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XXVII Congresso Interamericano de Engenharia Sanitária e Ambiental ABES - Associação Brasileira de Engenharia Sanitária e Ambiental 1 VII-031 - IMPLEMENTACIÓN DE UN MÉTODO INMUNOLÓGICO (ELISA) PARA DETECCIÓN DE CONTAMINACIÓN POR AMIBAS EN AGUA SUPERFICIAL José Javier Sánchez Chávez (1) Biólogo, Univ. Nacional Autónoma de México, Maestría en Ciencias (Biología). UNAM. Experiencia: 16 años en limnología (Eutroficación de embalses) y microbiología del agua (Protozoarios y helmintos). Posición actual: Investigador, laboratorio de Calidad del Agua. IMTA. Profesor de posgrado en Limnología (DEPFI-UNAM). Asociaciones: FEMISCA, North American Lake Management Society (NALMS). Luis Alberto Bravo Inclán Biólogo, Univ. Nacional Autónoma de México, Maestría en Ciencias, (Biología), UNAM. Experiencia: 12 años en limnología (Calidad del agua en embalses y manejo integral de cuencas) y microbiología del agua (Detección de bacterias patógenas por PCR). Posición actual: Investigador, laboratorio de Calidad del Agua, IMTA. Asociaciones: FEMISCA. Juan Leodegario García Rojas Biólogo, Univ. Nacional Autónoma de México, Maestría en Ciencias, (Biología) UNAM. Experiencia 16 años en tecnología enzimática, biosensores y microbiología del agua (Detección de Vibrio cholerae por ELISA. Posición actual: Investigador, laboratorio de Calidad del Agua, IMTA, Jefe del área de Microbiología. Asociaciones: FEMISCA, Sociedad Mexicana de Biotecnología y Bioingeniería. Alicia Lerdo de Tejada Brito Biólogo, Univ. Nacional Autónoma de México, Maestría en Ciencias, (Biología), UNAM. Experiencia: 12 años en hidrobiología (Toxicología acuática). Posición actual: Investigador, laboratorio de Toxicología, IMTA. Asociaciones: FEMISCA. Dirección (1) : Paseo Cuauhnáhuac, 8532 - Col. Progreso - Jiutepec - Mor - CP. 62550 - México - Tel. y Fax: (73) 19-4281 - e-mail: [email protected] RESUMEN Entamoeba histolytica (Eh), es un protozoario que provoca la amibiasis y que además de transmitirse principalmente por alimentos, también se puede transmitir por agua. Este organismo normalmente se encuentra en baja concentración en el agua, sin embargo, esto no reduce su alto potencial de patogenicidad. En este trabajo, se adaptó una metodología inmunológica normalmente referida como ELISA (Enzime Linked Immuno Sorbent Assay) para la detección de Eh en agua, la metodología fue estandarizada en muestras de agua sintética y posteriormente, aplicada en muestras ambientales. De acuerdo a los resultados, esta metodología puede aplicarse con una sensibilidad y especificidad altas para determinar la contaminación por amibas en aguas naturales y aguas residuales, que pueden estar relacionadas con fuentes de abastecimiento y distribución de agua para uso y/o consumo humano. PALABRAS-CLAVE: Entamoeba histolytica, Técnica Inmunológica, ELISA, Detección de Amibas en Agua, Protozoarios, Aguas Superficiales. INTRODUCCIÓN Existen aproximadamente 11,300 especies de amibas (Lugo y Sánchez, 1995), se presentan en hábitats que incluyen aire, suelo y agua. Se clasifican como especies patógenas (que parasitan al hombre o animales), y no patógenas (que son de vida libre). Desde el punto de vista taxonómico se agrupan en Gimnamebas (amibas desnudas), que carecen de una estructura rígida externa y viven en ambientes acuáticos como el mar, ríos y lagos; en amibas testadas que presentan una concha o testa que las cubre; finalmente, así también se reconocen otras especies de amibas que presentan un esqueleto interno. Los quistes de amibas son esféricos con dimensiones que oscilan entre 10 y 20 μm en estado maduro, presentan cuatro núcleos, dichos núcleos presentan endosoma central, discreto y brillan como puntos luminosos al microscopio.

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XXVII Congresso Interamericano de Engenharia Sanitária e Ambiental

ABES - Associação Brasileira de Engenharia Sanitária e Ambiental 1

VII-031 - IMPLEMENTACIÓN DE UN MÉTODO INMUNOLÓGICO (ELISA)PARA DETECCIÓN DE CONTAMINACIÓN POR AMIBAS EN AGUA

SUPERFICIAL

José Javier Sánchez Chávez(1)

Biólogo, Univ. Nacional Autónoma de México, Maestría en Ciencias (Biología). UNAM.Experiencia: 16 años en limnología (Eutroficación de embalses) y microbiología del agua(Protozoarios y helmintos). Posición actual: Investigador, laboratorio de Calidad del Agua.IMTA. Profesor de posgrado en Limnología (DEPFI-UNAM). Asociaciones: FEMISCA,North American Lake Management Society (NALMS).Luis Alberto Bravo InclánBiólogo, Univ. Nacional Autónoma de México, Maestría en Ciencias, (Biología), UNAM.Experiencia: 12 años en limnología (Calidad del agua en embalses y manejo integral decuencas) y microbiología del agua (Detección de bacterias patógenas por PCR). Posición actual: Investigador,laboratorio de Calidad del Agua, IMTA. Asociaciones: FEMISCA.Juan Leodegario García RojasBiólogo, Univ. Nacional Autónoma de México, Maestría en Ciencias, (Biología) UNAM. Experiencia 16años en tecnología enzimática, biosensores y microbiología del agua (Detección de Vibrio cholerae porELISA. Posición actual: Investigador, laboratorio de Calidad del Agua, IMTA, Jefe del área deMicrobiología. Asociaciones: FEMISCA, Sociedad Mexicana de Biotecnología y Bioingeniería.Alicia Lerdo de Tejada BritoBiólogo, Univ. Nacional Autónoma de México, Maestría en Ciencias, (Biología), UNAM. Experiencia: 12años en hidrobiología (Toxicología acuática). Posición actual: Investigador, laboratorio de Toxicología,IMTA. Asociaciones: FEMISCA.

Dirección(1): Paseo Cuauhnáhuac, 8532 - Col. Progreso - Jiutepec - Mor - CP. 62550 - México - Tel. y Fax:(73) 19-4281 - e-mail: [email protected]

RESUMENEntamoeba histolytica (Eh), es un protozoario que provoca la amibiasis y que además de transmitirseprincipalmente por alimentos, también se puede transmitir por agua. Este organismo normalmente seencuentra en baja concentración en el agua, sin embargo, esto no reduce su alto potencial de patogenicidad.En este trabajo, se adaptó una metodología inmunológica normalmente referida como ELISA (Enzime LinkedImmuno Sorbent Assay) para la detección de Eh en agua, la metodología fue estandarizada en muestras deagua sintética y posteriormente, aplicada en muestras ambientales. De acuerdo a los resultados, estametodología puede aplicarse con una sensibilidad y especificidad altas para determinar la contaminación poramibas en aguas naturales y aguas residuales, que pueden estar relacionadas con fuentes de abastecimiento ydistribución de agua para uso y/o consumo humano.

PALABRAS-CLAVE: Entamoeba histolytica, Técnica Inmunológica, ELISA, Detección de Amibas enAgua, Protozoarios, Aguas Superficiales.

INTRODUCCIÓNExisten aproximadamente 11,300 especies de amibas (Lugo y Sánchez, 1995), se presentan en hábitats queincluyen aire, suelo y agua. Se clasifican como especies patógenas (que parasitan al hombre o animales), y nopatógenas (que son de vida libre). Desde el punto de vista taxonómico se agrupan en Gimnamebas (amibasdesnudas), que carecen de una estructura rígida externa y viven en ambientes acuáticos como el mar, ríos ylagos; en amibas testadas que presentan una concha o testa que las cubre; finalmente, así también sereconocen otras especies de amibas que presentan un esqueleto interno. Los quistes de amibas son esféricoscon dimensiones que oscilan entre 10 y 20 µm en estado maduro, presentan cuatro núcleos, dichos núcleospresentan endosoma central, discreto y brillan como puntos luminosos al microscopio.

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La manera de adquirir la amibiasis es a través de ingestión de quistes o trofozoitos, ya sea por alimentossólidos o líquidos; en términos generales la mayor proporción de gente afectada se contagia por alimentossólidos, ya que el protozoario se reproduce en éste medio. En México y América Latina, se ha detectado queexiste una cantidad elevada de descargas de agua residual que tienen posibilidad de contaminar las redes dedistribución de agua potable, dichas descargas pueden estar contaminadas con Eh y por lo tanto, existe unmayor riesgo de adquirir la enfermedad a través del agua para consumo humano.

Mundialmente la amibiasis está catalogada como la tercera parasitosis causante de muerte, del 10 al 30% dela población se considera infectada y entre el 1 y 2% sufre de la enfermedad, presentando una mortalidadmayor a 100 mil decesos cada año (WHO, 1997). En Latinoamérica, se agrava la amibiasis por dos aspectos:

a) se ubica principalmente dentro de climas tropicales y subtropicales, sitios en donde se desarrollan con mayorfrecuencia enfermedades intestinales, b) debido a las malas condiciones socioculturales y sanitarias de la poblaciónrural. Hoy día está considerada, después del paludismo y la esquistosomiasis, la enfermedad parasitariagastrointestinal más importante (Conde y Mora, 1992). Por ello, es indispensable su detección, así como elestudio de las vías de infección y mecanismos que permitan evitar la propagación de estos organismos patógenos.

A pesar de que las bacterias han sido utilizadas por normatividad como el único indicador de la calidadmicrobiológica del agua, se ha reunido suficiente evidencia que indica que las bacterias, no son adecuadaspara predecir la presencia de virus o protozoarios. Para evaluar con precisión la presencia de enteropatógenos(bacterias, protozoarios, virus o helmintos) en agua, se requiere que cada uno sea evaluado por separado(Helmer, et al., 1991; Margolin, 1997), de tal manera que las interferencias con otros organismos tambiénpuedan ser discriminadas mediante pruebas cruzadas de especificidad, como lo llevan a cabo las reaccionesinmunológicas del complejo antígeno-anticuerpo.

De todos los casos de enfermedades gastrointestinales transmitidas por agua, solamente el 50% son atribuidosa microorganismos específicos, toxinas o químicos; hace 40 años se pensaba que Gardia lamblia era inocua yCryptosporidium parvum y Escherichia coli enterotoxigénica eran del todo desconocidos. En la actualidad,existen reportes de gastroenteritis causadas por especies de Microsporidia sp., Ciclospora sp., Isospora sp. yBlastocystis hominis en individuos inmunocomprometidos (LeChevallier, et al. 1990). Estos protozoariosestán emergiendo como potencialmente riesgosos para la salud humana por hidrotransmisión y sin embargo,aún no existen métodos para su detección en muestras clínicas o ambientales. El desarrollo de estos métodospermitirá una mejor vigilancia epidemiológica y la capacidad de monitorear estos organismos.

Según Helmer, et al. (op. cit.), existen cuatro vías de transmisión de organismos patógenos, desde su origenfecal hasta su regreso al huesped humano (ver fig. 1):

Figura 1. Principales vías de exposición humana a patógenos en el ambiente acuático.

Mariscos AguaPotable

AguaSuperficial y Subterránea

Plantas

Consumo

ConsumoContacto

Irrigación

Descarga

Extracción

Tratamiento

Descarga Excretas, agua residual

Aguascosteras

SueloExcreciónPatógenos

Cultivode mariscos

Consumo

Infiltración

CosechaHOMBRE

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• Abastecimiento de agua potable, aguas superficiales, o subterráneas contaminadas;• Actividades recreativas en aguas costeras, particularmente deportes de contacto corporal con el agua;• Consumo de mariscos contaminados, especialmente cuando se comen crudos;• Irrigación de cosechas con agua residual doméstica/municipal.

La detección, cuantificación y/o identificación de microorganismos enteropatógenos en agua es importante,debido a la gran cantidad de enfermedades adquiridas por hidrotransmisión. Según García et al. (1998), entrelos principales patógenos que pueden ser transmitidos por el agua en México destacan los siguientes Tabla 1:

Tabla 1. Patógenos que pueden ser transmitidos por el agua.Organismo Patógeno Efectos en la saludProtozoarios Cryptosporidium parvum

Entamoeba histolyticaGiardia lambliaNaegleria fowleri

- Diarrea- Disentería amibiana- Diarrea acuosa- Meningoencefalitis.

Bacterias Campylobacter jejuniEscherichia coliLegionella pneumophilaSalmonella spp.Shigella spp.Vibrio choleraeYersinia enterocolitica

- Gastroenteritis (disentería)- Gastroenteritis (diarrea acuosa, a veces sanguinolenta)- Infección respiratoria aguda- Tifoidea y salmonelosis (disentería y fiebre entérica)- Disentería bacilar- Cólera (diarrea acuosa)- Gastroenteritis (fiebre entérica).

Virus AdenovirusAstrovirus/CalcivirusCoxsackievirus ACoxsackievirus BEchovirusVirus de la Hepatitis ANorwalk virusPoliovirusRotavirus

- Infecciones respiratorias, conjuntivitis, gastroenteritis- Gastroenteritis- Meningitis e infecciones respiratorias- Miocarditis, meningitis e infecciones respiratorias- Meningitis, diarrea, fiebre e infecciones respiratorias- Hepatitis infecciosa- Diarrea acuosa, vómito y fiebre- Meningitis y parálisis- Diarrea acuosa y vómito.

Helmintos Ascaris lumbricoidesHymenolepis spp.Trichiuris trichiura

- En general, producen enfermedades del aparato intestinal(disentería, helmintiasis, desnutrición, entre otras).

Fuente: (Modificado de García et al. , 1998)

En el Instituto Mexicano de Tecnología del Agua (IMTA) durante el ciclo 1998-1999, se adaptó una metodologíapara la detección de amibas en muestras sintéticas. En este estudio se revisaron las técnicas existentes para detectarEh en muestras clínicas, y se adecuaron dos técnicas: a) La técnica de Leeds I usada para la concentración deparásitos en agua por medio de centrifugación y b) El análisis del antígeno específico de EHSA por medio deELISA. La técnica de ELISA, Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (Tijseen, 1985, Roit et al., 1985 y Kabir,1991), requiere de sensibilizar con anticuerpos las placas del análisis. El principio funcional de ELISA es lareacción con antígenos específicos que dan lugar a la producción de anticuerpos en organismos superiores. Lareacción de fijación en superficie es un método denominado “sándwich” que además de ser rápido, ha permitidoreconocer reacciones antígeno-anticuerpo con muy buena sensibilidad y especificidad (Ongerth, 1989). Se obtuvo lacurva de sensibilidad para detección del protozoario y se identificó la presencia de Eh en muestras inoculadas depacientes infectados con amibas. Las muestras estudiadas involucraron dos de las cuatro vías ambientales yamencionas (ver Fig. 1): de agua costera en zonas recreativas y de agua superficial utilizada para abastecimientopúblico.

Zonas de estudio - Los muestreos se realizaron en una bahía mexicana de uso turístico ubicada en costas delOcéano Pacífico en los meses de abril, junio, julio, agosto y octubre, de 1999. Del mismo modo y enseptiembre, se muestrearon tres presas nacionales ubicadas en la región hidrológica número 18 y finalmente,dos descargas municipales en el estado de Morelos, México.

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OBJETIVOS1. Aplicar la técnica de concentración por centrifugado y de análisis por Ensayo Inmunoenzimático

(ELISA), para detectar Entamoeba histolytica, en muestras de agua sintética.2. Determinar la especificidad de la técnica de ELISA empleando otras especies de protozoarios.3. Evaluar la aptitud del método por medio de la detección de este protozoario (Eh), en muestras

ambientales procedentes de descargas municipales, presas de almacenamiento y agua de mar (bahía).

METODOLOGÍATanto la colecta como la técnica de concentración de las muestras de agua analizadas para la detección de E.histolytica, fueron tomadas del método de Leeds I (APHA, 1995), para la identificación de E. histolytica.

Todas las muestras sintéticas se prepararon en 4 L de agua destilada y una muestra inoculada de heces fecalescon Eh, dichas muestras, fueron proporcionadas por el Instituto Nacional de Pediatría (INP), las cualesfueron previamente identificadas en colaboración con el personal del INP, usando las técnicas de Faust yELISA.

Las muestras de agua ambiental se colectaron en garrafones de plástico de 5 L a prueba de fugas, setransportaron en hieleras desde el sitio del muestreo hasta el laboratorio a unos 4°C y se almacenaron entre 2y 8°C, todas se examinaron en un período máximo de 8 días después de realizado el muestreo.

Las pruebas de especificidad se prepararon también con agua destilada y heces fecales con Entamoeba coli,Iodamoeba butschlii o Gardia lamblia, previa identificación por el método de Faust, a las que se aplicó latécnica de ELISA para detectar el antígeno específico de Eh.

Concentración de la muestra - A continuación, se describe brevemente la metodología de detección de Eh.• Homogeneizar la muestra y centrifugar en tubos de 250 mL a 2,500 r.p.m. durante 10 min.• Eliminar el sobrenadante con precaución de no aspirar el botón de sedimento.• Remover el sedimento y vaciar su contenido en tubos de 50 mL, centrifugarlos a 2,500 r.p.m. durante 10 min.• Eliminar el sobrenadante y depositar el sedimento en tubos de 15 mL, los cuales se centrifugan nuevamente a

2,500 r.p.m. durante 10 min.• Extraer el sobrenadante y vaciar el sedimento sobrante a un solo tubo de 15 mL, dejando de 3 a 5 mL de

muestra (ver figura 2).

Figura 2. Equipo y material utilizados para concentrar muestras de agua, en la detección de E.histolytica.

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Detección del antígeno específico de Eh por ELISA - La técnica de ELISA se realizó con un kitinmunológico, el análisis se sintetiza en la Fig. 3 y el equipo de lectura se presenta en la Fig. 4.

Inocular 300 µL de muestra concentrada Añadir controles y muestras, esperar 60 min yen la solución de dilución hacer 3 lavados en cada pozo

Figura 3. Procedimiento para la detección del antígeno específico de E. histolitica en agua (EHSA).

Añadir enzima conjugada y esperar 30 Añadir Sustrato de Añadir Solución de Lecturamin, hacer 5 lavados color y esperar 10 min parada de reacción y leer.

Figura 4. Lectura de ELISA por espectrofotómetro y comparación visual para la detección deE. histolytica en muestras de agua.

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RESULTADOS

Curva de sensibilidad del método ELISA - Los resultados de sensibilidad se muestran en la Fig. 5. Se observaque el valor positivo superior de la muestra sintética (INP), fue de 0.602 densidad óptica (DO), con 1 g de hecescontaminadas con Eh disuelta en 4 L de agua destilada y el valor positivo inferior de DO, fue de 0.053 con 0.050 gde heces, que equivale a una concentración de 12.5 mg/L.

Al pasar de 0.050 a 0.025 g de heces diluida en 4 L de agua, la técnica ya no fue capaz de detectar el antígenoespecífico de Eh, lo que equivale a una concentración de 6.25 mg/L.

Figura 5. Curva de sensibilidad de la técnica inmunológica para detectar de E. histolytica en muestrasde agua sintética.

Las pruebas cruzadas de especificidad que se llevaron a cabo con Entamoeba coli, Iodamoeba butschlii yGiardia lamblia, fueron negativas en los tres casos. Así mismo los resultados obtenidos en la técnica deELISA, corroboran que la cantidad de muestra de agua usada (de 100 a 300 µL), proporciona resultadosconstantes y reproducibles.

Resultados en descargas de la bahía - Se colectaron un total de 19 muestras, 14 de descargas de una zonacostera y 5 de bahía (agua de mar). En junio, se reportaron dos resultados positivos en bahía (descarga 1). Estosresultados positivos se presentaron durante el verano y antes de la época de lluvias.

En septiembre y octubre se presentaron otros cuatro resultados positivos, en descargas de la bahía (descarga 2 en dosocasiones) y descargas 4 y 5 ya en plena época de lluvias.

En la tabla 2, se muestran los resultados de detección de E. histolytica en la bahía, éstos corresponden a losmuestreos de abril, junio, julio y en el mes de octubre se incrementó el número de descargas monitoreadas por lasavenidas de la época de lluvias.

Resultados en las presas - En la tabla 3, se muestran los resultados de detección de E. histolytica en el sistemade presas en época de lluvias, se analizaron 15 muestras, se incluyeron 8 muestras en el cuerpo de agua (frentea la descarga correspondiente) y 7 descargas municipales. Los resultados obtenidos detectaron dos descargas conmuestras positivas (descarga 3 y 7). En el cuerpo de agua de los tres embalses no se detectó este patógeno.

En Morelos (Tabla 4), se detectó una muestra positiva en el efluente de la descarga municipal 1; esta última seidentificó primero por la técnica de Faust y posteriormente por la técnica de ELISA, resultando positiva en ambas.

0 .9 0 60 .8 1 1 0 .8 0 .8 2 2 0 .8 3 8

0 .7 5 5

0 .6 0 2

0 .2 3 5

0 .0 1 20 .0 5 30 .0 6 90 .0 9 9

0

0 .2 5

0 .5

0 .7 5

1

1 0 .5 0 .2 5 0 .1 0 .0 5 0 .0 2 5

g r d e h e c e s c o n E . h is t o ly t ic a

Den

sida

d óp

tica

C o n t ro l + C o n t ro l - M u e s tra IN P

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En la figura 6 se resumen los resultados: se analizaron un total 80 muestras, con el fin de detectar lapresencia de Eh por medio de ELISA en muestras de agua ambiental. Se encontró que el 33.3% fueronpositivos para agua residual del Edo. de Morelos; 27.3% para descargas a bahía; 13.3% en descargas aembalses y ausencia (0%) dentro de los embalses y agua de mar.

Tabla 2. Resultados de E. histolytica en Bahía 1999.Fecha deMuestreo

Estación Tipo demuestra

Antígeno específico deEntamoeba histolytica

04/Abr/99 Bahía 1 B Ausencia29/Jun/99 Descarga 1 D • Presencia

Bahía 2 B AusenciaDescarga 1 D • PresenciaBahía 2 B AusenciaBahía 1 B Ausencia

06/Jul/99 Bahía 1 B AusenciaDescarga 1 D Ausencia

13/Sep/99 Descarga 2 D • PresenciaDescarga 1 D AusenciaDescarga 3 D AusenciaDescarga 4 D • PresenciaDescarga 5 D AusenciaDescarga 6 D Ausencia

25/Oct/99 Descarga 1 D AusenciaDescarga 5 D • PresenciaDescarga 6 D AusenciaDescarga 3 D AusenciaDescarga 2 D • Presencia

B: muestra de Bahía D: muestra de descarga.

Tabla 3. Resultados de E. histolytica en los embalses, septiembre 1999.Estación Embalse Tipo de

muestraAntígeno específico deEntamoeba histolytica

Descarga 1 Presa 1 D AusenciaCuerpo de agua 1 “ CA AusenciaDescarga 2 “ D AusenciaCuerpo de agua 2 “ CA AusenciaDescarga 3 “ D • PresenciaCuerpo de agua 3 “ CA AusenciaDescarga 4 Presa 2 D AusenciaCuerpo de agua 4 “ CA AusenciaDescarga 5 “ D AusenciaCuerpo de agua 5 “ CA AusenciaDescarga 6 “ D AusenciaCuerpo de agua 6 “ CA AusenciaDescarga 7 Presa 3 D • PresenciaCuerpo de agua 7 “ CA AusenciaCuerpo de agua 8 “ CA AusenciaCA.- muestra del cuerpo de agua (junto descarga del mismo nombre) D: muestra de descarga.

Tabla 4. Resultados de detección de E. histolytica en Morelos, 1999Fecha Lugar Estación Tipo de

muestraAntígeno específico deEntamoeba histolytica

06/Ago/99 Descarga Mpal. 1 Efluente D • Presencia14/Sept/99 Descarga Mpal. 2 Influente

2 muestrasD Ausencia

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Figura 6. Frecuencia de aparición de amibas (Eh) en muestras de agua ambiental.

Con las modificaciones desarrolladas en IMTA, ya es posible la detección de E. histolytica en agua, lastécnicas inmunológicas superan las metodologías clínicas como los procedimientos de flotación y sedimentación,incluso el de inmunofluorescencia (IFA), que según LeChevallier, et al. 1990, supera el factor de recuperación hastaen 12 veces más que el método de flotación.

DISCUSIÓNLas nuevas metodologías con anticuerpos monoclonales (ELISA), como la implementada en este trabajoincrementan su eficiencia a través de sensibilidad y especificidad. En métodos cuantitativos se reportan porcentajesde recuperación, por ejemplo, en el caso de técnicas clínicas se logran factores de recuperación del 30% en adelante;en el caso de Inmunofluorescencia (IFA), Ongerth (1989) reporta factores de recuperación hasta del 74%(LeChevallier et al., 1990). En el IMTA en 1998-1999, se ha desarrollado con éxito la detección de E.histolytica y Giardia lamblia en muestras de agua y por medio de ELISA, que cambia el porciento derecuperación por especificidad y sensibilidad.

De hace dos años a la fecha, en el Hospital Infantil de México se ha demostrado la buena respuesta que hatenido el análisis clínico de ELISA en muestras sólidas para la detección de Eh. Rocha et al. (1999), tambiénreportan excelentes resultados de sensibilidad y especificidad con porcentajes que son mayores (95% y 100%)a los publicados por una técnica comercial (87 y 99%; Alexon ProSpecT, 1996). Sin embargo, encomparación con las técnicas microscópicas y por la naturaleza de la reacción inmunológica antígeno-anticuerpo de ELISA esta técnica es sólo cualitativa. Por lo que las técnicas tradicionales deben seguirpracticándose, como apoyo a las investigaciones relacionadas con protozoarios y otros parásitos que afectanal hombre.

Con relación a los análisis de ELISA para la detección de Eh practicados en muestras de agua, sólo existe elantecedente de Sánchez y Bravo (1999), donde se aplicó la técnica en muestras inoculadas con Eh, y seobtuvieron valores de 90 y 100% de sensibilidad y especificidad, respectivamente, los que son semejantes alos valores reportados por Rocha et al. (op. cit.) y Alexon ProSpecT (op. cit.).

Se llevó a cabo una prueba comparativa, en donde se identificó primero por microscopía la presencia de Ehen la descarga municipal 1 de Morelos (Fig. 7), y posteriormente se analizó por ELISA, resultando positiva alprocedimiento inmunológico implementado en el IMTA para la determinación de Eh.

33.327.3

13.3 0 0

86.772.766.7

100100

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Agua residual Desc. a bahía Desc. apresas

Agua Superf. Agua de mar

%Negativo a EhPositivo a Eh

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Figura 7. Quiste maduro de E. histolytica en el efluente de una planta detratamiento de agua residual en Morelos.

En este sentido, algunas técnicas clínicas de identificación han sido preferidas por ser rápidas y sencillas,además de considerar la presencia o ausencia del patógeno en lugar de su cantidad, para el caso de dar undiagnóstico clínico, sólo es necesario detectar la presencia de algunos organismos viables para que seconsidere un paciente como enfermo o portador. Cuando el patógeno se localiza en agua, las accionespreventivas a considerar aún están en proceso de investigación, ya que a la fecha, no se conoce untratamiento eficiente que pueda eliminar satisfactoriamente la viabilidad del patógeno.

A la fecha, no se han realizado estudios que intenten obtener un factor que cuantifi que de manera indirecta,los quistes de E. histolytica con las lecturas de la densidad óptica del lector de ELISA. Los valores delespectrofotómetro podrían ser directamente proporcionales con la cantidad específica de quistes. Por ejemplo,una técnica cita que el límite de detección del antígeno específico de Eh (EHSA), es de 40 nanogramos/mL(Alexon ProSpecT, 1996), pero no indica a qué cantidad de quistes de amibas corresponde dicho valor delEHSA.

En cuanto a las pruebas de reactividad cruzada la técnica reporta negativa a 17 especies con morfología muysemejante a Entamoeba histolytica, como los son: Entamoeba coli, Entamoeba hartmanni, Iodamoeba butschlii,Endolimax nana, Gardia lamblia, Dientamoeba fragilis, Ascaris lumbricolides, Criptosporidium parvum,Hymenolepis nana, Taenia sp., Trichuris trichura, entre otros. Los resultados de los experimentos llevados a cabo enel presente trabajo son semejantes ya que fueron negativos para tres especies.

Las enfermedades transmitidas por el agua generalmente se asocian por: contaminación directa (por excretasy/o agua residual) a un cuerpo de agua; deficiencias en el tratamiento de agua; ausencia de tratamiento, y/opor contaminación del agua después del tratamiento. Estas situaciones se presentan basicamente en sistemasde agua municipal y aguas para uso recreativo, que no tienen procesos adecuados para la remoción demicroorganismos, así como las evidentes descargas de aguas residuales en aguas superficiales. Por otro lado,se debe considerar el riesgo de contaminación por agua residual, en áreas cercanas a fuentes subterráneas(Helmer et al., 1991).

La resistencia a la desinfección de los quistes de protozoarios fue estudiada en un principio con E. histolytica,en la cual la viabilidad fue determinada por exclusión de eosina, esto es, si un quiste permanece sin colorcuando es expuesto a la tintura de eosina es considerado como viable, por lo contrario, cuando ésta penetra yse tiñe el quiste, se considera como no viable.

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Holff (1979), encontró que la exclusión de eosina es consistente con estimaciones de quistes viables quepueden ser encontrados por excitación in vitro. Jarrol et al. (1981), estudió el efecto del cloro sobre quistesviables, bajo diferentes condiciones; encontró que la sobrevivencia de los quistes se incrementaba cuando elpH tendía a ser más alcalino. La temperatura del agua, concentración de cloro y el tiempo de exposiciónfueron importantes en la sobrevivencia de los quistes y especialmente, que los quistes de protozoarios puedenser inactivados por cloración.

Jarroll et al. (op. cit.), probó 6 desinfectantes que son usados para tratamiento de pequeñas cantidades deagua, todos los desinfectantes destruyen el 100% de los quistes a 20°C, sin embargo en agua turbia algunosdesinfectantes fueron menos eficientes que en agua clara. Se comprobó que altas concentraciones de cloro yyodo inactivan a los quistes de protozoarios.

En contraste con la información anterior, Helmer et al. (1991) reporta que en la práctica la desinfección deagua residual, usualmente por la aplicación de cloro, nunca ha sido exitosa. Añaden que, aunque el cloroproporciona una buena reducción de las bacterias excretadas, la desinfección con este producto no posee lacapacidad para remover protozoarios y helmintos.

Otro método que se ha utilizado es la radiación ultravioleta, que ha sido considerada como una alternativapotencial para desinfectar en pequeños sistemas de agua de distribución, Rice et al. (1982), citan que losquistes de protozoarios fueron altamente resistentes a la radiación ultravioleta, de este modo, ellos concluyenque la radiación ultravioleta, por sí sola, no debe ser usada como quisticida.

En relación con la filtración, Logsdon y Lippy (1982) analizaron la remoción de bacterias, quistes deprotozoarios y virus por coagulación, sedimentación y filtración. En filtros lentos de arena, sistemas usadosen pequeños abastecimientos de agua, presentan una eficiencia de remoción del 90% de organismos de 7 a 12µm, que corresponde al tamaño de los quistes.

La filtración rápida se usa en poblados y sistemas de agua de mayor tamaño, también sirve para removerpatógenos. Sin embargo, la armada de los EE.UU. (U.S. Army, 1944), encontró que quistes de E. histolyticapasaron a través de filtros rápidos a velocidades entre 4.4 a 6.6 mm/s con pobre o nula coagulación. Logsdony Lippy (op. cit.), encontraron que, con una adecuada coagulación y velocidades de filtración no mayor a 2.7mm/s, se remueven el 99% de quistes.

CONCLUSIONESSe comprobó que la metodología para la detección de E. histolytica, es adecuada para su uso en muestrasambientales de agua. No obstante la baja concentración de quistes en agua, los resultados confirman que la cantidadde 300 µL de muestra concentrada es adecuada para detectar amibas en agua ambiental.

Se obtuvo la curva de sensibilidad para E. histolytica en muestras inoculadas en 4 L de agua destilada y se encontróque el límite de detección del antígeno específico de E. histolytica fue de 12.5 mg/L en muestras sintéticas.

Las pruebas cruzadas de especificidad a la presencia de Entamoeba coli, Iodamoeba butschlii y Gardia lamblia,fueron negativas, por lo tanto esta técnica resulta hasta el momento, específica para la detección de E. histolytica.

ELISA mostró alta sensibilidad (90%) y especificidad (100%), en comparación con la técnica deinmunofluorescencia que supera hasta en 12 veces las técnicas clínicas.

De un total de 80 muestras analizadas el porcentaje de aparición de resultados positivos para E. histolytica endescargas municipales de Morelos fue de 33.3%; en descargas a bahía fue del 27.3% y para las presas dealmacenamiemnto de agua 13.3%13.3%.

Todas las muestras ubicadas dentro de los cuerpos de agua estudiados fueron negativas, posiblemente E.histolytica se encuentre en bajas concentraciones por lo que será necesario adaptar las técnicas para estascondiciones. Por ejemplo, adecuar el volumen de muestra de agua, dependiendo de la calidad microbiológicade la misma.

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El análisis de E. histolytica cuesta alrededor de $20 USD por muestra y el tiempo de análisis, después delproceso de concentración, es de 8 horas con una capacidad máxima de 94 muestras por corrida.

Es probable que los resultados negativos en todas muestras de agua marina, sean producto de interferenciasprovocadas por la salinidad del agua.

La metodología para detectar E. histolytica en muestras de agua potable por medio de ensayoInmunoenzimático (ELISA), contribuye al desarrollo de nuevas metodologías, que promueven un manejointegral del recurso hídrico en los países latinoamericanos.

RECOMENDACIONESSe recomienda monitorear la presencia de quistes de Eh y otros protozoarios patógenos, en sedimentos decuerpos de agua utilizados para abastecimiento y recreación, tanto de agua dulce como marina.

Se sugiere muestrear las descargas de embalses de almacenamiento de agua, considerando los horarios demayor gasto y las diferentes estaciones del año.

En zonas costeras de uso recreativo, se recomienda aplicar la técnica de ELISA, cuando se presente alguna delas siguientes condiciones en fuentes de abastecimiento: A) Descargas de agua residual, B) Exceso decontaminación fecal y C) Presencia de otros factores socioculturales de riesgo para la transmisión deenfermedades hídricas.

Se recomienda verificar la detección de E. histolytica en agua de mar para adecuar la técnica inmunológicaen muestras de agua salada en caso de ser necesario.

Debido a la importancia que presentan el riesgo de la hidrotransmisión de patógenos a la población, serecomienda hacer pruebas de remoción de quistes de protozoarios por los métodos de tratamiento físico deagua existentes.

AGRADECIMIENTOSAgradecemos a la QFB. Mónica Mirabal; QFB. Gerardo García; Tec. Lab. Valente Gamez; Tec. Lab. SilviaValencia y Tec. Lab. Adán Pérez, personal de laboratorio del departamento de parasitología del InstitutoNacional de Pediatría (INP), quienes brindaron su tiempo en la capacitación sobre técnicas clínicas de E.histolytica. Así mismo, se agradece al INP, las facilidades para donar muestras para la realización delpresente estudio.

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