r t i ene m6s d i f i c u l t a d e s .

S i b i e n e s c i e r t o , que la sa l ida necesar iamente deb ia set- t-educida, ,ya que conducid a un psicrdmetro que para su funcionamiento requiere de una velocidad de a i r e de 3 m/s; ademls de que e l a i r e a l a s a l i d a d e b i a s e r c a p t u r a d o y burbujeado en agua Ac ida para cap tar esporas que pud iera acar rear .

La fermentacidn de la que puede extraerse informacidn pr-eponderante es l a U, que proporciona datos de dispersidn de la temperatura a n i v e l e s a x i a l e s y r a d i a l e s ( F i g . 4 . 2 ) , la l inea super io r - de l y rAf ico debe set- tomada con reserva, ya que pertenece a l ter-mopar super io r de l a columna de fet-mentacibn, en donde exist ian problemas de c i rculacidn de a i r e , p u 4 s e l sensor- se ubiccj a l a misma a l t u r a y en sent ido opuesto que l a s a l i d a d e l a i r e .

Los es tud ios de Saucedo que conllevan a l p lanteamiento de un modelo matemltico adaptado a l a t r a n s f e r e n c i a de calor en FSS, puede ser apl icable a e s t e t r a b a j o , s i se pat-te del modelo general , s in las s impl i f icaciones que &l considera , puesto que en su s is tema fe rmentat ivo , las p r inc ipa les r e s t r i c c i o n e s en e l mecanismo de t rans ferenc ia de calor se dan a un n ive l conduct ivo de ca lor ; fenomeno que no ocut-re en nuestro sistema, en e l que l a transmisicjn de ca lor es fundamentalmente convectivo. Pot- cons igu ien te , pa ra l a comprobacidn de l a a p l i c a b i l i d a d d e l modelo se requiere modif icar el programa que Saucedo elaborcj, con las consideraciones convenientes para nuestro s istema.

For nuestras exper iencias y en compat-acibn con 105 resul tados de Saucedo, qu ien reporta gradientes radia les de temperatura de 5 O/cm podemos i n f e r i r , que e l mecanismo de t ramis ibn de ca lor convect ivo es mas e f i c i e n t e que e l conduct i vo, ya que a l tomar la fermentaci6n mas representat iva (U) y e l im inando l a d l t ima l ec tu ra a 47 cm, por cuest iones anter iormente abordadas, se observan g rad ien tes rad ia les de 0.22 O/cm y a x i a l e s de 0.06 O/cm. S i n embargo, cabe mencionar que la na tu ra leza ami lacea de l sustt-ato empleado por Saucedo, d i f i c u l t a aun m6s l a tramnsferencia de calor .

E l pH i n i c i a l no s u f r i d v a r i a c i o n e s a p r e c i a b l e s con respecto al pH f i n a l de l a FSS, posiblemente como consecuencia de l a amor t iguac ibn con fe r ida po r l a u rea y e l s u l f a t o de amonio, y p o r l o s componentes quimicos del c i t r i c o .

Por alt imo, con respecto a las caidas, de presidn, solo se recop i la ron datos de las FSS I y 11. Las caidas de pres ibn con e l t ranscurso de l t iempo s imulaban e l comportamiento del crecimiento, como l o r-epot-taron Revah (comunicacibn personal ) . Para las FSS restantes, se presentat-on incrementos y disminuciones en e l seguimiento de caida de pres ibn, que lo at r ibu imos a la formacibn de c o r r i e n t e s p r e f e n c i a l e s de a i r e o l a d i s m i n u c i b n p o r e l burbujeo en el volumen de agua &ida contenida en la cubeta receptora de esporas.

6 CONCLUSIONES

E l sistema d e a i t - e c i b n f u & d i s e f i a d o p a r a p r o v e e r un a i r e c o n f l u j o , temperatura y h u m e d a d q u e p u d i e r a n set- c o n t r o l a d o s .

L a t e m p e r a t u r a d e l ait-e pudo ser e s t a b i l i z a d a e n 35+0.1 OC, 5 i e l e q u i p o se u t i l i z a so lo ( s i n FSS).

La e f i c i e n c i a e n la t r a n s m i s i b n d e ca lor d e s d e e l a g u a d e c a l e n t a m i e n t o hasta el a ire d e n t r o d e la a u t o c l a v e , f u b d e l 97%; y d e s d e el a q u a h a s t a la e n t r a d a d e l b ioreac tor f u e d e l 87%.

L a humedad d e l air-e s u m i n i s t r a d o p u d o s e r r e g u l a d a y m a n t e n i d a c o n s t a n t e , d e n t r o d e u n r a n g o que va d e s d e l a humedad d e l a'ire a m b i e n t a l h a s t a l a s a t u r a c i b n .

En e l d e s a r r o l l o d e una FSS, l a t e m p e r a t u r a p u d o ser c o n t r o l a d a e n 35 + 2OC.

Para u n a mejor t -emocibn d e ca lor metabblico e n l a FSS d e l a c6scat-a d e n a r a n j a , f u b n e c e s a r i o a u m e n t a r la poros idad d e l s u s t r a t o s b l i d o , a l s e l e c c i o n a r e l tamaflo d e p a r t i c u l a y a d i c i o n a r b a g a z o d e caPla.

En un sistema d e FSS s i n a i s l a r y c o n u n a r e l a c i b n b a q a z o - c i t r i c 0 d e l 15% , se s n c a n t r b q u e se r e q u e t - i a d e un f l u j o d e 28 l / m i n p a r a l a r e m o c i b n d e calot- metabblico; pero se o b t u v o u n g r a d i e n t e d e h u m e d a d e s e n t r e el c e n t r o y l a p e r i f e r i a d e l 20%, e n c o n t r a n d o u n a h e t e r o g e n e i d a d en l a d i s t r i b u c i b n t - a d i a l d e la a c t i v i d a d e n z i m 6 t i c a .

Con e l a i s l a m i e n t o d e l sistema d e FSS, se e v i t b la f o r m a c i 6 n d e c o n d e n s a d o s e n l a p a r e d d e l bioreactor, q u e t-edundb e n e l decremento d e los g r a d i e n t e s d e humedad.

En l a FSS aislada, las c o n d i c i o n e s a n t e r i o r m e n t e sefialadas como las a d e c u a d a s p a r a u n a FSS s i n a i s l a r , c a r e c i e r o n d e v a l i d e z "

34

Se encontrcj a la t-elaci4n bagaro-citric0 de 17.5%, como l a mas conveniente y f l e x i b l e , q u e permitiej el aumento d e l f l u j o de a i r e y por ende, de l a t r a n s f e r e n c i a de c a l o r s i n que se presentaran problemas de compactaciejn.

Se 1ogr6 disminuir los yradientes de humedad entre la FSS s i n a i s l a r y l a FSS a i s l a d a , a l 50% y como consecuencia se obtuvo una actividad enzimatica mas homogenea.

Los g r a d i e n t e s a x i a l e s se lograron minimizar hasta 0.06 */cm y l o s r a d i a l e s h a s t a 0.22 O/cm. Concluyendo que e l mecanismo de transferencia de calor convectivo es mas e f i c i e n t e en l a remociejn de calot- matabdlico q u e e l conduct ivo r-eportado pot- Samcedo.

35 1

I I

RECOMENDACIONES

Cuando se pretenda lograr el acceso a l s e r v i c i o de a i r e seco, primero debe de percatarse de cet-rat- el acceso d e l s e r v i c i o d e a i r e h6medo. F11 hacer caso omiso a esta sugerencia, una pequefía cantidad de aqua ser6 succionada y a r ras t rada po r tuber ias y accesot-ios a l a descarga.

Cuando se requiera cambiar de un f l u j o de a i r e a l t o a uno bajo o v iceversa , debe va r ia rse g radua lmente e l f l u jo , con l a f i n a l i d a d d e e v i t a r aumentos o disminuciones bruscas de la temperatura , or ig inados por e l t iempo de res idencia da1 a i r e en los set-pentines de calentamiento o p o r l a d is ipaci6n pronunciada de ca lor (en e l caso de un f l u j o ba jo ) po r tuber ias y accesorios.

Se sug iere , p roveer a la autoclave de un s e r v i c i o de enf r iamiento m6s e f i c i e n t e . E s t e puede lo_qrat-se con l a inc lus ibn de un nuevo serpentin en e l que se c i r c u l e agua.

Durante una FSS, e l c o n t r o l a d o r de temperatura debe pt-ogr-amarse en una temperatura l igeramente infer ior ( 1 O ) a l a r e q u e r i d a como constante, ya su tiempo de respuesta se retarda cuando su termopar se encuentra dentro de un sus t ra to si61 i d o .

Se recomiendan estudios en el disefío de medios de C u l t i v o pat-a l o s p r i n c i p a l e s s u s t r a t o s b l i d o s f a c t i b l e s de aprovechar.

Es a c o n s e j a b l e o p f i m i z a r e l u s o d e l f l u j o de a i r e abastecido a una FSS, en e l s e n t i d o de que en l a etapa de germinacibn del hongo se debe suministrat- e l f l u j o minimo pat-a l l e v a r a l c u l t i v o a la temperatura Bptima, adem6s de que se ha demostrado que en atmbsfet-as con una a l t a concentracion de COS, la germinacibn es favorecida. Durante la e tapa de c rec imiento e l f l u jo debe set- e levado para lograr- l a remocidn de calor metabblico; y en la e tapa estacionaria, se debe de nueva cuenta diminuit- e l f l u j o .

Se debe contar con u n controlador y medidor de temperatura, que p o s e a v a r i a s s a l i d a s de s e n a l e s a n a l m i c a s que sean cap tut-adas por un computador; y de e s t a maner-a e v i t a r l a c o n t i n u a y enqot-rosa toma de lectut-as manuales durante e l desarrollo de una FSS.

Se debe disefiar un bioreactor el cual permita el muestre0 continuo para e l e s t u d i o de c i n e t i c a s de producc i bn.

Por 6ltimo, para lograr la completa automatizacibn del p r o c e s o , s e s u g i e r e , i n s t a l a r v a l v u l a s de abertura y cerrado automatico ( d e solenoide) que permita e l a c c e s o de un s e r v i c i o a o t r o , segun los requerimientos del desarrollo fermentativo.

37 I

REFERENCIfX

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I

38 i

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APENDICE I

Medios de cultivo:

DE RAIMEAULT PARA SUSTRATOS AMILACEOS

En la p r e p a r a c i d n d e 2008q d e material a f e r m e n t a r c o n una humedad i n i c i a l d e l 30% se pr-ecisa de :

PARA CITRIC0

C o m p o s i c i 6 n p o r c e n t u a l e n b a s e seca:

Medios de cultivo calculados

FERMENTACIONES PRUEBA

P a r a una t-espec t ivamen te ,

humedad y peso i n i c i a l d e l 50% y 2000g se t i e n e :

10. oog 42. 0(:)g o. 979

0.679 21.679

FSS EN BAGAZO DE CAflR-CASCARA DE C I T R I C 0

Para una humedad y p e s o i n i c i a l d e l respectivamente, se t iene :

Urea . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 . 4 0 ~ ~

FeS04 o. 529

MgSO4 o. 36y

(NH4 =SO, 22.68g

KzHP04 1 l. 70cJ

NOTA: Los ccl lculos se real izan tomando en exclus ivamente a l c f t r - ico .

Tecnicas analfticas

CONSERV~CION Y PROPAGACION DE LA CEPA

70% y 18009

cons i det-ac i 6n

Se empleb Ayat- Papa-Dextrosa (PIDA) de E I O X O N . Se suspenden 39q de PDA en un 1 i t r o de agua dest i lada

y se l l e v a a e b u l l i c i b n .

La so luc ibn ca l iente se rec ibe en tubos de ensaye (para la conset-vacibn de la cepa) y en matt-aces E.M. o b o t e l l a s pat-a propagacibn.

Los r e c i p i e n t e s con medio se e s t e r i l i z a n en autoclave a 15 l i b ras de p res ibn du rante 15 min.

Ge l i f icados los medios , son inbculados pot- azada en una area e s t i t - i 1 , incubandose a 30 OC durante 50 horas.

" " - .. "I___ "1

I 41

222185

HUMEDAD

Se u t i l i z c j crna balanza para la determinac ibn de humedad OHAtJS, con las s igu ien tes i ns t rucc iones :

Cerc iorarse que e l peso esti! en cero. Pesar l a muestra (para una precisibn aceptable se

recomienda un peso entre 5 y 109). Estab lecer e l t iempo de secado (15 min en nuest ro

cas;a). Encender- 1Ampat-a de calentamiento a 2 watts de

intensidad. Seguir una curva de secado y en e l momento en que

evapore men05 de 100 mg/min, considerar que l a p b r d i d a de agua f u e t o t a l .

Se emplet3 e l medidor de a c t i v i d a d de agua DECAGON. Se i n t roduce una c a j a a l a mitad de su n i v e l con l a

muestra a a n a l i z a r y se jespera 5 min para leer la medic ibn.

A C T I V I D A D ENZIMATICA

Las endopoligalacturonasas (endo-F) fueron medidas por v iscos imet r ia , en un v iscosimetro Brookf ie ld.

La mezcla de r e a c c i h c o n t i e n e una so luc ibn de pec t ina G r i n s t e d a l 2% y un m 1 de extracto enzimAtico crudo. El ensayo se r e a l i z a en e l v i s c o s i m e t r o a 45 OC dur-ante 10 m i n . Una unidad de endo-F (UD), se de f ine como l a c a n t i d a d de enzima necesar ia pa ra reduc i r a l S?% l a v i s c o s i d a d de una so luc ibn de pec t i na en 10 min.

La ext racc idn de l a s enximas se e f e c t ~ a a l p r e n s a r una mezcla de 1Og de agua con 1Oq de producto fermentado.

E l pH fui! determinado en e l ex t rac to enz ima t i co .

". 4 2

APENDICE I1

VARIACIONES EfN LA HUMEI FERMENT'ON I

-1 Oot09.%ts I í&13-l&51 4 1&56l7:30 I n;SO-l7:68 1 l7:55-~8rM) I 18t601iO~5 I 40~06-22Z23 I m23-2a56 1 4

2865-24:26 I 24t26-2&41 I 25:4+27:47 I 27:47-2809 1 4

2&08-2&(53 I

20:l7-42100 I 2&W-%hW 4

c I S I S I S I S 4 S 4 S M S 1

AD DEL AIRE

EQ" ~UMEDO lEC0 IUMEDO ¡ECO IUMEDO lEC0 IUMEDO lEC0 IUMEDO ;ECO IUMEDO ;ECO IUMEDO ;ECO IUMEDO

TABLA 3.1

VARIACION EN EL FLUJO DEL AIRE FERMENT'ON IV

E L i u a m d 20 39 43 49 43 49 64 60 65 20

TABLA 3.3

VARIACIONES EN LA HUMEDAD DEL AIRE FERMEWTAGION IV

00.0- 10.1 10.1-1&6 10.6- 1m.o 10.0- lt.4 10.4- lm.8 1m.8-10.4 80.4-10.7 80.7-801 80.0-81.0 81.0-814

81.4-81.7 81.7-81.@ 81.8-88.0

n.1-884

t u - a l . 4

n.o-m.1

n1-n.a

GRADIENTE A X I A L DE TEMPERATURAS ? l R M W W ~ o I I V

TABLA 4.2 A

GRADIENTE AXIAL DE TEMPERATURAS rmmtnwou v

TABLA 4.2 B

GRADIENTE AXIAL DE TEMPERATURAS FERMENTACION 111

9

8 -

T - 6 -

S -

4 -

6 . I O 16 20 26 a0 as 40 TllYIO (HORAl)

TABLA 4.1 A

GRADIENTE RAMAL DE TEMPERATURAS FERMENTACION 111

O

8 -

t -

8 -

6 -

A U U M D I m.6 am

4 -

3 -

Aw VS AcTlVADAD ENZMTICA FERMENTA#oNN

Aw VS ACTIVIDAD ENZIMATKX FERMENTACKM V

Aw VS ACTIVIDAD ENZMATICA FERMENT-I

Aw VS AcTlVlDAD ENZIMATICA FEtwANTmmlIv

k

Q R A D I E N T E S

D E

H U M E D A D E 8

25

20'

15

d

10 I

5

PERFIL AXIAL DE HUMEDADES CONJUNTO DE FERMENTACIONES

6.7 35.9 NIVELES AXIALIS EN LA COLUMNA (cm)

NIVELES RADIALES A FERMEN I "&+ FERMEN II -*- FERMEN 111

"Ef FERMEN IV "++ FERMEN V