vías de muerte. caspase cysteine-dependent aspartate specific protease especificidad dominante...
TRANSCRIPT
Vías de muerte
caspase
cysteine-dependent aspartate specific protease
Especificidad dominante para sustratos conteniendo Asp (específico de caspasas)Excepción: Granzima B: activador de caspasas
Contienen un pentapéptido conservado: QACXG
conteniendo la cisteína del sitio activo (común en cisteína proteasas)
Horvitz y cols.: Caenorhabditis elegans
CED 3 CED4 CED9
CED 3: proteína pro-apoptótica con homología de secuencia con:
interleukin-1-converting enzyme (ICE)-like proteasas
pro-IL-1 IL-1
por clivaje entre Asp 116-Ala 117.
Para unificar la nomenclatura: CASPASAS
Caspasa 1: primera caspasa identificada (la numeración de los aácidos de todas las caspasas se refiere a ella)
Procesamiento de caspasasProcesamiento de caspasas
* Residuos esenciales para la catálisis Residuos para reconocimiento de sustrato
Interrogantes acerca de la función de algunas caspasas
* Caspasa 2: iniciadora vía TNFR
* Caspasas 4,5 y 13: rol desconocido
Se las agrupa como activadoras de Citoquinas por susimilitud con la secuencia con caspasa 1
Pero: caspasa 13 es activada por caspasa 8??Significado fisiológico desconocido
Estructura primaria de las caspasas
Estructura primaria de caspasas
La familia de las caspasas
Activación de las pro-caspasas 7 y 9
Sustratos de caspasas
Caspasas activ. de citoquinas (1, 4 y 5):(W/Y)EHD
Caspasas iniciadoras (8, 9 y 10): (I/L/V)EHD
Caspasas ejecutoras (3 y 7) y caspasa 2: DEXD
Uso de sustratos selectivos en mezclas de caspasas
Es complicado
La actividad y abundancia de cada caspasa, determina el resultado. La estructura ternaria es relevante
Sustratos de CaspasasElementos del citoesqueleto: actina, fodrina,
proteína tau y cateninaEnzimas encargadas de reparar (PARP) o degradar (DNAasa) el DNA
Factores de transcripción: Rb, MDM2
Proteínas quinasa y fosfatasas: PKC, fosfatasas 2-alfa, Akt
Productos de la familia Bcl-2
CAD-ICAD
Sustratos de caspasas
Sustratos e inhibidores de caspasas
Estructura de las caspasas
Heterodímeros: cada uno contiene un sitio catalíticocompuesto por residuos de ambas subunidades
Cada sitio activo contiene un S1 (+)(altamente conservado) para unir el Aspartato P1 (-) del sustrato
P2 y P3 tienen un efecto limitado sobre el clivaje del sustrato
P4 y S4 son relevantes en la especificidad por sustrato
Sustratos sintéticos
Secuencia tetrapeptídica de preferencia de caspasas
Sustratos sintéticos: tetrapéptidos conjugados a:
1) un cromóforo pNA (espectrofotometría)
2) un fluorocromo: AMC (7-amino-4-metilcumarina)
AFC (7-amino-4- trifluorometil- cumarina)
(espectrofluorometría)
La secuencia tetrapeptídica es una secuencia de “preferencia” y no absoluta
Muchas caspasas pueden clivar el mismo sustrato“in vitro” aunque con distinta eficiencia.
La elección depende de la concentración, tiempo dereacción y accesibilidad
Inhibidores Sintéticos
Se unen al sitio activo de las caspasas en forma reversible o irreversible
Algunos forman uniones covalentes con la cisteína del sitio activo
Bloquean o retrasan la muerte
Pueden ser tóxicos para la célula (incub. t largos)
Como ocurre con los sustratos de caspasas, los inhibidores no son específicos para una caspasa
Otros roles de las caspasas
• Regulación de la diferenciación celular: FADD es un regulador clave del desarrollo de células T
• Proliferación celular ( de células T) y progresión del ciclo celular
• Motilidad celular
• Internalización de receptores (FAS R)
Mecanismos de activación de caspasas
Homoactivación: requiere del reclutamiento de zimógenos a proteínas adaptadoras:
caspasas iniciadoras 8 y 10: DISC, mediado por R de muerte
caspasa iniciadora 9: Apoptosoma, compuesto por Apaf1, citocromo c, dATP/ATP y caspasa 9
Heteroactivación: ocurre por acción de otras proteínassobre los zimógenos caspasas
Dominios de Apaf-1
Card: se une al Card de caspasa 9NBD: dominio de unión a nucleótidos, involucrado en la oligomerizaciónWD40: involucrados en interacciones proteína-proteína
* El dominio CARD no está normalmente expuestoy no se une a procaspasa 9 a menos que Apaf1 seaactivado por dATP y citocromo c
* El acceso al dominio CARD está normalmente bloqueado por las WD40
* ATP y cit.c hacen que Apaf-1 sufra un cambio con-formacional que expone el dominio CARD uniendo luego la pro-caspasa 9
Apoptosoma: la rueda de la muerte
El sitio de unión para Cit. c con Apaf-1 no ha sido caracterizadoWD-40 regulan el sitio de uniónLa unión de Cit. C expone los sitios de unión para dATP
La homodimerización parece ser la clave para la activación de la procaspasa 9
Un evento único es que sólo uno de los dos polipép-tidos se vuelve activo
Probablemente los monómeros de procaspasa 9 unidos al apoptosoma recluten nuevos monómerosde procaspasa 9 para formar la holoenzima
El apoptosoma permitiría la interacción antiparalela de dos monómeros inactivos para formar el dímeroasimétrico activo
Interacciones caspasa 9-apoptosoma
Caspasa 9 libre: actividad mínima el apoptosoma actúa como holoenzima
La actividad del zimógeno y la forma procesada aumentan 2000 veces por unión al apoptosomaEstequiometría Apaf-1/caspasa 9: 1:1
El procesamiento proteolítico en el linker no es necesario para la activación de caspasa 9
El dominio N-terminal no se corta, la caspasa puede permanecer asociada al apoptosoma y activar casp. ejecutoras
Vias de muerte
Niveles de regulación de las caspasas
Hay precursores de caspasas expresados en forma
constitutiva deben estar estrechamente reguladas
1) Los precursores de caspasas están presentes en
una conformación que previene la autocatálisis
2) Necesitan de proteínas adaptadoras y cofactores
que cambien su conformación y las vuelvan activas
3) Compartimentalización de caspasas y cofactores
Niveles de regulación de caspasas
4) Unión específica de inhibidores naturales:
FLIP
IAPs
A diferencia de la familia Bcl-2, IAPs bloqueantanto la vía mitocondrial como la del R por unión a caspasas iniciadoras y efectoras
Localización de las caspasas
* Normalmente citosólica
* También se han encontrado en: núcleo RE
mitocondria
Algunas caspasas pueden traslocarse de un compar-timiento celular a otro en presencia de un estímulo apoptótico
Caspasas 2 y 9: de la mitocondria al citosolCaspasa 7: del citosol a la mitocondria
Las dos vías de muerte y sus Las dos vías de muerte y sus inhibidores naturalesinhibidores naturales
Miembros de la familia IAP
Para oponerse a la destrucción celular mediada por caspasas se cuenta con dos clases de inhibidores
* Miembros de la familia Bcl-2: bloquean la vía mitocon- drial
* Miembros de la familia IAP: bloquean la vía mitocon- drial y la vía del receptor
Se unen a caspasas iniciadoras y efectoras e inhiben su actividad
Miembros de la familia IAPMiembros de la familia IAPNIAP:atrofia muscular espinalBIR: Cys/His
RING, UBC: ubiquitin ligasa
Degradación decaspasas unidasvía proteasoma
Inhibición de caspasas por IAPs
XIAP
Es el más potente inhibidor de caspasas 3, 7 y 9
Aún no se conoce la función del dominio BIR 1
La región que circunda BIR 2 une específicamentecaspasas 3 y 7
BIR 3 une caspasa 9
BIR 2 no tiene rol directo en la inhibición de caspa-sas
XIAP es una proteína modular
BIR3 de XIAP se une a la caspasa 9 clivada
BIR 3 reconoce un tetra-péptido Ala-Thr-Pro-Phe
Este tetrapéptido también se encuentra en SMAC/DIABLO
La caspasa 3 cliva a la procaspasa 9
Posibles funciones de BIR 1
* Puede actuar estabilizando XIAP
* Puede interactuar e inhibir caspasas aún no identificadas
* Puede proveer una interfase para la unión de proteínas que interactúan con XIAP, modificando su actividad
¿Porqué tener una proteína con diferentes dominios que inhiban distintas caspasas?
Permite la regulación simultánea de varias caspasas
XIAP se une al apoptosoma donde interactúa con caspasas 9 y 3 sugiriendo que previene:
* la activación de caspasa 3 por caspasa 9 * la liberación de la caspasa 3 del apoptosoma
XIAP se asocia con el apoptosoma
La proximidad deXIAP a caspasas 3 y 9 y el hecho de que distintos dominios inhiban caspasas 3 y 9 justificarían la altaeficiencia y potenteinhibición de estas caspasas por XIAP
Inhibiendo a los inhibidores SMAC/DIABLO
Second Mitochondria derived Activator of CaspaseConecta a los IAPs con la MC controlada por la M
Se sintetiza como un precursor que se trasloca a la mitocondria
Allí se remueve un N-term de 55 aácidos (sec. de targeting) y se expone un tetrapéptido Ala-Val-Pro-Ile esencial para su unión a IAPs
Interactúa con: XIAP, c-IAP ½ y survivina
Activación de caspasas por SMAC/DIABLO
El linkerNH2-t deBIR2 ocupael sitio deunión del sustrato decaspasas
XAF1: una proteína de interacción con XIAP XIAP- Asociator Factor I
Antagoniza la habilidad de XIAP para inhibir la actividad de caspasas “in vitro”
A diferencia de SMAC/DIABLO no necesita serprocesado
Está localizado en el núcleo y no se conoce el mecanismo de inhibición. Se propone que ocurre en el núcleo
Los dos mecanismos posibles de regulación de XIAP
Smac/Diablo:No tendría efectoSobre la vía delReceptor
XAF-1: su locali-zación nuclearsugiere que puede interceptarambas víasapoptóticas
Miembros de la familia Bcl-2
Proteínas anti-apoptóticas
• BH1-BH4: son indispensables para su actividad de supervivencia
• BH1-BH4: no tienen actividad catalítica pero intervie- nen en la interacción con otras proteínas
• BH1-BH3: forman un surco hidrofóbico en la parte funcional; BH4 interviene en la estabilización del bol- sillo hidrofóbico
• Si se remueve BH4 la proteína se transforma en pro- apoptótica
Miembros pro-apoptóticos
* Ante un estímulo apoptótico exponen su dominio BH3mediante un cambio conformacional (Bcl-2 no puede hacerlo)
* Este dominio BH3 es el que va a interaccionar con el bolsillo hidrofóbico de las proteínas anti-apoptóticas
* El cambio conformacional puede ocurrir por:defosforilación: Badclivaje: Bid
* La consecuencia del cambio conformacional es la traslocación a la mitocondria
Bax: targeting, inserción, oligomerización y
formación del canal
No haycanal
canal
Modo de acción de Bcl-2-like y Bax-like factors
El casposoma de C.Elegans Modo de acción de una proteína BH3-only
BH3-only
Sensores y
Mediadores
de las res-puestas
apoptóticas
Targeting de Bid y Bad a la mitocondria
(A): t-Bid se puede unir a Bax o Bcl-Xl
(B): independientede caspasas
(C): un aumento en la conc. de Ca++
induce la calcineurina fosfatasaque defosforila Bad
Traslocación de proteínas en la apoptosis
Traslocación de proteínas durante la apoptosis
Fases en la decisión de la muerte celularFases en la decisión de la muerte celular
Cambios mitocondriales durante la apoptosis
Mecanismos de liberación de Citocromo c
Redistribución celular de la mitocondria Cambios morfológicos
a) Teñido de la mitocondria normalb) Mitoc. transfectadas con Bax e inhibidor general de
caspasas: la mitocondria se condensac) La mitocondria forma clusters alrededor del núcleo
Mecanismos de liberación de citocromo c
Se han postulado dos teorías:
1) Teoría de la ruptura no específica de la MME
PTP
2) Teoría de formación de canales conductores de
citocromo c
Posibles componentes del PTP
BPR: receptorbenzodiazepinas
CK: creatina quinasa
HK: hexoquinasa
Cph. D: ciclofilina D
Canal no selectivo
La apertura del PTP puede dispararse por efectoresfisiológicos como iones Ca, ROS, variaciones de pH,Bax
Consecuencia: repentino incremento de la permeabilidadde MMI ( 1,5 kDa), disipación del potencial dependien-te de protones y desequilibrio químico entre citoplasmay matriz mitocondrial
Estos eventos causarían un swelling de la matriz debidoa su alta concentración de solutos conduciendo a la disrupción de la MME
La ruptura de la MME ha sido raramente descripta y no explicaría la salida de proteínas del espacio intermembrana
Formación de canales conductores de cit. c
• Las estructuras de Bcl-XL y Bid se asemejan a las de algunas toxinas que pueden formar canales para iones y proteínas
• Bcl-XL, Bcl-2, Bax y tBid forman canales funcionales en vesículas sintéticas
• Las propiedades intrínsecas de los canales formados por proteínas pro y anti-apoptóticas difieren significati- vamente. Esto explicaría sus influencias opuestas so- bre la liberación de citocromo c
Liberación del Cyt c de la mitocondria
c) Bax se oligomeriza y forma megacanalesd) Bax coopera con VDAC para formar un gran canale) Bax o tBid forman un poro lipídico o un complejo proteína- lípido
Otras moléculas involucradas en al apoptosis
Traslocación de proteínas durante la apoptosis