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ESTUDIO DE TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS

DE LAS SUSTANCIAS PRIORITARIAS ORGÁNICAS

DE LA DIRECTIVA MARCO DE AGUAS (2000/60/CE)

Samuel Ordás Naise

Departamento de Ingeniería Química y Ambiental Universidad de Sevilla

Sevilla, a 10 de Julio de 2006

Quisiera agradecer a los profesores Don José Morillo Aguado y Don José Usero García, la paciencia que han tenido en la larga realización de este Proyecto Fin de Carrera, así como a Cristina, que siempre estuvo dispuesta a ayudarme si lo necesitaba.

A mis padres,

que vivieron toda la realización del proyecto

ESTUDIO DE TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS DE LAS SUSTANCIAS PRIORITARIAS DE LA DIRECTIVA MARCO DE AGUAS (2000/60/CE)

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ÍNDICE DE CONTENIDOS

I. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS. .................................................................................... 1

II. SUSTANCIAS PRIORITARIAS..................................................................................... 4 1. Introducción. .................................................................................................................. 4 2. Sustancias prioritarias...................................................................................................... 4

III. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS. ............................................................................. 15 1. Introducción. ................................................................................................................ 15 2. Características básicas................................................................................................... 17 3. Magnitudes fundamentales de la separación: selectividad, eficacia y resolución .................. 20

3.1. Selectividad. .......................................................................................................... 24 3.2. Eficacia. ................................................................................................................ 24 3.3. Resolución............................................................................................................. 26

IV. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA EFICACIA............................................... 29 1. Introducción. ................................................................................................................ 29 2. Fase inversa. ................................................................................................................ 29 3. Tipos de relleno ............................................................................................................ 31 4. Modelos de retención .................................................................................................... 32 5. Intercambio iónico. ....................................................................................................... 38 6. Pares iónicos. ............................................................................................................... 39 7. Exclusión molecular....................................................................................................... 41 8. Separaciones quirales.................................................................................................... 43 9. Afinidad. ...................................................................................................................... 44 10. Modos de elusión. ....................................................................................................... 45

V. CROMATOGRAFÍA DE GASES. .................................................................................... 48 1. Introducción. ................................................................................................................ 48 2. Sistemas de inyección de muestras................................................................................. 48

2.1. Modalidades de inyección........................................................................................ 49 2.2. Dispositivos externos para introducción de muestras ................................................. 53

3. La columna.................................................................................................................. 57 3.1. Tipos de columnas y dimensiones............................................................................ 57

3.1.1. Efecto de las dimensiones sobre el comportamiento de las columnas ................... 59 3.1.2. Efecto de las dimensiones sobre la eficacia y resolución. ..................................... 61 3.1.3. Preparación de columnas ................................................................................. 64

3.2. La fase móvil. ........................................................................................................ 65 3.2.1. Naturaleza y propiedades de las fases móviles más usadas. ................................ 66

3.3. Fases estacionarias................................................................................................. 68 3.3.1. Fases estacionarias líquidas. ............................................................................. 69 3.3.2. Fases estacionarias sólidas. .............................................................................. 77

4. Sistemas de detección. .................................................................................................. 79 4.1. Detectores de conductividad térmica........................................................................ 79 4.2. Detectores de ionización ......................................................................................... 80

4.2.1. Detector de ionización de llama (FID)................................................................ 81 4.2.2. Detector termoiónico (TID)............................................................................... 82


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4.2.3. Detector de captura de electrones (DCE). .......................................................... 83 4.2.4. Detector de fotoionización (DFI). ...................................................................... 84

4.3. Detectores electroquímicos. .................................................................................... 85 4.3.1. Detector de conductividad electrolítica (DCEL). .................................................. 85

4.4. Espectógrafo de Masas. .......................................................................................... 85 4.4.1. Sistema de introducción de muestra.................................................................. 86 4.4.2. Cámara de ionización....................................................................................... 89 4.4.3. Analizador....................................................................................................... 91 4.4.4. El Detector...................................................................................................... 93

4.5. Aplicaciones........................................................................................................... 94 5. Control del proceso cromatográfico................................................................................. 95 6. Temperatura programada .............................................................................................. 98

VI. PRECONCENTRACIÓN Y PURIFICACIÓN DE MUESTRAS........................................ 101 1. Introducción. .............................................................................................................. 101 2. Técnicas de extracción con disolventes. ........................................................................ 102 3. Extracción con fluidos supercríticos (McNally, 1996; King, 2002). .................................... 103 4. Técnicas de destilación. ............................................................................................... 103 5. Extracción-destilación simultánea (EDS). ....................................................................... 103 6. Inyección directa. ....................................................................................................... 103 7. Técnicas de fraccionamiento por absorción.................................................................... 104

7.1. Trampas capilares abiertas (TCA). ......................................................................... 105 7.2. Trampas capilares abiertas múltiples (TCAM). ......................................................... 106 7.3. Tubos Rellenos (Packed Beds)............................................................................... 106 7.4. Microextracción en fibra capilar (MEFC).................................................................. 106 7.5. Extracción Dinámica en Fase Sólida (EDFS). ........................................................... 107 7.6. Extracción por Absorción sobre Barra Agitadora (ESBA). .......................................... 108 7.7. Dispersión en Matriz de Fase Sólida (DMFS) ........................................................... 111

VII. MÉTODOS PROPUESTOS. ...................................................................................... 112 1. Análisis. ..................................................................................................................... 112

1.1. Introducción ........................................................................................................ 112 1.2. Pesticidas semivolátiles ......................................................................................... 112 1.3. Hidrocarburos policíclicos. ..................................................................................... 115 1.4. Organoclorados volátiles. ...................................................................................... 118 1.5. Otras sustancias................................................................................................... 120 1.6. Sustancias Prioritarias Orgánicas. .......................................................................... 123

2. Cromatografía de gases con espectrometría de masas (CG-EM). ..................................... 124 2.1. Instrumentación................................................................................................... 125 2.2. Procedimiento...................................................................................................... 126

2.2.1. Material. ....................................................................................................... 127 2.2.2. Factores de influencia. ................................................................................... 128

VIII. CONCLUSIONES................................................................................................... 132

IX. ANEXOS .................................................................................................................. 134

X. BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................... 147


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I. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS.

Una gran cantidad de compuestos orgánicos individuales se ha introducido en las

aguas de ríos, lagos y mares como resultado de las actividades antropogénicas. Las

principales fuentes responsables de la presencia de estos compuestos en las aguas

superficiales son las aguas residuales y emisiones industriales que contienen, entre otros,

diferentes disolventes orgánicos, compuestos orgánicos específicos y sus productos de

degradación; las aguas residuales urbanas (aceites contaminantes, detergentes), la

contaminación asociada a los medios de transporte (aceites contaminantes, compuestos

organometálicos y otros contaminantes específicos) y la actividad agraria (plaguicidas y

sus productos de degradación).

Considerando las vías de transmisión, los contaminantes orgánicos alcanzan los ríos

y embalses a través de fuentes puntuales (descargas de aguas residuales, fugas de aceite

de los barcos y otros vertidos), fuentes difusas (escorrentías en terrenos agrícolas, malas

prácticas de aplicación de plaguicidas, procesos de lixiviado en vertederos) o por

transporte a través de la atmósfera y posterior deposición.

En este contexto es donde surge la Directiva 2000/60/CE, también conocida

como Directiva Marco de Aguas (DMA), y publicada el día 22 de diciembre de 2000 en

el Diario Oficial de las Comunidades Europeas (CE) del Parlamento Europeo y del Consejo

de 23 de octubre de 2000, por la que se establece un marco comunitario para la

protección de las aguas superficiales continentales, de transición, costeras y subterráneas,

para prevenir o reducir su contaminación, promover su uso sostenible, proteger el medio

ambiente, mejorar el estado de los ecosistemas acuáticos y atenuar los efectos de las

inundaciones y las sequías.

La Directiva Marco relativa al Agua (DMA) extiende el campo de la protección

acuática a todas las aguas: establece el objetivo claro de que en el año 2015 debe

conseguirse un “buen estado ecológico” para todas las aguas europeas y el uso sostenible

del agua. La nueva Directiva representa un planteamiento ambicioso e innovador, con

vistas a la gestión del agua. Los elementos principales de la legislación incluyen:


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o La protección de todas las aguas – ríos, lagos, aguas costeras y aguas

freáticas

o El establecimiento de objetivos ambiciosos con el fin de asegurar que todas

las aguas se encuentren en “buen estado ecológico” en el año 2015

o La necesidad de establecer una cooperación transfronteriza entre países, y

también de todas las partes implicadas

o Asegurar la participación activa de todos los interesados, incluidas ONG y

comunidades locales, en todas las actividades de gestión del agua

o Contar con políticas de fijación de precios del agua y garantizar que el que

contamine pague

o Buscar un equilibrio entre los intereses del medio ambiente y los que

dependen de él

Los compuestos que afectan a la calidad del agua poseen propiedades físicas,

químicas y toxicológicas muy diferentes, por lo que la propuesta de medidas efectivas

para proteger las aguas litorales de su impacto adverso requiere disponer de una

información muy completa acerca de su distribución en los diferentes compartimentos

medioambientales. La calidad de la información referente al grado de contaminación de

las aguas depende de la información obtenida a partir de los métodos analíticos aplicados.

El principal problema con el que se encuentran los métodos de análisis de trazas de

compuestos orgánicos en el medio ambiente es la necesidad de cubrir un gran número de

analitos de interés a los bajos niveles de detección requeridos y en presencia de un

número incluso mayor de compuestos que pueden actuar como posibles interferentes

durante el análisis. Es necesario, por tanto, aplicar técnicas instrumentales sofisticadas

como son la cromatografía de gases (CG), la cromatografía líquida de alta resolución

(CLAE) o las llamadas técnicas acopladas en las que se combina una técnica de

separación apropiada con métodos de determinación espectrales como la espectrometría

de masas, la espectroscopia ultravioleta, espectroscopia infrarroja o la espectroscopia de

emisión atómica.


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Por otro lado, si se quieren determinar contaminantes orgánicos a niveles de

concentración tan bajos como los presentes en aguas (ng/L), es inevitable aplicar

procesos de preconcentración previo al análisis de los mismos. El objetivo de estos

procesos de preconcentración es aislar los analitos de interés de la matriz original y

transferirlos a una disolución compatible con el procedimiento de análisis instrumental a

aplicar. El factor de enriquecimiento de este proceso de transferencia puede oscilar entre

uno y cuatro órdenes de magnitud.

El principal objetivo de este proyecto es realizar un estudio crítico de las distintas

técnicas existentes para el análisis de las sustancias prioritarias de la Directiva Marco de

Aguas (2000/69/CE) y, sobre la base de lo anterior, proponer las técnicas más adecuadas

para el análisis de estas sustancias.


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II. SUSTANCIAS PRIORITARIAS.

1. Introducción.

Son objeto de estudio aquellas que aparecen en el Diario Oficial de las Comunidades

Europeas, “Decisión Nº 2455/2001/CE del Parlamento Europeo y del Consejo de 20 de

noviembre de 2001, por la que se aprueba la lista de sustancias prioritarias en el ámbito

de la política de aguas, y por la que se modifica la Directiva 2000/60/CE”.

Estas sustancias presentan métodos normalizados pero que no siempre alcanzan la

sensibilidad que requiere la nueva normativa, por lo que habrá que buscar nuevas

técnicas de análisis con el objeto de llegar a las sensibilidades requeridas.

Características y métodos normalizados para el análisis de los compuestos

prioritarios según la EPA (entre paréntesis aparece un compuesto representativo).

2. Sustancias prioritarias.

1. Alacloro: compuesto organoclorado cuya fórmula química es C14H20ClNO2. Se usa como herbicida en ciertos cultivos, como los de maíz, col y algodón. El alacloro es moderadamente tóxico para los organismos acuáticos. No se bioacumula significativamente. El uso de alacloro está prohibido en muchos Estados Miembros. Actualmente sólo tiene permiso para ser utilizado en cinco de ellos, entre los que se encuentra España, ya que parece ser un producto mejor adaptado a climas cálidos. Se fabrica en nuestro país.

2. Aldrina: compuesto organoclorado cuya fórmula química C12H8Cl6. es un insecticida de amplio espectro que se usa principalmente para combatir plagas del suelo y del algodón y en la lucha contra la langosta. Se genera en el medio ambiente como producto de la descomposición de la dieldrina; en los organismos vivos se transforma en dieldrina por efecto del metabolismo. Presenta una alta toxicidad para los organismos acuáticos y persistencia en el agua.

Estructura química del Alacloro

Estructura química del Aldrina


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3. Antraceno: hidrocarburo aromático

policíclico con fórmula química C6H4(CH)2C6H4. Se usa para síntesis química, creosote y otros preservantes de madera, membranas resistentes al agua y productos relacionados, así como para otros productos industriales y usos científicos específicos. Hace algunos años se empleó para la producción de quinina, en la actualidad se usa en la manufactura de productos del tinte. Además, otros productos que contienen antraceno como aceite de antraceno o alquitrán de carbón se han utilizado en cosmética, Ej.: jabones, lociones, aceites, champú y gel. Se bioacumula en la cadena alimentaria, concretamente en organismos acuáticos y plantas.

4. Atracina: compuesto organonitrogenado cuya fórmula química es C8H14ClN5. Se usa para eliminar malas hierbas en cultivos, y como herbicida no selectivo en tierras no cultivadas. La degradación de esta sustancia en el agua es lenta, pero no se acumula en la cadena alimentaria. Su utilización está permitida en Europa, excepto en Finlandia, Suiza, Dinamarca, Alemania y Austria.

5. Benceno: Hidrocarburo aromático con fórmula química C6H6. La principal utilidad del benceno es la producción de tres de sus derivados: etilbenceno, cumeno y ciclohexano. Y éstos son a su vez utilizados en la manufactura de otros productos. El benceno forma la base de una gran variedad de intermediarios aromáticos y para el grupo de compuestos cicloalipáticos. Es empleado como base en la manufactura de gomas sintéticas, plásticos, resinas, lubricantes, tintes, detergentes, medicamentos y pesticidas. El benceno es poco soluble en agua y no se acumula en plantas o animales.

6. Difeniléteres bromados: compuesto organohalogenado con fórmula química C12HxOBry. De esta familia de compuestos tan sólo se aconseja analizar como representante el Pentabromobifeniléter (penta-BDPE); ya que otros como el octa- y deca- BDPE están aún en estudio bajo la Regulación 793/93. El Penta-BDPE se utiliza en materiales esponjosos de poliuretano y productos de tapicería y

Estructura química del Antraceno

Estructura química del Atracina

Estructura química del Benceno


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aplicaciones automovilísticas; también se usa en la producción de poliuretano no poroso. No se disuelven fácilmente en agua; se adhieren a las partículas y se depositan en el fondo. Pueden acumularse en peces. Otros datos: Penta-BDPE no es producido en la Unión Europea, sino que es importado.

7. Cadmio y sus compuestos: Metal con símbolo químico Cd. Se utiliza en baterías Ni-Cd, en la producción de pigmentos, como estabilizante, como agente de galvanoplastia del metal y en aleaciones. El Cadmio se adhiere fuertemente a partículas en la tierra. Parte del cadmio se disuelve en el agua; no se degrada en el medio ambiente, pero puede cambiar de forma química. Las plantas, peces y otros animales incorporan el cadmio del medio ambiente. Este metal permanece en el organismo por largo tiempo y puede acumularse después de años de exposición a bajos niveles.

8. Parafinas cloradas de cadena corta: compuesto organoclorado con fórmula química: CnH2n+2–zClz (n =10-13; z = 4-10). Son utilizadas como plastificantes de PVC, fluidos para trabajar el metal, retardantes de llama en textiles y caucho, textiles resistentes al agua, pinturas, sellante y adhesivos, cuero, etc. Son muy tóxicas para los organismos acuáticos y pueden provocar efectos nocivos a largo plazo sobre el medio acuático.

9. Clorofenvinfos: compuesto organofosforado con fórmula química: C12H14Cl3O4P. Se usa como aracnicida e insecticida. No parece acumularse en plantas ni animales acuáticos. Los clorofenvinfos están en el mercado y se producen dentro de la Unión Europea.

10. Cloropirifos: compuesto organoclorado con fórmula química C9H11Cl3NO3PS. Se usa Como insecticida, aracnicida y nematicida. Se ha usado ampliamente en viviendas y en agricultura. En el hogar, se usa para controlar cucarachas, pulgas y termitas; también se utiliza en collares de animales domésticos para erradicar pulgas y garrapatas. En agricultura, se emplea para suprimir garrapatas en el ganado y en forma de rocío para el control de plagas en las cosechas. Los clorpirifos se adhiere firmemente a partículas del suelo, además, es poco soluble en agua. Es muy tóxico para los organismos acuáticos.

Estructura química del Clororfenvinfos

Estructura química del Clororpirifos


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11. o, p-DDT: pesticida usado extensamente en el pasado para controlar insectos

en agricultura e insectos que transmiten enfermedades como la malaria. Su fórmula química es C14H9Cl5. Aún se usa en algunos paises, especialmente en zonas tropicales. Sus efectos sobre la salud son graves.

12. p, p-DDT: pesticida usado extensamente en el pasado para controlar insectos en agricultura e insectos que transmiten enfermedades como la malaria. Su fórmula química es C14H9Cl5. Aún se usa en algunos países, especialmente en zonas tropicales. Sus efectos sobre la salud son graves.

13. 1,2-Dicloroetano: compuesto organoclorado cuya fórmula química es ClCH2CH2Cl. El uso más común es la producción de cloruro de vinilo, sustancia que se emplea para manufacturar una gran variedad de productos plásticos y de vinilo, incluyendo cañerías, tapices de muebles y automóviles, cubiertas, artículos para el hogar, piezas de automóviles. Se usa también como solvente y se añade a la gasolina para evitar el uso del plomo como antidetonante. Se degrada muy lentamente en el agua. El 1,2-dicloroetano liberado se evaporará al aire o pasará a través del suelo y entrará al agua subterránea.

14. Diclorometano: Halocarbono, su fórmula química es CH2Cl2. El cloruro de metilo es un solvente industrial. Se utiliza para quitar pintura, para la preparación de plásticos revestidos (adhesivos), en la purificación y aislamiento de intermediarios o en la manufactura de productos químicos finos o farmacéuticos. También puede emplearse como un solvente de procesos para reacciones químicas (producción del ester de la celulosa y formación de cinta fotográfica, producción de policarbonato) y para la extracción de materiales de la fruta y de productos de bebidas (Ej.: descafeinado del café). El cloruro de metilo no se disuelve fácilmente en agua. Es improbable que el cloruro de metilo se acumule en plantas o en animales.

15. Dieldrina: es un insecticida que se utiliza principalmente en los cultivos de algodón. Su fórmula química es C12H8Cl6O. Debido a su excelente solubilidad en el agua, la dieldrina se acumula en los sistemas acuáticos, siendo muy tóxica para sus organismos.

Estructura química del o, p-DDT

Estructura química del p, p-DDT

Estructura química de la Dieldrina


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16. Di(2-etilhexil)ftalato (DEHP): Ftalato con fórmula química C24H38O4. Es

utilizado generalmente como plastificante en polímeros (principalmente en PVC). También es utilizado en aplicaciones no poliméricas como adhesivos y sellantes, pintura y lacas, cartuchos de tinta de impresora y condensadores. También es utilizado en materiales de cerámica avanzados utilizados para aplicaciones electrónicas y estructurales. Generalmente también se añade a los plásticos para hacerlos más flexibles. El DEHP está presente en productos de plástico tales como cubiertas de paredes, manteles, baldosas, tapices de muebles, cocinas de baño, mangueras, forros de piscinas, ropa impermeable, dodotis para bebés, muñecas, juguetes, zapatos, tapices y techos de automóviles, cubierta de alambres y cables, tuberías para uso médico y bolsas para almacenar sangre. No se evapora ni se disuelve fácilmente en agua, especialmente si se encuentran en profundidad. Se disuelve más rápido en agua si ésta contiene gas, aceite o limpiadores de pintura. El DEHP en el suelo o el agua puede ser degradado por microorganismos a compuestos que no son dañinos. Se encuentra en plantas, peces y otros animales, pero los animales que ocupan los lugares más altos en la cadena alimentaria pueden degradar DEHP, de manera que los niveles en sus tejidos son generalmente bajos.

17. Diuron: compuesto organoclorado, su fórmula química es C6H3Cl2NHCON(CH3)2. Se usa como herbicida para el control de la mala hierba en tierras no cosechadas. Muy peligroso para el ambiente acuático. Puede provocar daños a largo plazo. Su utilización está registrada en todos los Estados Miembros, excepto en Finlandia y Suecia.

18. Endosulfán (alpha-endosulfán): compuesto organoclorado con fórmula química C6H6Cl6O3S. Se usa para controlar insectos tanto en cosechas de productos comestibles como no-comestibles, y también como preservativo para madera No se disuelve fácilmente en agua, y además se adhiere a partículas en suspensión o a sedimentos en el fondo. Puede acumularse en los cuerpos de animales que habitan en aguas contaminadas con endosulfán. Es muy tóxico para algunas especies.

19. Endrina: su fórmula química es C12H8Cl6O. Es un pesticida para controlar insectos, roedores y pájaros. La sustancia es muy tóxica para los organismos acuáticos. En la cadena alimentaria referida a los seres humanos tiene lugar bioacumulación.

Estructura química del Endosulfán

Estructura química de la Endrina


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20. Fluoranteno: su fórmula química es C16H10. A lo largo de la cadena

alimentaria de interés para el ser humano, se produce una bioacumulación, especialmente en aceites y grasas.

21. Hexaclorobenceno: compuesto organoclorado, su fórmula química es C6Cl6. Los principales metabolitos son pentaclorofenol, tetraclorohidroquinona y pentaclorotiofenol, pero se han descrito más de 43 metabolitos diferentes. El HCB ya no se produce ni se utiliza intencionadamente en la Unión Europea. El HCB se utilizó anteriormente como funguicida, en la manufactura de barras de aluminio y grafito y como intermediario en la producción de compuestos aromáticos clorados. Se encuentra asimismo presente como impureza en varios pesticidas, como la atracina, y en numerosos procesos químicos, incluyendo la fabricación de percloroetileno, clorobencenos, y otros compuestos orgánicos clorados, como PVC. Es tóxico y se bioacumula.

22. Hexaclorobutadieno: compuesto organoclorado, su fórmula química es Cl2:CClCCl:CCl2. Se utilizaba principalmente como solvente para caucho y otros materiales, como líquido intercambiador de calor, como líquido transformador, fluido hidráulico y como licor para eliminar manchas de hidrocarburos. También ha sido empleado como preparador de semillas y funguicida para varias cosechas. También era utilizado en la manufactura de productos como barras de grafito y aluminio. El cincuenta por ciento del hexaclorobutadieno en el agua puede degradarse a otros productos químicos en aproximadamente 30 días. Los peces y mariscos pueden acumular hexaclorobutadieno. Ya no se produce en la Unión Europea.

23. Hexaclorociclohexano (α-isómero, Lindano): compuesto organoclorado. Hay ocho formas químicas (llamadas isómeros) del HCH. Las más comunes son alfa-, beta-, gama-, y delta-HCH. El más común de los isómeros es el gama-HCH (conocido también como lindano). Este compuesto se usó como insecticida en frutas y cosechas de hortalizas (incluso en tabaco y hortalizas cultivadas en invernaderos) y en plantaciones forestales (incluso árboles de Navidad). Aún se

Estructura química del Fluoranteno

Estructura química del Hexaclorobenceno

Estructura química del Hexaclorobutadieno


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sigue usando en ungüentos para tratar piojos en la cabeza y el cuerpo y contra la sarna. En el suelo, el sedimento y el agua, es degradado a sustancias menos peligrosas por algas, hongos y bacterias. Los isómeros de los HCH se degradan rápidamente en agua; el lindano no permanece en el agua por más de 30 días. Puede acumularse en tejidos grasos de peces. El lindano es tóxico para peces y organismos acuáticos invertebrados. Muchos países prohíben la utilización de lindano.

24. Isodrina: pesticida organoclorado con fórmula química C12H8Cl6.

25. Isoproturón: compuesto organonitrogenado con fórmula química C12H18N2O. Se usa como herbicida sistemático selectivo en el control de malas hierbas. No es relevante la bioacumulación en peces.

26. Plomo y sus compuestos: metal cuyo símbolo químico es Pb. El plomo tiene muchos usos diferentes como fabricación de baterías, productos rodados, compuestos químicos: (estabilizantes, esmaltes de cerámica, cristal para tubos de monitores de ordenador), municiones, pesos, aleaciones (soldaduras, fabricación de cobre amarillo), forros de cable (cables de transmisión) y aditivos en gasolina. El plomo no se degrada, sin embargo los compuestos de plomo son transformados por la luz solar, el aire y el agua. El movimiento del plomo desde el suelo hasta las aguas subterráneas dependerá del tipo de compuesto de plomo y de las características del suelo. El plomo y sus compuestos se acumulan en los seres vivos.

27. Mercurio y sus compuestos: metal cuyo símbolo químico es Hg. El mercurio metálico se utiliza en la producción de gas de cloro y sosa cáustica y en termómetros, implantes dentales y pilas. Las sales de mercurio se emplean en cremas para aclarar la piel y en cremas y ungüentos antisépticos. El

Estructura química del Hexaclorociclohexano

Estructura química del Isoproturón Estructura química de la Isodrina


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metilmercurio puede formarse en el agua y el suelo por la acción de bacterias, y se acumula en los tejidos de peces.

28. Naftaleno: hidrocarburo aromático policíclico, su fórmula química es C10H8. El Naftaleno tiene una gran variedad de aplicaciones: como materia de base del anhídrido ftálico, en la manufactura de ciertos colorantes, creosote (preservantes de madera), repelente de polillas, en la pirotecnia para los efectos especiales de la industria cinematográfica, en la síntesis de algunos productos farmacéuticos y pesticidas, etc. Se disuelve moderadamente en agua; no es bioacumulable. Una de las empresas más relevantes en la producción de Naftaleno se encuentra España.

29. Níquel y sus compuestos: elemento metálico, su símbolo químico es el Ni. Se emplea en unos 300,000 productos aproximadamente para consumo, aplicaciones industriales, militares, de transporte, en la marina y en la arquitectura. Aunque en la mayoría de los casos se utiliza como aleación. El níquel presenta una considerable toxicidad en peces y plantas acuáticas.

30. Nonilfenoles (4-(para)-nonilfenol): hidrocarburo aromático, su fórmula química es C15H24O. Una gran cantidad de nonilfenoles se utilizan para la producción de nonilfenol etoxilato (NPEs). Los nonilfenoles se utilizan como intermediarios químicos para resinas y aditivos, detergentes industriales, procesado de textil y cuero, emulsiones de polimerización y productos agroquímicos. El medio acuático es el más sensible a este tipo de sustancia, los riesgos de envenenamiento son muy elevados. Tienen tendencia a acumularse en los organismos vivos.

31. Octilfenoles (para-tert-octilfenol): hidrocarburo aromático, su fórmula química es C8H17C6H4OH. Usos: Se utiliza en la producción de etoxilatos, como surfactantes, etc. Sustancia potencialmente persistente o muy persistente y tóxica.

Estructura química del Naftaleno

Estructura química del Nonilfenol

Estructura química del Octilfenol


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Estructura química del Pentaclorobenceno

31. Pentaclorobenceno: hidrocarburo aromático, su fórmula química es C6HCl5. Se usa como intermediario químico en la producción del funguicida quintoceno (pentacloronitrobenceno). Es también una impureza en otros productos, como hexaclorobenceno. Es persistente y bioacumulable. Muy tóxico para los organismos acuáticos.

32. Pentaclorofenol: compuesto organoclorado con fórmula química C6Cl5OH. Es usado como preservante de textiles que pueden ser atacados por hongos y bacterias. Los niveles de este compuesto, que se pueden encontrar en organismos acuáticos, son generalmente bajos.

33. Hidrocarburo aromáticos policíclicos (Benzo(a)pireno, Benzo(b)fluoranteno, Benzo(g,h,i)perileno, Benzo(k)fluoranteno, Indenol(1,2,3-cd)pireno): la fórmula química general es CxHyR Los hidrocarburos aromáticos policíclicos son un grupo de más de 100 sustancias químicas Los HHPP se encuentran generalmente como una mezcla de dos o más de estos compuestos, tal como el hollín. Los HHPP se encuentran en el alquitrán, el petróleo crudo, el creosote y alquitrán para techos, algunos se utilizan en medicamentos o para fabricar tintes y pesticidas. La mayoría de los HHPP no se

Estructura química del Pentaclorofenol

Estructura química del Benzo(g,h,i)perileno

Estructura química del Benzo(k)fluoranteno

Estructura química del Indenol(1,2,3-cd)pireno

Estructura química del Benzo(a)pireno

Estructura química del Benzo(b)fluoranteno


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disuelven fácilmente en agua. Los microorganismos pueden degradar los HHPP en el suelo o en el agua después de un período de semanas a meses. En el suelo, los HHPP se adhieran firmemente a partículas; ciertos HHPP se movilizan a través del suelo y contaminan el agua subterránea. La cantidad de HHPP en plantas y en animales puede ser mucho mayor que la cantidad en el suelo o en el agua donde viven estos organismos.

34. Simacina: compuesto organonitrogenado con fórmula química ClC3N3(NHC2H5)2. Es un herbicida que se utiliza para el control de las malas hierbas. Se emplea en cultivos como cereales, frutas (Ej.: uvas y cítricos) y nueces, así como en ciertas aplicaciones no agrícolas como céspedes. La simacina es poco tóxica para organismos acuáticos, sin embargo tiene una toxicidad mayor en plantas.

35. Compuestos de Tributiltín (tributiltin-catión): compuesto organoestánnico con fórmula química CxHyRSn. Se emplea en pinturas para evitar la bioincustración en el fondo de los buques. También se usan como preservantes de la madera; pueden acumularse en peces y otros animales y en plantas; es muy tóxico para éstas. Se adhieren al sedimento y a las partículas en suspensión en el agua.

36. Triclorobencenos (1,2,4-Triclorobenceno): compuesto organoclorado con fórmula química C6H3Cl3. Usados como intermediarios químicos, particularmente para ciertos herbicidas, pigmentos y tintes. También se utilizan como solventes de procesos. En el pasado han sido empleados como portadores de colorantes, lubricantes y aditivos; también en algunos productos farmacéuticos. En aguas, se adsorben en los sedimentos y se bioacumulan en los organismos. Ya no se sigue produciendo en la Unión Europea.

37. Triclorometano (Cloroformo): compuesto trihalometanos, cuya fórmula química es CHCl3. Se utiliza en productos farmacéuticos, prótesis y en los sectores químico y médico, así como sustancia orgánica para productos químicos y petroquímicos. La mayor parte de la producción de cloroformo se emplea para fabricar monoclorodifluorometano (CFC22) que se aplica como refrigerante. Además se utiliza como producto intermedio en la fabricación de tetrafluoretano que luego puede ser polimerizado (PTFE). También encuentra aplicación en la fabricación de colorantes, productos farmacéuticos y pesticidas. Su uso como solvente y como anestésico está disminuyendo rápidamente. En el medio acuático, el cloroformo se descompone con extrema lentitud. La bioacumulación del

Estructura química del Simacina

Estructura química del 1,2,4-Triclorobenceno


14

cloroformo es mínima a pesar de su alta liposolubilidad. El agua potable contiene, en ciertas ocasiones, elevadas concentraciones de cloroformo resultante de la cloración del agua. Debido a la distribución universal y a la considerable cantidad que ingresa al medio ambiente todos los años, se debe considerar al cloroformo como una amenaza ecológica. El Cloroformo se produce en 6 de los Estados Miembros, entre ellos España.

38. Trifluralina: compuesto organonitrogenado, su fórmula química es F3C(NO2)2C6H2N(C3H7)2. Es uno de los principales herbicidas y es utilizado en el control de hierbas anuales y para malas hierbas y forrajes, cereales, vegetales, semillas oleaginosas y cosechas de ciertas frutas. La trifluralina es muy tóxica para los peces y otros organismos acuáticos. Se bioacumula moderadamente. Su uso está autorizado en todos los Estados Miembros, excepto en Suecia, Dinamarca y Holanda.

Estructura química del Trifluralina


15

III. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS.

1. Introducción.

A principios del siglo XX (Ettre, 1993), el botánico ruso M.S. Tswett había observado

que la clorofila y los pigmentos asociados son solubles en éter de petróleo y ligroína

(fracciones ligeras de la destilación del petróleo, muy usadas como disolventes no polares

en aquella época), pero que estos disolventes no eran capaces de extraerlos de las hojas.

Por el contrario, si se añadía etanol al disolvente, la extracción se producía sin ningún

problema. Concentró la disolución a sequedad, disolvió los pigmentos en ligroína e

impregnó con la disolución un papel de filtro, matriz celulósica de composición afín a los

tejidos de las hojas. Cuando sometió el papel a una extracción con ligroína sólo consiguió

arrastrar los carotenos, permaneciendo la clorofila. La adición de pequeñas cantidades de

etanol a la ligroína producía la inmediata extracción de todos los pigmentos.

Como no existía ninguna afinidad química entre los pigmentos y la celulosa, dedujo

que estos cambios de solubilidad se debían a fenómenos de adsorción, lo que constituye

una notable deducción, teniendo en cuenta que en aquella época muy pocos científicos

poseían conocimientos del tratamiento teórico de la adsorción.

Intuyó las posibilidades que se le presentaban de poner a punto un método de

separación de pigmentos que, quizás, podría extenderse a cualquier otro tipo de

sustancia, y planteó el siguiente experimento: rellenó con un sólido en polvo un tubo de

vidrio de unos 12 cm. de altura y unos 3 cm. de diámetro, acabado en un estrechamiento

taponado por una bola de papel de filtro, pasó ligroína pura para desplazar el aire, e

introdujo un extracto de pigmentos en ligroína. Ayudó el paso de la disolución con algo de

presión o vacío, observando la progresión por los colores de las bandas. Ensayó como

relleno más de un centenar de sólidos, obteniendo buenos resultados con muchos de

ellos, entre los que se encontraban la inulina, el carbonato cálcico y la alúmina. Como

disolventes utilizó ligroína y etanol.

Estos resultados los comunicó al Congreso de la Sección de Biología de la Sociedad

de Ciencias Naturales de Varsovia, en marzo de 1903. Sus dos publicaciones más

importantes sobre el tema aparecieron en 1906 en el Berichte der Deutschen Botanischen

Gesellschaft (Imforme de la sociedad botánica alemana). Puesto que se podía seguir el

proceso visualmente mediante el colorido de las bandas de los pigmentos, dio el nombre


16

de cromatografía a la técnica. De esta manera se produjo uno de los descubrimientos más

importantes del siglo XX.

Los trabajos de Tswett fueron prácticamente ignorados durante un periodo de

veinte años. Las razones de este olvido pueden ser las siguientes: en primer lugar, el libro

(Tswett, 1910) en que describe la técnica fue publicado en ruso; además, en 1913 dichos

trabajos sufrieron un feroz ataque por parte de Willstatter y Stoll, que no fueron capaces

de reproducir los experimentos; y, finalmente, en aquella época los químicos orgánicos

estaban interesados fundamentalmente en los productos mayoritarios (procesos de

enriquecimiento y purificación). Fue el fuerte desarrollo posterior de la Bioquímica, más

interesada en componentes menores y en procesos de separación total de mezclas

complejas, el que despertó el interés por la cromatografía.

Éste fue el origen casual de una de las técnicas más importantes de separación que

existen hoy día, de hecho, su uso es muy distinto del de una simple etapa previa de

eliminación de interferentes, ya que es un método cualitativo de análisis al usar como

parámetro los tiempos necesarios para la elutriación, y puede llegar a ser cuantitativo

mediante el uso de detectores apropiados.

Un proceso de separación consiste básicamente en hacer que diferentes sustancias

químicas, que comparten un espacio homogéneo, es decir, cuyas concentraciones en

cualquier parte de dicho espacio son las mismas, pasen a ocupar zonas preferentes en

éste u otros espacios.

Una separación perfecta implicaría la separación total de todos los constituyentes de

forma que en cada una de las zonas preferentes se encuentre solo un compuesto. Lo

normal, sin embargo, es que los resultados de un proceso de separación no sean totales,

sino que se produzcan alteraciones en las concentraciones, ci, de cada componente de la

mezcla. Si consideramos dos zonas del espacio que compartan de forma homogénea las

moléculas de dos compuestos distintos, antes de la separación la concentración de cada

compuesto sería la misma en cada una de las dos zonas consideradas. Una separación

consistiría en conseguir que, después del proceso, exista una diferencia de la

concentración en ambos puntos. Estas expresiones pueden interpretarse como la

existencia de cierta preferencia de los componentes por una de las zonas. A partir de

estos sencillos conceptos puede definirse una magnitud que sirva para describir la calidad


17

de una separación: el factor de separación, α, que es la relación de la separación entre

dos componentes, siendo i y j los componentes, y a y b las zonas.

bj

aj

bi

ai

cc

cc

=α

Ecuación del factor de separación

Cuanto más se diferencie α de 1, mejor será la separación. Un ejemplo muy claro

para explicar esta magnitud es una extracción líquido-líquido en un embudo de

decantación: α sería el cociente entre los coeficientes de reparto de los dos solutos. En

una destilación simple las zonas a y b serían el calderín del destilador y el receptáculo del

destilado y, en un proceso cromatográfico, las fases móvil y estacionaria.

2. Características básicas.

Es difícil dar una definición de la cromatografía que sea clara y unívoca. Si se quiere

describir la forma en que se produce, puede decirse que se trata de una técnica de

separación en la que la mezcla a resolver se introduce en un sistema formado por un

fluido (fase móvil), que circula en íntimo contacto con una fase estacionaria (sólida o

líquida), que permanece inmóvil durante el proceso. Cuando una molécula de soluto se

encuentra en la fase móvil, avanza a la misma velocidad media que ésta, pero cuando

entra en la fase estacionaria, su velocidad media es cero. Si los componentes de la mezcla

difieren en su afinidad por alguna de las fases, sus velocidades medias de avance a lo

largo del sistema serán diferentes. Como consecuencia de ello se produce la separación.

Para clasificar los diferentes tipos de cromatografía, el primer criterio que puede

establecerse es la naturaleza de las fases. Como segundo criterio, se utiliza el mecanismo

de separación:

1. Cuando la fase estacionaria es un líquido, el mecanismo de separación predominante es el reparto, por lo que se le denomina cromatografía de reparto.

2. Si la fase estacionaria es un sólido, cabe la posibilidad de varios mecanismos, dependiendo de su naturaleza:


18

a. Cromatografía de adsorción. Se basa en la distinta magnitud de las

interacciones de los componentes de la mezcla con la superficie activa de la fase estacionaria.

b. Cromatografía de intercambio iónico. La fase estacionaria es un sólido con capacidad para intercambiar iones con la fase móvil.

c. Cromatografía de exclusión molecular: La fase estacionaria es un sólido reticular con tamaños de retícula del mismo orden que las moléculas de la muestra a separar. Estas moléculas serán capaces de penetrar en más o menos huecos según su tamaño, forma, cargas eléctricas, etc.

d. Cromatografía de afinidad. Se utiliza como mecanismo de separación una interacción específica entre el analito y la fase estacionaria. Si la interacción es de tipo biológico, será cromatografía de bioafinidad.

Otro criterio es la relación de polaridad entre la fase móvil y la estacionaria.

1. Cuando la fase móvil es menos polar que la estacionaria se denomina cromatografía en fase normal (FN).

2. Cuando la fase móvil es la más polar, se denomina cromatografía en fase inversa (FI). Esta última forma, que es la más utilizada actualmente en cromatografía de líquidos, usa como fase estacionaria una molécula no polar (monomérica o polimérica) unida químicamente a un soporte. El comportamiento de este tipo de fase estacionaria es intermedio entre el de un sólido y un líquido, inclinándose más en uno u otro sentido según las condiciones del entorno, fundamentalmente la naturaleza de la fase móvil.

La cromatografía puede clasificarse también de acuerdo con la forma de desarrollar

el proceso cromatográfico:

1. Cromatografía frontal. Se introduce la muestra de forma continua en el sistema cromatográfico, constituyendo ella misma la fase móvil.

2. Cromatografía de desplazamiento. La fase móvil contiene un componente más afín a la fase estacionaria que los componentes de la muestra y es capaz de desplazarlos de ella.

3. Cromatografía de elución. La muestra se introduce en un momento determinado y la fase móvil circula continuamente. Los componentes de la muestra salen de la columna como zonas, que en el caso ideal presentan una distribución gaussiana de concentración y están separadas unas de otras.

Por último, la disposición geométrica de las fases también puede emplearse para

clasificar las técnicas cromatográficas:


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1. Si la fase estacionaria se sitúa en un tubo, se trata de cromatografía en

columna.

2. Si se deposita sobre una superficie abierta (papel, placa de vidrio o metal), se denomina cromatografía en plano.

El contenido de este proyecto se concreta en la cromatografía en columna, aunque

los principios básicos, tanto termodinámicos como de la dinámica del proceso, son

comunes a todas ellas. La forma habitual de desarrollar el proceso en una columna es la

elución, al igual que en el sistema original de Tswett.

La cromatografía en columna se realiza en un equipo instrumental que consta de las

siguientes partes fundamentales:

Figura III.1

Esquema básico de un cromatógrafo.

1. Una fuente de fase móvil, cuya naturaleza depende fundamentalmente del tipo de fluido que se utilice.

2. Un sistema de regulación y medida del caudal o la presión de la fase móvil.

3. Un sistema de inyección de la muestra: se trata de un dispositivo que permite introducir la muestra en la corriente de fase móvil.

4. La columna: es la parte fundamental, ya que en ella se produce la separación. Se trata de un tubo construido en diversos materiales (metal, vidrio, sílice fundida, polímeros, etc.), de una longitud que puede oscilar entre varios centímetros y más de un centenar de metros, y cuyo diámetro interno varía entre varios micrómetros y varios centímetros. La forma de distribución de la fase estacionaria y el valor de la relación de fases, (volumen de fase móvil / volumen de fase estacionaria) dan lugar a los diferentes tipos de columnas.

5. Un recipiente termostatizado para controlar la temperatura de la columna. En cromatografía de líquidos es frecuente trabajar a temperatura ambiente en cuyo


20

caso se prescinde de este componente. En cualquier caso, para medidas precisas es imprescindible su uso.

6. Un sistema de detección: es un dispositivo que mide en continuo y transforma en una señal eléctrica una propiedad, generalmente física, de la fase móvil, que se ve ampliamente alterada por la presencia de pequeñas concentraciones de otras sustancias (componentes de la muestra).

7. Un sistema de amplificación y tratamiento de la señal eléctrica generada en el detector. El tratamiento puede incluir la adquisición y almacenamiento de datos y ciertos cálculos mediante un sistema informático

3. Magnitudes fundamentales de la separación: selectividad, eficacia y resolución

La cromatografía es un proceso dinámico, en cuya ejecución es necesario controlar

rigurosamente una serie de variables experimentales si se desea obtener resultados

reproducibles. La magnitud más importante es la velocidad de desplazamiento de los

analitos. Ésta depende, para un sistema cromatográfico dado, de la temperatura y del

gradiente de presión aplicado.

La temperatura influye normalmente en las propiedades de todas las sustancias. Su

control y conocimiento exactos son un importante indicador de la calidad de un

cromatógrafo.

El tiempo necesario para llevar a cabo un análisis está directamente relacionado con

la velocidad con que se mueven los analitos. Esta variable puede controlarse y medirse

fácilmente con bastante precisión. Su valor depende de la naturaleza de las sustancias a

estudiar y de las condiciones experimentales elegidas. Los dispositivos instrumentales que

permiten modificarla son diferentes dependiendo del tipo de fluido utilizado como fase

móvil (líquido, gaseoso o supercrítico). Esta regulación es otro factor primordial para

evaluar la calidad de un cromatógrafo. En cuanto a su medida, puede hacerse a partir del

tiempo de permanencia del soluto en la columna y de la longitud recorrida de la misma.

• Datos experimentales

Cuando se introduce una sustancia en una columna cromatográfica, la zona que

ocupa se va ensanchando durante su progresión a lo largo de la misma y su distribución

de concentraciones se puede asimilar, generalmente, a una función de Gauss.


21

Figura III.2

Representación de la función de Gauss.

En cromatografía en columna, la información que se obtiene es el cromatograma y

registro analógico o digital de la composición del efluyente de la columna en función del

tiempo, que suministra el sistema de detección.

Frente a las técnicas espectroscópicas, que suelen producir resultados

experimentales (espectros) generalmente complejos y, a veces, complicados de

interpretar; las técnicas de separación se caracterizan por originar para una misma

muestra resultados sencillos y fáciles de evaluar. En general, el trabajo del analista se

orienta a la búsqueda de las condiciones experimentales más adecuadas para que se

produzca la separación. Hay que considerar que, mientras que un espectro se asemeja en

general a una imagen fija de las moléculas objeto de estudio, las separaciones son

procesos fisicoquímicos dinámicos.

Los datos experimentales directos que se producen en un proceso de separación

cromatográfica en columna son:

• El tiempo de retención de las moléculas de un soluto en la columna. Este tiempo se mide en el máximo de la distribución, que coincide con el centro de gravedad en las distribuciones simétricas.

Durante el recorrido en una columna cromatográfica, las moléculas de un soluto se distribuyen entre las fases móvil y estacionaria, permaneciendo un tiempo tM en la primera y otro tR’ en la segunda. tM se denomina tiempo básico o tiempo muerto, y se define como el tiempo medio que tarda en recorrer la columna una sustancia que no se retiene en la fase estacionaria o, lo que es lo mismo, el


22

tiempo de retención de la fase móvil. A tR’ se le denomina tiempo de retención ajustado y es la magnitud relacionada con el tiempo que las moléculas del soluto permanecen retenidas en la fase estacionaria. Las diferencias de esta magnitud para distintos solutos reflejan la facilidad de su separación en el sistema.

• Anchura y forma del pico. La zona cromatográfica entra en la columna con una distribución de concentraciones que depende del sistema de introducción empleado. La inyección teóricamente ideal sería la de un cilindro de altura infinitamente pequeña, que se puede representar matemáticamente por la función delta de Dirac. La zona después evoluciona a lo largo de la columna, ensanchándose hasta llegar al detector, donde presenta una distribución que se puede describir, en primera aproximación, por una curva de Gauss.

En muchos casos existen desviaciones del modelo gaussiano que es necesario tener en cuenta. Es bastante frecuente encontrar zonas cromatográficas asimétricas. En este caso, puede evaluarse la asimetría de la zona mediante la relación de distancias del eje de la distribución a la curva, a la mitad de la altura del eje (am y bm) o al 10% de dicha altura (a10 y b10) como puede observarse en la figura. Cuanto mayor sea la desviación de la unidad de la relación a/b, la zona será más asimétrica. En general, cuando se mide a mitad de la altura se obtiene una estimación de la asimetría, y al 10% se tiene en cuenta también la cola de la zona, es decir, su parte final.

Figura III.3

Medida de la asimetría de la zona.

• El flujo cromatográfico. La velocidad lineal media de la fase móvil, ū, puede estimarse a partir del tiempo básico y la longitud de la columna, L.

Los valores medios puntuales de la velocidad a lo largo de la columna obedecen de forma satisfactoria a la ley de Darcy.


23

Para la integración de la ecuación de Darcy es necesario conocer la ecuación de estado del fluido que constituye la fase móvil. En general, en cromatografía de gases y de fluidos supercríticos suele utilizarse como aproximación válida el modelo de los gases perfectos. Si es necesaria mayor precisión, se utiliza la ecuación del virial para cromatografía de gases, pero ésta no es la práctica normal. En cromatografía de líquidos sirve como aproximación válida en la mayoría de los casos la consideración de la fase móvil como líquido incompresible.

• La retención cromatográfica. Cuando una zona cromatográfica progresa a lo largo de una columna y la fase móvil circula a una velocidad lineal u, la velocidad de la zona, v, será inferior (para las sustancias que se quedan retenidas en la columna) o igual a la de la fase móvil (para las no retenidas). La relación entre ambas velocidades se llama factor de retardo, R, que varía entre cero y 1. Al ser además la longitud fija para una determinada columna, el factor de retardo relaciona también el tiempo muerto y el tiempo de residencia de forma directa.

Este factor es muy usado en la cromatografía plana por su facilidad de medida. En la cromatografía en columna, la retención se suele expresar mediante el factor de retención (V), que se define como la relación entre el tiempo de retención ajustado y el tiempo básico. Desde un punto de vista físico, k representa la relación entre los tiempos medios que una molécula de soluto reside en las fases estacionaria y móvil, es decir, la relación de probabilidades de estar en una u otra fase y, en consecuencia, será también la relación entre el número de moléculas de soluto que, en un instante determinado, están en las fases estacionaria y móvil.

Existe una evidente relación entre k y R, ya que son dos formas de medir el mismo fenómeno.

Se denomina relación de fases, β, al cociente entre los volúmenes de fase móvil y de fase estacionaria de la columna

El volumen de retención, VR, de un compuesto es el volumen de fase móvil que entra en la columna desde el instante de la inyección hasta el momento de la salida del máximo de la distribución de la zona que ocupa. De la misma manera que para el tiempo de retención, puede definirse el volumen de retención ajustado.


24

3.1. Selectividad.

La selectividad de un sistema cromatográfico para separar una pareja de sustancias

i y j se puede describir mediante el factor de separación, α, que se definió anteriormente.

El valor de α constituye una estimación de la idoneidad del sistema para separar la pareja

de sustancias. Cuando su valor es la unidad, el sistema es incapaz de producir la

separación y será necesario recurrir a otro sistema distinto. Por el contrario, cuanto más

difiera de la unidad, la separación será más fácil. En cromatografía, si a > 1,14 se

considera que la separación es fácil; si a < 1,01, se estima que la separación es muy

difícil, α posee todas las propiedades termodinámicas de K, magnitud termodinámica que

sólo depende de la naturaleza del soluto y las fases, y de la temperatura, con la ventaja

de que su medida es más fácil y exacta al tratarse de una magnitud que se mide con

relación a otra sustancia.

3.2. Eficacia.

Cada zona cromatográfica no solamente progresa a lo largo de la columna sino que,

además, se ensancha. La magnitud del ensanchamiento se puede medir mediante la

desviación típica (σ) de la zona. Esta magnitud no es función lineal del camino recorrido

en la columna (z), pero sí lo es la varianza (σ 2) a través de la expresión:

σ2 = H·z

donde la constante de proporcionalidad H se denomina altura equivalente a un plato

teórico y constituye una estimación de la eficacia del sistema de separación. Cuanto

menor sea su valor, el sistema será más eficaz ya que el ensanchamiento de la zona por

unidad de longitud de columna recorrida será menor.

H describe fundamentalmente la calidad del sistema, pero no su eficacia total. Para

ello se define otra magnitud, el número de platos teóricos de la columna, N, que es la

relación entre la longitud de la columna y la altura equivalente de un plato teórico.

Como es evidente, dentro de la columna cromatográfica no existen platos, siendo el

origen de estas magnitudes, H y N, la búsqueda de similitud con las descritas para la

destilación. Basándose en este símil, se describe H en una separación cromatográfica


25

como el tramo de columna en el que se produce un equilibrio de distribución entre las

fases

De manera análoga, N sería el número total de equilibrios de distribución que se

producen a lo largo de toda la columna. Aunque estas afirmaciones son difíciles de

comprobar porque la comparación con la destilación es cuestionable, el valor comparativo

de H y N dentro de las técnicas analíticas de separación es innegable

La primera ecuación que se propuso para el cálculo de la altura de plato fue la

ecuación de van Deemter, q se aplica normalmente a las columnas de relleno (van

Deemter et al., 1956). Para columnas capilares abiertas se suele usar la ecuación de

Golay (Golay, 1959). Su cálculo se puede simplificar para casos particulares donde algún

tipo de contribución sea despreciable. Lo mismo ocurre con la expresión más general para

el cálculo de H (Scott, 1992).

Figura III.4

Representación de la ecuación de van Deemter.

La eficacia ahora descrita es sólo válida si se cumple la condición de dilución infinita,

según la cual se pueden despreciar las interacciones soluto-soluto, cumpliéndose la

linealidad del coeficiente de distribución a temperatura constante. El coeficiente de

distribución representa la relación entre las concentraciones del soluto en la fase móvil y

en la fase estacionaria. En condiciones ideales viene dada por la siguiente expresión:

cS = K ' cM

Cuando la concentración de soluto aumenta lo suficiente como para que la

condición de dilución infinita no sea aplicable (sobrecarga), las expresiones de la eficacia


26

no son válidas ya que ésta depende de la concentración, variando la velocidad de las

partículas de soluto dependiendo de su posición. Todo esto provoca que la anchura del

pico aumente, y se pueda producir una pérdida de su simetría y una variación de su

posición.

Los factores que más influyen en la aparición de la sobrecarga son el diámetro de la

columna y el mecanismo de separación, sobrecargándose antes el mecanismo de

adsorción que el de reparto. Las columnas de relleno tienen por norma general una

mayor capacidad que las columnas abiertas.

Por último cabe decir, que la eficacia de una columna cromatográfica es

independiente del tipo de cromatografía

3.3. Resolución.

Si se ha inyectado en la columna una pareja de sustancias que avanzan a distintas

velocidades, la distancia entre los máximos de las zonas (Δz) progresará de forma lineal a

lo largo de la columna. Simultáneamente, el ancho de las zonas (4σ) también variará a lo

largo de la columna, de forma que existe un punto de la columna, situado a una distancia

z1 de la entrada, donde Δz = 4σ, es decir, en el que las dos zonas están perfectamente

separadas, aunque unidas por la base. Cuando la distancia recorrida sea menor que z1, la

Figura III.5

Evolución de la distancia entre zonas y de su anchura a lo largo de la columna.


27

Figura III.6

Valores de las concentraciones de dos zonas: a) antes de alcanzar la posición z1; b) en z1; c) después de z1.

separación no será perfecta (Δz < 4σ) y las zonas estarán solapadas. Si las zonas han

sobrepasado la posición z1 (Δz > 4σ), no sólo estarán totalmente separadas sino que

existirá distancia apreciable entre sus bases. A partir de estas consideraciones puede

definirse la resolución entre dos zonas, RS, como la relación entre estos dos valores, Δz y

4σ.

Considerando que el objetivo principal de las técnicas de separación es resolver

mezclas, puede comprenderse la importancia de esta magnitud. Cuando RS < 1, las zonas

están solapadas y la separación de las dos sustancias no es total. Si RS < 1, la separación

es total pero se está utilizando una columna demasiado larga, lo que supone un tiempo

de análisis mayor del necesario. Las mejores condiciones para la separación de un par de

compuestos serán las que originen RS = 1, ya que las sustancias estarán perfectamente

separadas en el menor tiempo posible.

La resolución puede expresarse también en términos de tiempos como la relación

entre la diferencia de tiempos de retención entre las dos sustancias que se pretende

separar, y τ, que es la desviación típica del tiempo medio de permanencia en la columna

de las moléculas que forman parte de la última zona en alcanzar el detector. 4τ

representa aproximadamente el tiempo que transcurre entre el comienzo y el final de la

salida del 95% de la zona de la columna.


28

Puede pensarse con toda lógica que cualquier separación, por muy difícil que sea,

es posible con tal que α≠1 y se disponga de una longitud de columna necesaria. El

importante factor que no tiene en cuenta este razonamiento es el tiempo de análisis que,

en primera aproximación, se define como el tiempo de retención del último componente

en ser eluido.

Puede ocurrir que las condiciones necesarias para obtener RS > 1 sean tales que el

tiempo de análisis sea inviable, o simplemente poco práctico. Por esta razón es

importante definir una nueva magnitud, la rapidez de la columna (Halasz, 1968), que se

puede evaluar mediante la velocidad de generación de platos, N/tR. Esta magnitud, como

la eficacia, para que tenga valor comparativo entre columnas debe medirse para

sustancias que se retengan de forma similar (el mismo valor de k). Existe así una relación

entre la selectividad y eficacia con la resolución.


29

IV. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA EFICACIA

1. Introducción.

La cromatografía de líquidos comprende todas las técnicas cromatográficas en las

que la fase móvil es un líquido. Dentro de ellas se encuentran desde las más primitivas de

cromatografía en papel, en capa fina o en columna abierta, hasta los métodos de

cromatografía de líquidos de alta eficacia (CLAE) que vamos a tratar a continuación.

La comparación de los métodos de cromatografía de gases con los de cromatografía

de líquidos pone de manifiesto una clara diferencia en el papel que juega la fase móvil en

ambos tipos. Las separaciones cromatográficas se rigen por la interacción de los solutos

con el sistema cromatográfico, entendiendo como tal el conjunto fase móvil-fase

estacionaria. La fase móvil tiene un papel primordial en el proceso de cromatografía de

líquidos en lo que respecta a las interacciones con el soluto, mientras que en

cromatografía de gases la fase móvil es prácticamente inerte. En CLAE la naturaleza de la

fase móvil se puede cambiar prácticamente de manera casi ilimitada, de forma que su

modificación permite variar ampliamente la selectividad y controlar la separación de los

constituyentes de la muestra, aun con un número limitado de fases estacionarias. De

acuerdo con la naturaleza de estas fases, los modos más utilizados de CLAE se pueden

resumir en fase inversa, intercambio iónico, pares iónicos y exclusión molecular, sin

olvidar la importancia que están adquiriendo otros modos entre los que hay que destacar

la cromatografía de líquidos quiral y la de afinidad.

La naturaleza tan diversa de las fases estacionarias y móviles que se pueden

emplear en CLAE lleva consigo una gran versatilidad en los mecanismos de separación.

Esta versatilidad se ve incrementada por la posibilidad de provocar en el interior de la

columna de separación equilibrios secundarios de tipo ácido-base, de formación de pares

iónicos, de reparto micelar o de formación de complejos. Los modos de separación más

usados en la práctica son los siguientes.

2. Fase inversa.

Esta nomenclatura obedece a razones históricas, como contraposición a la fase

normal, modalidad en desuso en CLAE. La denominación de fase normal o fase inversa

hace referencia a la polaridad relativa de las fases móvil y estacionaria. Mientras que en


30

fase normal la fase estacionaria es más polar que la fase móvil, en fase inversa el sistema

cromatográfico está constituido por una fase estacionaria, que generalmente es de

naturaleza apolar, y una fase móvil más polar que la fase estacionaria.

La cromatografía de líquidos en fase inversa es el modo de CLAE más empleado en

la actualidad y será la que tratemos en estos apartados. Se estima que el 50% de las

separaciones que se llevan a cabo en cromatografía de líquidos emplean este modo

(Majors, 1995). Este hecho se debe a la comercialización de rellenos específicos para esta

modalidad, que son estables, reproducibles, de pequeño tamaño de partícula, y que

permiten alcanzar una elevada velocidad de transferencia de materia, lo que da lugar a

columnas con elevada eficacia. Las fases estacionarias más simples desde un punto de

vista conceptual son las basadas en sílice con funcionalidad alquilo, que se obtienen

uniendo mediante enlace covalente un n-alquilsilano a la superficie de una partícula de

sílice. Otros tipos de fases de «arquitectura» más complicada, tales como las oligoméricas

o las poliméricas, también se emplean en este modo de separación. La fase móvil es

generalmente agua con un modificador orgánico (metanol, acetonitrilo o

tetrahidrofurano). Con el fin de optimizar la selectividad de la separación pueden

emplearse mezclas ternarias o cuaternarias de estos disolventes.

El mecanismo por el que tiene lugar la separación en fase inversa está abierto a

debate. Su estudio supone un conocimiento lo más detallado posible de las fuerzas que

intervienen en la interacción del soluto con los componentes de la fase móvil, la

interacción del soluto con las moléculas de la fase estacionaria y la transferencia de la

molécula de soluto de la fase móvil a la fase estacionaria. La dificultad para estimar estas

interacciones reside en los conocimientos limitados que se tienen sobre la termodinámica

de las disoluciones y, sobre todo, en la dificultad para modelizar de manera adecuada las

fases estacionarias en las condiciones de separación. Con este fin se ha estudiado el

efecto que tienen diferentes rellenos de fase inversa sobre la retención y la selectividad

(Antle et al., 1985; Tchapla et al., 1993), concluyendo que sus distintos comportamientos

se deben a las diferencias en la relación de fases entre unas columnas y otras, a la

desigual polaridad de las fases y a la diferente afinidad de los solutos por las fases

empleadas, controlada principalmente por fuerzas de dispersión.

A modo de ejemplo de la dificultad que tiene caracterizar una fase estacionaria, se

ha de saber que la relación de fases en una columna de fase inversa está relacionada con


31

la longitud de la cadena hidrocarbonada unida a la sílice, con la densidad superficial de la

fase (μmoles de n-alquilsilano por unidad de superficie de sílice) y con la superficie

específica del material silíceo empleado en su preparación. La fase móvil juega un doble

papel: por una parte, su naturaleza y composición determinan las interacciones con las

moléculas del soluto; por otra, modifica notablemente la organización de la fase

estacionaria, interviniendo indirectamente en las interacciones entre ésta y el soluto. La

interacción entre el soluto y las cadenas hidrocarbonadas de la fase estacionaria no es

sólo función de la naturaleza del soluto, sino también de la densidad superficial y

organización de la fase (Tchapla et al., 1993).

3. Tipos de relleno

Pueden dividirse en tres grandes grupos: monoméricos, oligoméricos y poliméricos.

• Fases monoméricas. Se preparan por reacción de un n-alquildimetil-clorosilano y los grupos silanoles de la superficie de la sílice, dando lugar a una unión covalente a través de un grupo siloxano (Si-O-Si). Desde un punto de vista estructural son las fases más sencillas de las tres citadas, ya que las cadenas n-alquílicas forman una monocapa sobre la superficie de la sílice. El grado de recubrimiento que consiguen los diferentes fabricantes con estas fases varía entre 2 y 4 μmoles/m2, dependiendo de las condiciones de reacción y del tipo de silano usado. Esta característica justifica en parte las diferencias de comportamiento cromatográfico observado entre los diferentes productos comerciales para fase inversa. Se estima que después de la funcionalización todavía quedan aproximadamente un 50% de los grupos silanoles de la superficie de la sílice sin reaccionar, debido a impedimentos estéricos. Parte de los grupos silanoles residuales pueden ser bloqueados (Proceso denominado end-capping) en una reacción posterior del relleno con un silano de menor tamaño, generalmente trimetilclorosilano. A pesar de esta segunda reacción, un buen número de grupos silanoles permanecen sin bloquear y pueden interaccionar con el soluto durante el proceso de separación.

• Fases oligoméricas. Si la superficie de la sílice está saturada con agua y se emplea un n-alquiltriclorosilano como reactivo, éste reacciona simultáneamente con los grupos silanoles de la sílice y con el agua presente en el medio originando una reacción de entrecruzamiento del silano y la formación de un n-alquilpolímero, que quedará unido a la superficie originando un recubrimiento de espesor equivalente a varias monocapas del n-alquil-derivado. Generalmente el espesor de esta multicapa varía de unos puntos a otros de la superficie. La formación del polímero tiene dos consecuencias: la densidad superficial en estas fases es bastante mayor que en las fases monoméricas; y, debido al


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entrecruzamiento del silano, el ordenamiento es también mayor que en las monoméricas.

• Fases poliméricas. Están constituidas por polímeros sintéticos de los que el más empleado es el copolímero estireno-divinilbenceno. Debido a que en este caso toda la partícula está enteramente constituida por polímero, estos rellenos presentan generalmente mayor retención que las fases monoméricas y las oligoméricas y, probablemente, un mayor grado de orden que las anteriormente descritas.

Figura IV.1

Síntesis del copolímero estireno-divinilbenceno (http://www.tecnociencia.es/especiales/intercambio_ionico/introduccion.htm).

De esta descripción se puede deducir que es posible emplear varios tipos de fases

estacionarias, que difieran notablemente en la densidad superficial y la organización de

los restos orgánicos que intervienen en la retención. Por tanto, es lógico pensar que estas

fases pueden interaccionar con el soluto de maneras diferentes, dependiendo de las

condiciones de separación (fase móvil, temperatura, etc.).

4. Modelos de retención

Se han propuesto tres modelos basados respectivamente en el efecto solvófobo, el

reparto del soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria, y en la adsorción del soluto

sobre la fase estacionaria.

• Modelo del efecto solvófobo. Este modelo pone de relieve el papel primordial de la fase móvil en cromatografía de líquidos en fase inversa (CLFI) al admitir que el soluto, debido a su hidrofobicidad, es expulsado de la fase móvil hacia la fase estacionaria. Se describe a continuación de forma resumida este efecto desde un punto de vista termodinámico, pudiendo consultarse los trabajos originales (Melander y Horváth., 1980; Horváth y Melander, 1976,1977), para un estudio más detallado.


33

El equilibrio que da lugar a la retención de un soluto, i, sobre la fase estacionaria, S, en presencia de la fase móvil, puede escribirse como:

i+S->iS

donde iS es el complejo formado por asociación del soluto adsorbido sobre la fase estacionaria. Como ya se ha indicado, la retención del soluto puede expresarse a través del factor de retención, k, que está relacionado con el coeficiente de distribución.

Para estudiar la variación del potencial químico se puede considerar el proceso

dividido en dos partes: la correspondiente a las interacciones entre i y S en un

gas inerte para originar el complejo iS y debida a la introducción de i, S e iS

dentro del disolvente.

En muchos casos las interacciones entre i y S fuera del disolvente tienen lugar a través de fuerzas de tipo dispersivo, siendo posibles otras interacciones que contribuyan a la retención del soluto si éste es polar (interacciones dipolo-dipolo o dipolo-dipolo inducido) o si la fase estacionaria tiene grupos polares o que permitan transferencia de carga.

Para calcular el valor de la variación del potencial químico se puede suponer que para introducir las especies i, S, o iS en el disolvente es necesario crear un hueco capaz de alojar a cada una de dichas especies. La energía necesaria para crear el hueco es función de su tamaño, que a su vez depende del volumen de la molécula que se pretende introducir y de la tensión superficial del disolvente. Esta energía se denomina término de cavidad, Δμcav. A la energía correspondiente a la interacción de la molécula alojada en el hueco con el disolvente que la rodea, Δμint, contribuyen tres términos: un término que incluye las interacciones de tipo van der Waals entre el soluto y el disolvente, un término electrostático (si la molécula de soluto está cargada eléctricamente) y un término entrópico.

El balance de fuerzas que contribuyen a favor y en contra de la asociación determina que i y S estén más o menos fuertemente asociados y, por tanto, que el soluto esté más o menos retenido por la fase estacionaria. Cuanto mayor sea la tensión superficial, mayor será la retención ya que se requiere más energía para crear la cavidad que aloje a cada especie en la fase móvil. La influencia de ΔA (incremento de área) se justifica al tener en cuenta que el complejo iS presenta al disolvente acuoso una superficie menor que la suma de las que presentan i y S por separado, siendo por tanto el sistema asociado más estable que sin asociar. Si existen cargas no compensadas entre i y S, cuanto mayor sea la constante dieléctrica del medio mayor será la retención.


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Por tanto, según este modelo, en cromatografía en fase inversa el soluto es expulsado hacia la fase estacionaria debido a la tensión superficial de la fase móvil. La asociación entre las moléculas de soluto y de fase estacionaria facilita la estabilidad del complejo iS que controla la retención al disminuir la superficie orgánica en contacto con la fase móvil. Sin embargo, el modelo solvófobo no considera las interacciones del soluto con la fase estacionaria si no es a través del área de contacto ΔA. Esto quiere decir que, de acuerdo con este modelo, la retención del soluto es en buena parte independiente de la fase estacionaria utilizada, lo que está en desacuerdo con un buen grupo de resultados experimentales que demuestran que, para determinadas fases estacionarias, tanto la retención como la selectividad están relacionadas con la naturaleza y la densidad de recubrimiento de la fase estacionaria (Dorsey y Cooper, 1994; Sanders y Wise, 1990; Sentel y Dorsey, 1989).

• Modelo de reparto. Una teoría más reciente sobre la retención en cromatografía de líquidos en fase inversa, que explica en parte el efecto de la fase estacionaria, ha sido desarrollada por Dill et al. (Dill, 1980; Dill et al., 1988; Dorsey y Dill, 1989). Proponen que la retención del soluto se debe fundamentalmente al balance de dos tipos de fuerzas: las originadas por la interacción de las moléculas de soluto con las que la rodean en la fase estacionaria y en la fase móvil, que se pueden expresar a nivel molecular mediante las constantes de interacción binarias; y las que proceden del ordenamiento parcial, con la correspondiente disminución de entropía, que experimentan las cadenas de la fase estacionaria al alojar las moléculas del soluto entre ellas. El modelo se puede describir brevemente de la forma siguiente:

El coeficiente de reparto entre la fase móvil y la fase estacionaria, y por tanto la retención, viene dado por el cociente entre sus concentraciones en las fases estacionaria y móvil, ci

S/ciM, lo cual se puede relacionar con el potencial químico

mientras se considera equilibrio.

a. Interacción de las moléculas de soluto con las que le rodean en la fase estacionaria y en la fase móvil. El modelo supone que cada una de las dos fases es un líquido amorfo y que la retención se puede asemejar al reparto del soluto entre dos fases, una acuosa y otra orgánica. Este reparto se puede cuantificar por el coeficiente de reparto entre una fase acuosa, de la misma composición que la fase móvil cromatográfica, y un hidrocarburo líquido, de la misma naturaleza química que la fase estacionaria cromatográfica pero con mayor número de grados de libertad. En este caso, la fuerza que controla la transferencia del soluto de una fase a otra es la afinidad química relativa de aquél con la fase estacionaria o con la móvil.


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De una forma simple, la fase estacionaria y la fase móvil se representan en el modelo mediante una red tridimensional de celdillas elementales con las que interaccionan las moléculas de soluto. A nivel molecular, el proceso de transferencia de una molécula de soluto de la fase móvil a la fase estacionaria se puede visualizar como la sucesión de tres procesos elementales (Dorsey y Dill, 1989).

Figura IV.2

Representación esquemática de la transferencia de una molécula de soluto: (i) desde la fase móvil; (M) a la fase estacionaria; (S) en el modelo de reparto.

a. Creación de una cavidad del tamaño del soluto en la fase estacionaria.

b. Proceso de transferencia.

c. Llenado de la cavidad dejada por el soluto en la fase móvil.

La fuerza que gobierna la transferencia del soluto procede de las

interacciones necesarias para poner en contacto las moléculas i y j cuando

están separadas una distancia infinita. Diferentes fuerzas contribuyen, por

ejemplo, si las moléculas i y j tienen una carga neta, existe un componente

de tipo electrostático; si i y j tienen dipolos permanentes, el valor es

proporcional al del producto de los momentos dipolares.

Este modelo explica varios hechos importantes observados

experimentalmente en cromatografía en fase inversa:

a. La retención de los solutos es generalmente proporcional al coeficiente de reparto entre la fase móvil y un hidrocarburo líquido de la misma naturaleza química que la fase estacionaria.


36

b. El factor de retención es proporcional al tamaño del soluto ya que el

tamaño de cavidad está relacionado con el factor n.

c. lnK debe crecer linealmente con la tensión superficial de la fase móvil, puesto que ésta lo hace con trabajo necesario para poner en contacto dos moléculas de la fase móvil separadas una distancia infinita.

d. Todos los factores que cambian la solubilidad del soluto en la fase estacionaria o en la fase móvil deben modificar su retención; por ejemplo, se observa que aumentando el pH de la fase móvil los solutos ácidos débiles aumentan su carga neta y su afinidad por la fase móvil.

Aunque este modelo elemental se ha desarrollado para un disolvente puro, puede extenderse fácilmente para mezclas de cualquier número de componentes en la fase móvil, como es la práctica habitual en fase inversa.

b. Efecto del ordenamiento de las cadenas de la fase estacionaria al alojar al soluto. El modelo de reparto permite, aplicando cálculos de mecánica estadística, tener en cuenta las variaciones de conformación que se producen en las cadenas hidrocarbonadas de la fase estacionaria al penetrar en ellas las moléculas de soluto.

La creación de la cavidad dentro de la fase estacionaria para alojar al soluto induce una extensión y un mayor orden en las cadenas de la fase estacionaria. Dicho en términos termodinámicos, la introducción del soluto entre las cadenas de la fase estacionaria es entrópicamente desfavorable, lo que obliga a realizar un trabajo para llevar a cabo este proceso. A partir de esta suposición, el modelo permite predecir, en aceptable acuerdo con los resultados experimentales, que la representación del coeficiente de reparto del soluto entre la fase estacionaria y la fase móvil frente a la densidad de recubrimiento del relleno debe pasar por un máximo. A valores bajos de la densidad de recubrimiento, el coeficiente de reparto aumenta linealmente; a valores elevados, el coeficiente de reparto disminuye debido a la dificultad del soluto para penetrar en la fase estacionaria al aproximarse ésta al estado cristalino.

• Modelo de adsorción. Utilizando el mismo modelo de celdillas establecido por Dill para el modelo de reparto, se puede desarrollar un modelo de adsorción si se supone que en las condiciones experimentales no hay penetración del soluto en la fase estacionaria.

Comparando esto con lo dicho antes sobre las interacciones, se llega a la conclusión de que para la misma naturaleza química de soluto y disolvente, como el trabajo de las moléculas con la fase móvil es del mismo tipo en ambos


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mecanismos, la adsorción será más débil que el reparto, ya que la entalpía de transferencia es del orden de z veces menor, según el modelo de la red tridimensional cúbica. Esto se debe a que solamente una fracción 1/z de la molécula de soluto, la que se adsorbe sobre la superficie, intercambia moléculas con la fase móvil que la rodea y el resto permanece invariable.

La evidencia experimental obtenida con fases estacionarias bien definidas y

sistemas de soluto modelo hacen pensar que los tres mecanismos descritos anteriormente

pueden tener lugar en cromatografía en fase inversa. Que la separación esté controlada

por uno u otro mecanismo depende del tipo de fase estacionaria utilizada, de la fase móvil

empleada, de la mayor o menor rigidez de los solutos a separar y de la temperatura

(Tchapla et al., 1993). Las condiciones más probables en las que cada mecanismo tiene

lugar son:

1. La estructura de la fase estacionaria en forma de empalizada sugiere una interacción del soluto con la parte terminal de las cadenas unidas de la fase estacionaria, que puede ser descrita por el modelo de adsorción. Esta situación se ha observado en la retención sobre fases monoméricas con elevada densidad de recubrimiento de solutos de una cierta flexibilidad, como los que contienen largas cadenas hidrocarbonadas, entre los que se encuentran las series homólogas de los alquilbencenos.

Figura IV.3

Modelo de organización de la fase estacionaria: (a) empalizada, (b) cepillo y (c) gavilla de heno.

2. En el caso de la estructura en forma de cepillo puede haber una inserción de las moléculas de soluto dentro de la fase estacionaria, con interacción entre el soluto y la fase estacionaria controlada por fuerzas de tipo solvófobo. Este comportamiento se ha observado en la separación de solutos flexibles sobre fases monoméricas con baja densidad de recubrimiento.

3. En la estructura en forma de gavilla de heno, las moléculas de soluto están inmersas en la fase estacionaria como en un proceso de reparto. Se ha observado que este modelo es más probable en fases oligoméricas, en las que


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los solutos flexibles pueden introducirse fácilmente entre las cadenas hidrocarbonadas.

No hay que olvidar que bajo las cadenas hidrocarbonadas de la fase estacionaria los

grupos silanoles libres pueden intervenir también en la retención, sobre todo de los

solutos básicos, que poseen centros de densidad electrónica alta como nitrógenos con

pares electrónicos no compartidos o cargados positivamente. Por ejemplo, Horváth et al.

(Nahum y Horváth, 1981; Bij et al., 1981) han observado, empleando columnas de alquil-

sílice, variaciones anormales de la retención de solutos polares, como péptidos con grupos

amino no protegidos, en función del contenido en agua de la fase móvil. El

comportamiento vuelve a ser normal si esos grupos amino se bloquean o si se añade una

amina a la fase móvil. Sin embargo, este efecto de los grupos silanoles es en general

pernicioso para la separación, ya que conduce a picos cromatográficos anchos y con

colas. En la medida de lo posible, se trata de evitar esta adsorción parásita causada por

los silanoles libres empleando un aditivo catiónico en la fase móvil que los enmascare, tal

como la trietilamina, o fases especialmente diseñadas para la separación de compuestos

básicos, en las que la interacción entre el soluto y los grupos silanoles de la superficie es

muy pequeña.

5. Intercambio iónico.

La cromatografía de intercambio iónico se usa para el análisis de sustancias

cargadas eléctricamente en las condiciones de trabajo. En este modo de cromatografía se

emplean fases estacionarias con grupos funcionales cargados eléctricamente. El soporte

puede ser sílice o un polímero. La fase móvil contiene un tampón, que controla la carga

de los solutos, y una sal, que compite con los solutos en su interacción con las cargas de

la fase estacionaria. Las cargas permanentemente unidas al soporte cromatográfico están

compensadas por contraiones, es decir, por iones libres de carga opuesta. El paso a

través de la columna de una muestra, o fase móvil, con iones del mismo signo que los

contraiones de la columna puede provocar el desplazamiento de los contraiones y la

retención de los iones de la muestra o fase móvil. La selectividad y la fuerza de elución

dependen de parámetros como el tipo y concentración de iones en la fase móvil y el pH.

Para una misma fase móvil, el aumento de la concentración salina disminuye la retención

de los solutos. Además de la concentración del contraíon, su naturaleza también influye

sobre la retención a través de la constante de equilibrio del intercambio. Su valor refleja

la relación de afinidad del intercambiador iónico por el soluto y el contraión, que


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generalmente es mayor para iones de mayor carga, con menor volumen hidratado y

mayor polarizabilidad. De este modo la retención de los solutos de la muestra aumenta,

en general, con la naturaleza del anión en la fase móvil en el siguiente orden:

citrato < sulfato < oxalato < yoduro < nitrato < cromato < bromuro

< sulfocianuro < cloruro < formiato < acetato < hidroxilo < fluoruro

El aumento en la retención sobre cambiadores catiónicos aumenta con la naturaleza

del ión presente en la fase móvil en el siguiente orden

Ba2+ < Pb2+ < Sr2+ < Ca2+ < Ni2+ < Cd2+ < Cu2+ < Co2+ < Zn2+ < Mg2+ < UO22+

< Tl+ < Ag+ < Cs+ < Rb+ < K+ < NH4+ < Na+ < H+ < Li+

El pH de la fase móvil juega también un papel importante sobre la retención,

controlando fundamentalmente la ionización de la muestra.

Los intercambiadores iónicos pueden clasificarse en catiónicos y aniónicos. Dentro

de cada grupo pueden diferenciarse los intercambiadores fuertes y débiles. Los

intercambiadores catiónicos fuertes contienen generalmente grupos sulfónicos, mientras

que los carboxilatos suelen estar presentes en los intercambiadores catiónicos débiles. Las

sales de amonio cuaternario son los grupos funcionales más usuales en los

intercambiadores aniónicos fuertes, empleándose las aminas primarias en los

intercambiadores aniónicos débiles.

6. Pares iónicos.

Este modo de cromatografía permite la separación de solutos que se encuentran

ionizados en las condiciones de trabajo. En la mayoría de las ocasiones, las separaciones

se llevan a cabo en las mismas columnas que se emplean en fase inversa sin formación

de pares iónicos. La fase móvil consiste en la mezcla de un tampón acuoso y un

modificador, a la que se le añade un contraión de carga opuesta a la del soluto. Para el

análisis de sustancias aniónicas se emplean frecuentemente como contraiones las sales de

amonio cuaternario, mientras que las sales de n-alquilsulfatos se encuentran entre los

contraiones más utilizados para el análisis de sustancias catiónicas.

En el caso más simple de cromatografía de pares iónicos, el soluto i y el contraión c

son solubles en la fase móvil acuosa M, mientras que el par iónico ic es soluble en la fase


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estacionaria orgánica S. El proceso para solutos aniónicos y catiónicos podría

representarse respectivamente de forma esquemática como sigue

i-M+c+M ->icS

i+M+c-M ->icS

Sin embargo, no está probado que éste sea el mecanismo en todos los casos. Hay

algunos autores que describen el proceso como un intercambio iónico, al interpretar que

el contraión está adsorbido sobre la fase estacionaria, mecanismo que parece más

probable en el caso de contraiones de gran tamaño.

La retención está controlada por diversos parámetros, entre los que hay que

destacar la naturaleza y concentración del contraión, la fuerza iónica de la fase móvil y su

pH.

Para un mecanismo de retención simple esquematizado según:

iM+cM->icM->icS

y teniendo en cuenta la relación entre el factor de retención y el coeficiente de

distribución, y la ley de acción de masas, la retención del soluto aumenta linealmente con

la concentración de contraión. En la práctica, esta previsión se cumple en un intervalo

reducido de concentraciones del contraión, debido a que los equilibrios implicados en la

retención son más complejos que los indicados.

La influencia de distintos factores sobre la retención es diferente si la formación del

par iónico tiene lugar en la fase móvil que si ocurre en la fase estacionaria (Horváth et al.,

1977). La relación entre la retención del soluto en presencia del contraión y la que tendría

en su ausencia, definida como el incremento de la retención, es función de la carga del

contraión y del tamaño y la carga del soluto cuando el par iónico se forma en la fase

estacionaria. Cuando la formación del par iónico tiene lugar en la fase móvil, la retención

depende de la superficie de la parte hidrófoba del contraión y de la carga del soluto, pero

no de su tamaño.

La retención del soluto aumenta al hacerlo la constante de equilibrio de formación

del par iónico. De este modo, para el análisis de solutos catiónicos, cuanto más fuerte sea


41

el ácido que da lugar al contraión, el equilibrio de formación del par iónico estará más

desplazado hacia la formación del par y mayor será la retención. Otro factor que tiene

influencia sobre la retención es la longitud de la cadena alquílica del contraión que, al

aumentar, produce un incremento de su hidrofobicidad y, como consecuencia, de la

retención.

Junto con la sal correspondiente al contraión puede introducirse otra sal en la fase

móvil con objeto de controlar la fuerza iónica. A bajas fuerzas iónicas puede producirse

una disminución en la retención del soluto respecto a la que tendría sin la adición de la sal

debido a la competencia entre ésta y el soluto por unirse al contraión. Para fuerzas

iónicas elevadas, el aumento de tensión superficial debido al efecto de la concentración

de la sal es responsable del aumento en la retención.

El pH de la fase móvil influye a través de su efecto sobre la ionización del soluto.

Cuanto mayor es el grado de ionización, más se favorece la formación del par iónico, y

mayor es la retención.

7. Exclusión molecular.

En cromatografía de exclusión la separación de los componentes de la muestra está

basada en el tamaño efectivo de sus moléculas.

El soporte cromatográfico actúa como un tamiz molecular. La retención de las

moléculas es función de su tamaño, eluyendo en primer lugar las moléculas mayores, que

no se introducen en los poros del relleno, y correspondiendo el mayor tiempo de

retención a las moléculas más pequeñas, cuyo diámetro les permite entrar y salir de los

poros del relleno cromatográfico.

En cromatografía de exclusión la separación está controlada por el relleno de la

columna, por lo que es aconsejable el empleo de columnas con pequeños tamaños de

partícula para obtener elevadas eficacias. Su naturaleza puede ser polimérica o basada en

sílice, siendo crítica la elección del relleno en función de los tamaños moleculares de los

solutos a separar, y siendo necesario obtener la curva de calibración para los diferentes

materiales de relleno. En la figura puede observarse la representación teórica de una de

estas curvas, en la que a un volumen de retención VR(A), eluyen las moléculas cuyo

elevado tamaño (≥MWA) impide su entrada en los poros del material de relleno, y eluyen


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por tanto en el volumen de exclusión de la columna. A un volumen VR(D), el volumen de

permeación, eluyen todas aquellas moléculas de tamaño suficientemente pequeño

(≤MWD) para poder entrar y salir de todos los poros del material de relleno. En el

intervalo de volumen de elución entre VR(A) y VR(D) pueden separarse las moléculas de

tamaños intermedios. Como puede observarse, cuanto menor sea la pendiente de esta

zona de la curva mayor será la posibilidad de separar compuestos de tamaños

moleculares próximos. Hay que tener en cuenta que estas curvas de calibración se suelen

obtener con compuestos patrón de unas determinadas características químicas y

geométricas. Es evidente que, además del peso molecular, la disposición geométrica de la

molécula tiene gran influencia sobre su tamaño efectivo y sobre la probabilidad de

introducirse en los poros del relleno cromatográfico. Esta consideración es importante

tanto para la elección de la columna apropiada para la separación de los componentes de

una muestra dada, como para calcular el peso molecular de un soluto a partir de una

recta de calibrado y de su tiempo o volumen de retención en una columna de exclusión

molecular.

Figura IV.4

La retención en cromatografía de exclusión.

A diferencia de otros modos de cromatografía de líquidos, en exclusión molecular la

fase móvil no juega un papel específico en la discriminación de los solutos, sino que su

misión es transportarlo a lo largo de la columna. La selección de la fase móvil se basa en

su capacidad para disolver la muestra, su baja viscosidad para evitar altas presiones y su

compatibilidad con el relleno cromatográfico. Además de estas características y como ya

se indicó, la fase móvil debe en ocasiones eliminar las interacciones específicas entre el

soluto y el relleno. La retención no deseable debida a fenómenos como adsorción,


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interacciones iónicas, etc., puede ponerse de manifiesto mediante la presencia de picos

en el cromatograma con tiempos de retención superiores al tiempo de permeación, que

suele corresponder al disolvente.

8. Separaciones quirales.

La importancia que tiene la diferenciación de enantiómeros ha desencadenado un

interés creciente por el desarrollo de procedimientos que permitan su separación. Por ello

se hace aquí una breve referencia a los métodos que permiten la resolución de estas

moléculas.

La separación de enantiómeros mediante cromatografía de líquidos puede abordarse

de diferentes modos. El procedimiento tradicional para la separación de enantiómeros es

su transformación en diastereoisómeros, que pueden separarse en CLAE, generalmente

en fase inversa, sin el empleo de fases quirales. Sin embargo, este procedimiento conlleva

la necesidad de preparar derivados, con el consiguiente riesgo de reacciones secundarias,

y requiere la disponibilidad de reactivos quirales de pureza controlada. Además, el

proceso es largo y laborioso y, en muestras con bajo contenido en enantiómeros, es difícil

lograr un rendimiento cuantitativo. Estos inconvenientes se evitan con la separación

directa de los enantiómeros, que puede realizarse mediante fases estacionarias quirales o

añadiendo aditivos quirales en la fase móvil. La inclusión de estos aditivos es fácil de

llevar a cabo y permite gran número de variaciones.

La preparación de fases estacionarias quirales puede realizarse por recubrimiento

del relleno al hacer pasar la solución a través de la columna, o por unión iónica o

covalente del reactivo quiral al material de relleno de la columna. Dentro de los rellenos

cromatográficos hay que destacar los siguientes grupos:

1. Los que producen interacciones π-π.

2. Los que portan una proteína unida, de modo que los dos enantiómeros experimentan interacciones de distinta magnitud con la proteína durante su paso por la columna.

3. Los que incluyen cavidades quirales, que pueden producirse por polimerización del material de relleno en presencia de un mol de quiral, como se mencionará al hablar de las técnicas de impresión molecular, este grupo comprende también las ciclodextrinas y los éteres corona.

4. Derivados de polisacáridos, como celulosa, amilosa, etc.


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9. Afinidad.

La cromatografía de afinidad se basa en la interacción específica entre una

molécula, o grupo de moléculas, y un ligando, que es una molécula que se fija a la fase

estacionaria para interaccionar con las del soluto. Cuando uno de los componentes del

complejo, generalmente el ligando, se inmoviliza en un soporte cromatográfico, la

formación del complejo específico puede utilizarse como base para la separación. El

mayor auge de la cromatografía de afinidad, desde sus orígenes a finales de los años 60,

ha correspondido a la cromatografía de bioafinidad, en la que las interacciones entre

ligandos y moléculas se basan en reconocimientos de tipo biológico. Este desarrollo se ha

potenciado con la difusión del estudio de biomoléculas en áreas como la biotecnología, la

bioquímica o la farmacología. Diferentes biomoléculas pueden tener características

fisicoquímicas muy similares, por lo que su separación por técnicas basadas en estas

propiedades puede resultar difícil, mientras que sí puede abordarse mediante

cromatografía de bioafinidad al ser ésta una técnica basada en interacciones altamente

específicas entre un ligando y una macromolécula. En este sentido, los antígenos se unen

a los anticuerpos, el RNA mensajero híbrida con el DNA complementario, etc.

La retención en cromatografía de bioafinidad se debe a uniones complejas que

incluyen distintos tipos de interacciones no covalentes, como son fuerzas de van der

Waals, puentes de hidrógeno, fuerzas hidrófobas, dipolo-dipolo, de transferencia de carga

o electrostáticas. La orientación espacial adecuada de los grupos a través de los cuales se

realiza la interacción facilita una elevada combinación cooperativa de fuerzas, lo que

constituye la base de la elevada selectividad y especificidad del enlace en cromatografía

de bioafinidad.

Entre los modos más selectivos de cromatografía de bioafinidad se encuentra la

cromatografía de inmunoafinidad, basada en el reconocimiento entre antígenos y

anticuerpos. Un antígeno es una sustancia que introducida en un organismo origina una

respuesta inmune, es decir, origina la producción de anticuerpos específicos frente a ese

antígeno. Esta respuesta altamente específica de la naturaleza, se ha aprovechado en los

métodos inmunológicos de análisis para emplear los anticuerpos como reactivos

específicos contra los antígenos. Cuando los anticuerpos se inmovilizan en un relleno

cromatográfico, el inmunoadsorbente formado puede emplearse para llevar a cabo

métodos de cromatografía de inmunoafinidad.


45

El anticuerpo se encuentra inmovilizado en la columna, a través de la cual se hace

pasar la muestra que contiene el antígeno, es decir el analito de interés. Éste es

capturado y queda retenido en la columna, mientras que el resto de los componentes de

la muestra que no son reconocidos por el anticuerpo eluyen sin retenerse. La detección

de los compuestos retenidos puede realizarse de diferentes formas, siendo la más usual

su elución con un agente de desorción para medir la respuesta en el detector del

cromatógrafo. La principal ventaja de esta técnica es su selectividad, de modo que

eligiendo el anticuerpo adecuado puede analizarse un único compuesto o, si interesa, se

puede analizar conjuntamente toda una familia de compuestos que tengan en común las

zonas de la molécula que son reconocidas por el anticuerpo, es decir que tengan los

mismos epítopos. De manera inversa, pueden analizarse anticuerpos específicos

empleando una columna con el correspondiente antígeno.

Dada la selectividad proporcionada por los distintos reconocimientos específicos que

se dan en la naturaleza, se han desarrollado técnicas para tratar de imitar este

comportamiento para el análisis de otras sustancias, preparando sintéticamente rellenos

cromatográficos para el reconocimiento y análisis de una o varias moléculas dadas. Estas

técnicas se denominan de impresión molecular (Ngo, 1993). La influencia de la

orientación espacial de los grupos funcionales en la selectividad de la interacción impone

un cuidadoso control de las posiciones de unión en la preparación de rellenos

cromatográficos de impresión molecular.

La preparación de polímeros de este tipo comienza mezclándose la molécula que se

quiere reconocer, el molde, con los monómeros adecuados para producir interacciones

específicas. A continuación se polimeriza la mezcla en presencia de concentraciones

elevadas de un agente de entrecruzamiento para formar un polímero rígido e insoluble.

Finalmente se elimina el molde de modo que la red polimérica dispone de microcavidades

con impresiones que son complementarias en forma y en funcionalidad química con el

molde. Si este material polimérico se emplea como relleno en una columna, se retendrán

de forma preferente las moléculas similares al molde.

10. Modos de elusión.

Se denomina fuerza eluyente o poder de elución de una fase móvil a su capacidad

para eluir un soluto dado desde una fase estacionaria determinada (Snyder, 1968). Un

disolvente B tendrá mayor fuerza eluyente que otro disolvente A, si un soluto tiene un


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factor de retención menor, en la misma columna, cuando se emplea B como fase móvil,

que cuando se emplea A. En términos generales, se habla de eluyentes fuertes y

eluyentes débiles, según que su fuerza eluyente sea alta o baja. Así por ejemplo, en

cromatografía de líquidos en fase inversa, cualquier modificador orgánico (metanol,

acetonitrilo o tetrahidrofurano) es un disolvente fuerte en comparación con el agua, que

en esta técnica es siempre el disolvente más débil que se utiliza. En una fase móvil

formada por la mezcla de agua y modificador orgánico, cuanto mayor sea su contenido en

modificador mayor será su fuerza eluyente, ya que los solutos estarán menos retenidos

cuanto mayor sea la concentración de disolvente orgánico en la fase móvil. Por la misma

razón, en cromatografía de intercambio iónico, cuanto mayor es la concentración de sal

en la fase móvil mayor es su poder de elución para solutos iónicos.

Se puede cambiar de forma considerable el factor de retención de las sustancias a

separar, y por tanto el tiempo de duración del análisis, modificando la fuerza eluyente de

la fase móvil. Una parte de las estrategias para optimización de los métodos de

separación en cromatografía de líquidos se basa en los conocimientos que se tienen de

cómo varía la fuerza eluyente de la fase móvil con su composición (Snyder et al., 1968).

En cromatografía de líquidos hay dos estrategias generales para abordar una

separación: la elución isocrática y la elución en gradiente.

• Elución isocrática. La fuerza eluyente de la fase móvil permanece constante durante la separación. Se emplea generalmente cuando los componentes de la muestra tienen factores de retención semejantes. En estos casos casi siempre es posible encontrar una composición de la fase móvil en la que todos los solutos se eluyen en un intervalo de retenciones razonable (1 < k < 10) con una resolución óptima.

• Elución en gradiente. En las separaciones en gradiente se hace variar el poder de elución de la fase móvil a lo largo del análisis cambiando la composición de la fase móvil que entra en la columna, de acuerdo con un programa preestablecido. La elución en gradiente se emplea en la separación de mezclas complejas, formadas por solutos de naturaleza muy distinta y que poseen un amplio intervalo de factores de retención (1 < k < 50). Este modo de elución permite incluir todos los componentes en un solo cromatograma utilizando una opción similar a la que representa la programación de temperatura en cromatografía de gases. Si una muestra compleja se tratase de analizar mediante elución isocrática con una fase móvil de elevado poder de elución con el fin de hacer salir de la columna todos los componentes en un


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tiempo razonable (~30 min), es probable que los componentes de menor retención salieran próximos al tiempo básico y con poca resolución. Por el contrario, si se utilizase una fase móvil de bajo poder de elución para conseguir la resolución de los primeros componentes, los solutos de mayor retención tardarían mucho tiempo en eluirse y originarían picos anchos que, debido a su dilución en la fase móvil, serían difíciles de detectar. En estos casos la elución en gradiente permite incrementar la fuerza eluyente de la fase móvil a lo largo del análisis para provocar una disminución de los factores de retención, tanto más acusada cuanto más retenido esté el compuesto. Los solutos menos retenidos eluyen bien resueltos al comienzo del gradiente, cuando una fase móvil de baja fuerza eluyente entra en la columna; en esta etapa del gradiente los solutos más retenidos avanzan muy lentamente hasta que llega fase móvil de fuerza eluyente creciente en sucesivas etapas. Entonces la velocidad de desplazamiento de los solutos más retenidos se acelera y eluye. En una elución en gradiente, los componentes de la muestra salen de la columna en tiempos razonables y generalmente dan lugar a picos estrechos fácilmente detectables. La diferencia de comportamiento de los solutos en elución isocrática y en gradiente se ilustra en la figura (Snyder, 1980).

Figura IV.5

Fracción de columna recorrida (r) por las bandas de los solutos X, Y, Z en función del tiempo para una separación isocrática (a) y en gradiente de elución (b); c y d

representan los cromatogramas que se originan; tg corresponde al momento en que r = 1; X el soluto menos retenido; Z el soluto más retenido.


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V. CROMATOGRAFÍA DE GASES.

1. Introducción.

Su comienzo data del 1951, año en el que la revista Journal of Biochemistry recibió

un trabajo escrito por James y Martin (1952) sobre cromatografía de reparto gas-líquido,

donde se asentaron las bases teóricas de la técnica, si bien fue van Deemter (1956) quien

realizó el desarrollo teórico más importante. A lo largo de esa década se sucedieron

diversos avances como la programación de temperatura (Griffiths et al., 1952), las

columnas capilares abiertas (Golay, 1958) y los detectores de ionización (McWilliam y

Dejar, 1958; Lovelock, 1958); aunque realmente los avances han continuado desde

entonces haciendo de esta técnica la más utilizada para análisis cuantitativo y cualitativo

para compuestos orgánicos de volatilidad media o alta.

2. Sistemas de inyección de muestras.

La mayor parte de los dispositivos existentes para la introducción de muestras en

cromatografía de gases llevan a cabo su tarea tratando de no alterar las condiciones de

temperatura, presión y flujo, es decir, sin interrumpir el funcionamiento. Al igual que en

otras técnicas, un sistema óptimo debe cumplir una serie de requisitos:

- La composición de la fracción de muestra introducida en la columna cromatográfica debe ser la misma o muy similar a la composición de la muestra original, para poder obtener un correcto análisis cuantitativo; es decir, no deben existir pérdidas de componentes por descomposición, adsorción u otro mecanismo, ni tampoco discriminación entre componentes por otras causas.

- La anchura de zona ocupada por la muestra debe ser mínima para aprovechar al máximo la eficacia de la columna.

- Debe funcionar de manera perfectamente reproducible.


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2.1. Modalidades de inyección.

En los cromatógrafos de gases la muestra debe pasar a la columna directamente o

arrastrada por el gas portador, sin alterar su flujo. Teniendo en cuenta la sensibilidad

deseada y la capacidad de carga de la columna, se introducen cantidades que van desde

los microgramos a los picogramos, empleando volúmenes que pueden oscilar desde los

nanolitros a varios centenares de microlitros; en estos casos, y tratándose de mezclas

muy diluidas, la mayor parte del disolvente se elimina antes de llegar a la columna.

La mayoría de los equipos comerciales van provistos de algún tipo de inyector, que

es básicamente una cámara de pequeño volumen situada a la entrada de la columna,

recorrida por el gas portador y dotada de calefacción independiente. Todos ellos tienen,

además, un pequeño obturador, que consiste generalmente en una membrana de

elastómero llamada septum que se perfora mediante una microjeringa al introducir la

muestra. Las modalidades de inyección más comunes son las siguientes.

Figura V.1

Esquema de inyectores de CG, sin y con divisor de flujo.

• Con evaporación previa

a. Inyección directa:

El esquema se muestra en la figura. La muestra introducida a través del septum se vaporiza bruscamente y es arrastrada por el gas portador hacia la columna. La cámara se mantiene a una temperatura ligeramente superior a la de la columna.


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Este tipo de inyectores tiene un requisito: el gas portador debe circular por la

cámara a una velocidad tal que el ensanchamiento de la zona de muestra sea mínimo, y ello se consigue cuando su velocidad lineal en la cámara es similar o superior a la que lleva en la columna. Por ello este tipo de inyector se utiliza con buenos resultados en columnas de gran diámetro, sean de relleno o abiertas.

En general poseen más ventajas que inconvenientes: el ensanchamiento de banda es inapreciable, no hay pérdidas de ninguna clase, salvo para solutos termolábiles, y la cámara suele ir recubierta de una camisa de vidrio o cuarzo, especialmente desactivada y fácil de limpiar, para minimizar la adsorción. Sin embargo, cuando se utiliza este tipo de dispositivo con columnas de pequeño diámetro, cuyos flujos óptimos son bajos (<1 ml/min), la diferencia de velocidades lineales entre cámara y columna provoca un ensanchamiento incompatible con la eficacia que se espera de tales columnas.

b. Inyección con división de flujo (split) (Grob, 1986):

El esquema básico se muestra en la figura. Se utiliza para columnas de pequeño diámetro, generalmente capilares abiertas.

El gas portador que arrastra la muestra, una vez evaporada, se divide en dos partes: una pasa a la columna y otra se envía al exterior. El objetivo que se persigue es evitar el ensanchamiento de la zona ocasionado por las diferencias de diámetro entre la cámara y la columna. Para conseguirlo, es importante que la velocidad lineal del gas en la cámara sea igual o superior a la velocidad en la columna, lo que se consigue fácilmente si la salida de gas hacia el exterior está situada por detrás de la entrada en la columna, como se observa en la Figura.

Figura V.2

Esquema de control neumático de inyección con división de flujo.

La división de flujo ocasiona una división equivalente de la muestra que, en principio, debe ser proporcional a la relación de división de flujos, también conocida


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por relación de división de flujos y que se define como la relación entre el flujo total y el que pasa por la columna, Ftotal/Fcolumna. Desgraciadamente esta relación no siempre se mantiene estable y representa la principal fuente de problemas de este tipo de inyector.

Cuando se introduce una muestra disuelta, la disolución es lanzada como un surtidor de microgotas: las más pequeñas se evaporan y otras chocan con las paredes calientes de la camisa de vidrio. Dado el poco tiempo que la mezcla de gas y muestra permanece en la cámara (1-5 s), algunas gotas que contienen los componentes menos volátiles pueden ser arrastradas al exterior antes de evaporarse completamente, lo que se pone de manifiesto como una disminución del área en el cromatograma de ciertos componentes discriminados.

Para evitar o minimizar este tipo de problemas se han propuesto diferentes diseños para la camisa de vidrio. Por otra parte, la evaporación brusca del disolvente en un espacio tan reducido provoca una sobrepresión, que altera momentáneamente la relación de división de flujos y, por lo tanto, hace casi imposible calcular con exactitud qué cantidad de muestra se ha enviado realmente a la columna. Esta sobrepresión es también la causa de que el procedimiento no permita introducir grandes volúmenes de muestra, ya que el exceso se enviaría al exterior.

Este tipo de dispositivos suelen llevar una salida de gas portador adicional, llamada purga del septum, destinada a enviar al exterior, sin que contaminen la columna, la mayor parte de los monómeros y demás impurezas que, procedentes del material elastómero del septum, pasan continuamente al gas portador. La inyección con división de flujo es quizá la más utilizada en el trabajo con columnas capilares al ser un procedimiento rápido, cómodo, moderadamente reproducible y fácil de automatizar.

Sus principales inconvenientes son:

La discriminación de ciertos componentes de la muestra cuando se trabaja con mezclas de amplio intervalo de ebullición.

La descomposición de muestras termolábiles.

La dificultad de llevar a cabo un calibrado absoluto del sistema, ya que casi nunca se llega a saber cuánta muestra ha llegado realmente al detector.

c. Inyección sin división/con división interrumpida (splitless):

Se emplea para aumentar la cantidad de muestra que llega al detector, sobre todo cuando se trabaja en el análisis de trazas con columnas capilares.


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Se utilizan los mismos inyectores mencionados anteriormente, pero se opera

del siguiente modo: el divisor de flujo se cierra, se introduce la muestra, y se vuelve a abrir después de un periodo controlado de tiempo del orden de 15 a 60 s. De esta manera la mayor parte de la muestra penetra lentamente en la columna mientras el divisor está cerrado, y los últimos restos son barridos hacia el exterior cuando se abre de nuevo.

Para compensar el ensanchamiento de zona ocasionado se puede operar de dos formas:

• La más frecuente consiste en mantener la columna a temperatura muy baja a fin de que los vapores de la muestra vayan condensando en una zona lo más estrecha posible a medida que van entrando (crioenfoque). Una vez abierto el divisor de flujo se programa la temperatura del horno según requiera el proceso cromatográfico, con lo que se obtiene una eficacia comparable a la de una inyección en modalidad split. Evidentemente, es necesario que exista una diferencia de temperaturas importante entre el punto de ebullición de los solutos y la temperatura inicial de la columna, a fin de que condensen totalmente.

• Otra forma de conseguir la reconcentración es utilizando el llamado efecto del disolvente. En este caso, se trata de lograr que el disolvente condense a la entrada de la columna, formando, junto con la fase estacionaria, una especie de fase mixta de elevado espesor que reduce local y temporalmente la relación de fases, β, lo que supone el aumento del factor de retención de las moléculas de soluto situadas en el frente de la zona cromatográfica y, por tanto, un impedimento para su avance. De esta forma, los solutos quedan atrapados en el primer tramo de la columna, cubierto temporalmente con esta fase mixta; una vez que se evapora el disolvente, los solutos comienzan a eluirse en forma de banda reconcentrada. Es preciso elegir un disolvente que tenga un punto de ebullición lo suficientemente elevado para poder condensar en las condiciones elegidas y que se separe convenientemente de los solutos. Cuando se trabaja con fases no inmovilizadas el disolvente puede acabar arrastrando la fase estacionaria, desnudando la columna interiormente; para evitarlo, se puede intercalar un capilar sin fase antes de la columna, o dejar deliberadamente sin recubrir 1 -2 m en cabeza de columna, lo que se denomina zona sin retención.

Para trabajar en cualquiera de estas dos modalidades se utilizan los mismos dispositivos, llamados inyectores con/sin división de flujo. Los equipos comerciales llevan a cabo el control neumático básicamente de una de estas dos maneras: regulación por la presión de entrada a la columna y un restrictor variable en la salida


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al exterior, o uso de un sistema de retrocontrol de presión a la salida, manteniendo un regulador de flujo a la entrada).

d. Inyector con temperatura programada (PTV) (Schomburg, 1985)

Es básicamente igual que los descritos anteriormente, pero en lugar de trabajar a una temperatura prefijada la muestra se introduce en frío, se deposita sobre un relleno y se calienta rápidamente hasta una temperatura determinada, lo que provoca la evaporación homogénea de la disolución y su arrastre hacia la columna.

La combinación de esta programación de temperatura con la operación de las válvulas de apertura y cierre del divisor de flujo permite eliminar de modo selectivo gran parte del disolvente y aumentar la cantidad de muestra introducida, reduciendo casi por completo la discriminación y disminuyendo la descomposición de muestras lábiles.

• Sin vaporización previa

El procedimiento (Grob, 1987) que cumple esta condición se llama inyección en columna. En él la muestra se deposita directamente en cabeza de la columna, sin vaporización previa ni división de flujo. Para ello se utilizan inyectores con obturador mecánico en vez de septum y jeringas especiales con agujas de pequeño diámetro externo (<0,3 mm), compatible con el interno de las columnas, que suele ser de 0,3-0,5 mm.

Las ventajas son muchas: no hay división de la muestra ni discriminación, no hay precalentamiento excesivo ni contacto con metales a altas temperaturas, se evitan descomposiciones, y desaparecen los problemas típicos del septum tales como la contaminación con siliconas volátiles y con partículas sólidas. También tiene sus inconvenientes: el disolvente puede afectar a la fase estacionaria, las agujas de las jeringas se obstruyen con facilidad y las muestras deben estar lo más exentas posible de compuestos no volátiles, que se depositarían en su totalidad en la columna.

2.2. Dispositivos externos para introducción de muestras

Según sea el estado físico de la muestra, se necesitarán diferentes tipos de dispositivos para tomarla y transferirla al sistema cromatográfico, ya sea directamente a la columna o al inyector, y respetando los requisitos indicados más arriba. Algunos de estos dispositivos son muy simples, como las microjeringas; otros son equipos tan voluminosos y sofisticados como el propio cromatógrafo, y muchos de ellos incluyen toma de muestra e introducción en la columna, reemplazando a los inyectores de tipo básico descritos anteriormente. Se pueden mencionar los que se utilizan para:


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Tabla V.1

Dispositivos externos más usados para la introducción de muestras en CG (Dabrio et al., 2000)

• Introducción de muestras en estado líquido.

Además de las muestras líquidas, una gran parte de las muestras sólidas se introducen disueltas en algún disolvente, lo que hace que el procedimiento más común de inyección de muestras utilice microjeringas de pequeño volumen (1-10 μl). Sin embargo, la búsqueda de mayor sensibilidad y el acoplamiento CL-CG han sido las principales causas del desarrollo de las técnicas de inyección de volúmenes muy superiores.

No es posible la introducción en una columna capilar de volúmenes del orden de 100 μL de líquido o superiores, aunque sería muy ventajoso para el análisis de trazas o cuando se tienen muestras muy diluidas que no es fácil concentrar sin perder parte de los analitos.

Para trabajar en estas condiciones, hay que introducir la muestra en una zona sin retención o en una precolumna, evaporar la mayor parte del disolvente a baja temperatura eliminándolo a través del divisor de flujo o de otro sistema similar, y reconcentrar los solutos mediante efecto de disolvente o simple crioenfoque.

Es recomendable llevar a cabo este tipo de inyecciones mediante algún sistema automático.

Válvulas Muestras gaseosas

Jeringas de gases

Microsondas Muestras sólidas

Pirolizadores

Muestras Líquidas o disueltas en un líquido Microjeringas

Vapor confinado

Arrastre con gas inerte Compuestos volátiles en matrices sólidas

o líquidas

Desorción Térmica


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• Introducción de muestras en estado gaseoso.

En algunos casos este tipo de muestras se puede introducir directamente en la columna, pero muchas veces hay que llevar a cabo una etapa de enriquecimiento o preconcentración. Entre los distintos dispositivos utilizados para la introducción de muestras gaseosas se pueden mencionar:

o Jeringas de gases. Dotadas con un émbolo antifuga, especialmente diseñadas para estos casos.

o Válvulas. Similares a las que se emplean en cromatografía de líquidos.

• Introducción de muestras en estado sólido.

o Microsondas. Muchas son parecidas a las jeringas de líquidos, con la punta preparada para introducir pequeñas cantidades de sólidos que se depositan en ella, bien directamente, bien por evaporación a partir de una disolución. Algunas de ellas pueden utilizarse con los inyectores provistos de septum mencionados para muestras líquidas.

o Pirolizadores. Permiten analizar muestras no vaporizables. Son dispositivos que provocan la descomposición térmica controlada de la muestra y el arrastre de sus fragmentos hacia la columna. Si la pirólisis es reproducible, el análisis de esos fragmentos suministra la información deseada acerca de la composición de la muestra. Este tipo de inyección se aplica a compuestos que no pueden eluirse en cromatografía de gases, como macromoléculas o incluso células.

• Introducción de compuestos volátiles.

o Sistemas de muestreo de vapor confinado (static headspace). Cuando una muestra líquida o sólida que contiene componentes volátiles se mantiene a temperatura constante en un recipiente cerrado, dichos componentes se reparten entre líquido y vapor; cuando se alcanza el equilibrio, la cantidad de cada componente en la fase gaseosa depende de su concentración inicial en la fase líquida o sólida, de la temperatura y del coeficiente de actividad.

La fase gaseosa puede inyectarse directamente en el cromatógrafo de gases. Como suele estar muy diluida se requieren cantidades de muestra relativamente grandes, y es habitual el uso de columnas con


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Figura V.3

Inyección de espacios de cabeza, (a) Vapor confinado, (b) Arrastre con gas inerte.

elevada cantidad de fase estacionaria o columnas de relleno. Existen varios dispositivos comerciales que operan automáticamente, lo que suele ser necesario para conseguir una reproducibilidad satisfactoria.

o Métodos de arrastre con gas inerte. Si se hace pasar una corriente de

gas a través de una muestra líquida o sólida que contiene componentes volátiles, éstos son arrastrados de modo continuo por el gas y pueden llegar a extraerse casi totalmente de la disolución. Para recuperar los analitos es necesario pasar el gas por una trampa que los retenga.

Las trampas se basan en dos modos básicos de captura de solutos: la criocondensación o la adsorción. El posterior calentamiento de las trampas permite introducir los solutos en la columna. Si la desorción de la trampa es lenta, se produce un ensanchamiento de la zona que se debe reconcentrar en cabeza de columna.

o Desorción térmica. Se utiliza para extraer compuestos volátiles de muestras sólidas o de trampas donde aquéllos hayan condensado previamente. La muestra se calienta en una corriente de gas portador que arrastra los componentes volátiles hacia la columna. Habitualmente se requiere una etapa de crioconcentración, pudiendo ser la reconcentración por espacio en cabeza innecesaria si los componentes a determinar tienen factores de retención moderados o altos. Entre sus ventajas pueden citarse la ausencia de disolventes y la sencillez de la etapa de preparación. Su principal inconveniente es la posibilidad de formación de artefactos por descomposición térmica de la matriz o la pérdida de componentes lábiles.


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3. La columna.

Las dimensiones de la columna tienen una trascendencia directa en la eficacia del

sistema, y el material de que está construida condiciona en ciertos casos los parámetros

de operación. Las columnas en Cromatografía Gaseosa se pueden clasificar en dos tipos

principales: abiertas y de relleno. En las primeras, la fase estacionaria se impregna sobre

la pared interna del tubo, dejando en el centro un canal para la fase móvil; en las

segundas, la fase se deposita sobre partículas sólidas que llenan completamente el tubo

en el que van contenidas.

3.1. Tipos de columnas y dimensiones

Los tubos son casi siempre cilíndricos, aunque a veces se han propuesto de sección

rectangular o elíptica. Las columnas analíticas que se utilizan en Cromatografía Gaseosa

tienen una gran variedad de dimensiones, tal como se recoge en la tabla.

Figura V.4

1Columna de relleno de cromatografia gaseosa (http://www.uib.es/depart/dqu/dquo/pau/Cromatograf%92a/columnas.html).


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Tabla V.2

Dimensiones habituales en las columnas que se usan en Cromatografía Gaseosa (Dabrio et al., 2000)

Tipo Denominación Diámetro (mm)

Longitud (m)

Cantidad de fase

dp (um)

Ultrarrápidas/ microcapilares 0,05-0,1 10-25 0,1-0,5a -

Capilares 0,1-0,3 10-100 0,1-5a -

Semicapílares/ megacapilares 0,5-0,75 10-100 0,2-5a -

PLOT 0,5-1 10-100 0,5-1b -

Abiertas

SCOT 0,5-1 10-100 0,5-30b 80-500

Capilares rellenas 0,8-1 2-7 5-15c 80-200

De relleno

Clásicas 2-6 2-7 5-15c 80-500

a df, en μm. b espesor del lecho (soporte + fase estacionaria), en μm. c % de fase estacionaria.

Figura V.5

Sección Transversal de distintos tipos de columnas.


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En las columnas capilares abiertas de pared recubierta (WCOT, Wall-Coated Open

Tubular) la fase estacionaria se deposita sobre la pared interna del tubo, que es lisa y en

general poco modificada; en las columnas abiertas de pared porosa (PLOT, Porous-Layer Open Tubular) existe una capa porosa sobre la pared interna que se suele conseguir por

corrosión de la pared o por deposición de un producto sólido. La capa porosa puede servir

de soporte para la fase líquida estacionaria o actuar ella misma como fase estacionaria.

Las columnas abiertas recubiertas con soporte (SCOT, Support-Coated Open Tubular) son

similares a las PLOT, sólo que en este caso la capa porosa consta de partículas sólidas

depositadas a partir de una suspensión que también se pueden recubrir de fase

estacionaria.

Figura V.6

Columna Capilar WCOT (http://www.uib.es/depart/dqu/dquo/pau/Cromatograf%92a/columnas.html)

3.1.1. Efecto de las dimensiones sobre el comportamiento de las columnas

Tanto el tipo de columna como sus dimensiones influyen fundamentalmente sobre tres características: la permeabilidad, la relación de fases y la capacidad de carga, que a su vez determinan su distinto comportamiento cromatográfico.

a. Permeabilidad.

La permeabilidad específica, B0, expresa la resistencia de la columna al paso de la fase móvil.

La baja permeabilidad explica la gran caída de presión en las columnas de relleno y limita a menos de 5 m. la longitud que pueden tener cuando se utiliza un intervalo habitual de presión, es decir, menos de 8 kg/cm2, y tamaños de partícula no excesivamente pequeños (hasta 100-120 mesh). En columnas abiertas de diámetro igual o menor que 0,1 mm, la longitud máxima no suele exceder los 15-


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20 m, mientras que las de 0,2-0,3 mm de diámetro pueden alcanzar fácilmente los 100 m de longitud sin problemas de operación.

b. Relación de fases (β).

Es la relación entre el volumen de fase móvil y el de fase estacionaria en la columna.

En las columnas abiertas, el volumen de fase móvil es prácticamente igual al volumen geométrico interno; en las columnas de relleno, corresponde a la suma del volumen libre entre partículas más el de los poros, y suele ser difícil de calcular. El volumen de fase estacionaria se deduce, bien a partir del peso y la densidad de la fase utilizada al preparar la columna, bien a partir de la determinación del volumen de retención específico, Vg para un patrón. El valor de β es mucho mayor en las columnas abiertas que en las de relleno.

c. Capacidad de carga.

Representa la cantidad máxima de soluto que se puede eluir sin provocar sobrecarga, es decir, la cantidad máxima de soluto que sigue cumpliendo la condición de dilución infinita. Para un compuesto con un factor de retención determinado, es función de la cantidad de fase estacionaria por unidad de volumen de columna, lo que quiere decir que depende del peso de relleno y del porcentaje de fase depositada en el mismo para las columnas rellenas, y de df y el diámetro interno para las capilares de pared recubierta.

Tabla 0.3

Comparación de columnas abiertas de distinto diámetro y con diferente cantidad de fase estacionaria.

Diámetro interno (μm) H(k=2) df (μm) β Capacidad de carga

(μg)

0,1 500 0,02 200

0,2 250 0,04

0,1 800 0,06

0,5 160 0,3 320 0,31

1 80 0,5

0,25 530 0,3

0,5 265 0,6

1 133 1 530 0,59

5 27 10


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3.1.2. Efecto de las dimensiones sobre la eficacia y resolución.

a. Longitud.

La eficacia es directamente proporcional a la longitud de la columna, en cambio, la resolución es proporcional a la raíz cuadrada de la longitud de la columna

b. Diámetro interno de la columna (dc).

Para las columnas de relleno, el diámetro de la columna no aparece en la ecuación general de la eficacia, lo que significa que influye poco sobre la altura de plato; de hecho, su efecto es poco apreciable para los diámetros de tubo que se utilizan habitualmente en análisis (de 1 a 6 mm), siendo en cambio importante con diámetros muy superiores, como cuando se trabaja a escala preparativa.

Por el contrario, en columnas abiertas, la eficacia varía con el diámetro de la columna, ya que su cuadrado figura en los términos de la ecuación de Golay correspondientes a la resistencia a la transferencia de materia en la fase móvil, CM, y en la fase estacionaria, CS. La contribución del término CM es elevada, limitando el número de platos que se pueden obtener con un tubo de un diámetro determinado.

Figura V.7

Variación de la eficacia con el diámetro interno en columnas capilares abiertas (Dabrio et al., 2000)

c. Espesor de película de fase estacionaria (df):

También se encuentra relacionado con la eficacia, ya que su cuadrado figura en el término de resistencia a la transferencia de materia en la fase estacionaria, y comienza a ser apreciable cuando el espesor de película es elevado (>1 μm).


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d. Tamaño de partícula (dp):

Su contribución es importante en las columnas de relleno ya que aparece en dos términos de la ecuación de la eficacia.

A no ser que las partículas sean esféricas y uniformes, su efecto final no es fácil de predecir cuantitativamente (Littiewood, 1962) debido a las dificultades que presenta la estimación de los parámetros relacionados con la estructura geométrica del lecho de partículas (γ, λ, ω, q). La eficacia de las columnas aumenta cuando se utilizan rellenos más finos y uniformes, con el límite práctico para un tamaño de partícula en torno a 100 μm, por debajo del cual la permeabilidad B0 se hace demasiado pequeña y requiere una presión de entrada superior a la que suelen proporcionar los equipos comerciales.

e. Materiales del tubo.

El material ideal debería ser flexible, con buena conductividad térmica, transparente, inerte, irrompible y económico. Como tal material no existe, hay que seleccionar el que posea las especificaciones más adecuadas a cada caso.

Para las columnas de relleno se suele recurrir a materiales como el vidrio y el acero inoxidable, ya que la influencia de la pared en el comportamiento de estas columnas es pequeña: en primer lugar, la superficie interna del tubo es mucho menor que la superficie del relleno; además, la actividad superficial de ambos materiales no es muy elevada, comparable a la del relleno no recubierto por la fase estacionaria. Entre los dos materiales citados más arriba, el vidrio tiene la ventaja de su mayor inercia química frente a posibles acciones catalíticas del acero; su desventaja es la fragilidad.

En el caso de las columnas capilares abiertas, la influencia de la superficie interna del tubo es muy grande, ya que soporta una pequeña cantidad de fase estacionaria y una fracción importante de las moléculas eluidas entran en contacto con dicha pared cuando se disuelven en la fase estacionaria. Por ello la inercia química del tubo, que a veces se refuerza mediante tratamientos químicos de desactivación, es el requisito primordial para la selección, seguido por la resistencia a la rotura. El material más usado actualmente es la sílice vítrea, también llamada sílice fundida, recubierta exteriormente de poliimida, que es un material menos frágil que el vidrio y con una inercia química elevada; otros materiales mucho menos usados son el Ni y el vidrio. La transmisión de calor a través de los tubos de sílice vítrea es especialmente eficiente debido a su reducido espesor de pared (<0,1 mm).


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f. Soportes.

En las columnas de relleno la fase estacionaria se deposita sobre partículas llamadas soporte. La primera columna de cromatografía de gases (James y Martin, 1952) utilizaba un soporte de Celita con aceite de silicona como fase estacionaria. Los materiales propios de la cromatografía en columna, como la sílice o la alúmina, que se utilizaron en los primeros años, fueron pronto reemplazados por otros, como las tierras de diatomeas, carbones, bolas de vidrio, etc., que modernamente tienden a ser a su vez sustituidos por materiales de síntesis tales como sílices, carbones grafitados y polímeros orgánicos.

Un soporte ideal debe ser indeformable a la presión, presentar resistencia a la rotura y al calor, y poseer estabilidad química, inercia química superficial, superficie específica elevada y tamaño y porosidad uniforme. Los soportes vendidos comercialmente se homogeneizan por tamizado y su intervalo de tamaños suele expresarse en unidades de paso de tamiz ASTM.

1. Soportes silíceos naturales. Los soportes silíceos naturales, o tierras de diatomeas, son conglomerados de algas unicelulares y están constituidos por un 90% de SO2, siendo el resto varios óxidos metálicos. Estas tierras dan lugar a dos series de soportes:

• Soportes rosas. Se producen por calcinación a elevadas temperaturas (>1.000 °C), a las cuales se forman óxidos de hierro que le dan el color. Son muy porosos, duros y densos, y soportan hasta un 30% de fase estacionaria líquida. Su superficie es muy activa, por lo que sólo se utilizan para separar compuestos muy inertes.

• Soportes blancos. Se originan por tratamiento de los anteriores con fundentes a unos 900 °C. El material se funde en parte, el hierro forma complejos incoloros y el soporte obtenido posee menor superficie específica, menos densidad, es muy frágil pero bastante más inerte. No es habitual cargarlos con más de un 10-15% de fase líquida.

Ambas series de soportes se lavan con ácidos para eliminar los óxidos más superficiales, indicándose en el nombre comercial con las siglas AW (Acid-washed), y a veces se desactivan por tratamiento con dimetilclorosilano para reducir el número de grupos silanol superficiales, usándose en este caso las siglas DMCS.

2. Soportes silíceos de síntesis. Están constituidos por un 99% de Si02, y se caracterizan por su tamaño y forma regulares y por tener tratamientos de desactivación muy controlados. Muchos de ellos son similares a los que se


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usan en cromatografía de líquidos, con tamaños de partícula entre 50-100 μm, que son ligeramente mayores que en esa modalidad.

3. Otros soportes. Algunos polímeros orgánicos, aunque diseñados primordialmente como fases estacionarias sólidas, se pueden recubrir con fase estacionaria líquida. Existen también soportes mixtos, similares a los de fase inversa en cromatografía de líquidos, constituidos por un núcleo de sílice con una capa de moléculas orgánicas ligadas (C-8, C-18, fenilalquil, diclorofenil, etc.). Esta capa tendría la misión en cromatografía de gases de desactivar la superficie y facilitar la impregnación con la fase estacionaria líquida.

3.1.3. Preparación de columnas

Mientras que la preparación de columnas de relleno es relativamente sencilla y puede llevarse a cabo en cualquier laboratorio, la preparación de columnas abiertas requiere bastante habilidad. A continuación se indican, de forma resumida, los pasos más importantes que hay que seguir para preparar una columna, utilizando tubos, soportes y fases comerciales.

a. Columnas de relleno.

Se pesa una cantidad del soporte elegido algo mayor que la necesaria para llenar la columna, y se le añade una disolución que contenga la cantidad necesaria de fase estacionaria disuelta. Se agita, se desgasifica y se elimina el disolvente por evaporación o filtración. El relleno se seca y se introduce en el tubo limpio mediante presión o vacío, y con vibración suave, para conseguir una distribución lo más compacta posible. Los extremos se obturan con lana de vidrio y rejilla metálica, o fritados. Los tubos se pueden utilizar más de una vez.

b. Columnas abiertas de pared recubierta.

A no ser que el tubo comercial, que debe ser siempre nuevo, esté ya desactivado, hay que llevar a cabo algún tratamiento previo de desactivación, que puede llegar a ser muy laborioso. La fase se disuelve en un disolvente de bajo punto de ebullición (Pentano, didorometano, éter etílico y sus mezclas, son los más usados) y se deposita sobre la pared interna de dos formas (Grob, 1986):

• Método estático. La columna se llena con una disolución diluida de fase estacionaria, se cierra uno de los extremos, y se va haciendo evaporar el disolvente por el otro mediante vacío o temperatura superior a la de ebullición del disolvente, con lo que la fase va quedando depositada en la pared.


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• Método dinámico. Se hace circular por el tubo una pequeña cantidad de

disolución concentrada de fase estacionaria empujada por un gas inerte que va mojando el tubo por el frente y evaporándose por detrás, dejando a su paso una capa muy fina de fase estacionaria.

El método estático es más difícil de llevar a cabo, pero controla perfectamente la cantidad de fase depositada en la columna y el espesor de la capa, pudiendo llegarse a obtener películas muy uniformes de hasta 5 μm. El método dinámico es muy sencillo de realizar, pero la cantidad de fase que se deposita se puede calcular sólo aproximadamente, la uniformidad es difícil de conseguir y el espesor de la película es siempre reducido.

Si se quiere obtener una columna más estable, hay que dar un tratamiento extra de reticulación química de la fase estacionaria, para lo cual se añade a la disolución de llenado el reactivo deseado y la reacción se lleva a cabo, después de la impregnación, mediante calor o irradiación. El exceso de reactivo se elimina por lavado o por arrastre con gas inerte.

3.2. La fase móvil.

En la cromatografía gaseosa, la fase móvil es siempre un gas que suele ser inerte y

que cumple aproximadamente la ecuación de los gases perfectos. Al ser el producto pV

constante a lo largo de la columna, la densidad, presión y la velocidad de la fase móvil

variarán de forma no lineal, siendo sus valores función de la distancia a la entrada de la

columna.

A continuación vamos a comentar las variables más importantes que nos vamos a

encontrar en la cromatografía gaseosa:

• El valor medio de la velocidad lineal se podría obtener tanto de su cálculo a partir de la longitud de la columna y el tiempo básico, como a través de j, factor de corrección de la compresión.

• El flujo de la fase móvil se define como el volumen de fase móvil que pasa por la sección de columna en la unidad de tiempo, y está relacionado con la velocidad lineal a través del área y de la porosidad.

El flujómetro suele estar a temperatura ambiente, por lo que el flujo que obtenemos de él habrá que corregirlo para la temperatura de la columna, lo cual es sencillo al permanecer el resto de parámetros constantes, por lo que para gases ideales se puede aplicar una simple regla de tres.


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• El volumen de retención es el volumen de gas portador necesario para eluir un

compuesto de tiempo de retención tR.

Existen varios tipos de volúmenes de retención:

a. Volumen total de retención (VR): tiene en cuenta la totalidad del gas portador.

b. Volumen de retención ajustado (V’R): tiene en cuenta el volumen básico relativo al tiempo básico.

c. Volumen de retención neto (VN): se obtiene de la corrección del anterior con el factor de la compresibilidad.

• El volumen de retención específico a la temperatura de la columna es el volumen de retención neto por gramo de fase estacionaria.

Pasar al volumen de retención específico a 0ºC resulta sencillo, y como antes, en caso de ser todos los demás parámetros constantes, se puede aplicar proporcionalidad.

Teniendo en cuenta que el volumen de interpartícula, V0, coincide con el volumen

básico corregido, se puede relacionar el coeficiente de distribución con el factor de

retención (k), vinculándose un parámetro puramente cromatográfico con una variable

termodinámica y pudiendo usarse la medida de VN como método para conocer los

coeficientes de reparto de una forma sencilla.

3.2.1. Naturaleza y propiedades de las fases móviles más usadas.

Se suele emplear un gas inerte cuya única función sea arrastrar las moléculas de

soluto a través de la columna, en general se suele emplear nitrógeno, helio o hidrógeno

(este último necesita de medidas especiales en el laboratorio) como gas portador. La

selección de uno u otro suele hacerse atendiendo a criterios económicos y de rapidez.

• Viscosidad (μ).

Influye en la circulación de la fase móvil a través de la ley de Darcy, necesitando un gradiente de presión mayor para viscosidades mayores.

En las condiciones de trabajo que se dan en la cromatografía gaseosa, el valor de la viscosidad no varía con la presión, aunque sí con la temperatura, pudiéndose estimar ésta última mediante una aproximación.

Recientemente se han tabulado valores de μ entre 0 y 400ºC para hidrógeno, helio y nitrógeno (Hinshaw y Ettre. 1997). Lo que se puede observar es que al


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aumentar la temperatura se produce una disminución del flujo, especialmente en columnas de relleno y columnas abiertas de pequeño diámetro.

Tabla V.3

Algunas propiedades de los gases más utilizados como fases móviles, en cromatografía de gases (Dabrio et al., 2000).

H2 N2 He Ar

0 ºC 84 165,8 186,4 210

100 ºC 103 208 229 271 Viscosidad

(μpoise) a 1 atm

200 ºC 121 246 270 321

Volumen molecular (ml) + 7,07 17,9 2,88 16,1

DG (cm2/s) para n-octano 0,227 0,0726 0,248 0,0587

• Coeficiente de difusión en la fase móvil (Dm).

Los valores de este coeficiente están estrechamente relacionados con el tamaño molecular de forma inversamente proporcional.

Figura V.8

Eficacia de una columna con diferentes gases portadores (Dabrio et al., 2000).


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El valor de los coeficientes de difusión es un parámetro de gran importancia ya que influye directamente sobre dos términos de la ecuación general de la eficacia.

La naturaleza del gas portador no influye en el valor de Hmin en Cromatografía Gaseosa pudiéndose calcular mediante el uso de expresiones, ocurriendo lo mismo con la velocidad óptima.

La velocidad óptima es mayor para hidrógeno y helio que para el nitrógeno, al ser la difusividad de este último sensiblemente menor. Esto significa que para las mismas condiciones, la eficacia de columnas que usen helio o hidrogeno como gases portadores es mayor que las de nitrógeno a partir de una cierta velocidad, por lo que se pueden realizar los análisis más rápidamente sin pérdidas significativas en la eficacia.

Otra ventaja de la alta difusividad del hidrógeno y del helio es que repercute favorablemente en H, pero también contribuye al mayor ensanchamiento de la zona en los posibles volúmenes extracolumna, sobre todo en el inyector, donde se requiere especial atención a la relación volumen/velocidad de gas portador.

• Pureza.

Si bien la presencia de impurezas inertes no afecta a la separación, si puede resultar perjudicial para la fase estacionaria, principalmente la presencia de agua y oxígeno a altas temperaturas. Otras impurezas pueden dar lugar a la aparición de picos extraños en el cromatograma. Por todo esto se recomienda usar gases portadores con una pureza mínima del 99.998% y el uso de sistemas adicionales de purificación a la entrada del equipo, especialmente si las líneas de conducción del gas son largas.

3.3. Fases estacionarias.

En la cromatografía gaseosa nos encontramos dos tipos de fases estacionarias, las

sólidas, que emplean un mecanismo de adsorción en su interacción con el soluto, y las

líquidas, que usan un mecanismo de reparto.

La selectividad que presenten, se debe sobre todo a la naturaleza de la fase

estacionaria, aunque la temperatura también influye.


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3.3.1. Fases estacionarias líquidas.

• Mecanismos de separación en fases líquidas.

El mecanismo de reparto es el más importante cuando la fase estacionaria es líquida, y consiste en una distribución del soluto entre la fase vapor y la líquida en la cual se disuelven. Si el soluto formara una disolución real con la fase estacionaria, se podría aplicar la ley de Henry.

Teniendo en cuenta otras ecuaciones como la de los gases perfectos y de la densidad, se puede llegar a la conclusión de que las sustancias se eluyen en orden inverso a sus presiones de vapor, o lo que es lo mismo, en orden creciente de puntos de ebullición. Esto es así siempre y cuando los compuestos sean químicamente similares como las series homólogas, ya que si los coeficientes de distribución son muy distintos, la elución no seguirá este orden.

A pesar de lo complicado de prever el comportamiento cromatográfico a partir de valores termodinámicos, se pueden dan algunas normas generales:

a. Los solutos apolares en fases apolares presentan un comportamiento relativamente próximo al ideal, y se eluyen en orden similar al de sus puntos de ebullición.

b. Cuando un soluto con coeficiente de actividad elevado, que tiene sus moléculas fuertemente asociadas, se disuelve en una fase apolar, su interacción con la fase estacionaria será muy débil y su retención menos que la de un soluto apolar con similar presión de vapor.

c. Cuando se eluye un soluto apolar sobre una fase polar, cuyas moléculas están fuertemente asociadas entre sí y rechazan al soluto, la interacción mutua es también débil.

d. Cuando fase y soluto son polares y pueden interaccionar entre sí positivamente, la retención es elevada.

(Dabrio et al., 2000)

En general la elección de la fase estacionaría dependerá de la diferencia entre los puntos de ebullición de las sustancias a separar, de manera que si son muy distintos, una fase estacionaria cualquiera será capaz de llevar a cabo la elución de forma correcta, pero si son similares, necesitaremos usar una fase estacionaria que sea selectiva, interaccionando de forma distinta con las sustancias, lo que da lugar a una diferencia entre los coeficientes de actividad de las mismas. A veces la similitud molecular entre los solutos es tan grande, que esto no es suficiente y necesitamos del uso de propiedades especiales para obtener una elución satisfactoria. Los mecanismos a los que podemos recurrir son:


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a. Interacciones quirales: se usa para la separación de parejas de

isómeros ópticos (enantiómeros) que siempre coeluyen en condiciones normales. Para lograrlo usamos fases que contengan grupos ópticamente activos (quirales, que interaccionan selectivamente con uno de los miembros de la pareja, reteniéndolo en mayor medida que al otro. No obstante, la diferencia de retención no deja de ser pequeña, por lo que requiere del uso de columnas de gran eficacia.

b. Interacciones con mesofases: los cristales líquidos son moléculas alargadas o planas que permanecen en estado líquido dentro de un cierto intervalo de temperatura, pero a diferencia de otras sustancias lo hacen con un determinado orden, en una orientación, de modo que la geometría molecular de los solutos puede usarse como factor discriminatorio, no pudiendo todos alojarse entre las moléculas de la fase estacionaria (mesofases).

c. Formación de complejos: se aprovechan las posibilidades de formación de complejos entre organometálicos que posean iones, como Cu2+, Co2+, o Ni2+, y solutos con grupos donadores de electrones, como olefinas, compuestos aromáticos,…

d. Otros mecanismos mixtos: además de los citados, nos podemos encontrar adsorciones en las interfases gas-líquido, y líquido-sólido. Estas adsorciones suelen tener problemas añadidos como picos sustraídos total o parcialmente, ensanchamientos, colas o pérdidas de simetría.

• Propiedades de las fases líquidas.

La variedad de sustancias que podríamos usar como fase estacionaria es muy grande, pero normalmente se usan compuestos poliméricos. Los criterios para la elección de la fase estacionaria son varios y se encuentran analizados a continuación.

a. Intervalo de temperatura de uso: el límite inferior viene marcado por el punto de fusión o reblandecimiento en su defecto, mientras que el límite superior lo marca o la temperatura a la que la presión de vapor es apreciable (≥0.1 mmHg), o por el aumento de la señal del detector originada por la descomposición térmica de la fase estacionaria. Una pureza insuficiente del gas o la presencia de puntos activos en el soporte o en la pared interna de la columna pueden provocar una disminución de dicho intervalo.

b. Polaridad: está relacionado con el número y tipo de grupos funcionales presentes en la fase estacionaria, pero es difícil de expresar de forma numérica, debiéndose medir en principio a partir de parámetros moleculares. El problema es que muchas de las fases estacionarias usadas no tienen una composición unívoca, si no que son una mezcla compleja de sustancias


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orgánicas de la cual conocemos solo su composición aproximada. Esto se soluciona mediante el uso de una serie de escalas arbitrarias donde se usa unos solutos modelo estudiándose las retenciones que sufren.

Figura V.9

Elución de un compuesto polar (n-decanol) en una mezcla de n-alcanos, (a) en una fase polar (FFAP) y (b) en una fase apolar (OV-1),

en idénticas condiciones (Dabrio et al., 2000).

Sz Kováts (1965) propuso utilizar la serie de los n-alcanos como serie homóloga

de referencia para la Cromatografía Gaseosa, evitando así la necesidad de

referencia a un patrón de la retención relativa. Así salieron los índices de

retención.

La escala de índices de retención tiene unas interesantes propiedades:

• Para una fase estacionaria dada, la variación de sus valores con la temperatura es pequeña y lineal.

• Sus valores poseen una gran reproducibilidad, ya que son independientes de los parámetros operacionales y poco dependientes de la temperatura. Su determinación experimental es muy fácil a partir de los factores de retención.

(Dabrio et al., 2000)

La escala de McReynolds es una de las más importantes, y se aplica exclusivamente a la Cromatografía Gaseosa. Considera que las interacciones moleculares son aditivas, usando una serie de solutos de referencia para estudiar el efecto individual de cada tipo de interacción, por ejemplo, los


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alcanos representan las fuerzas de dispersión y el benceno las de inducción. Las contribuciones individuales se representan a través de los índices de retención de cada soluto en la fase de estudio (I), y en escualano (Iesc), que es el soluto que se eligió como referencia (1,6,10,15,19,23-hexametil-docosano).

Tabla V.4

Propiedades de las fases estacionarias utilizadas en cromatografía de gases (Dabrio et al. 2000.

La diferencia entre los índices de retención está relacionada con una serie de parámetros propios de cada compuesto, llamados sondas de McReynolds, y con otra serie de parámetros característicos de la fase que se denominan constantes de McReynolds.

Como el límite superior de uso de las columnas de escualano es muy bajo (120 °C), y es imposible determinar los índices de retención en ciertas fases que no son líquidas a esa temperatura, se ha propuesto utilizar en su lugar un hidrocarburo ramificado, el 24,24-dietil-19,29-dioctadecil-heptatetra-contano, que se conoce como C87, y que se puede calentar hasta 260 °C.

c. Viscosidad: el coeficiente de difusión en un líquido se puede estimar mediante la ecuación de Wilke y Chang, donde se puede observar que el


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coeficiente de difusión de un líquido es inversamente proporcional a la viscosidad del disolvente, por lo que interesaría utilizar líquidos de baja viscosidad como fases estacionarias.

Esta es la razón por la cual se han usado polímeros lineales, ya que poseen una baja viscosidad tanto por ser lineales como por su menor peso molecular. Su inconveniente es que las columnas capilares abiertas se impregnan mal con líquidos de baja viscosidad al formarse gotas en vez de la buscada película, razón por lo que se usan polímeros de peso molecular elevado para estos recubrimientos.

La eficacia que se obtiene con el uso de estos polímeros es, al contrario de lo que se podría pensar, semejante a la obtenida con fases de baja viscosidad, lo cual se puede explicar en parte por el empleo de altas temperaturas que disminuyen la viscosidad, y por la movilidad molecular de estos polímeros, que permiten a las pequeñas moléculas de soluto deslizarse con facilidad entre las largas cadenas de la fase estacionaria.

d. Tensión superficial: buscamos una fase estacionaria capaz de formar una película estable y uniforme sobre un sólido, para lo que su tensión superficial debe ser inferior a la energía superficial del sólido. Este problema suele aparecer sobre todo en las columnas capilares con superficies lisas de baja energía (teflón, vidrio), no teniendo por qué haber problemas en materiales activos (metales) o inertes pero con superficie específica elevada.

e. Pureza: es necesario una elevada pureza para evitar separaciones no reproducibles. Además ciertas impurezas pueden acortar la vida útil de la columna.

• Fases líquidas más usadas.

En los primeros tiempos se utilizaron con éxito toda clase de productos industriales: lubricantes como Apiezon, aceites y gomas de silicona, detergentes como Triton, Alkaterge, etc., anticongelantes como etilenglicoles, y otros muchos.

Actualmente, hay dos tipos fundamentales de fases estacionarias: algunos de los productos mencionados, que se venden parcialmente purificados y sometidos a controles de calidad que garanticen un comportamiento cromatográfico reproducible, y moléculas de síntesis que suelen ir dirigidas a la resolución de problemas específicos y que resultan mucho más fiables.

a. Hidrocarburos: algunas de las fases más antiguas eran de este tipo, por ejemplo, los Apiezones son parafinas que suelen dar buenos resultados en la


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separación de isómeros cis y trans. Actualmente algunos hidrocarburos se utilizan como fases de referencia (como el escualano en la escala de McReynolds).

b. Polisiloxanos: los polisiloxanos o siliconas, debido a sus excelentes propiedades, son el grupo de moléculas más utilizadas.

Figura V.10 Estructura general de los Polisiloxanos.

La longitud de la cadena se relaciona con la viscosidad del producto, que puede variar entre 103 y 106 cpoises (aceites y gomas de silicona, respectivamente). La funcionalidad química de los radicales R determina la polaridad y la estabilidad térmica. Las más usadas tienen sustituyentes metilo, vinilo, trifluoropropilo, fenilo y cianoalquilo (en orden aproximado de menor a mayor polaridad).

Las metil siliconas (con el 100% de R = CH3) son las más estables químicamente; su polaridad es muy baja en la escala de McReynolds, su intervalo de operación es muy amplio, y se emplean como fase estacionaria universal para abordar problemas desconocidos o cualquier tipo de separación que no requiera una selectividad muy elevada. A veces se preparan con un pequeño porcentaje (<5%) de grupos vinilo, lo que eleva su polaridad ligeramente y facilita su reticulación.

La sustitución de parte de los grupos metilo por radicales trifluoropropilo origina las trifluoropropil siliconas, cuya polaridad es relativamente baja, pero poseen una selectividad especial que las hace muy útiles en determinadas aplicaciones (acetatos de alditol, plaguicidas clorados,…).

Los grupos fenilo, que forman parte de las fenil siliconas en porcentajes que alcanzan el 50% como máximo, confieren al polímero una polaridad de tipo medio y buena estabilidad térmica.

Los grupos cianoetilo o cianopropilo originan las fases más polares de que se dispone comercialmente; de hecho, el producto con índice 100 en la escala CP-Index es una cianopropil silicona. La estabilidad térmica de estas fases es


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menor que la de otras siliconas, y además son muy sensibles al oxígeno y a determinados reactivos, por lo que requieren el uso de gas portador de gran pureza y mantener el flujo de gas inerte durante el apagado y encendido del horno, e incluso en el almacenamiento.

c. Polioxiranos: los polietilenglicoles y polipropilenglicoles siguen en popularidad a las siliconas, siendo en este caso cadenas lineales con la siguiente fórmula general:

Se utilizan polímeros de peso molecular muy variable, comprendidos entre 3 x 102 y 4 x 106, pero el más empleado es el conocido como Carbowax 20M, cuyo peso molecular medio está comprendido entre 16.000 y 20.000. Exhiben una polaridad media y su estabilidad térmica es discreta, pero se consideran insustituibles en el análisis de compuestos volátiles, aceites esenciales, alcoholes, etc. Cuando los grupos OH terminales se esterifican con ácido nitrotereftálico se obtienen fases de polaridad y características muy similares, pero capaces de eluir correctamente ácidos libres y de sustraer aldehídos.

d. Fases quirales: en 1966 (Gil-Av et al., 1966) se utilizaron por primera vez derivados de aminoácidos puros que, actuando como fase estacionaria, podían separar enantiómeros de aminoácidos. Posteriormente se han usado dipéptidos y diamidas. Como su estabilidad térmica era muy reducida, se sustituyeron por cianosiliconas poliméricas, donde el grupo ciano se ha hecho reaccionar con amidas.

Otro tipo de fases quirales son los complejos metálicos (Schurig, 1977), que se han utilizado para separar olefinas, alcoholes, aminas y otros compuestos.

En los últimos años han aparecido numerosos derivados de ciclodextrinas (König, 1992), que han permitido separar gran número de pares enantioméricos de estructura química muy diversa. Se puede obtener un amplio intervalo de polaridades según la naturaleza de los sustituyentes que reemplazan los H activos de la ciclodextrina, que pueden ser grupos metilo, pentilo, acetilo, butirilo y algún otro. Según la naturaleza de los sustituyentes varía su estabilidad química y térmica, y proporcionan una gran versatilidad para la separación de compuestos. Muchas de ellas se utilizan disueltas en polisiloxanos, a los que algunas se han unido químicamente. La selectividad de estas fases es también muy distinta para parejas de enantiómeros


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químicamente similares, y no es fácil de predecir. Un ejemplo se muestra en la figura 3.8.

Figura V.11

Separación de enantiómeros de alcoholes y acetatos arílicos bicíclicos utilizando una columna de ciclodextrina sustituida.

e. Fases mixtas: están constituidas por la mezcla de dos o más fases (Molera et al., 1969), y se utilizan por dos motivos: para aprovechar las selectividades de ambas cuando se quieren separar dos parejas o más de compuestos que no se resuelven en una única fase, o para mejorar propiedades físicas, tales como la viscosidad o la tensión superficial, de otra fase muy selectiva. Con este último objetivo, las ciclodextrinas suelen mezclarse con siliconas para su empleo como fases estacionarias, ya que por sí solas no impregnan bien las columnas de pared recubierta.

f. Fases inmovilizadas: inmovilizadas, reticuladas, entrecruzadas, ligadas... todos estos adjetivos se aplican a una fase que no puede ser extraída de la columna por lavado con disolventes. No siempre está claro que esto suceda porque la fase estacionaria se haya unido químicamente a la pared interna de la columna o al soporte, o porque las moléculas de la fase se hayan unido entre sí constituyendo un polímero tridimensional insoluble,; lo que es cierto es que se puede disponer de columnas con fases estacionarias inmovilizadas cuyas propiedades de retención sean prácticamente idénticas a las de las fases solubles originales, y con varias ventajas adicionales: mayor estabilidad frente al tiempo y frente a la inyección de grandes volúmenes de muestra, además de la posibilidad de lavar las impurezas acumuladas con el uso.


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3.3.2. Fases estacionarias sólidas.

Son las que primero se usaron en cromatografía de gases y también las más

sencillas de utilizar en la preparación de una columna (Kiselev y Yashin, 1969).

Actualmente se limita su uso a la resolución de un pequeño porcentaje de problemas,

tales como el análisis de gases permanentes, para los que resultan insustituibles.

El mecanismo básico de separación cuando se emplean fases sólidas es la

adsorción, en condiciones que se pueden considerar de sorción puramente física

(fisisorción): fuerzas de van der Waals con energías de interacción pequeñas, que dan

lugar a procesos de adsorción/desorción muy rápidos. En estas condiciones se forman

monocapas de moléculas que no llegan a cubrir la superficie del adsorbente. Para

conseguir buenas eficacias es muy frecuente utilizar columnas abiertas de pared

recubierta con soporte.

• Ventajas e inconvenientes de las fases sólidas

a. La adsorción es un fenómeno que permite obtener selectividades muy altas capaces de poner de manifiesto diferencias estructurales muy pequeñas. Los isótopos del hidrógeno se separaron ya en 1962 (Mohnke y Saffert, 1962).

b. Los procesos de sorción/desorción suelen ser más rápidos que los de disolución/evaporación y, en consecuencia, se pueden conseguir con facilidad eficacias muy elevadas.

c. Estos procesos tienen lugar en un intervalo de temperaturas muy amplio, sin que se produzcan pérdidas de fase estacionaria por evaporación (sangrado).

d. La falta de linealidad de las isotermas, motivada por la perdida de la condición de dilución infinita antes de formar incluso la primera monocapa, limita la capacidad de carga de estas columnas. Más allá de la zona lineal, habrá que usar modelos para poder describir el proceso. En el caso de adsorción de gases sobre sólidos, la ecuación propuesta por Langmuir resulta adecuada.


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Figura V.12

Isoterma de Langmuir.

e. Los factores de retención son en general altos, lo que es una ventaja para el

análisis de compuestos de bajo peso molecular y un inconveniente para los

de alto peso molecular.

• Tipos de fases sólidas

Se utilizan fases sólidas en forma de partículas pequeñas de superficie específica elevada, y, como en cualquier otro relleno cromatográfico, conviene que sean lo más uniformes posible en cuanto a tamaño, porosidad, actividad superficial y distribución en la columna. Además, deben ser térmicamente estables y químicamente inertes para que no reaccionen con los solutos.

Aunque tradicionalmente se han venido usando productos de origen natural con escaso tratamiento, similares a los soportes que se describen más adelante, actualmente se prefiere utilizar productos de síntesis, que permiten un mejor control de su composición y propiedades:

- Las fases inorgánicas permiten trabajar a temperaturas muy elevadas; entre ellas podemos citar variedades comerciales de sílice (Spherosil, Durasil), carbón grafitado (Carbopack, Graphpack), tamiz de carbón (Carbosieve, Spherocarb), zeolitas y alúmina.

- Las fases orgánicas suelen ser de tipo polimérico; son muy usados los polímeros de estireno/divinilbenceno (Chromosorb serie Century, Porapaks), los de óxido de fenileno (Tenax) y los polifluorocarburos (Kel F).


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4. Sistemas de detección.

Aunque la lista de detectores existentes para cromatografía de gases es muy amplia

(Scott, 1996), los más usados se pueden distribuir, según su fundamento físico, en cuatro

grupos: conductividad térmica, ionización, electroquímicos y espectroscópicos. Cada uno

de estos grupos incluye diferentes dispositivos que pueden funcionar en distintas

modalidades.

Figura V.13 Esquema de detectores de conductividad térmica,

(a) Sistema con dos filamentos, (b) Dispositivo con un solo filamento.

4.1. Detectores de conductividad térmica

Han sido muy utilizados, aunque actualmente su uso ha disminuido. Son detectores

universales de sensibilidad media y que responden a la concentración.

El efluyente de la columna se hace pasar por una cámara que contiene un filamento

caliente; cuando se establece el régimen estacionario, la velocidad de disipación de calor

entre el filamento y la pared de la cámara se hace constante, e igualmente la temperatura

del filamento. Al aparecer un soluto disuelto en el gas portador, varía la conductividad

térmica de la mezcla y, por tanto, la velocidad de disipación de calor en la cámara, lo que

conduce a una modificación momentánea de la temperatura del filamento que, a su vez,

hace variar su resistencia eléctrica. Esta variación de resistencia se mide fácilmente con

un puente de Wheatstone.

El diseño clásico consta de dos dispositivos como los de la figura; por el primero

pasa el efluyente de la columna y por el segundo, de referencia, pasa gas portador puro;

cuando las composiciones son distintas, el puente de Wheatstone se descompensa. El


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diseño moderno lleva un único filamento y un sistema de modulación de la señal que

produce mayor sensibilidad y una compensación más fiable; en este caso el efluyente se

hace pasar alternativamente por las células con o sin filamento.

Los gases portadores más recomendables para este tipo de detector son H2 y He,

que presentan conductividades térmicas del orden de 200-300 veces mayores que la

mayoría de las sustancias orgánicas de peso molecular superior a 50. Así pues, la

respuesta puede ser cuantitativamente diferente de unas sustancias a otras, y su valor

depende también de la geometría de la cámara, de la temperatura seleccionada y del

flujo.

Este detector es muy adecuado para el análisis de sustancias que no den respuesta

satisfactoria en otros detectores, como es, por ejemplo, el caso de los gases

permanentes. Como es un detector no destructivo, es de gran utilidad en operaciones a

escala preparativa y para intercalarlo en serie con otro detector más selectivo.

4.2. Detectores de ionización

Todos ellos tienen en común el hecho de ionizar los solutos, suministrando al

efluyente de la columna una energía que puede ser térmica, química, electromagnética o

radiactiva. La respuesta de este tipo de detectores depende de dos factores: el

rendimiento de producción de iones y la eficacia de captación de los mismos.

Además de la fuente de energía, todos estos detectores tienen en común el empleo

de dos electrodos: el polarizador, que suministra una diferencia de potencial adecuada, y

el colector, que puede ser indistintamente el ánodo o el cátodo, encargado de recoger los

iones producidos.

Cuando el detector es atravesado solamente por gas portador, el campo eléctrico

entre ambos electrodos origina una corriente de fondo que aumenta o disminuye, según

los casos, cuando aparece un soluto. Todos estos detectores requieren para su correcto

funcionamiento mantener una geometría constante mediante una alineación cuidadosa de

los electrodos, y un aislamiento eléctrico eficaz, ya que los potenciales aplicados suelen

ser relativamente altos.


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4.2.1. Detector de ionización de llama (FID)

Es el más utilizado por ser casi universal, tener un intervalo lineal amplio, una

sensibilidad elevada y un volumen muerto casi inexistente, así como un mantenimiento

sencillo. La figura muestra su esquema. La energía de ionización la suministra la llama

producida por una mezcla del efluyente de la columna con un gas combustible,

normalmente hidrógeno; a su alrededor fluye una corriente de aire, de tal manera que los

bordes de la llama son ricos en 02 y el centro en H2.

Figura V.14

Esquema de un detector de ionización de llama.

Cuando la llama se somete a una diferencia de potencial de ~100-300 V, se produce

una pequeña corriente de fondo debida a la formación de iones H+, O2- y OH-. Al aparecer

en la llama una sustancia orgánica, se produce un incremento notable de la corriente que

se atribuye a la ionización química de la sustancia en la parte más fría de la llama. Las

reacciones que se producen en la llama son muy complejas y del tipo

CH + 0 -> CHO + e-

La combustión prosigue hasta quemar totalmente los solutos, dando CO2 y H2O. La

mayor parte de las sustancias orgánicas tienen una respuesta muy similar, aunque los

compuestos con pocos enlaces C–H y ricos en O y heteroátomos dan respuestas

notablemente bajas; el ácido fórmico, por ejemplo, tiene una respuesta prácticamente

nula.


82

El FID es un detector de flujo másico muy sencillo de calibrar. La temperatura de la

llama se regula mediante los flujos de gas que forman parte de ella. Cuando se trabaja

con columnas capilares, que tienen un flujo de gas portador muy bajo, es frecuente

añadir una cantidad extra de gas inerte llamada supletorio a la salida de la columna para

enfriar ligeramente la llama y aumentar la respuesta. La mayor parte de los equipos

comerciales detectan 10-12 g de carbono/s, con un intervalo lineal de 107.

4.2.2. Detector termoiónico (TID).

También es conocido como NPD (detector de nitrógeno y fósforo). Son una serie de

dispositivos derivados del FID, que pueden funcionar con y sin llama. La fuente de

ionización es una superficie cerámica que contiene algún metal alcalino (como Rb o Cs)

que puede calentarse hasta 800 °C.

Esta superficie, en caliente, puede ceder fácilmente electrones a sustancias

electronegativas que entren en contacto con ella; los iones formados son recogidos por el

electrodo colector. Los distintos modos de trabajo se obtienen variando la composición

química de la superficie emisora, su temperatura y el tipo de gas portador.

• Con un gas inerte, tal como He o N2, y una superficie rica en Cs, se consigue una sensibilidad muy alta para grupos electronegativos como NO2, SH, halógenos, etc., que interaccionan directamente con la superficie, con factores de respuesta que pueden llegar a ser hasta 108 veces mayores que los de los hidrocarburos.

• Introduciendo gases reactivos se originan reacciones químicas en fase gaseosa que hacen variar la especificidad. Por ejemplo, introduciendo aire y un flujo de H2 reducido se forma una cuasi-llama junto a la superficie caliente, con radicales que descomponen químicamente a las moléculas orgánicas; este proceso forma selectivamente iones de productos que contengan nitrógeno y fósforo, con respuestas de 102 y 104 veces superiores a la del C respectivamente, consiguiéndose límites de detección del orden de 1-10 pg.

• Otra variante incluye un FID: los solutos se queman en la llama y los productos de combustión se ionizan, lo que hace que la respuesta de los compuestos con heteroátomos resulte independiente de la estructura original.


83

4.2.3. Detector de captura de electrones (DCE).

Es un detector muy popular en análisis medioambiental dada su especificidad y

sensibilidad hacia compuestos con grupos electronegativos. Un esquema de este detector

puede verse en la figura V.15.

Figura V.15

Detector de captura de electrones.

La ionización se consigue mediante una fuente radiactiva (de 3H o 63Ni) de baja

intensidad (unos 10 pCi) que emite radiación beta, constituida por electrones. Si se

establece una diferencia de potencial baja entre los electrodos (<20 V), los electrones

serán lentos, condición que se acentúa por sus choques elásticos con las moléculas del

gas portador. El N2 y la mezcla Ar/CH4 95:5 son gases adecuados para este detector,

mientras que el He y el Ar puros no lo son. Cuando un soluto con afinidad electrónica

llega a la cámara, encuentra un plasma de electrones lentos entre los dos electrodos; al

capturar algunos de estos electrones se forman iones negativos más pesados, que son

más lentos que los electrones, y la corriente de fondo disminuye.

La respuesta depende de factores propios del detector (Lovelock y Lipsky, 1960),

como la diferencia de potencial entre los electrodos (los equipos modernos pueden

trabajar a tensión continua o pulsada), el tipo de fuente y la temperatura; pero también

se ve afectada por factores como el flujo y la naturaleza del gas portador o el sangrado

de la columna.

La respuesta varía mucho de unos compuestos a otros (Pellizzari, 1974), y eso

favorece la detección de organoclorados en presencia de otros compuestos que


84

contengan solamente C, H y O. Niveles típicos de límite de detección (LD) son 0,1-1 pg

para compuestos electronegativos, en un intervalo lineal de 103-104.

Tabla V.4

Respuestas relativas aproximadas de distintos tipos de compuestos al DCE

4.2.4. Detector de fotoionización (DFI).

En este caso la ionización se consigue mediante una lámpara UV separada de la

corriente de gas portador por una ventana de fluoruro alcalino que permite el paso de los

fotones. El flujo fotónico y la energía que llegan a la cámara dependen del tipo de

lámpara y del material de la ventana. Los solutos se ionizan cuando la energía UV supera

su potencial de ionización.

Lógicamente, la respuesta varía de unos compuestos a otros, pero regulando la

energía fotónica se modula la selectividad, mientras que a través de la intensidad fotónica

se actúa sobre la sensibilidad; se pueden detectar así compuestos orgánicos e

inorgánicos.

Se trata pues de un detector no destructivo, que puede trabajar como detector

universal o específico, por ejemplo, para hidrocarburos aromáticos. Es compatible con la

mayor parte de las fases móviles usuales (He, N2, H2...), produce un bajo nivel de ruido

de fondo y tiene un intervalo lineal amplio (107).

Tipo de compuesto Respuesta

Hidrocarburos 0,01

Éteres, ésteres y cetonas 0,01-0,1

Alcoholes, aldehidos, aminas, nitrilos, compuestos monoclorados 0,1-1

Enoles, oxalatos, compuestos diclorados y monobromados 1-10

Compuestos triclorados, anhídridos, barbituratos 10-300

Nitrocompuestos, compuestos triclorados, dibromados y monoiodados 300-1000

1,2-dicetonas, quinonas, piruvatos, compuestos policlorados, tribromados y diiodados 1000-10000


85

En cambio, su respuesta varía de unos compuestos a otros ya que los ioniza de

distinta forma. Otro inconveniente es que tiene cierto volumen muerto al producirse la

ionización en una cámara. El empleo de láseres puede hacer bajar su volumen a niveles

de subnanolitros y la sensibilidad al nivel del femtogramo. Se emplea en aplicaciones

ambientales (hidrocarburos aromáticos, tetraetilplomo, cloruro de vinilo, etc.).

4.3. Detectores electroquímicos.

La mayor parte de estos detectores se han diseñado para análisis ambientales de

sustancias con heteroátomos (halógenos, S, N).

4.3.1. Detector de conductividad electrolítica (DCEL).

El efluyente de la columna pasa por un reactor de Ni que puede calentarse hasta

1.000 °C, donde se mezcla con H2 (que forma haluros con los halógenos y NH3 con el

nitrógeno) o con 02 (que forma óxidos con el azufre). Los productos de reacción se llevan

a una célula electrolítica por la que circula una solución ácida o básica. La aparición de

compuestos ionizables hace variar la conductividad eléctrica, que es la propiedad que se

mide en continuo. Si se desea que sea realmente específico, el detector debe llevar

también un sistema de sustracción de compuestos para eliminar los posibles productos de

interferencia antes de que lleguen a la célula.

4.4. Espectógrafo de Masas.

Este método pertenece al grupo de las técnicas espectroscópicas que por la

importancia de los datos que suministran pueden considerarse en realidad métodos

analíticos por sí solos en vez de simples detectores. La espectrometría de masas es la más

importante en su acoplamiento con los métodos cromatográficos, aunque también

podemos nombrar a las espectrofotometrías IR y UV-visible, pero debido a la escasa

presencia de estas otras técnicas espectrométricas, vamos a comentar directamente la

espectrografía de masas.

La Espectrometría de Masas es una técnica analítica en la cual los átomos o

moléculas de una muestra son ionizados, separados de acuerdo con su relación masa /

carga (m/z) y detectados. Nace en 1886 cuando Golstein descubre los iones positivos en

un tubo de descarga eléctrica a baja presión. Wien (N. Física 1911) en 1898 muestra que


86

los rayos de esos iones podían ser desviados por campos eléctricos y magnéticos. Entre

1912 y 1919, Aston (N. Química 1922) y Thomson (N. Física 1906) realizaron

modificaciones a la técnica, anticipando este último el enorme potencial de esta técnica

dentro de la química analítica. En 1924, Aston fue capaz de determinar las abundancias

isotópicas de más de 50 elementos. Pero no fue sino hasta los años cuarenta que se

popularizó su uso en Química. Hoy en día existen diferentes tipos de espectrómetros de

masas comercialmente disponibles. Sus diferencias se encuentran en la forma de llevar a

cabo cada uno de los procesos necesarios para la detección de las sustancias.

En forma esquemática podemos decir que los espectrómetros de masas consisten

de cuatro secciones fundamentales: 1) Sistema de introducción de muestra; 2) Cámara de

ionización; 3) Analizador y 4) Detector. Las modificaciones instrumentales han sido de la

mayor trascendencia en la Espectrometría de Masas. Los analizadores, que comenzaron

siendo sectores magnéticos, han evolucionado a sectores de cuadrupolo, sextupolos,

octupolos, trampa de iones, analizadores por tiempo de vuelo, llegando a contener uno o

dos sectores para lograr una mayor precisión.

4.4.1. Sistema de introducción de muestra

Para poder llevar a cabo el análisis existen dos requisitos previos, que la muestra se

halle en estado gaseoso y que exista vacío.

Figura V.16

Esquema espectómetro de masas (http://www.asms.org/whatisms/index.html).


87

El primer requisito limitaba antiguamente la aplicación a muestras en estado

gaseoso, pero gracias al desarrollo de estos equipos, hoy en día se puede aplicar también

a muestras en estado líquido, e incluso embebidas sobre una matriz sólida.

La espectrometría de masas cumple satisfactoriamente la mayor parte de los

requisitos para poderse acoplar con la cromatografía de gases, al ser una técnica de

elevada sensibilidad, capaz de hacer barridos rápidos y de registrar los espectros de los

compuestos en fase gaseosa. Sin embargo, presenta el problema de operar a alto vacío,

lo que parece en principio incompatible con la elución de la muestra acompañada de una

cantidad elevada de gas portador.

Existen diversas razones para que se necesite un sistema de vacío en un

espectrómetro de masas:

• La cámara de ionización podría contaminarse, y oxidarse el filamento u otros elementos a alta temperatura.

• La presencia en la cámara de una gran proporción de un gas competiría con la muestra para la ionización y produciría fenómenos de ionización química.

• En la etapa de separación de masas las colisiones intermoleculares reducirían la resolución.

En el acoplamiento CG-EM, el uso como portador de un gas inerte altamente

purificado reduce el problema de la contaminación, pero sigue presente la necesidad de

eliminarlo en la cámara de ionización y en el analizador. Para ello existen dos

posibilidades que dependen del tipo de columna empleada, ya que ésta condiciona el flujo

de gas portador.

• Acoplamiento con columnas capilares de diámetro inferior a 0,3 mm.

Estas columnas son las más utilizadas en la actualidad, y su flujo no suele

sobrepasar 1 ml/min. Cuando se emplea helio como gas portador, los sistemas

de bombeo utilizados en los actuales espectrómetros de masas pueden

eliminar este flujo de gas manteniendo una presión inferior a 10-4 mmHg en la

cámara de ionización e incluso más reducida en el analizador. La columna

capilar puede introducirse, debidamente termostatizada, hasta la cámara de

ionización sin ningún requisito instrumental.


88

Figura V.17

Acoplamiento directo CG-EM.

Hay que tener en cuenta el cambio en las condiciones de operación del proceso cromatográfico, ya que debido a que la salida de la columna se encuentra a vacío en lugar de a presión atmosférica, se produce una dilución de las zonas cromatográficas. Otros problemas de este tipo de conexión son la necesaria interrupción del sistema de vacío cuando se cambia la columna, y las variaciones de la presión en cámara causadas por los cambios en las condiciones cromatográficas.

Para evitarlos se ha recurrido a la interfase denominada de división en régimen abierto, en la que la cámara de ionización y la salida de la columna se conectan a un dispositivo abierto a la atmósfera y barrido por un flujo de helio. Si las dimensiones del tubo de conexión cámara-dispositivo se calculan de forma que una caída de presión de 1 atm a su través corresponda a un flujo de helio que permita mantener un vacío adecuado, este vacío no variará cuando cambie el flujo de la columna cromatográfica, ni siquiera cuando ésta se sustituya.

Figura V.18

Divisor en régimen abierto.

• Interfases para columnas rellenas o capilares de elevado diámetro (>0,3 mm). Estas columnas dan lugar en su operación habitual a flujos de 5-25 ml/min, que no pueden eliminarse de forma satisfactoria con los sistemas de vacío propios de un espectrómetro de masas. El aumento de presión resultante puede dar lugar a pérdida de resolución en el analizador y a reacciones ión-molécula en la cámara de ionización.


89

La eficacia de una interfase se mide mediante el rendimiento, Y, definido como el porcentaje de muestra de la columna que alcanza el detector.

Otro parámetro del sistema es el enriquecimiento, E, dado por la relación entre las concentraciones de la muestra en la cámara de ionización y en el gas portador a la salida de la columna.

La interfase más sencilla es un divisor de flujo, que introduce en la cámara de ionización el flujo que ésta puede soportar (<1 ml/min) mientras que el resto se elimina o se desvía a otro detector para el registro del cromatograma. Sin embargo, tanto su rendimiento, próximo al 5% para un flujo de 20 ml/min, como su enriquecimiento, igual a la unidad, son muy poco satisfactorios. Por este motivo se han desarrollado diversos tipos de interfases que presentan distintas ventajas e inconvenientes según el tipo de muestras a analizar.

La más extendida es la interfase tipo haz molecular (Jet), en la que el efluyente de la columna se hace pasar por un pequeño orificio donde adquiere una gran velocidad. Enfrentado con dicho orificio, a una distancia entre 0,1-0,5 mm se encuentra otro, directamente conectado a la cámara de ionización. Mientras que las moléculas de muestra relativamente pesadas atraviesan con pérdidas mínimas el camino entre los dos orificios, las más ligeras del gas portador se desvían de él debido a su mayor facilidad de difusión y son atrapadas por el sistema de vacío de la interfase. Esta interfase presenta un rendimiento típico del 50-80% y un enriquecimiento próximo a 10, que utilizando sistemas de doble interfase puede aproximarse a 100. Sin embargo, la extensión del uso de las columnas capilares ha conducido a la práctica desaparición de estas interfases para el acoplamiento CG-EM.

4.4.2. Cámara de ionización

Como ya dijimos, el espectrómetro de masa mide la relación masa/carga de los

iones, por lo que antes de realizar su análisis necesitamos cargar eléctricamente las

moléculas generalmente neutras del analito, y esto se realiza en la cámara de ionización.

La ionización más común es la ionización por impacto electrónico, donde las

moléculas ya gaseosas del analito son sometidas a un bombardeo con electrones de alta

energía, los que provocan la fragmentación en iones. Los iones con la carga que nos

interesa (sólo se pueden analizar los iones de un determinado signo en cada vez) son

impulsados hasta el analizador por el campo eléctrico presente, mientras que los otros

iones van a parar al electrodo recolector y las moléculas neutras son expulsadas. Con esta


90

técnica de ionización se producen muchos menos iones negativos que positivos, por lo

que suele registrarse el espectro de masas positivo.

Figura V.19

Cámara de ionización por impacto electrónico (http://www.asms.org/whatisms/index.html).

En los casos en los que es importante determinar la masa molecular y la estructura

del analito, esta técnica presenta el gran inconveniente de producir una gran

fragmentación, siendo difícil o imposible relacionar el ión original con los resultantes de la

fragmentación. Existen otras posibilidades que sí producen una ionización “suave”; estas

técnicas están basadas en la ionización química y en la ionización desortiva.

La Ionización química suele producirse por una transferencia de protones al exponer

el analito a un exceso de gas ionizante, como puede ser el metano.

La otra técnica consiste en un proceso donde las moléculas son a la vez evaporadas

de una superficie e ionizadas, no conociéndose el proceso exacto por el que se produce.

Los distintos métodos englobados en esta técnica son:

• Bombardeo con átomos rápidos: la ionización se produce por impacto de átomos de alta velocidad en una muestra disuelta en un medio protector líquido no volátil.

• SIMS (Secundary Ion EM): consiste en el impacto de iones de alta velocidad sobre una fina lámina de muestra con un substrato metálico o disuelta en una matriz líquida.

• Desorción con plasma: impacto de fragmentos procedentes de una fisión nuclear, sobre una muestra sólida depositada en una lámina metálica.


91

• MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization): fotones de alta

energía impactan sobre una muestra embebida en una matriz sólida orgánica.

• Desorción de campo eléctrico: La muestra depositada sobre un soporte sólido especial es sometida a un alto gradiente eléctrico.

• Electrospray: Consiste en generar gotas cargadas muy pequeñas al nebulizar la muestra a través de una aguja sometida a un alto voltaje. El agua de la gota se irá evaporando gradualmente hasta un punto donde el número de cargas electrostáticas repulsivas en la superficie es tan grande con relación al tamaño de la gota que se produce una explosión, debida a la repulsión de las cargas en la gota. Esta explosión genera un gran número de gotas cargadas más. Esta técnica tiene la característica especial de que la muestra entra en la cámara de vacío ya en forma de iones.

4.4.3. Analizador

El analizador es el encargado de que solamente los iones con una determinada

relación masa/carga lleguen al detector, para lo cual se pueden usar distintos métodos:

con sectores magnéticos, con filtros de cuadrupolos, trampas de iones, etc.

Figura V.10

Esquema analizador Sector magnético.

Una de las formas más comunes consiste en usar un campo magnético para curvar

la trayectoria de los iones, el radio de esta curvatura dependerá de la relación m/z y sólo

aquellos iones con una trayectoria adecuada terminarán en el detector, el resto se

dispersarán. Una forma más avanzada consiste en combinar está técnica con un enfoque

por campo eléctrico. Este campo eléctrico se sitúa previamente al magnético y actúa de

forma que enfoca a los iones con una determinada energía cinética. Este equipo se llama

espectrómetro de masas de doble enfoque, y es capaz de diferenciar compuestos de la

misma masa nominal pero distinta composición química.


92

Figura V.2

Esquema analizador de cuadrupolos.

Los filtros de cuadrupolos tienen una resolución menor que los de doble enfoque,

pero su bajo coste hace que sean la opción elegida en muchos casos. Su nombre proviene

de estar formado por cuatro polos paralelos, los iones enfocados dependen de la

trayectoria inducida en los iones al ser sometidos simultáneamente a un campo constante

y una radiofrecuencia, de forma que solo aquellos que entren en resonancia llegarán al

detector.

Las trampas de iones operan con un principio parecido al anterior, pero tienen la

particularidad de que no opera como un filtro, ya que los iones que no son enfocados

permanecen retenidos, pudiéndose usar posteriormente. Consiste en una estructura tipo

sándwich donde los iones son seleccionados en función del voltaje aplicado en los

electrodos. La forma de operar con este EM suele ser haciendo un barrido, de forma que

los iones son seleccionados secuencialmente, analizándose todos.

Figura V. 22

Esquema analizador trampa de iones.


93

Otro tipo de analizador es el de tiempo de vuelo, donde se la relación m/z se

determina según el tiempo que tarde en recorrer cada ión una distancia conocida al ser

acelerados. La ventaja de este EM es que es muy rápido y detecta todos los rangos de

m/z.

4.4.4. El Detector

Su funcionamiento es muy sencillo, ya que consiste en convertir la energía de

colisión de los iones sobre la superficie del detector en un flujo de iones, electrones o

fotones que son los que realmente son detectados.

Figura V. 23

Espectro de masas del CO2 (http://www.asms.org/whatisms/index.html).

El resultado de todo esto es el conocido espectro de masas, que consiste en una

gráfica donde se representan la intensidad del flujo de iones en función de m/z. Esta

forma de llevar a cabo el análisis hace que la respuesta a un solo compuesto sea múltiple,

es decir, que en espectro de masas aparecerá no solo el ión de la molécula, si no todo los

iones que en los que esta se puede descomponer en la ionización, por lo que en el

análisis de una muestra compleja, el espectro será muy complicado. Si lo que queremos

es analizar un compuesto en particular, deberemos aislarlo primero, ya que la presencia

de otros compuestos provoca un solape en el espectro, el cual da lugar a error. Por ello,

previamente a la aplicación de esta técnica se suelen someter los analitos a un proceso

de separación, y aquí es donde es tan ventajoso el combinar está técnica con la

cromatografía, ya sea líquida o gaseosa, debido a su gran capacidad y versatilidad a la

hora de realizar las separaciones de la muestra.

Cuando el interés del análisis es principalmente cuantitativo en vez de cualitativo,

como es el caso de este proyecto, la forma más normal de operación consiste en el


94

denominado modo registro selectivo de iones (SIM, Selected Ion Monitoring), donde se

enfoca la relación m/z del ión o iones que sean representativos de la molécula bajo

estudio, ahorrando tiempo de análisis y pudiendo incluso elegirse una determinada forma

de ionización que favorezca la presencia de un determinado ión, aumentando la

sensibilidad al poder mantenerse el analizador en un valor de m/z. Está técnica suele

ofrecer mejores resultados con un límite de detección más bajo en comparación con el

funcionamiento en modo escaneo, donde se analizan todos los iones dentro de un

determinado intervalo de m/z.

Figura V. 24

Ejemplo de espectro de masas (http://www.asms.org/whatisms/index.html)

El acoplamiento del EM con los sistemas informáticos actuales, permite que estos

almacenen, presenten e interpreten los espectros en una base de datos online, ofreciendo

unos resultados mucho más cómodos de leer y manejar.

4.5. Aplicaciones

La mayor parte de los compuestos orgánicos, y también muchos organometálicos e

inorgánicos, pueden separarse por cromatografía de gases. Para ello es necesario que

puedan pasar al estado de vapor sin descomponerse a temperaturas inferiores a unos

400-450 °C. En la práctica, los criterios para estimar si esto es posible se basan en dos

tipos de propiedades de los analitos: el peso molecular y la polaridad. Así, mientras que

no existen límites inferiores de peso molecular, los límites superiores pueden situarse

hacia 1.000 para sustancias apolares como hidrocarburos y triglicéridos.


95

La polaridad, estimada por la cantidad y tipo de grupos funcionales, puede limitar

de manera drástica la volatilidad. Mientras que ácidos libres o aminas de peso molecular

medio pueden analizarse fácilmente, la presencia de ambas funciones en una misma

molécula (aminoácidos), aun con pesos moleculares inferiores a 200, impide la

volatilización y por tanto el análisis directo por esta técnica. Por otra parte, la formación

de derivados se emplea a veces para aumentar la sensibilidad o especificidad del método

analítico.

Los tipos de aplicaciones en cromatografía de gases se pueden clasificar en tres

categorías:

• Preparativas. Van dirigidas a la preparación de productos puros industriales y muy pocas veces se emplean en los laboratorios analíticos. Los problemas de escalado son similares a los que se pueden plantear en otras técnicas; pero al tratarse de una mezcla gaseosa, las dificultades (principalmente la formación de aerosoles) pueden surgir al provocar la condensación de los productos de interés.

• Químico-físicas. La técnica se utiliza, no para separar compuestos, sino para determinar ciertas propiedades del sistema como superficies específicas, isotermas de adsorción, cinética de reacciones, etc. (Laub y Pecsock, 1978; Conder y Young, 1979).

• Analíticas. Constituyen el grupo más numeroso. Aunque son casi ilimitadas, hay que destacar sus posibilidades frente a otras técnicas: se consiguen resoluciones muy elevadas en sustancias poco polares, así como sensibilidades muy altas mediante su acoplamiento con técnicas espectroscópicas. Pueden mencionarse una serie de campos en los que se utiliza preferencialmente, como gases permanentes, hidrocarburos (petroquímica, geoquímica), ambientales (aires, aguas, suelos, organismos), alimentos y cosméticos (aromas, lípidos, carbohidratos, aditivos), muestras biológicas (componentes de tejidos, metabolitos, drogas, fármacos, hormonas, feromonas), microorganismos (metabolitos, productos de fermentación), química forense (incendios provocados, drogas), etc.

5. Control del proceso cromatográfico

Las características geométricas de la columna así como el tipo y cantidad de fase

estacionaria que contienen, juegan un papel fundamental en el proceso cromatográfico.

Desde el punto de vista del cromatografista, es conveniente poder influir sobre este

proceso para adecuarlo a los requisitos de un análisis determinado, y no siempre es

posible disponer de la columna óptima para ello.


96

En el caso de la cromatografía de gases, existen dos magnitudes: el flujo de gas

portador y la temperatura de la columna, que son fáciles de controlar desde el

instrumento y pueden utilizarse para modificar el desplazamiento de los solutos a través

de la columna así como el respectivo cromatograma.

• Flujo de gas portador

El flujo a través de la columna puede controlarse mediante un regulador de la presión en cabeza de la columna o mediante un regulador de flujo. La relación entre presión y flujo, en el caso de las columnas abiertas de sección circular, podría calcularse mediante la ley de Poiseville.

La velocidad media del gas portador ū a lo largo de la columna está relacionada con el flujo, y éste se puede medir fácilmente de forma experimental, aunque en el caso de columnas capilares con flujos muy bajos puede ser difícil medirlo con exactitud.

La velocidad media del gas portador o la inversa del tiempo básico tM, se pueden utilizar para estimar el flujo en una misma columna con fines comparativos; siendo su ventaja que se pueden determinar con mayor exactitud a partir de medidas en el cromatograma.

El flujo interviene en la retención de forma que para un compuesto y fase estacionaria dados, el tiempo de retención es inversamente proporcional al flujo en la columna. Según esto, sería conveniente aumentar el flujo para reducir el tiempo de análisis, el problema es que como ya se vio, existe un valor óptimo de la velocidad, uop, para el que se produce el valor mínimo de la altura de plato. Es fácil concluir que, mientras que nunca se deben utilizar flujos inferiores al óptimo, puede ser conveniente emplear flujos superiores para reducir el tiempo de análisis si la pérdida de eficacia no degrada la separación de la muestra a resolver.

Es importante señalar que el flujo es capaz de modificar el tiempo de retención, tR, pero no tiene ninguna incidencia sobre el factor de retención, k, lo que en otras palabras significa, que afecta por igual a todos los componentes de la muestra.

• Temperatura de la columna

La temperatura de la columna se supone que es la misma del horno en el que está instalada, y esta última puede controlarse y medirse con exactitud. Cuando el gas portador se controla mediante un regulador de presión, su flujo a través de la columna varía con la temperatura de ésta debido al cambio de


97

viscosidad. Sin embargo, la influencia fundamental de la temperatura sobre la retención viene dada por su relación con el volumen de retención ya que cuando la temperatura aumenta, la retención disminuye de forma muy marcada.

En general, los valores de k muy bajos no son recomendables para llevar a cabo una separación, ya que la resolución tiende a cero cuando k también lo hace. Tampoco deben utilizarse valores muy altos, ya que el tiempo de análisis aumenta sin ventajas notables. Por estos motivos, dependiendo de la facilidad de separación de la muestra, se recomienda trabajar a una temperatura tal que los valores de k se encuentren entre 1 y 15.

Para intervalos de temperatura que no exceden los 30 °C, puede considerarse que la entalpía y entropía de tránsito permanecen constantes. Por tanto, cuando se mide la retención (K, Vg, k o tR) en un intervalo así y se representan sus logaritmos frente al inverso de la temperatura absoluta, se obtiene una recta para cada componente de la mezcla. Estas rectas tienen pendientes parecidas cuando corresponden a moléculas con grupos funcionales similares, ya que también lo son sus interacciones con la fase estacionaria y, por tanto, sus entalpías de tránsito. Las ordenadas en el origen, más relacionadas con el efecto entrópico, están influidas por otras características de la molécula, tales como su tamaño y forma. Se puede deducir que las rectas originadas por los miembros de una serie homóloga, que se diferencian en un grupo metileno, son paralelas y equidistantes. En cambio, cuando las sustancias poseen estructuras diferentes, se originan rectas con pendientes distintas, que pueden cruzarse (recta a con b y c en la figura). En este caso existe una temperatura en la que los picos coinciden, y a partir de ella se invierte el orden de elución.

Figura V.25

Variación de la retención con la temperatura (Dabrio et al., 2000)

Existen casos en los que se obtienen líneas quebradas en vez de rectas cuando se representa lnk frente a 1/T. Cuando este fenómeno se produce es debido a que en el intervalo experimental de temperaturas se ha producido algún tipo de transformación de la fase estacionaria, como cambio de estado de


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agregación, sistema de cristalización u otro capaz de alterar el valor de la entalpía de tránsito. El resultado es que el punto en que cambia la pendiente corresponde a la temperatura de transformación.

La medida de esta temperatura por el procedimiento indicado se utiliza frecuentemente en el estudio de polímeros. Para ello se coloca el polímero como fase estacionaria en una columna y se inyectan patrones apropiados a varias temperaturas. Esta técnica se conoce inadecuadamente como cromatografía inversa.

6. Temperatura programada

En una muestra con numerosos y diversos componentes suele ser imposible la

elución de todos ellos en una sola operación a temperatura constante: una temperatura

baja, adecuada para la separación de los menos retenidos, implica un tiempo de análisis

muy alto para los últimos en eluir, mientras que si la temperatura se aumenta para que

éstos presenten una retención conveniente, los de menor retención se eluyen a valores de

k muy bajos, con una resolución insuficiente. En estos casos suele ser obligado recurrir a

la elución a temperatura programada.

El párrafo anterior justifica que en la mayor parte de los análisis por cromatografía

de gases de muestras complejas se recurra a la operación en el modo de temperatura

programada (Harris y Habgood, 1966), en el que la temperatura de la columna varía a lo

largo del proceso cromatográfico. Dicha variación suele consistir en un incremento por

unidad de tiempo (velocidad de calentamiento o de programación, expresada

generalmente en °C/min). Se denomina rampa a un periodo de operación con velocidad

de calentamiento constante; el desarrollo de un cromatograma puede incluir varias

rampas con distintas velocidades y periodos isotermos.

La variación de la temperatura provoca que el valor del factor de retención, k, de un

compuesto varíe a lo largo de la columna.

El cociente r/F, al que se llama programa, es el parámetro de operación más

significativo: si permanece constante, la temperatura de retención, TR, de un compuesto

no varía. En ese cociente, r representa la velocidad de calentamiento y F el flujo.

La temperatura influye directamente en la retención cromatográfica a través de la

relación entre Vg y T. Como la viscosidad del gas portador varía con la temperatura, si la


99

presión de entrada en la columna es constante, la reducción del flujo de fase móvil a lo

largo de una programación de temperatura puede llegar a ser muy marcada cuando el

incremento de temperatura alcanza los 100 °C. Si se utiliza un regulador de flujo, lo que

cambia es la presión de entrada.

La compleja intervención de la temperatura en las magnitudes que regulan la

velocidad de la zona en cromatografía de gases impide la resolución matemática, para lo

que sería necesaria una relación sencilla entre el volumen y la temperatura. Este es uno

de los inconvenientes de trabajar a temperatura programada, que complica la

interpretación teórica de los resultados así como el cálculo de magnitudes básicas de la

columna. Su empleo habitual pretende sólo conseguir que los compuestos atraviesen la

columna en las mejores condiciones para su separación.

Desde el punto de vista práctico, la programación de temperatura da lugar a

cromatogramas fácilmente distinguibles de los registrados en isoterma. Entre las

variaciones que implica en la respuesta cromatográfica se puede distinguir:

Figura V.26

Elución de una mezcla de compuestos: (a) en isoterma y (b) con temperatura programada. (Dabrio et al., 2000).


100

Anchura de pico. A diferencia del cromatograma isotermo, en que la anchura del

pico, w, aumenta de manera prácticamente lineal con k; en temperatura programada los

picos tienen una anchura que es similar a lo largo de una rampa, aunque crece en

periodos isotermos. Esto significa que pierden su sentido algunos parámetros basados en

la determinación de w, como la mayor parte de los relacionados con la eficacia.

• Tiempo y volumen de retención. Dado que la temperatura varía a lo largo del proceso cromatográfico, no puede calcularse el volumen de retención. Es muy utilizada la temperatura de retención, TR, que se define como aquella temperatura a la que se eluye el máximo del pico y que se relaciona fácilmente con el tiempo de retención ya que las rampas usadas tienen pendiente constante.

• Cuando se compara con un cromatograma isotermo, el cambio más llamativo en la retención es que, con programación lineal, los componentes de series homólogas se eluyen con un espaciado similar. Para la comparación de datos de retención procedentes de distintos laboratorios, se emplean los índices lineales en operación a temperatura programada en lugar de los índices de Kováts, aplicables a una programación lineal de la temperatura. Se pueden sustituir sus valores por los de los tiempos de retención.

• Otra característica suele ser la deriva de la línea base, que puede llegar a ser muy marcada si el sangrado de fase estacionaria es elevado. Según sea el equipo disponible, se puede compensar de dos formas: utilizando dos columnas iguales en paralelo, una de ellas para eluir la muestra y otra que sólo produce la señal de fondo y restando ambas señales en tiempo real, o con una sola columna, haciendo un programa en blanco sin muestra antes del análisis y efectuando la resta de ambos cromatogramas una vez almacenados en un ordenador.


101

VI. PRECONCENTRACIÓN Y PURIFICACIÓN DE MUESTRAS.

1. Introducción.

La etapa más delicada del análisis de estos compuestos es el fraccionamiento, que

es cuando se separan estos compuestos de la matriz de la muestra para introducirlos en

la columna cromatográfica. Las formas de llevarlo a cabo son diversas, y de usar una u

otra dependerán qué compuestos se aíslen y en qué medida. También tiene un gran coste

de tiempo, por lo que las mejoras en este sentido, como pueda ser la automatización del

proceso, son también muy importantes.

La extracción líquido-líquido (ELL) y la extracción en fase sólida (EFS) son las

técnicas de tratamiento de muestras más empleadas en el análisis cromatográfico de

aguas. La prevalencia de las técnicas de extracción líquido-líquido en el pasado se debía al

carácter hidrofóbico de los contaminantes considerados entonces como prioritarios. Aún

en la actualidad, la ELL es ampliamente usada en muchos métodos, especialmente aque-

llos orientados al enriquecimiento de trazas de contaminantes no polares en agua, aunque

su uso se encuentra actualmente desaconsejado por diversos los organismos

medioambientales que recomiendan el uso de las llamadas técnicas limpias (aquellas que

no usan disolvente).

Las técnicas limpias presentan dos ventajas:

• El disolvente no interfiere con compuestos de volatilidad similar en su análisis por Cromatografía Gaseosa.

• No es necesaria la etapa de preconcentración del disolvente, lo que evita la pérdida de compuestos de alta volatilidad así como la concentración de las impurezas existentes en los disolventes.

El objetivo del presente estudio es discutir el potencial y posibilidades de los

procesos de extracción líquido-líquido y de extracción en fase sólida, que son los dos

procedimientos de tratamiento de muestras previos a la determinación cromatográfica,

más empleados, en lo que se refiere a su aplicación en rutina en programas de vigilancia

de la calidad de aguas superficiales, centrándonos en el caso de los compuestos volátiles

ya que son el tipo de contaminantes más importante de este estudio.


102

El fundamento teórico de ambos procesos se basa en un principio similar, la

distribución de un soluto en la interfase de un sistema de dos fases. La distribución del

soluto entre ambas fases (líquido-líquido o líquido-sólido) viene gobernada por la afinidad

de este soluto por cada una de las fases, y viene caracterizada por una constante de

distribución. En la extracción líquido-líquido el transporte de los solutos de una fase

acuosa a un disolvente orgánico inmiscible con el agua, depende fundamentalmente de la

hidrofobicidad del soluto y de su solubilidad en el disolvente.

2. Técnicas de extracción con disolventes.

Se basan en la polaridad de los sustancias ya que la mayor o menor afinidad entre

los compuestos y el disolvente reside en la semejanza entre sus polaridades. Al tener una

gran cantidad de compuestos volátiles baja polaridad, un disolvente apolar dará un buen

resultado.

La extracción se puede realizar con matrices en estado sólido, líquido o gaseoso,

siendo asequibles y de fácil utilización, pero teniendo como inconveniente el tener que

usar disolventes de elevada pureza y los pobres resultados con compuestos que sean muy

volátiles.

En el caso de extracción líquido-líquido, la preconcentración se lleva a cabo en una

única etapa de transferencia del soluto de la fase acuosa a un disolvente orgánico. Una

vez alcanzado el equilibrio, una alícuota del disolvente orgánico es introducida en el

analizador. En ocasiones, sin embargo, puede ser necesario redisolver el analito en otro

disolvente que sea compatible con el sistema de análisis.

Existen técnicas más complejas que optimizan la extracción. Un ejemplo es la

Soxhlet, que al implicar un calentamiento, no se puede aplicar a compuestos termolábiles.

Otro ejemplo es la llamada Single-Drop, que consiste en poner en contacto la

muestra con una gota de disolvente que pende de una jeringa de inyección en

cromatografía gaseosa que, a pesar de su simplicidad conceptual, presenta problemas a

la hora de llevarla a la práctica como la inestabilidad de la gota y la complejidad

operacional (Jeannot y Cantwell, 1997; Jeannot y Cantwell, 1997; He y Lee, 1997).

La extracción líquido-líquido se emplea rutinariamente para la preconcentración de

PCBs, OCPs y HHAAPP. Para la extracción de plaguicidas organoclorados se puede


103

emplear hexano como disolvente de extracción debido a las buenas recuperaciones que

proporciona y a su compatibilidad con el sistema de análisis CG-DCE. Para la extracción

de hidrocarburos poliaromáticos se emplea freón dadas sus buenas recuperaciones y sus

ventajas de cara a su mayor inocuidad para el operador. Sin embargo el impacto adverso

que el freón provoca en la capa de ozono está haciendo que su uso se vaya reduciendo

cada vez más y se estudie su sustitución por hexano.

3. Extracción con fluidos supercríticos (McNally, 1996; King, 2002).

Su principio de funcionamiento es semejante al de los disolventes (de hecho se

comportan como auténticos disolventes), pero sin el impacto medioambiental de estos

últimos. Además actúan en parte como líquidos y en parte como gases, aunando las

ventajas de ambos. Por contra, tienen un alto coste de instrumentación (Kerrola, 1995).

4. Técnicas de destilación.

El fraccionamiento tiene lugar según la volatilidad de los compuestos, no siendo

apto para compuestos poco volátiles, pero tampoco para los compuestos muy volátiles

por el inconveniente que supone la etapa de preconcentración. Debido al calentamiento al

que se ven sometidos, los compuestos deben ser termoestables.

5. Extracción-destilación simultánea (EDS).

Conjuga tanto extracción con disolventes como destilación, por lo que su capacidad

de extracción depende tanto de la volatilidad como de la polaridad de los compuestos

(Chaintreau, 2001).

6. Inyección directa.

Es una técnica muy sencilla y rápida que consiste en inyectar el vapor contenido en

un recipiente, siendo el inconveniente la sensibilidad que se obtiene, que no es alta.

Han surgido otras que modifican algunos de sus aspectos, entre las que destaca el

arrastre con gas inerte, aplicable a muestras tanto sólidas (desorción térmica directa),

líquidas (burbujeo) y gaseosas. Las técnicas automáticas que se basan en estas técnicas

son la desorción térmica automática (ATD) y el “Purga&Trampa”, de las que no solo

destaca su automatización sino la ausencia de disolventes orgánicos y su alta sensibilidad.


104

7. Técnicas de fraccionamiento por absorción.

Estas técnicas han sido inspiradas en las cromatográficas, compartiendo sus mismos

principios y tecnología. Como ejemplo de esto se puede citar el PDMS, que es uno de los

materiales absorbentes más usados y también una de las fases estacionarias más

comunes para columnas capilares.

La creciente popularidad de las técnicas de extracción en fase sólida se debe no

sólo a sus evidentes ventajas sobre la ELL (menor consumo de disolventes orgánicos, no

formación de emulsiones, menor contacto del analista con sustancias potencialmente

tóxicas), sino también al progresivo perfeccionamiento de estos métodos que han

reducido las desventajas iniciales.

La aparición de los discos de extracción de membranas ha permitido aumentar la

velocidad del proceso de preconcentración, y la mayor producción de materiales para EFS

han abaratado sus precios. La amplia gama de materiales para EFS recientemente

desarrollados les ha permitido cubrir las exigencias de los nuevos contaminantes

(plaguicidas y otras sustancias químicas industriales y sus productos de degradación).

Actualmente, las principales características que hacen de la EFS una técnica pre-

ferente son: su facilidad de automatización, su capacidad de conservación y

almacenamiento de las muestras, y su gran potencial para ofrecer soluciones a complejos

problemas de preseparación y preconcentración en los estudios de vigilancia de la calidad

de las aguas superficiales.

El principio básico de este tipo de fraccionamiento es el uso de un material

extractante no solo como preconcentrador si no como elemento de fraccionamiento,

obteniéndose excelentes resultados con componentes de volatilidad alta y media.

Se pueden clasificar en dos tipos según el muestreo (Baltussen et al., 2002):

• Muestreo dinámico. La muestra se pone en contacto con el absorbente al hacerla circular a través de éste. Entre sus tipos se hayan trampas capilares abiertas, trampas capilares abiertas múltiples y tubos rellenos.

• Muestreo estático. En este caso tanto la muestra como el absorbente comparten el mismo volumen, no siendo la agitación o sonificación más que una forma de acelerar la llegada al equilibrio. En este tipo encontramos


105

microextracción en fibra capilar, extracción dinámica en fase sólida y extracción por absorción sobre barra agitadora.

La mayoría de los procedimientos de extracción en fase sólida comprenden la

transferencia del soluto en dos fases. Inicialmente, el soluto es adsorbido de la fase

acuosa, sobre la superficie sólida de un absorbente o en la fase estacionaria enlazada a la

misma, y, posteriormente, el soluto es eluido con un disolvente adecuado (o desorbido

térmicamente en un cromatógrafo de gases). En este caso, la selección del solvente

adecuado (es decir, la selección de la fuerza de las interacciones responsables de la unión

del soluto en la fase sólida) y la selección del disolvente de elución o de las condiciones

de desorción térmica (es decir, la energía necesaria para romper estas uniones) deben

realizarse adecuadamente a fin de obtener una preconcentración cuantitativa.

Cuando se emplean procedimientos de extracción en fase sólida, normalmente es

necesario filtrar las muestras a través de un filtro de membranas antes de la extracción.

De este modo, los resultados obtenidos tienen en cuenta únicamente el contenido de

analito en la fase acuosa. Aún en el caso de que no se aplicara ningún proceso de

filtración previo a la extracción, difícilmente los analitos adsorbidos en las partículas

sólidas serían retenidos en los adsorbentes de los cartuchos de extracción en fase sólida.

Existen numerosos estudios comparativos de ambas técnicas a nivel general (Junk

et al., 1987; Liska et al., 1989; Barceló, 1991), y ensayos experimentales de comparación

de ambas técnicas (Chiadek y Maraño, 1984; Fingler et al., 1987), que han demostrado la

superioridad de la extracción en fase sólida en numerosas aplicaciones, especialmente

cuando se pretende preconcentrar compuestos de carácter polar.

7.1. Trampas capilares abiertas (TCA).

Las trampas capilares abiertas consisten en una columna capilar recubierta de una

fina capa de fase estacionaria (10 - 17 μl), que es la encargada de atrapar los analitos

(Bicchi et al., 1987, 1988). La extracción de éstos se realizara generalmente por desorción

térmica (Burger y Munro, 1986; Blomberg y Roeraade, 1987), aunque también se pueden

emplear disolventes (Blomberg y Roeraade, 1987).

El inconveniente de esta técnica es la pequeña cantidad de fase estacionaria

presente, que hace que no sea muy sensible, no siendo demasiado factibles como


106

soluciones ni el aumentar el largo de la columna (Zhang y Pawliszyn, 1996), ni el espesor

de la capa estacionaria (Roeraade y Blomberg, 1989; Burger et al., 1990; Blomberg y

Roeraade, 1988). Otro inconveniente es el bajo flujo a través del capilar (< 10 ml / min),

que implica altos tiempos de muestreo.

7.2. Trampas capilares abiertas múltiples (TCAM).

Ortner y Rohwer (1996) mejoraron las trampas capilares abiertas colocando varios

TCAM en paralelo, que aunque aumenta notablemente la cantidad de fase estacionaria

absorbente, la limitación del flujo (15 ml / min) y la geometría de la trampa hace que no

se consiga una retención cuantitativa de los analitos.

7.3. Tubos Rellenos (Packed Beds).

Los tubos rellenos fueron introducidos por Baltussen et al. (1997) y supusieron otro

avance en lo que se refiere a la cantidad de fase estacionaria presente (hasta 300 μl),

aumentando la sensibilidad. Otra ventaja añadida es que permiten flujos mucho mayores

que las trampas capilares (Baltussen et al., 1999), lo que disminuye notablemente el

tiempo de muestreo.

Sin embargo, presentan inconvenientes en su difícil aclopamiento directo con CG o

CG/EM debido, entre otras cosas, a los altos caudales usados para la desorción y a la

imposibilidad de muestrear compuestos de alta volatilidad en muestras líquidas, ya que se

perderían en la necesaria etapa de secado.

El primer inconveniente se podría solucionar con un divisor de corrientes, pero iría

en detrimento de la sensibilidad; la otra opción sería usando complejos dispositivos de

desorción con dos puntos de división de flujo y una trampa fría entre ellos.

7.4. Microextracción en fibra capilar (MEFC).

Presentada por Arthur y Pawliszyn (1998) a principio de los noventa, consiste en un

dispositivo a modo de jeringa que posee una fibra capilar retráctil recubierta con una fase

extractante, ya sea adsorbente, absorbente o una combinación de ambas.


107

Esta técnica es tremendamente sencilla y versátil, siendo: automatizable (Arthur et

al., 1992; Górecki y Pawliszyn, 1995; Górecki y Pawliszyn, 1997; Boussahel et al., 2002;

Górecki et al., 1999), de bajo coste, tiempos de muestreo reducidos, pudiéndose acoplar

directamente a un inyector con división o sin división de flujo cualquiera y admitiendo

varios modos de muestreo (Lord y Pawliszyn, 2000); por todo esto se ha hecho una

técnica tremendamente popular a pesar de que su baja cantidad de absorbente hace que

esta técnica no sea demasiado sensible.

Figura VI.1

Recuperación en función del tiempo de absorción

Una variante es la MEFC hermética (Zhang y Pawliszyn, 1996), donde en el interior

de la jeringa queda confinado un volumen de 110 μl con los compuestos más volátiles,

aumentando la sensibilidad en el análisis de estos compuestos.

Si se desea consultar más acerca de sus campos de aplicación, Hernández et al.

(2000), Silva et al. (2000) y Theodoridis et al. (2000).

7.5. Extracción Dinámica en Fase Sólida (EDFS).

La EDFS (Lipinski, 2001) es una técnica similar al la anterior pero sin fibra retráctil,

donde el muestreo se hace subiendo y bajando el émbolo de la jeringa múltiples veces

para que con el bombeo se acelere el establecimiento de un equilibrio entre la matriz de

la muestra y el absorbente.


108

7.6. Extracción por Absorción sobre Barra Agitadora (ESBA).

El ESBA es una técnica nueva (Baltussen et al., 1999), consistente en un imán

encapsulado en una funda de vidrio que a su vez está recubierta por una capa de PDMS

(la cantidad de absorbente varia según las dimensiones).

Las ventajas de este método son muchas, entre ellas que la cantidad de absorbente

que maneja es elevada (semejante a la de los tubos rellenos y las TCAM multicanal), lo

que hace que su sensibilidad sea elevada incluso para los compuestos más volátiles, ya

que el secado tras el muestreo de un líquido es sencillo y rápido.

La sencillez de la preparación de la muestra junto con la capacidad de ser

automatizado hacen de este método uno de los mejores para diversas aplicaciones (en

especial para el análisis de pesticidas en aguas), siendo su gran inconveniente el alto

coste, al venderse junto con el equipo de desorción térmica de la casa, que lo

comercializa bajo el nombre de “twister”.

Existe una nueva técnica desarrollada por Tienpont et al. (2000) llamada

“headspace sorptive extraction” (HSSE) con fundamentos muy similares a los de MEFC, y

consistente en recubrir con PDMS unas varillas de vidrio que se colocan en el espacio en

cabeza de un vial o Erlenmeyer que contenga la muestra a fraccionar en agitación

(Tienpot et al., 2000).

En general, el progreso en este campo ha sido grande, pero seguramente no

termine aquí si no que seguirá avanzando hacia técnicas aún más sofisticadas.


109

Tabla VI.1

Ventajas e inconvenientes de las técnicas de fraccionamiento de VOCs por Absorción (D. Estaban, 2003)

TÉCNICA VENTAJAS INCONVENIENTES

Bajos flujos de muestreo

Baja sensibilidad TCAM (Dinámica) Trampa fácil de adquirir

Desorción compleja

Sensibilidad Bajos flujos de muestreo TCAM Multicanal

(Dinámica) Desorción térmica directa en el inyector Trampa difícil de elaborar

Sensibilidad Análisis de volátiles en muestras líquidas Tubos rellenos

(Dinámica) Altos flujos de muestreo Complejo acoplamiento con CG por

los flujos de introducción de Muestra

Sencillez

Bajo coste

Versatilidad

Automatización MEFC (Estática)

Fibras que combinan absorbentes con adsorbentes

Baja sensibilidad

Sencillez EDFS (Estática)

Muestreo más eficaz que MEFC Técnica nueva con falta de

aplicaciones

Sensibilidad ESBA (Estática)

Automatización Instrumentación cara

Sensibilidad HSSE (Estática)

Automatización Instrumentación cara


110

Tabla VI.2

Aplicaciones de las técnicas de fraccionamiento de VOCs por absorción (D. Esteban, 2003)

TÉCNICA APLICACIÓN Nº CITA

Volátiles en plantas 39 TCAM

Drogas 40

Compuestos olorosos en aguas 29 TCAM múltiples

Aire ambiental 29, 41

Fenoles en aguas 42

Aminas en muestras acuosas 43

Pesticidas e hidrocarburos poliaromáticos (HHAAPP) en aguas 31

Ftalatos en muestras de aire 44

Tubos rellenos

Nicotina en muestras de aire 45

Aguas para beber 46

Bencenos sustituidos en aguas 47

Pesticidas clorados en aguas de desecho y para beber 48, 49

Suelos 50

Zumos de frutas 51

Zumos de Naranjas 52, 53

Aceites vegetales 54

Ácidos grasos de cadena corta en azúcar de caña y de remolacha 55

Vinos espumosos 56

Volátiles de azufre en el aroma de la trufa blanca y negra 57

Quesos 58

MEFC

Mentol y mentona en alimentos y productos farmacéuticos 59

Hidrocarburos policíclicos aromáticos en muestras acuosas 60

Aguas residuales o de desecho 61

Mejillones y aguas de puerto 62

Bebidas de limón 63

Volátiles quirales en fresas 64

Fungicidas tipo dicarboxamida en vino 65

Conservantes en bebidas, vinagres, salsas acuosas y bebidas 66

Compuestos monoterpénicos en aceites esenciales 67

ESBA

Fluidos biológicos 68, 69

EDFS Pesticidas halogenados en aguas 36 MEFC, ESBA y

HSSECafé 70

MEFC y HSSE Plantas aromáticas y medicinales 71

Aguas 72

Pesticidas y clorobencenos en fresas 73 MEFC y ESBA

Pesticidas organoclorados y clorobencenos en frutas vegetales 74 MEFC y tubos

llVolátiles emitidos por plantas vivas 75


111

7.7. Dispersión en Matriz de Fase Sólida (DMFS)

En esta técnica se produce simultáneamente una disrupción y extracción de

muestras sólidas y semisólidas mediante la dispersión de la muestra sobre un soporte

sólido, seguido por un lavado y elusión con una pequeña cantidad de solvente.

Su acoplamiento a cromatografía líquida es muy sencillo y, en esencia, se puede

considerar como un método que no usa disolventes.


112

VII. MÉTODOS PROPUESTOS.

1. Análisis.

1.1. Introducción

Las características más importantes que se han tenido en cuenta en la elección de

las técnicas analíticas son:

Alcanzar bajos límites de detección.

Sencillez de la preparación de la muestra.

Un amplio campo de aplicación.

Para los límites de detección se han tomado como referencia los valores dados en el

estudio encargado por la Unión Europea a la Sociedad Fraunhofer, siendo estos

provisionales (Lepper, 2002).

A la hora de comparar las técnicas de preconcentración se han agrupado los

espectrómetros de masas, ya que en la literatura se pueden encontrar distintos equipos,

como el CIPA (ionización a presión atmosférica) o el EMAR (espectrómetro de masas de

alta resolución) entre otros.

Las sustancias prioritarias se han agrupado en:

Pesticidas semivolátiles

Hidrocarburos policíclicos

Organoclorados volátiles

Otras sustancias.

En la bibliografía consultada han aparecido multitud de posibles técnicas para el

análisis de los distintos grupos, aunque muchas de ellas no se han considerado lo

suficientemente relevantes como para ser comentadas.

1.2. Pesticidas semivolátiles

El análisis medioambiental de estas sustancias se viene realizando desde hace

mucho tiempo, por lo que existe una gran variedad de bibliografía para su estudio. Este

grupo no posee propiedades semejantes, si no que contiene a aquellas sustancias útiles


113

en la lucha contra las plagas. Esto explica el porqué de la amplia variedad de técnicas

para su análisis y el reducido campo de acción de algunas de ellas.

Las sustancias incluidas dentro de los pesticidas volátiles y presentes en la directiva

son: Alacloro, Aldrina, Atracina, Clorofenvifos, Cloropirifos, o,p-DDT, p,p-DDT, Dieldrina,

Diurón, Endosulfán(alfa), Endrina, α-HCH, β-HCH, δ-HCH, Isodrina, Isoproturón, Lindano

(γ-HCH), Simacina, Trifluoralina.

Los pesticidas de mayor polaridad han sido excluidos de esta clasificación, ya que

los métodos aplicables a estas sustancias para obtener unos resultados aceptables, son

distintos de los usados para las sustancias aquí estudiadas, debido especialmente a la

inefectividad de la preconcentración por EFS, MEFS y ESBA, siendo en estos casos más

corriente la aplicación de P&T o EC. Tanto EFS como MEFS y ESBA pertenecen a la misma

familia de técnicas de fraccionamiento por absorción, siendo EFS el comienzo de esta

rama que ha caído ya en un notable desuso, aunque aún está presente en una parte

considerable de la bibliografía seleccionada, incluyendo interesantes artículos para ciertos

compuestos. La diferencia entre MEFS y ESBA es menor, siendo la principal distinción

entre ellos la mayor facilidad de aplicación del más moderno, que consiste simplemente

en utilizar un agitador magnético que está recubierto del material absorbente. En

resumen, el uso de una técnica u otra suele deberse a la antigüedad del estudio en

cuestión.

Entre las técnicas más importantes aparece la CG-EM, usándose como método de

preconcentración EFS, MEFS o ESBA. La CG es siempre una columna capilar de

cromatografía gaseosa con He por fase móvil, y que trabaja con un gradiente de

temperatura.

El detector es un elemento que varía, tanto en el método usado en la detección

(escaneo, registro selectivo de iones,…), como en el tipo (ionización a presión

atmosférica,...). La espectrometría de masas en tándem se considera una técnica distinta,

aunque podría englobarse como un tipo de detector de masas avanzado, ya que su

campo de aplicación es el mismo. Estos equipos están basados en los espectrómetros que

salieron a la luz hace unos 5 años, consistentes en un triple cuádruplo con fuentes de

ionización a presión atmosférica. Entre sus ventajas está la de aislar un determinado ión y

provocar su fragmentación mediante colisiones, permitiendo una mejor discriminación de

las posibles interferencias de la matriz de la muestra. Los requisitos especiales que debe


114

satisfacer este equipo son: buena selección del ión, un aislamiento y almacenamiento

eficiente del mismo y unas condiciones óptimas de la disociación inducida por colisión.

El detector de masas en tándem se distingue del modelo simple en que realiza la

detección en dos etapas. El modo de análisis más común es el llamado ESCANEO DE

IONES, donde primero se realiza un análisis de todos los iones dentro del rango m/z de

interés, y a continuación se seleccionan los iones de un determinado m/z, para pasar a la

segunda etapa, en que entran en la cámara de fragmentación y se analizan los

fragmentos resultantes de la misma.

La CG-EM es la técnica con mayor campo de aplicación y mejores resultados para

los pesticidas, siendo las excepciones el Diurón y el Isoproturón, para los que la

cromatografía líquida sigue siendo la técnica por excelencia, aunque el alto límite fijado

por la directiva para el Isoproturón hace que otros métodos menos aptos lo alcancen

fácilmente.

Carabias-Martínez et al. (2003), consigue analizar el Isoproturón mediante MEFS-

CG-EM, siendo esto lo más relevante de su artículo, ya que sus resultados son en general

pobres, alcanzando un LD de 0.02 μg/l y una precisión de 18.6 con una concentración de

0.3 μg/l para el Isoproturón. Sus resultados para los otros pesticidas no son mejores. En

otros estudios se pueden observar valores mucho mejores aplicando la misma técnica:

véase Estefani Morales (2004), y Gonçalves y Alpendurada (2004); por lo que es un

resultado extraño el que consiga tan buenos valores en el análisis de los dos pesticidas

más complicados en el análisis por CG, como son el Diurón e Isoproturón. Pese a que se

ha realizado una búsqueda, no se han encontrado estudios que puedan afianzar la idea

del análisis por CG de estos compuestos.

La utilización más general de esta técnica es la de Estefani Morales (2004), donde

aplica ESBA-CG-EM a todos los pesticidas del grupo, a excepción de los dos citados

anteriormente, con unos LLDD cercanos a 0.005 μg/l para la mayoría de los casos, y

obteniendo un buen coeficiente de correlación (r2>0.99) excepto en el DDT y la Simacina.

Cabe destacar que es el único estudio de los consultados, donde se realiza la detección de

la Isodrina, siendo posible que en otros, aunque no se hayan analizado, sea viable la

aplicación de sus métodos para el análisis de esta sustancia.


115

Otros autores que alcanzan muy buenos resultados son: Gonçalves y Alpendurada

(2004). En su artículo se comparan los resultados para distintos usos del detector de

masas (Full Scan, SIS, μSIS y MSxMS), observándose que los resultados para el MSxMS

son mejores en todos los aspectos y prácticamente todas las sustancias, con resultados

siempre inferiores a 0.005 μg/l para el LD y 10% para la precisión y repetibilidad; el

coeficiente de correlación se mantiene por encima de 0.993; todo ello nos da una idea de

la potencia del método. Si comparamos las otras técnicas, Full Scan es la que obtiene un

resultado menos favorable, y μSIS, que destaca por encima de su similar SIS, es la más

recomendable.

En general, la definición que realizan los distintos autores de las variables que

utilizan varía de unos a otros, siendo uno de los métodos más usados para el LD escoger

aquel valor en el que la relación señal/ruido es igual a 3.

1.3. Hidrocarburos policíclicos.

Los HHPP han sido objeto de un intenso estudio debido a que están considerados

como sustancias mutágenas y/o cancerígenas, siendo su presencia en el medio ambiente

0

2

4

6

8

10

12

1416

18

Nº Sust.

ES

BA-

CG

-E

M

ME

FS-C

G-

EM

-EM

ME

FL-C

G-

EM

ME

FS-C

G-

EM

EFS-

CL-

EM

EFS

-CG

-D

CE

Métodos

Sust. noalcanza ellímite

Sust. conlímite n/a

Nº Sust.alcanza ellímite

Ilustración VII.1

Pesticidas semivolátiles


116

fruto de: combustiones incompletas de compuestos orgánicos, emisión de vehículos,

vertidos industriales, vertidos accidentales de petróleo, etc.

Las sustancias incluidas en este grupo son: Antraceno, Benzo(a)pireno,

Benzo(b)fluoranteno, Benzo(g,h,i)perileno, Benzo(k)fluranteno, Fluoranteno,

Indenol(1,2,3-cd)pireno y Naftaleno.

Las técnicas instrumentales de análisis más utilizadas para su determinación se

encuentran en la Cromatografía de Gases (CG) y la Cromatografía de Líquidos de Alta

Resolución (HPLC), así como la espectrofotometría de absorción UV-Visible y la

espectrofluorimetría, aún cuando las técnicas espectroscópicas convencionales requieren

de procesos de separación previos por las grandes interferencias espectrales presentes.

En la tabla puede observarse como los resultados obtenidos por Estefani Morales

(2004) cumplen los requisitos pedidos por la directiva, si bien siempre quedan por debajo

de los obtenidos por Kolahgar et al. (2002). Ambos autores utilizan la misma técnica

(ESBA-CG-EM), e incluso equipo de la misma marca, por lo que la diferencia entre los

resultados debe de hallarse en el procedimiento en sí o en la definición de los resultados

presentados.

Respecto a lo primero, Estefani Morales (2004) usa un Twister de 20 mm

adicionando un 20% de NaCl para aumentar las fuerzas iónicas, mientras que Kolahgar et

al. (2002) adiciona Hiomina hasta una concentración de 10 μg/l, para evitar la absorción

de los analitos sobre la pared de vidrio del material usado durante la preparación de la

muestra. Hay que recordar que según Gimeno et al. (2002), uno de los principales

problemas de los HHAAPP es su tendencia a ser absorbidos por las superficies con las que

entran en contacto.

Otro punto donde divergen ambos estudios es en el tiempo de desorción. En

Estefani Morales (2004) es de 14 h., para asegurarse de una completa extracción (el

procedimiento para este autor agrupa también al heterogéneo grupo de los pesticidas),

mientras que en Kolahgar et al. (2002) es de tan sólo 3.5 horas, ya que a partir de ese

momento aparecen extrañas bajadas y subidas en la recuperación.

La otra posible diferencia está en las definiciones de los valores aportados por cada

uno, que es uno de los problemas más importantes encontrados en la elaboración del

presente proyecto, ya que impide la comparación directa de los valores. Mientras que el


117

primer autor calcula los límites de detección según lo indicado en las normas “ISO 11843-

1” e “ISO 11843-2”, el segundo lo calcula como los valores estadísticos teóricos basados

en la fluctuación de la respuesta al Blanco y la sensibilidad del método (3σ entre la

sensibilidad), reconociendo que el límite cuantitativo práctico aumenta hasta 1 ng/l

aproximadamente, valor que sigue mejorando el obtenido por Estefani Morales (2004).

Decir cual de los métodos es más exacto es complicado, y recordamos lo dicho en el

apartado anterior acerca del tema.

En cualquier caso, los límites de detección alcanzados por ambos autores en el uso

de esta técnica, son satisfactorios para el análisis de los HHPP dentro de la directiva

MARCO, por lo que es una técnica recomendable al analizarse todas las sustancias de este

grupo con unos LLDD del orden de 1 ng/l para Kolahgar et al. (2002) y del orden de 10

ng/l para Estefani Morales (2004). Este último obtiene unos mejores coeficientes de

correlación, >0.99 para todos excepto el Naftaleno y Benzo(g,h,i)perileno para los que

son levemente inferiores; el otro autor consigue resultados semejantes en la mayoría de

los casos excepto para el Benzo(a)pireno, donde obtiene tan solo un 0,92543. La

precisión también es mejor en el estudio realizado por Estefani Morales (2004), donde

permanece por debajo del 10% en comparación del 15% que tiene como valor máximo

Kolahgar et al. (2002), quien sí alcanza unos muy buenos valores de recuperación, como

se puede ver en la tabla, la mayoría del 100%, valores que, aunque Estefani Morales

(2004) no proporcione, deberían ser similares.

012345678

Nº Sust.

ESBA-CG-EM EFS-CL-DF

Métodos

Sust. no alcanzael límite

Sust. con límiten/a

Nº Sust. alcanzael límite

Ilustración VII.2

Hidrocarburos Policíclicos.


118

El otro método es el de Gimeno et al. (2002), que usa EFS-CL-F, cuyos resultados

varían notablemente, siendo en general semejantes a los de Estefani Morales (2004) salvo

para el Indenol(1,2,3-cd)pireno, para el que alcanza un pobre LD de 0.1 (μg/l). Los

resultados de este autor se realizan sobre muestras reales de agua de mar y, arguye, que

los realizados con el detector de Fluorescencia deben superar a los obtenidos por EM

debido a la dificultad de los HHPP para ser ionizados; un contrapunto a este argumento

puede ser el uso de CIPA-EM, especialmente eficaz en la detección de elementos poco

ionizables; sin embargo, la comparación entre estos dos métodos realizada por el mismo

autor parece confirmarlo en todos los casos, salvo en el Indenol(1,2,3-cd)pireno. Es

también el que alcanza un mejor Coeficiente de Determinación, siempre superior a

0.9996. No analiza ni el Naftaleno ni el Antraceno.

1.4. Organoclorados volátiles.

En este grupo incluimos: Cloroformo (Triclorometano), Diclorometano, 1, 2-

dicloroetano, Tetracloroeteno, Tetraclorometano, 1,2,4-triclorobenceno y 1,1,2-

tricloroeteno.

Este grupo resulta problemático ya que la mayoría de las técnicas hasta ahora

vistas, estaban enfocadas a sustancias poco polares, no dando buenos resultados para los

compuestos más volátiles; por ello aparecen en este apartado métodos no presentes en

apartados anteriores.

De los tres procedimientos estudiados, P&T-CG-EM es el más potente respecto a sus

resultados, alcanzando unos límites realmente bajos y dejando sin analizar sólo un

compuesto, que seguramente, pueda ser determinado por este método sin mayor

problema. De los otros dos métodos, IDA-CG-DCE resulta más atractivo que ES-CG-DCE,

obteniendo unos mejores resultados y siendo su aplicabilidad muy buena, además, EC-

CG-DCE no alcanza el límite en una de las sustancias, mientras que IDA-CG-ECD deja dos

elementos sin analizar, siendo posible el que se pudiera aplicar. La diferencia básica entre

ambos métodos estriba en la forma de introducir la muestra en la columna.

Ekdahl y Abrahamsson (1997) hacen un interesante estudio, donde alcanzan unos

resultados muy por encima del resto de la bibliografía consultada, realizando además una

comparación entre dos métodos: P&T-CG-DCE y P&T-CG-EM. Con el primero analizan

Cloroformo, Tetracloroeteno y Tetraclorometano hasta unos niveles del orden de 10-12


119

μg/l, realizando una nueva comparación dentro de este método, entre una trampa de

gran volumen acoplada a una columna cromatográfica (0.53mm de diámetro) y una

trampa de pequeño volumen en combinación con una columna capilar (0.32mm de

diámetro); el resultado obtenido por esta última mejora los resultados en el límite de

detección en, aproximadamente, uno o dos ordenes de magnitud. Usando la segunda

técnica, los límites de detección aumentan tres órdenes de magnitud, pero analiza el

diclorometano además de las ya citadas. Las eficiencias alcanzadas por ambos métodos

rozan el 100%, siendo la repetibilidad muy buena, ya que la desviación estándar relativa

no supera el 3% para ninguno de los casos.

Los resultados antes vistos dan una idea de la potencia de los métodos que

combinen P&T con el DCE para el grupo de los organoclorados volátiles, siendo además

muy probable que se pueda aplicar al resto de sustancias, ya que todas ellas han sido

analizadas por otros autores usando el DCE, como Cristina Huertas, que usa EC-CG-DCE.

Huybrechts et al. (2000), que analiza todas las sustancias del grupo menos el

diclorometano y el 1,1,2-Tricloroeteno mediante P&T-CG-EM, obtiene unos resultados

que, aunque buenos (~ng/l), son más pobres que los anteriores. Lo que puede ser de

interés en el artículo, es que aumente el campo de aplicación del método sin pérdidas

relativas en sus resultados, lo que avala la idea de que se pueda aplicar el método para

0

1

2

3

4

5

6

7

Nº Sust.

IAD

-CG

-D

CE

EC

-CG

-D

CE

P&

T-C

G-

EM

P&

T-C

G-

DE

A

P&

T-C

G-

DC

E

Métodos

Sustanciasdonde noAlcanza elLímite

Nº sustanciasdonde alcanzael límite

Ilustración VII.3

Organoclorados Volátiles.


120

todas las sustancias.

El artículo de Wolska et al. (1998) ofrece unos resultados llamativos al compararlos

con los obtenidos por medio de EC-CG-DCE; usando un detector y columna similar y una

introducción de la muestra extremadamente simple, obtiene unos límites de detección

entre 1 y 4 ordenes de magnitud inferiores sobre muestras reales, estando todos por

debajo de los 0.1 μg/l excepto para el 1,2,4-triclorobenceno, para el cual obtiene 0.24. La

repetibilidad expresada en R.S.D permanece por debajo de 8.9%, valores obtenidos a

unas concentraciones cercanas al límite de detección, por lo que la precisión resulta

bastante satisfactoria. El coeficiente de determinación permanece por encima de 0.998,

por lo que indica una relación altamente lineal. La excepción en estos dos valores vuelve

a ser el 1,2,4-triclorobenceno, compuesto para el cual se obtienen unos valores algo

superiores.

La técnica usada para obtener estos valores es muy sencilla, y consiste en inyectar

la muestra acuosa de forma directa, lo que ahorra mucho tiempo de análisis al eliminar la

parte de la preparación previa, que es la más difícilmente automatizable. El procedimiento

recibe su nombre de inyección directa acuosa (“Direct Acuous Injection”), no siendo más

que eso, la inyección de una pequeña cantidad (1-2 μl) en una columna con una fase

estacionaria especialmente adaptada para separar los compuestos del agua. Esto elimina

el problema antes existente de separar en el proceso previo los analitos, ya que estos

poseen una gran afinidad con el agua. El inconveniente es que debido a la pequeña

cantidad de analitos inyectados, los límites de detección no son tan bajos como los

obtenidos por otros métodos en otras sustancias.

1.5. Otras sustancias.

En este grupo se encuentran las sustancias que no han podido incluirse en ninguno

de los anteriores. Como consecuencia inmediata de esto, nos encontramos con que el

número de métodos aplicables con buenos resultados aumenta con respecto a los otros

casos, siendo su aplicación mucho más específica. La excepción a esto es el ESBA-CG-EM,

donde Estefani Morales (2004) vuelve a aplicarlo con éxito a todas las sustancias.

Las sustancias incluidas son: Benceno, Hexaclorobenceno, Hexaclorobutadieno, 4-

Nonilfenoles, 4-tert-Octilfenol y Pentaclorobenceno.


121

El hecho de que Estefani Morales (2004) analice prácticamente todos los

compuestos objeto de estudio del presente proyecto, se debe a que también se enfoca en

la directiva MARCO, mientras que los otros autores determinan en cada caso las

sustancias de su interés.

Como se acaba de decir, Estefani Morales (2004) analiza todas las sustancias

incluidas en este grupo, con unos resultados del orden de 0.01 μg/l para todos los casos

excepto para el benceno, donde tan solo consigue alcanzar un LD de 1 μg/l, que si bien

es suficiente (el límite marcado por la directiva es de 1.6 μg/l), no deja de ser pobre.

El mal resultado obtenido para el benceno no es fácilmente asignable, ya que

Peñalver Hernando (2002), habla del PDMS (fibra usada por el “Twister”) como

especialmente apta para el benceno, afirmando alcanzar recuperaciones del 100%. Sin

embargo, ésta es la principal diferencia entre los métodos aplicados por Estefani Morales

(2004) y Huybrechts et al. (2000), ya que este último aplica P&T-CG-EM para su análisis,

obteniendo un LD de 0.02205, que mejora notablemente el resultado obtenido por EFS.

Aún así, el Benceno es una de las sustancias problemáticas de su estudio, para la que

obtiene una mala precisión, 26%. El autor culpa de los malos resultados en este

compuesto al alto nivel presente en el blanco, que es del mismo orden del resultado. Este

alto nivel parece formarse a partir del material absorbente usado (Tenax TA), y podría

evitarse en parte, bajando la temperatura de desorción, lo que influiría negativamente en

el resultado de los otros compuestos. El cálculo del límite de detección usado por este

autor para este compuesto, consiste en la suma del valor medio obtenido en el blanco y la

cantidad de analito para una relación señal/ruido=3. Esta forma de cálculo se aplica

0123456

Nº Sust.

ES

BA

-C

G-E

M

P&

T-C

G-

EM EC

-M

EFS

-C

G-E

M

Métodos



Ilustración VII.4

Otras Sustancias.


122

debido al alto valor del blanco y a que la variación de la concentración en el mismo no

fluctúa por encima del 30%.

Este mismo autor también analiza el Hexaclorobutadieno, ahora con mejores

resultados (LD: 0,00124 μg/l, Repetibilidad: 12.9%), alcanzando el límite marcado por la

directiva para esta sustancia (este límite no fue alcanzado por Estefani Morales (2004).

En dos estudios más se aplican la familia de técnicas de fraccionamiento por

absorción en combinación con CG-EM, son Gonçalves y Alpendurada (2004), ya

comentado en el apartado de pesticidas, y Mol et al. (2000), haciéndolo para el

Hexaclorobenceno y los 4-Nonilfenoles respectivamente. Ambos autores alcanzan un LD

aproximadamente de la mitad que Estefani Morales (2004), si bien la repetibilidad y

coeficiente de determinación del primero son relativamente malos. El análisis realizado

por Mol et al. (2000), encuentra diversos problemas en el análisis directo de los 4-

Nonilfenoles, entre ellos la adsorción y el ensanchamiento del pico cromatográfico, debido

a interacciones con otros compuestos, dependiendo esto de la matriz de la muestra y de

la antigüedad de la columna, lo que complica aun más la detección. Por ello decide

realizar una derivación del compuesto, lo que le permite evitar los problemas al hallar el

producto de esta reacción. La derivación se realizó añadiendo como reactivo derivador N-

metil-N-(tert.-butildimetiltrifluoroacetamida) (MTBSTFA), la solución se mantiene a 75º C

durante tres horas, y el detector se configuró en modo escaneo (esto sugiere una posible

Ilustración VII.1

Cromatogramas para el 4-n-octilfenol and 4-n-nonilfenol.


123

mejoría del LD usando otro método). De todas formas, el autor no recomienda esta

técnica para realizar análisis cuantitativos de esta sustancia, al ser determinada de forma

indirecta.

La otra técnica encontrada para el análisis del Hexaclorobenceno y

pentaclorobenceno, es la que consiste en acoplar el espacio en cabeza con la extracción

sobre fase sólida, y aparece desarrollada en el artículo de He et al. (2000). Este

acoplamiento entre ambas técnicas consiste en que la fibra está en contacto con la fase

gaseosa, disminuyendo el tiempo necesario para la extracción, al ser mayor la difusividad

en el gas que en el líquido. La extracción se realiza a 40º C, y en ella se obtienen

resultados que mejoran de forma importante los obtenidos a temperatura ambiente, para

los dos compuestos en cuestión. Esta técnica es especialmente apta para compuestos

volátiles o semivolátiles. Los LLDD son del orden de los conseguidos por los otros autores,

pero tiene una buena repetibilidad, 1.19% y 8.19% para ambos compuestos, obtenido

con el EM en modo RSI, y aporta una alternativa al análisis de estos compuestos.

1.6. Sustancias Prioritarias Orgánicas.

Tras el análisis de los distintos métodos, se puede llegar a la conclusión de que la

técnica más apta para el análisis de las sustancias prioritarias es el ESBA-CG-EM, que

analiza la mayoría de los compuestos, alcanzando los límites de detección marcados por el

estudio encargado para la directiva MARCO, éste sería, por tanto, el método base para el

análisis de las sustancias prioritarias orgánicas en aguas.

Habría que recordar de nuevo que el uso de la EM en tándem sería, en principio,

más recomendable que el uso de la EM simple, aunque la mejoría no esta muy

contrastada, y en algunos casos parece ser insuficiente para que compense el de este

equipo.

Para abarcar un número aún mayor de compuestos se podría complementar está

técnica con alguna otra. Los métodos más aptos para ello serían P&T-CG-EM como la que

mejor complementaría el resultado del EFS-CG-EM, ya que obtiene muy buenos

resultados con los organoclorados volátiles, además de ser capaz también de analizar el

hexaclorobutadieno; o IDA-CG-DCE, la cual complementaría a la EFS-CG-EM en el análisis

de las sustancias polares, obteniendo unos resultados algo peores que la anterior, pero de

aplicación más sencilla y obteniendo unos resultados muy satisfactorios.


124

La última alternativa del análisis de los organoclorados volátiles sería el uso de EC-

CG-DCE, pero teniendo en cuenta que esta técnica, aunque ofrece buenos resultados, no

alcanza el límite propuesto en el Diclorometano, pero consiguendo analizar el 1,1,2-

tricloroeteno, que no fue objeto de estudio en las otras técnicas mencionadas.

Con todo esto se analizarían la mayoría de las sustancias, y ya sólo quedarían el

Isoproturón y el Diurón, cuyo método propuesto sería la cromatografía líquida, y los

Cloropirifos, para los que no se encontró ninguna técnica capaz de alcanzar el límite propuesto.

2. Cromatografía de gases con espectrometría de masas (CG-EM).

En este apartado vamos a comentar en profundidad la técnica que hemos adoptado

en el apartado anterior como base, estudiando sus distintas variables para optimizar el

procedimiento lo máximo posible.

0

5

10

15

20

25

30

35Nº Sust.E

SB

A-C

G-E

M

P&

T-C

G-E

M

ME

FS-C

G-E

M-E

M

ME

FL-C

G-E

M

EFS

-CG

-DC

E

ME

FS-C

G-E

M

EFS

-CL-

EM

IAD

-CG

-DC

E

EC

-CG

-DC

E

P&

T-C

G-D

EA

P&

T-C

G-D

CE

Métodos


Sust. conlímite n/a


Ilustración VII.5 Sustancias Prioritarias.


125

El acoplamiento con la espectrometría de masas proporciona a la cromatografía de

gases la solución a su desventaja de su poca capacidad para el análisis cualitativo, por lo

que es usado principalmente en métodos de análisis que buscan la identificación de los

compuestos analizados. La complementariedad de ambas técnicas se basa en que la

cromatografía de gases diferencia claramente miembros de series homólogas con similar

espectro y permite la distinción de isómeros de posición, distinción difícil de llevar a cabo

por espectrometría de masas, mientras que dos sustancias de diferente estructura que se

solapan en un cromatograma pueden tener un espectro de masas completamente

distinto.

El uso práctico de este acoplamiento se ha extendido a partir de 1980 mediante una

serie de mejoras tanto en la cromatografía de gases (columnas capilares de sílice fundida,

fases inmovilizadas...) como en la espectrometría de masas (eficaces sistemas de vacío,

alta sensibilidad...).

Los avances informáticos han sido también fundamentales en el desarrollo de este

acoplamiento, permitiendo realizar el tratamiento de datos necesario para interpretar la

compleja información producida a un bajo coste. Un primer paso en el tratamiento es el

almacenamiento en forma digital de todos los espectros de masas registrados a lo largo

de la elución cromatográfica. A partir de estos datos, se reconstruye un perfil

cromatográfico similar a los producidos por cualquier detector a partir de la integración de

la señal de todos los fragmentos iónicos. Los espectros individuales se pueden interpretar

o comparar automáticamente con los almacenados en una biblioteca.

Las características mencionadas hacen del acoplamiento CG-EM el método analítico

más eficaz para el análisis cualitativo y cuantitativo de mezclas complejas de productos

volátiles.

2.1. Instrumentación

Desde el punto de vista instrumental, el acoplamiento CG-EM se presenta de

acuerdo con dos planteamientos distintos.

El primero de ellos es propio de grandes espectrómetros y considera que el

cromatógrafo de gases es un sistema de introducción de muestras en la cámara del


126

espectrómetro de masas equivalente a una sonda de introducción directa, un depósito

para introducción indirecta o a otras posibles modalidades.

El punto de vista opuesto considera al espectrómetro de masas como un detector

sofisticado del cromatógrafo de gases, e incluso lo denomina detector de masas o

detector de iones. Es propio de instrumentos sencillos y relativamente económicos, cuya

accesibilidad ha sido el origen del gran desarrollo de aplicaciones basadas en la

espectrometría de masas a finales de los años 80 y principios de los 90 (Wach, 1994).

Estos aparatos presentan prestaciones inferiores a las de los espectrómetros de

masas convencionales. Su intervalo de masas suele alcanzar sólo las 450-800 uma, lo que

impide el análisis de sustancias de alto peso molecular. El tamaño y la capacidad de

bombeo limitan el uso de distintos métodos de ionización de muestras, que generalmente

se reduce al impacto electrónico. El sistema de separación de masas suele ser un

cuadrupolo o una trampa de iones, que no permiten medidas de alta resolución. Estas

limitaciones, sin embargo, no son importantes en el uso típico de estos aparatos, que es

el análisis cualitativo de mezclas complejas separables por CG.

Si se fija el analizador en un valor m/z determinado en lugar de llevar a cabo un

barrido amplio, aparece a cambio una elevada sensibilidad hacia los compuestos que

presenten un fragmento de esa masa en su espectro, tanto mayor cuanto mayor sea la

intensidad relativa del fragmento y menor su presencia en el ruido de fondo del

instrumento. Este modo de operación, que combina la sensibilidad y selectividad propias

de la espectrometría de masas con la separación que proporciona la cromatografía de

gases, recibe el nombre de registro selectivo de iones (SIM, Selective Ion Monitoring) y

permite utilizar el acoplamiento CG-EM como un sistema de análisis cuantitativo de gran

sensibilidad e independiente de interferencias de compuestos que, aunque solapasen con

el pico correspondiente al compuesto buscado, no interferirían en su determinación si no

presentaran en su espectro el fragmento utilizado.

2.2. Procedimiento.

El procedimiento que se va a describir a continuación, está destinado al análisis de

compuestos semivolátiles con un equipo con extracción por absorción sobre barra

agitadora (ESBA), la entrada de muestras tiene lugar por una desorción térmica (DT) que


127

introduce la muestra en un cromatógrafo de gases de columna capilar (CG), con un

detector del tipo espectrómetro de masas (ESBA-DT-CG-EM).

El Procedimiento óptimo ha de permitir el análisis rutinario de un gran número de

muestras el mismo día del muestreo, de forma automatizada y con una sensibilidad lo

suficientemente elevada como para poder cumplir al menos con los criterios establecidos.

La absorción y fraccionamiento se realiza sobre polidimetilsiloxano (PDMS) que recubre

una barra magnética. Tras un cierto tiempo predeterminado de extracción, los analitos

atrapados sobre el polímero son desorbidos térmicamente en el inyector, produciéndose a

continuación un crioenfoque de la muestra que favorece un estrechamiento de las bandas

cromatográficas.

2.2.1. Material.

La extracción se realiza mediante la técnica de ESBA, en la que la cantidad de

polímero usado para la absorción es de 25-100 μl frente a los tan solo 0.5 μl que ofrece

MEFC; aparte de esta ventaja, el resto de mecanismos son similares entre ambas. En

especial vamos a realizar la extracción con “twisters” (nombre comercial de las barritas

agitadoras), usando el modelo de 10mm × 0.5mm (largo × espesor del recubrimiento),

siendo el proveedor Gerstel (Müllheim a/d Ruhr, Alemania).

Los “twisters” deben ser sometidos a una desorción térmica a 300ºC durante 4 h en

un flujo de helio de 50 ml / min antes del primer uso.

La extracción se realiza en Erlenmeyer de 100 ml de capacidad donde se introduce y

somete a agitación en un agitador magnético, también perteneciente a la casa Gerstel.

Para la elaboración de la matriz se usa cloruro de sodio y metanol CLAE-grade. Las

muestras se elaborarán con agua pura obtenida de un Mili-Q (Millipore, milford, MA, USA).

Los factores que afectan a la desorción son: la temperatura, el tiempo y el flujo de

helio en la desorción, así como la temperatura de crioenfoque en el inyector de muestras.

La optimización de estos factores se realizó comparando las áreas de los picos

obtenidos bajo las mismas condiciones: 20 ml de agua pura, y 20% NaCl, con barras de

10 mm × 0.5 mm PDMD absorbiendo durante 4 h a 1400 rpm.


128

2.2.2. Factores de influencia.

Según Baltussen et al. (1999), los factores que afectan a la extracción del analito en

equilibrio son solamente dos, el coeficiente de reparto octanol-agua (Kow) y el radio de

fase.

En la práctica es mayor el número de factores que afectan a la operación de

extracción: la adición de NaCl, la adición de metanol, el volumen de las muestras, el tipo

de barra agitadora usada, el perfil del equilibrio con el tiempo en la barra y la estabilidad

del analito en la misma; a los que hay que añadir los factores que determinan la

desorción térmica y el crioenfoque de la muestra en el sistema de inyección que son:

temperatura y tiempo de desorción, flujo de desorción, y temperatura de crioenfoque.

El estudio se realizó prestando especial atención a los analitos más polares ya que

es con estos con quienes demuestra una menor eficacia la extracción sobre PDMD

(apolar).

a. Temperatura de desorción (TDS):

Experimentalmente se puede comprobar que la temperatura de desorción no afecta a la calidad del cromatograma, obteniéndose áreas de picos similares; aunque si afecta al sangrado del recubrimiento de PDMS, siendo este sangrado menor a 280ºC por lo cual seleccionamos esta temperatura para la desorción térmica en el TDS.

b. Tiempo de desorción (TDS):

El suministrador de los twister recomienda usar flujos de desorción de 50 ml / min y, usando este flujo para nuestro procedimiento, se llega a la conclusión experimental de que un tiempo de desorción de 6 min es suficiente para extraer todos los compuestos de interés en nuestro caso, incluidos los menos volátiles, por lo que tomamos este tiempo para nuestro procedimiento de análisis (con 4min basta para simacina, lindano a-HCH; para p,p’.DDD, indenopireno, p,p’-DDE y benzo[k]fluoranteno, es necesario los 6 min).

c. Flujo de desorción (PTV):

Se puede comprobar que flujos pequeños de 20 ml / min son insuficientes para una adecuada transferencia de los compuestos menos volátiles como el benzo[k]fluoranteno, y que los flujos excesivos también resultan contraproducentes para el análisis, seguramente por impedir una correcta concentración de los compuestos más volátiles en el PTV. Un flujo de 75 ml/min de He puede resultar un buen compromiso entre ambos.


129

d. Temperatura de crioenfoque (PTV):

Las temperaturas relativamente elevadas como los 60ºC, resultan poco eficientes para atrapar los compuestos más volátiles como pueden ser el HCH y el lindano, que resultan tremendamente perjudicados.

Las temperaturas bajas para el resto de los compuestos dan lugar a áreas de pico inesperadamente pequeñas en el cromatograma, quizás por perdida de efectividad en la transferencia de los analitos atrapados a causa de la condensación del agua o la formación de hielo en el puerto de inyección, siendo el área del pico correspondiente al benzo[k]fluoranteno una de las que disminuye en mayor medida.

Se toma una temperatura de 20ºC como compromiso entre ambos efectos.

e. Adición de NaCl:

Debido a la naturaleza del material absorbente, la eficiencia de extracción será menor para los compuestos polares que para los no polares (Baltussen et al., 1999). La adición de sal al medio provocará un incremento de las fuerzas iónicas, mejorando la extracción de estos compuestos, especialmente para la simacina y la atracina, que pueden alcanzar 5 veces el área original con una adición del 20% de NaCl (Catherine et al., 1992; Eisert y Levsen, 1995; Valor et al., 1997).

En este caso también existe un efecto perjudicial para el otro grupo de sustancias, en este caso las apolares (Beltrán et al., 1998), aunque el uso de cantidades moderadas (5-10% NaCl) pueden incluso favorecer su análisis. Cantidades mayores (20-30%) pueden provocar pérdidas del área cromatográfica que superen ampliamente el 50% del valor original en el caso de indenolpireno, perileno, aldrin y p,p’-DDE.

Elegimos una adición de NaCl hasta el 20% como compromiso entre ambos efectos.

f. Efecto de la adición de metanol y la silanización en la absorción sobre las paredes de vidrio:

Los compuestos muy apolares, principalmente los HHAAPP de 5 ó 6 anillos, son adsorbidos por las paredes del instrumental de vidrio lo que limita en gran medida su recuperación (Baltussen et al., 1999; Heiden et al., 2001; Kicinski, 1993; Ackerman y Hurtubise, 2000; Benjits, 2001), recomendándose la adición de metanol para mantenerlos en solución. Esta adsorción depende del estado de la pared de vidrio, absorbiendo más aquellas dañadas por un limpiado abrasivo o ácidos fuertes.


130

Si bien la reproducibilidad no se ve afectada, no deja de ser un efecto adverso

a evitar, siendo la adición de un 5-10% de metanol una opción que disminuye la adsorción de los HHAAPP de 5 ó 6 anillos entre un 30 y un 100%, pero que disminuye la absorción de los compuestos más polares de un 30 a un 70%. Al ser nuestro análisis multielemental, esta opción resulta no muy recomendable.

Al contrario de lo que se pudiera pensar (Wennrich et al., 2001; Beltrán et al., 1998), la silanización de las paredes de vidrio no afecta a la adsorción una gran cantidad de compuesto como comprobó León et al., (2003). Sin embargo, esté problema afecta especialmente a los HHAAPP, compuestos para los que resulta conveniente la adición de Hiomina hasta una concentración de 10 μg/l (Kolahgar et al., 2002).

g. Volumen de muestra y cantidad de PDMS:

Para los compuestos más polares, principalmente la simacina y en menor grado la atracina, el incrementar el volumen de muestra tiene muy poco efecto sobre la cantidad extraída.

Para compuestos apolares, el aumento del volumen de muestra por encima de los 50 ml tiene un efecto limitado debido a que el tiempo para alcanzar el equilibrio es mayor que el tiempo que se mantiene la agitación. Además, la geometría del recipiente, la longitud del “twister” y el volumen de muestra son tres factores

Figura VII.2

Influencia del Metanol y la Hyamina en la recuperación de 100 ng/l PAH en soluciones acuosas Kolahgar et al. (2002).


131

interrelacionados que también afectan de manera sensible, siendo importante que busquemos la mayor eficiencia de agitado posible.

Elegimos un volumen de muestra de 100 ml y “twisters” de 20 mm × 0.5 mm para el análisis.

h. Tiempo de agitación:

La relación entre extracción y tiempo de agitación depende de la velocidad de agitación y la temperatura a la que se realiza, resultando que a temperatura ambiente, la absorción de los compuestos más volátiles tiene lugar en unas 4-6 horas, siendo necesarias 24 para los menos volátiles. Teniendo en cuenta lo importante de este tiempo para la aplicabilidad del método, seleccionamos 14 horas como compromiso entre ésta y un buen análisis.

Es muy importante que en condiciones donde no se alcance el equilibrio, se controlen los tiempos usados para realizar la absorción en orden de obtener una buena reproducibilidad del experimento.

i. Estabilidad de la muestra extraída:

El proceso de análisis dura unos 58 min, y teniendo en cuenta la posibilidad de introducir 20 muestras en el muestreados automático, hace un tiempo de unas 20 horas. Este tiempo no afecta prácticamente a la respuesta como se puede comprobar al ver que la respuesta tras 30 horas alcanza el 99% de la inicial. Para tiempos de hasta 63 horas si existe una disminución sensible de la recuperación (entre un 10 y un 25%). Estos resultados contradicen los previsibles teóricamente, ya que se podría esperar unas pérdidas de los compuestos más volátiles por evaporación.

j. Velocidad de agitación:

Una mayor velocidad de agitación disminuye el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio, siendo el único inconveniente el obtener una rotación estable. Escogemos 900 rpm como velocidad alta y estable de agitación.


132

VIII. CONCLUSIONES.

En este apartado se muestran las conclusiones alcanzadas en la elaboración de

presente Proyecto Fin de Carrera acerca de los métodos para el análisis de las sustancias

prioritarias orgánicas en la directiva MARCO de aguas.

Para la realización del estudio se han consultado extensa bibliografía, usándose más

de 70 estudios como fuentes directas de datos en la elaboración de los resultados. Como

consecuencia de todo ello se puede llegar a la conclusión de que existe un método que

destaca sobre el resto en el análisis de las sustancias prioritarias, debido principalmente a

su gran campo de aplicación, pero también por su aplicabilidad y alto nivel de

automatización, este método es el ESBA-CG-EM, con el que se consiguen analizar a 29 de

las 40 sustancias prioritarias.

Los compuestos analizados dentro de los requerimientos por el método serían:

Alacloro, Aldrina, Atracina, Clorofenvifos, o,p-DDT, p,p-DDT, Dieldrina, Endosulfán(alfa),

Endrina, α-HCH, β-HCH, δ-HCH, Isodrina, Lindano (γ-HCH), Simacina, Trifluoralina,

Antraceno, Benzo(a)pireno, Benzo(b)fluoranteno, Benzo(g,h,i)perileno,

Benzo(k)fluranteno, Fluoranteno, Indenol(1,2,3-cd)pireno y Naftaleno, , Benceno,

Hexaclorobenceno, , 4-Nonilfenoles, 4-tert-Octilfenol y Pentaclorobenceno.

Tras esto nos quedarían 11 compuestos donde, o bien no se alcanzaba el límite de

detección requerido, o bien no se han encontrado referencias bibliográficas que usaran el

método en el análisis particular de los compuestos.

La técnica de P&T-CG-EM, aunque de elevado coste, sería la que mejor

complementaría el campo de aplicación de ESBA-CG-EM, consiguiendo analizar 7 de los

11 compuestos, 6 de ellos organoclorados volátiles, y siendo probable que pueda analizar

el organoclorado restante (1,1,2-tricloroeteno).

Las sustancias analizadas serían: Cloroformo (Triclorometano), Diclorometano, 1,2-

dicloroetano, Tetracloroeteno, Tetraclorometano, 1,2,4-triclorobenceno y

Hexaclorobutadieno.

Aplicándo ambos métodos, nos quedarían aún cuatro sustancias sin técnica

asignada para su análisis, las cuales pasamos a detallar a continuación:


133

o Isoproturón y diurón tendrían que ser analizadas por CL, técnica por

excelencia para el análisis de estas sustancias según la bibliografía

consultada.

o 1,1,2-tricloroeteno puede ser analizado por EC-CG-DCE.

o Los Cloropirifos no han podido ser analizados por ninguno de los métodos

presentes en la bibliografía dentro de los requisitos marcados, siendo por

tanto el único compuesto para el que no se han alcanzado los obtejivos

marcados.

Ésta sería la combinación más exhaustiva y con mejores posibilidades de análisis de

las sustancias prioritarias orgánicas, si bien existen otras alternativas que sustituyen a

P&T-CG-EM como método complementario de la ESBA-CG-EM:

o EC-CG-ECD: este método analizaría Cloroformo (Triclorometano), 1,2-

dicloroetano, Tetracloroeteno, Tetraclorometano, 1,2,4-triclorobenceno y

1,1,2-tricloroeteno, no alcanzando el límite en el Diclorometano ni

analizando el Hexaclorobutadieno. Su ventaja está en la mayor economía del

equipo.

o IAD-CG-DCE: este método, aunque con un campo de aplicación algo inferior,

es más simple y de más fácil aplicación que los anteriores; Cloroformo

(Triclorometano), 1,2-dicloroetano, Tetracloroeteno, Tetraclorometano, y

1,2,4-triclorobenceno, serían analizados satisfactoriamente, quedando sin

analizar Diclorometano, 1,1,2-tricloroeteno y Hexaclorobutadieno.

Con esto queda establecido para cada Sustancia Prioritaria, un método

recomendado de análisis, en función de las consideraciones tomadas en el Proyecto.


134

IX. ANEXOS


135

ABREVIATURAS

CG Cromatografía Gaseosa CL Cromatografía Líquida DCE Detector de Captura de Electrones DDL Detector de Diodos en Línea DF Detector de Fluorescencia EC Espacio en Cabeza EM Espectrómetro de Masas EM-EM Espectrómetro de Masas en Tándem EFL Extracción en Fase Líquida EFS Extracción en Fase Sóida ESBA Extracción Sobre Barra Agitadora IAD Inyección Directa Acuosa MEFL MicroExtracción en Fase Líquida MEFS MocroExtracción en Fase Sólida P&T Purga y Trampa


136

ANEXO 1.

PESTICIDAS SEMIVOLÁTILES


137

SUSTANCIA PRIORITARIA MÉTODO AUTORES

LÍMITE MÉTODO

(μg/l)

RANGO DE LINEALIDAD

(μg/l) PRECISIÓN TIPO DE MUESTRA REPETIBILIDAD COEFICIENTE DE

DETERMINACIÓNRECUPERACIÓN

(%)

EFS-CG-EM D. De Almeida Azebedo et al. (2000) 0.02 11.76 Agua de río 0.997 91 (n=11)

ESBA-CG-EM M.J. Estefani Morales (2004) 0.00614 0.9997 9

R. Carabias-Martınez et al. (2003) 0.033 20.27 Acuíferos y aguas de superficie 0.9951

MEFS-CG-EM C. Gonçalves y M.F. Alpendurada (2004)4 0.003-0,005 3 11.3 1,4 No Real 6.8 8,4 0.9924

Alacloro

MEFS-CG-EM-EM C. Gonçalves y M.F. Alpendurada (2004) 0.0053 7.01 No Real 5.62 0.998

EFS-CG-EM C. Aguilar et al. (1997) 0.02 0,05-20 Agua corriente 0.9983


MEFL-CG-EM C . Basheer et al. (2002) 0.0593 5-100 2.01 10 Agua de mar artificial 0.9915 105 Aldrina


D. De Almeida Azebedo et al. (2000) 0.009 12.96 Agua de río 0.999 EFS-CG-EM

C. Aguilar et al. (1997) 0.02 0-05-20 Agua corriente 0.9994

EFS-CL-EM S. Rodriguez-Mozaz et al. (2004)12 0.002793 15 6 Agua potable. de río y de acuíferos 0.996 94

EFS-CL-EM-EM R . Bossi et al. (2002) 0.00811 Agua de lluvia 74±3


C. Gonçalves y M.F. Alpendurada (2004)4 0.006-0,010 3 9.4 1,4 No Real 8.9 8,4 0.9934 95 (N=10) MEFS-CG-EM

R. Carabias-Martınez et al. (2003) 0.023 25.67 Acuíferos y aguas de superficie 0.9953

Atracina



MEFS-CG-EM C. Gonçalves y M.F. Alpendurada (2004)4,5 0.009-0,068 3 11.6 1,4 No Real 9.1 8,4 0.9814 Clorofenvifos MEFS-CG-EM-

EM C. Gonçalves y M.F. Alpendurada (2004)5 0.0023 9.71 No Real 8.62 0.997

MEFS-CG-EM C. Gonçalves y M.F. Alpendurada (2004)4 0.001-0,004 3 19.4 1,4 No Real 12.1 8,4 0.9624 105 (n=4)

ESBA-CG-EM M.J. Estefani Morales (2004) 0.00314 0.9994 9 Cloropirifos MEFS-CG-EM-

EM C. Gonçalves y M.F. Alpendurada (2004) 0.001 12.81 No Real 9.92 0.995


138


LÍMITE MÉTODO

(μg/l)

RANGO DE LINEALIDAD

(μg/l) PRECISIÓN TIPO DE MUESTRA REPETIBILIDAD COEFICIENTE DE


(%)

MEFS-CG-DCE R. Boussahel et al. (2002)12 0.005 0.025-40 1.26 No Real 9.68 13 0.987

EFS-CG-EM D. De Almeida Azebedo et al. (2000) 0.004 14.06 Agua de río 0.9999 o.p'-DDT




MEFL-CG-EM C . Basheer et al. (2002) 0.0173 5-100 1.66 10 Agua de mar artificial 0.9958 68 p.p'-DDT


EFS-CG-DCE C. Aguilar et al. (1997) 0.001 0,002-20 Agua corriente 0,9996

EFS-CG-EM C. Aguilar et al. (1997) 0.05 0.10-20 Agua corriente 0.9985


MEFL-CG-EM C . Basheer et al. (2002) 0.0473 5-100 2.32 10 Agua de mar artificial 0.9944 92


Dieldrina


EFS-CL-DDL R. Carabias-Martinez et al. (2004) 0.0303 16 1 Agua de río 0.999

EFS-CL-EM S. Rodriguez-Mozaz et al. (2004)12 0.010953 14 6 Agua potable. de río y de acuíferos 0.999 99 Diurón



EFS-CG-DCE C. Aguilar et al. (1997) 0.0005 0,001-20 Agua corriente 0,9981 74 (n=4)


C. Aguilar et al. (1997) 0.05 0.10-20 Agua corriente 0.9993



α-Endosulfán



139


MEFL-CG-EM C . Basheer et al. (2002) 0.0333 5-100 1.93 10 Agua de mar artificial 0.9995 98 Endrina


EFS-CG-DCE C. Aguilar et al. (1997) 0.0002 0.0005-20 Agua de río 0.9993




α-HCH


EFS-CG-EM D. De Almeida Azebedo et al. (2000) 0.02 13.06 Agua de río 0.9985

ESBA-CG-EM M.J. Estefani Morales (2004) 0.00614 0.9997 9 β-HCH


EFS-CG-DCE C. Aguilar et al. (1997) 0.0002 0,0005-20 Agua corriente 0.9996


C. Aguilar et al. (1997) 0.02 0.05-20 Agua corriente 0.9999 δ-HCH


Isodrina ESBA-CG-EM M.J. Estefani Morales (2004) 0.00814 0.997 9

EFS-CL-DDL R. Carabias-Martinez et al. (2004) 0.0243 11 1 Agua de río 1.000


EFS-CL-EM-EM R . Bossi et al. (2002) 0.00611 Agua de lluvia 79±4 Isoproturón

MEFS-CG-EM R. Carabias-Martınez et al. (2003) 0.023 18.67 Acuíferos y aguas de superficie

EFS-CG-DCE C. Aguilar et al. (1997) 0.0002 0,0005-20 Agua corriente 0,9971





Lindano (γ-HCH)



140








Simacina


EFS-CG-EM D. De Almeida Azebedo et al. (2000) 0.005 6.56 Agua de río 0.9984

ESBA-CG-EM M.J. Estefani Morales (2004) 0.00514 0.9978 9 Trifluoralina

MEFS-CG-EM R. Carabias-Martınez et al. (2003) 0.013 23.87 Acuíferos y aguas de superficie 0.9802

1Precisión intermedia expresada en % R.S.D. a una concentración de 0.1 (μg/l) 7 R.S.D. n=4 a un nivel de concentración de 0.3 μg/l 2Repetibilidad expresada en % R.S.D. (n=9) 8 Repetibilidad expresada en % R.S.D. (n=6) 3 Radio Señal/Ruido = 3 9 Según norma ISO 11095

10 % R.S.D. 4 Los datos:repetibilidad. precisión y coeficiente de determinación son los obetidos usando el MS en modo μSIS 11 L.O.D. calculada como 3 veces la desviación standard del análisis de 5 muestras de 0.040 μg/l

12 Resultados para n=7 y concentraciones de 0.5 μg/l. 5 Analiza los Clorofenvifos Z y E. Datos de los Clorofenvifos E (más desfavorables). 13 C.V. en % 6 % S.D. 14 Los límites de detección según lo indicado en las normas ISO 11843-1 e ISO 11843-2 (n=4)


ANEXO 2.

HIDROCARBUROS POLICÍCLICOS


142

SUSTANCIA PRIORITARIA MÉTODO AUTORES LÍMITE MÉTODO (μg/l) RANGO DE LINEALIDAD (μg/l) TIPO DE MUESTRA REPETIBILIDAD

COEFICIENTE DE

DETERMINACIÓRECUPERACIÓN (%)

M.J. Estefani Morales (2004) 0.002 4 2 6 0,9999 5

B. Kolahgar et al. (2002) 0.0012 1,3 15 2 0,99865 99M.J. Estefani Morales

(2004) 0.008 4 8 6 0,9984 5

B. Kolahgar et al. (2002) 0.0012 1,3 10 2 0,92543 100

EFS-CL-DF R.A. Gimeno et al. (2002) 0.001 1 0,004-1 Agua de Mar >0,9996M.J. Estefani Morales

(2004) 0.014 4 7 6 0,9859 5

B. Kolahgar et al. (2002) 0.0003 1,3 10 2 0,92903 100


(2004) 0.012 4 6 6 0,9875 5

B. Kolahgar et al. (2002) 0.0002 1,3 14 2 0,99848 100


(2004) 0.011 4 10 6 0,9993 5

B. Kolahgar et al. (2002) 0.0005 1,3 6 2 0,97357 100


(2004) 0.003 4 2 6 0,9996 5

B. Kolahgar et al. (2002) 0.0001 1,3 10 2 0,99946 100


(2004) 0.007 4 6 6 0,9948 5

B. Kolahgar et al. (2002) 0.0014 1,3 12 2 0,99894 100


(2004) 0.011 4 7 6 0,9869 5

B. Kolahgar et al. (2002) 0.0005 1,3 12 2 0,98782 83

5 Según norma ISO 11095 6 sr

ESBA-CG-EM

ESBA-CG-EM

ESBA-CG-EM

ESBA-CG-EM

ESBA-CG-EM

ESBA-CG-EM

1 Límite para σ=32Repetibilidad expresada en % para una concentración de 10 ng/l3 Límite estadístico Teórico

Antraceno

Benzo(a)pireno

Benzo(b)fluoranteno

Benzo(g,h,i)perileno

Benzo(k)fluranteno

Fluoranteno

Indenol(1,2,3-cd)pirenoESBA-CG-

EM

ESBA-CG-EM

4 Los límites de detección según lo indicado en las normas ISO 11843-1 e ISO 11843-2 (n=4)

Naftaleno


ANEXO 3.

ORGANOCLORADOS VOLÁTILES


144

SUSTANCIA

PRIORITARIA MÉTODO AUTORES LÍMITE MÉTODO (μg/l) RANGO DE LINEALIDAD (μg/l) TIPO DE MUESTRA REPETIBILIDAD COEFICIENTE DE

DETERMINACIÓN

IAD-CG-DCE L. Wolska et al. (1998) 0.04 1 0,1-1,43 Real 6 3 0,999 2

P&T-CG-DEA N.Campillo et al. (2004) 0,05 0,4-5 No Real 8,5 2 0,9989

P&T-CG-EM Tom Huybrechts et al. (2000)2 0,01974 5 Agua de MarP&T-CG-DCE A. Ekdahl y Katarina Abrahamson (1997) 0.6 x 1012 6

Agua de Mar 3

P&T-CG-EM A. Ekdahl y Katarina Abrahamson (1997) 0.1 x 109 6Agua de Mar 5

EC-CG-DCE Cristina Huertas Olivares (en preparación) 1,62

P&T-CG-EM Tom Huybrechts et al. (2000)2 0.04107 5 Agua de MarP&T-CG-DEA N.Campillo et al. (2004) 0,4 2,5-25,0 No Real 8,5 2 0,9992

P&T-CG-EM A. Ekdahl y Katarina Abrahamson (1997) 1 x 109 6Agua de Mar 1


IAD-CG-DCE L. Wolska et al. (1998) 0.09 1 0,4-6,0 Real 8,9 3 0,998 2

P&T-CG-DEA N.Campillo et al. (2004) 0,06 0,5-10,0 No Real 4,7 2 0,9999

P&T-CG-EM Tom Huybrechts et al. (2000)2 0.00504 5 Agua de Mar




P&T-CG-DCE A. Ekdahl y Katarina Abrahamson (1997) 0.2 x 1012 6Agua de Mar 3






P&T-CG-DCE A. Ekdahl y Katarina Abrahamson (1997) 0.3 x 1012 6Agua de Mar 3




IAD-CG-DCE L. Wolska et al. (1998) 0.24 1 0,23-3,5 Real 13 3 0,993 2



1,1,2- tricloroeteno EC-CG-DCE Cristina Huertas Olivares (en preparación) 0,6

1 Límite para n=32 n=10

4 LOD obtenidos utilizando la norma ISO 11843-2 para el caso más desfavorable (K=1)

5 Límite de detección como el doble del valor medio del blanco6 Límite de detección señal/ruido=37 Límite de detección como la suma del valor medio del blanco y la señal/ruido=3

Tetraclorometano

1,2,4-triclorobenceno

3 RSD a la más baja concentración

Cloroformo (Triclorometano)

1, 2-dicloroetano

Diclorometano

Tetracloroeteno


ANEXO 4.

OTRAS SUSTANCIAS


146


LÍMITE MÉTODO

(μg/l)

TIPO DE MUESTRA REPETIBILIDAD COEFICIENTE DE


(%)

ESBA-CG-EM M.J. Estefani Morales (2004) 1 4 0,9899 5 Benceno

P&T-CG-EM T. Huybrechts et al. (2000) 0,02205 12 Agua de Mar 26 7

ESBA-CG-EM M.J. Estefani Morales (2004) 0,003 4 0,9997 5 Hexaclorobenceno EC-EFS-CG-

EM Y. He et al. (2000) 0,006 1 Acuífero y Agua Corriente

3,8 2,6 92 3,6

ESBA-CG-EM M.J. Estefani Morales (2004) 0,01 4 0,9999 5 Hexaclorobutadieno

P&T-CG-EM T. Huybrechts et al. (2000) 0,00124 8,9 Agua de Mar 12,9 9,10 ESBA-CG-EM M.J. Estefani Morales (2004) 0,013 4 0,9846 5

4-Nonilfenoles EFS-CG-EM H.G. J. Mol et al. (2000) 0,006 1 Muestras

Reales 10 11 69 11

4-tert-Octilfenol ESBA-CG-EM M.J. Estefani Morales (2004) 0,004 4 0,9998 5

ESBA-CG-EM M.J. Estefani Morales (2004) 0,008 4 0,9944 5 Pentaclorobenceno EC-EFS-CG-

EM Y. He et al. (2000) 0,004 1 Acuífero y Agua Corriente

3,8 2,6 99,6 3,6

1 Límite para Señal/Ruido=3 8 Límite calculado como 2 veces el valor medio del Blanco 2 Repetibilidad en % para una concentración de 1000 ng/l 9 Lhexacloro-1,3-butadieno 3 n=3 10 Repetibilidad en % para una concentración de 56,03 ng/l, n=10 y un

periodo de 20 días. 4 Los límites de detección según lo indicado en las normas ISO 11843-1 e ISO 11843-2 (n=4) 11 En % para una concentración de 50-120 ng/l y n=4 5 Según norma ISO 11095 6 Para muestras de acuífero

12 Suma del valor medio del blanco mas la concentración de analito que cumple una relación señal/ruido=3

7 Repetibilidad en % para una concentración de 29,30 ng/l, n=10 y un periodo de 20 días.


X. BIBLIOGRAFÍA.

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