xvi congreso uruguayo de patologÍa clÍnica · se considera un método aplicable como último...

XVI CONGRESO URUGUAYO DE PATOLOGÍA CLÍNICA VI Jornadas Uruguayas de Residentes de Laboratorio Clínico

I Jornadas de Citología Rioplatenses

6 – 8 de noviembre de 2016. Hotel Radisson. Montevideo

Curso: Aportes del Laboratorio Clínico en los estudios de la esterilidad y fertilización asistida.

Coordinadores: Dr. Julio Blanco y Dr. Pedro Cladera

El Laboratorio Andrológico

Dr. José María Montes.

Declaración de conflicto de intereses: Director General de Fertilab, Laboratorio de Análisis Clínicos

Co-Director del Banco de Gametos y Embriones Humanos del Uruguay Integrante del Centro de Esterilidad Montevideo (CEM)

Desarrollo del tema

• Concepto de andrología.

• La necesidad de un laboratorio específico.

• El laboratorio clínico andrológico diagnóstico.

• El laboratorio clínico andrológico preparativo.

• Criopreservación de semen.

• Micromanipulación del espermatozoide.

• Aseguramiento de la calidad

• Casos.

El poder de un cambio de paradigma

• De la infertilidad conyugal centrada en la mujer a la infertilidad conyugal centrada en la pareja.

• El surgimiento de una nueva especialidad médica: Andrología.

Desarrollo del tema








• Casos.

Asuntos semánticos

• Semen, esperma o eyaculado.

• Seminograma, espermograma, espermatograma, espermiograma.

• Gameto o gameta.

• Esterilidad o infertilidad.

• Spz

ESPERMOGRAMA Un rey con pies de barro

¿Qué es? • Es el estudio del semen que

correctamente realizado y adecuadamente interpretado informa al médico sobre: – Espermatogénesis – Funcionalidad espermática – Función de glándulas anexas – Permeabilidad de la vía – Existencia de infección – Existencia de inmunidad

¿Qué no es?

Espermograma según OMS 2010 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen. Fifth

Edition. World Health Organization. 2010.

Técnicas habituales – Estudio físico-químico:

volumen, licuefacción, viscosidad, apariencia y pH.

– Recuento espermático.

– Motilidad espermática.

– Vitalidad espermática.

– Morfología espermática.

– Anticuerpos antiespermáticos de superficie.

– Agregación y aglutinación espermáticas.

– Células redondas (recuento y diferenciación).

Técnicas opcionales

– Índices teratozoospérmicos.

– Interacción semen-moco.

– Bioquímica seminal.

– CASA.

Técnicas“investigacionales”

– ROS.

– Interacción spz-ovocito.

– Unión a zona pelúcida.

– Reacción acrosómica.

– Test de hámster

– Estudios de la cromatina.

Espermograma • “Piedra angular del diagnóstico andrológico”. • Un análisis clínico muy especial:

– Estudia una muestra biológica que no existe… – No analiza una alícuota de un universo mayor. – Condiciones preanalíticas falibles. – Muchas determinaciones diferentes. – Gran componente subjetivo. – Variabilidad biológica grande. – Variabilidad técnica importante. – Difícil de automatizar. – Intervalos de referencia arbritarios y cambiantes. – Solapamiento entre poblaciones fértil e infértil. – No se ajusta al motivo por el cual se solicita.

No basta sólo con el espermograma

• Es variable

• Es subjetivo

• Es inespecífico. La respuesta tubular es monocorde.

• Es actual. No tiene valor evolutivo

• Es poco discriminatorio. Poblaciones fértiles e

infértiles se solapan.

• Es probabilístico.

ESHRE June 2002

• From the results of semen we can never predict whether a specific man can become a biological father or not.

• There are no specific properties one can measure in the whole population of sperm that specifically reflect the fertilizing capacity of the very small number of sperm which are able to reach the site of fertilization.

• The results of semen analysis have been used to categorize men into groups with different probabilities of achieving pregnancy within a certain time period.

Las pruebas funcionales espermáticas surgen como

respuesta a las limitaciones del espermograma para definir con precisión la fertilidad del varón.

“However, even if semen analysis is done with the utmost care, its

predictive value remains limited. Reliable sperm function tests do not yet exist and urgently required” (ESHRE, Capri Workshop, 1996)

En busca de la piedra filosofal

“El test de fertilidad” Pruebas funcionales espermáticas

• Interacción semen-moco cervical (Kremer, 1965).

• Recuperación de spz móviles.

• Test de sobrevida espermática.

• Hiperactivación (CASA)

• Reacción acrosómica (Henkel y col. 1993)

• Unión a zona pelúcida (Oehninger y col. 1992)

• Test de hámster (Barros y col. 1978)

• Decondensación de la cromatina.

Lugar actual de las PFE

• Son pruebas difíciles de estandarizar • Adolecen de baja reproducibilidad • Algunas son complejas de implementar • Han perdido parte de su interés con el

advenimiento del ICSI. • Quedan reservadas para tres propósitos:

– Asistir en la toma de decisión sobre la técnica de reproducción asistida a implementar.

– Evaluación de resultados y efectos adversos de los tratamientos.

– De investigación.

Una vuelta de tuerca

El daño bioquímico.

• Principio general de la patología.

• Estrés Oxidativo (EOx) o Nitrooxidativo (ENOx)

• ROS: Hidroxilo (OH-), superóxido (O2-), óxido nítrico (NO-), peróxido (RO2-),

lipoperoxil (LOO-), lipoperóxidos (LOOH), ozono (O3), peroxidonitrito (ONOO-), tiol (RS), ác. hipoclórico (ClOH), …

• Daño celular:

– Etapa reversible

– Etapa irreversible

Gran interés actual en el ENOx por su correlación con:

• Disminución de la capacidad fecundante

• Alteración del desarrollo embrionario

• Abortos

• Defectos congénitos

• Cáncer pediátrico

Tremellen K, Aitken RJ, Chen SJ, Agarwal A, entre otros.

Spz es especialmente sensible al ENox: Escasos mecanismos protectores del daño por ROS

Alto contenido de PUFAs en la membrana Expuesto a la “intemperie”

Los “talones de Aquiles” espermáticos:

• Fosforilación oxidativa

• Membranas celulares

• Citoesqueleto

• Síntesis proteica

• Cromatina

Consecuencias inmediatas

• Disminución del ATP intracelular

• Lipoperoxidación a nivel de membranas

• Determina:

– Disminución de la motilidad

– Disminución de la vitalidad

– Alteraciones morfológicas a nivel de la cabeza, pieza intermedia y cola.

Eox y su rol dual Tomado de : Effect of Oxidative Stress on male reproduction. Agarwal A y col. World J Mens Health. Apr 25, 2014; 32(1):1-17.

Valorar el ENOx por el laboratorio

• Métodos directos: – Quimioluminiscencia – Resonancia espin electrónica – Nitroblue tetrazolium test

• Métodos indirectos: – Medida del ATP espermático – A nivel de la membrana espermática:

• Medición del MDA • THO

– A nivel de la motilidad espermática • Test de sobrevida espermática • Recuperación de espermatozoides móviles • Test de estrés espermático modificado (MOST) • Velocidad espermática (CASA)

– A nivel de la cromatina espermática: • TUNEL • COMET • Test de azul de anilinina

• Evidencias sugerentes en el espermograma estándar: – Hiperviscosidad seminal (debido al malon-dihialdehído, MDA). – Leucocitospermia – Espermatozoides inmaduros

Métodos para detectar fragmentación del ADN espermático

• Pruebas directas: – TUNEL (Terminal deoxinucleotidyl transferase-mediated

deoxiUridine triphosfhate-Nick End Labeling) – ISNT (In situ nick translation) – COMET a pH neutro (Electroforesis de células únicas).

• Pruebas indirectas: – SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay). – TNA (Test de Naranja de Acridina). – SCD (Sperm Chromatin Dispersion test). – COMET a pH ácido (Electroforesis de células únicas). – DBD-FISH (Dna Breakage Detection Fluorescense In Situ

Hybridization).

Desarrollo del tema








• Casos.

ART (TRA): Técnica de Reproducción Asistida

Es todo procedimiento en el cual se maneja, o bien, el gameto masculino o bien, ambos gametos (masculino y femenino) con el propósito de:

Lograr el embarazo en parejas infértiles. Minimizar el riesgo de contagio infeccioso en parejas sero-discordantes fértiles e infértiles. Evitar el riesgo de transmitir enfermedad genética de uno de los integrantes de la pareja a la descendencia en parejas fértiles e infértiles.

“Fuentes” de espermatozoides

• Eyaculado

– Por masturbación

– Por coito condomatoso

– Por coito interrupto

– Por vibración

• Orina

• Epidídimos

• Testículos

Técnicas de reproducción asistida

De baja complejidad:

Inseminación artificial (IA)

De alta complejidad:

Transferencia intratubaria de gametos (GIFT)

Fecundación in vitro (FIV ó IVF)

Inyección intracitoplasmática de Spz (ICSI)

¿Por qué hay que “preparar” el semen para las “ARTs”.

Los spz capaces de fecundar al óvulo son una población reducida, seleccionada y capacitada de la población total de spz eyaculados.

El plasma seminal contiene, por un lado, sustancias descapacitantes del spz y, por otro, sustancias (prostaglandinas, linfoquinas, citoquinas, etc) y elementos formes (espermatozoides degenerados, macrófagos, polimorfonucleares) nocivos -incluso letales- para la mujer. En condiciones normales no alcanzan la cavidad uterina.

Los métodos de preparación de semen mejoran los resultados en términos de tasa de embarazo.

Es obligatorio para toda ART excepto la IA con depósito del semen en el fondo de saco vaginal. No hacerlo es considerado una práctica de lesa medicina.

Preparación de semen. Objetivo.

•Producir una alta concentración de spz móviles eumórficos competentes para la fecundación y a su vez, libre de plasma seminal, spz alterados, células redondas y microorganismos.

•Pero... ¿Cuán alta?

Preparación de semen. Métodos.

•Lavado (sperm wash)

•Migración (swim up)

•Filtración

•Centrifugación en gradiente de densidad

Sperm wash. Kaskarelis y Comninos, 1959.

Una vez licuada la muestra de semen se diluye con medio de cultivo (Ham's F10, Hepes tamponado) o con suero fisiológico tamponado en la proporción de 1:1 a 1:3.

La suspensión se centrifuga por 10 min a 150-200g o por 3 min a 500g.

Se descarta el sobrenadante y el pellet resultante se resuspende en un volumen de 0.3 a 0.5 mL de medio de cultivo.

El procedimiento puede repetirse una o dos veces más.

El lavado espermático permite separar las células (spz y otras) del plasma seminal pero no permite seleccionar una población de spz competentes ni separarlos de células redondas.

Se considera un método aplicable como último recurso en muestras seminales oligozoospérmicas extremas que no puedan ser procesadas por otros métodos preparativos.

Swim-up. Lopata y col. 1976.

Después de lavado (ver sperm wash) y concentrado de los spz, el pellet resuspendido en poco volumen es dividido en varios tubos de fondo redondeado y se coloca encima (conservando la interfase) 0.5 mL de medio de cultivo.

Los tubos son incubados inclinados (30º) por 30 a 60 min a 37ºC en atmósfera de 5% de CO2 permitiendo así que los spz móviles “naden” hacia la fase superior dejando en la inferior spz inmóviles, células, microorganismos, etc.

Se colecta el sobrenadante de todos los tubos evitando destruir la interfase. Se ajusta el volumen final a 0.5 mL.

El swim up permite obtener una excelente o muy buena muestra casi pura de spz móviles eumórficos, pero la tasa de recuperación es baja o muy baja (sólo del 10% dependiendo de las propiedades físico-químicas del semen y de los volúmenes empleados en las fases inferiores).

Centrifugación en gradiente de densidad. Pertoft y col. 1977.

Spz normales, spz amorfos, células redondas y bacterias tienen diferentes densidades.

•Separación de spz móviles mediante centrifugación 10-20 min a 200-600g en gradiente de densidad discontinuo (90% y 45%) de partículas de sílice coloidal estabilizadas con enlace covalente de silanos hidrófilos (SpermGrad, SupraSperm). •El pellet es lavado y resuspendido para inseminar en 0.3-05 mL de medio de cultivo.

Diferencias entre los métodos de preparación de semen

Técnica Tipo de

muestra de semen a procesar

Recuperación spz móviles

Selectividad spz móviles

Tiempo de trabajo (min)

Costo

Sperm wash Mala Alta Baja 15 Bajo

Swim up Buena Baja Alta 90 Medio

Separación por

gradiente Regular Media Media 30 Alto

Desarrollo del tema








• Casos.

El spz puede ser criopreservado. Fertilidad diferida y fertilidad sustituida.

1776. Spallanzani informó que muestras de semen congeladas en nieve contenían spz que podían ser “reanimados” al descongelarlos.

1866. Mantegazza comunicó la sobrevida de los spz a -17ºC y sugirió por primera vez el banco de semen.

1949. Polge descubrieron el efecto crioprotector del glicerol.

1953. Sherman comunicó el primer embarazo con semen congelado con glicerol en hielo seco.

1964. Perloff informó el primer embarazo con semen congelado con glicerol en nitrógeno líquido. Primeros bancos de semen en USA y Japón.

1970 y +. Se desarrollaron los bancos de semen en el mundo.

1978. Primer Encuentro Internacional de Criopreservación de Semen Humano. Primer banco de semen en España.

1986. Se funda el Banco de Semen en el Uruguay.

Misión del banco de semen

Conservar espermatozoides

vitales y funcionales, por tiempos prolongados (décadas) con el fin de emplearlos en forma diferida para lograr el embarazo por medio de técnicas de reproducción asistida.

Criopreservación de semen

Es un procedimiento médico estandarizado. Sherman (1986), Schill and Bollmann

(1986), Brotherton (1990), Quinn (1993), Van der Elst (1997), Agca and Critser (2002), Hovatta (2003), Anger (2003).

La demanda del servicio se ha incrementado en las últimas décadas por:

La mejora en las tasas de sobrevida de los pacientes oncológicos

El advenimiento del ICSI

La aparición del sida.

La donación de semen

Daños.

• Dependientes de la magnitud y grado de reversibilidad de las alteraciones (químicas, eléctricas, térmicas) que se producen a nivel de las membranas celulares.

• Dependientes en forma inversa de la complejidad del sistema celular. • Momentos críticos:

– Fase inicial de la congelación – Fase de descongelación y vuelta a las condiciones fisiológicas.

• Fisiopatología: – Choque térmico (choque por frío). De 37 a 0 grado Celsius. Puede mitigarse

con agentes crioprotectores, fosfolípidos, congelación lenta y pre-incubado en medio con elevado contenido salino.

– Choque (estrés) osmótico (deformación celular y exposición a concentraciones elevadas de solutos). Es mayor con baja velocidad de enfriamiento.

– Formación de hielo intracelular (“Choque espicular”). De 0 a -132 grados Celsius. Es mayor con alta velocidad de enfriamiento.

Fenómenos bioquímicos durante la congelación

• Los sistemas enzimáticos se “paran”.

• No se produce energía.

• El transporte activo y la difusión facilitada cesan; el transporte pasivo y osmótico continúan.

• Las membranas “se endurecen” (transición de fase fluida a gel) y con ello se vuelven frágiles y de semipermeables se hacen impermeables al agua. Choque térmico o Shock por frío (Cold shock).

• La célula se deshidrata.

• El agua se congela.

Los agentes crioprotectores (CPA)

• Modifican las propiedades físico-químicos de las soluciones acuosas en las cuales ocurre la criopreservación.

• Son sustancias hidrosolubles de baja toxicidad que disminuyen el punto crioscópico de una solución.

• Lo anterior determina que cuando empiece la formación de hielo la célula será menos vulnerable.

Tipos de crioprotectores

• Penetrantes (PM bajo; congelación lenta): – 1,2-Propanodiol (PROH). – Dimetilsulfóxido (DMSO) – Etilen-glicol (EG) – Glicerol

• No Penetrantes (PM alto; congelación rápida): – Sacarosa – Glucosa – Polivinilpirrolidona (PVP) – Dextrano – Polietilen-glicol (PEG)

Protocolos de criopreservación

• No existe “el protocolo”.

• Dependen del sistema celular.

• Dependen de los crioprotectores usados.

• Se clasifican según la temperatura en función del tiempo:

– Lenta (0,5°/min hasta los -80°).

– Rápida (2500°/min)

– Ultra-rápida o vitrificación (> 30,000°/min)

Aplicaciones médicas

Criopreservación de semen propio

Criopreservación de semen donado

Indicaciones de la criopreservación de semen propio

Preservación de la capacidad reproductiva de hombres fértiles o sub-fértiles que

se expondrán a riesgo real o potencial de perderla (quimioterapia, radioterapia,

cirugía, tóxico ambiental o bélico, gonadopatía progresiva, previo a la vasectomía).

Disponibilidad de semen en períodos de ausencia.

Respaldo de muestra en los programas de reproducción asistida.

Almacenamiento de espermatozoides extraídos de testículo, epidídimo, orina.

Acumulación de semen en casos de subfertilidad.

Bioseguridad en pacientes infectados (HIV, hepatitis C) con carga viral

indetectable.

Disfunciones eyaculatorias.

Postergación de la fertilidad.

2 0 1 0

6 4 9 10

20

32

42 37

50

62 63

71 76

59

68 71 69

87

93

83 78 77

103

118

139

0

20

40

60

80

100

120

140

Casos nuevos criopreservados por año -Fertilab-

Estadística Banco de Semen Propio (Período 1987-2015) - MOTIVOS

Número de consultas: 1558 Número de casos criopreservados: 1528 Número de pacientes: 1397

Motivos: oncológicos 555 40.2 % respaldo de TRA 551 39.9 % biopsia testículo/asp.epidídimo 118 8.5 % ausencia 101 7.3 % pre vasectomía 15 1.1 % epg deficitario 11 0.8 % enfermedad autoinmune 8 0.6 % en tránsito 7 0.5 % retroeyaculación 5 0.4 % varicocele 4 0.3 % bioseguridad 4 0.3 % trastornos eyaculatorios 3 0.2 %

Sustituir la fertilidad: Inseminación artificial con semen donado

• Médicas – Infertilidad conyugal de causa masculina absoluta y

definitiva, refractaria a tratamiento.

– Enfermedad hereditaria del hombre que no desea transmitir a su descendencia.

– Enfermedad infecciosa del hombre que no desea transmitir a su compañera.

– Mujer Rh negativa sensibilizada al factor Rh con esposo Rh positivo.

• Sociales

Selección de donantes Pre-requisitos: Hombre sano entre 18 y 34 años

Educación secundaria Fin altruista y anónimo

Selección: Interrogatorio y examen médico

Evaluación psicológica Estudio de semen con cultivo (micoplasmas y chlamidias) y prueba de

criotolerancia Estudio de sangre (chequeo metabólico, hemograma, infecciosas, cariotipo y

mapeo de portador genético)

Participación: Entregar muestras de semen para lograr hasta 25 nacidos

Control sanguíneo periódico hasta seis meses después de finalizada su participación

Firmar consentimiento informado Aceptar que el anonimato puede ser levantado por el concebido

Cumplir con las formalidades del banco

BANCO DE SEMEN DE DONANTES DATOS EVOLUTIVOS

FERTILAB mayo 2015

(datos hasta año 2014 finalizado)

PERÍODO 1991-2014 TOTAL IIU FIV-ICSI

Nº DONANTES (1-240) 69

Nº PACIENTES 871 793 75

Nº CASOS (ingreso + reingreso) 1022 928 89

Nº DE PROCEDIMIENTOS 3300 3063 220

28

68 59

103 101

133 115

148

173 171

223 230 228

202

287

0

50

100

150

200

250

300

350

1999 2001 2003 2005 2007 2009 2011 2013 2015

Nº TOTAL DE CICLOS/AÑO

0

10

20

30

40

50

60

2000 2002 2004 2006 2008 2010 2012 2014

Motivo de ingreso según el año

Factor masculino

Mujer sola

Pareja homosexual

Alteración cromosómica

Tumor testicular

Enf. Transmisión sex

Respaldo

Desarrollo del tema








• Casos.

Aseguramiento de la calidad

• Forma parte imprescindible de la actividad del laboratorio clínico que procura demostrar y evaluar de manera objetiva y documentada la validez de los procedimientos utilizados para generar datos confiables.

• Presupone: – La existencia de un sistema de control de calidad de las mediciones. – La existencia de un sistema de documentación (Manual de procedimientos). – Técnicos entrenados. – Múltiples puntos de control.

• Pocos laboratorios andrológicos tienen implementado sistemas de aseguramiento de la calidad.

• La mayoría tienen sistemas de gestión de la calidad que controlan otros aspectos del trabajo de laboratorio apoyando al área de andrología que por las características del espécimen en estudio lo hacen difícil de estandarizar.

• Se necesita de un sistema de control de calidad externo.

Desarrollo del tema








• Casos.

Ejemplo 1

Volumen: 0.8 mL

Color: Blancoamarillo

pH: 7,8

Recuento: 20: spz/mL

Motilidad: 4 21 25 50 %

Morfología 2 %

Cinc: 1,0 mcmol/eyac

a-glucosidasa:120 mU/eyac

Fructosa 9,8 mg/eyac

3,1 mL

Blancoamarillo

7,6

95: zoides/mL

28 25 15 32 %

16%

5,3 mcmol/eyac

250 mU/eyac

8,5 mg/eyac

Ejemplo 2

Volumen: 0.5 mL Color: Blanco pH: 6,8 Recuento: 0: spz/mL Motilidad: ----- Morfología (Kruger) ------ Cinc: 5,0 mcmol/eyac a-glucosidasa: < 10 mU/eyac


Ejemplo 3

Volumen: 1,5 mL Color: Blancoamarillento pH: 8,2 Recuento: 50: spz/mL Motilidad: a: 3% b: 10% c: 45% d: 42% Vitalidad: 40 % Morfología (Kruger) 3 % Células redondas: 6:/mL POX positivas: 80% SWIM UP: 5: /mL Cinc: 1,8 mcmol/eyac a-glucosidasa: 180 mU/eyac


Ejemplo 4

Volumen: 3,5 mL Color: Blancoamarillento pH: 7,8 Recuento: 50: spz/mL Motilidad: a: 3% b: 10% c: 45% d: 42% Vitalidad: 80 % Morfología (Kruger) 3 % Células redondas: 6:/mL POX positivas: 5% SWIM UP: 5: /mL Cinc: 3,6 mcmol/eyac a-glucosidasa: 580 mU/eyac


Ejemplos 3 y 4

Volumen: 1,5 mL

Color: BA

pH: 8,2

Recuento: 50:

Motilidad: 3% 10% 45% d: 42%

Vitalidad: 40 %

Morfología (Kruger) 3 %

Células redondas: 6:/mL

POX positivas: 80%

Swim up: 5:

Cinc: 1,8

a-glucosidasa: 180

Fructosa 1,5

Volumen: 3,5 mL

Color: BA

pH: 7,8

Recuento: 50:

Motilidad: 3% 10% 45% d: 42%

Vitalidad: 80 %

Morfología (Kruger) 3 %

Células redondas: 6:/mL

POX positivas: 5 %

Swim up: 5:

Cinc: 3,6

a-glucosidasa: 580

Fructosa 4,5

Ejemplo 5

Volumen: 4,0 mL Color: Blancoamarillento pH: 7,8 Recuento: 150: spz/mL Motilidad: a: 40% b: 20% c: 15% d: 25% Vitalidad: 90 % Morfología (Kruger) 16 % Células redondas: 0,1:/mL POX positivas: 5% SWIM UP: 45: / mL Cinc: 5,6 mcmol/eyac a-glucosidasa: 710 mU/eyac


Departamento de Espermología de Fertilab

Equipo Doctora en Medicina: Mariel Cánepa. Licenciadas en Bioquímica: Carla Bonelli Carolina Surka Licenciadas en Laboratorio: Verónica Acosta Valeria Mariatti Natalia Méndez Adriana Rodríguez Gissel Rovira Andrea Torrens Administrativas: Andrea Burgos Fernanda Caselli Rossana Mautone

xvi congreso uruguayo de patologÍa clÍnica · se considera un método aplicable como último...

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