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Universidad Nacional de Cuyo
Facultad de Ciencias Agrarias
VALIDACION E INCERTIDUMBRE DEL METODO
NORMALIZADO PARA ION NITRITO EN AGUA
TESIS DE GRADO
LICENCIATURA EN BROMATOLOGÍA
Autor: Laura Vanesa Savina
Instituto Nacional de Tecnología Industrial Mendoza
Aráoz 1511 Luján de Cuyo
www.inti.gob.ar
Mendoza, 2017
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Estructura de la tesis de grado
La memoria de esta tesis de grado, se estructura en cinco capítulos. En el primer capítulo "
Introducción" se recogen los fundamentos teóricos que se han utilizado en el desarrollo del
presente trabajo. Tras una breve introducción sobre la importancia del control de la
presencia de ión nitrito en agua, se detalla la validación de métodos analíticos y la
elaboración de un programa de validación incluyendo las diferentes etapas para su
creación. Posteriormente se introduce el concepto de incertidumbre y se estudia su
relación con otros parámetros tales como la precisión y exactitud, con la visión de citar la
metodología para la estimación de la incertidumbre y la importancia de su determinación.
También en él se citan los objetivos del presente trabajo y la hipótesis planteada para su
estudio.
En el segundo capítulo " Materiales y métodos para la validación" se presenta la
metodología utilizada para la realización del método seleccionado 4500-NO2- B
colorimétrico citado en el Standard Methods y la elaboración de un procedimiento de
validación mediante etapas definidas que se pueden utilizar como guía para completar con
éxito el procedimiento. En el tercer capítulo " Resultados y discusión para la validación" se
desarrolla la metodología para la evaluación de los parámetros establecidos y la discusión
de los mismos basados en los resultados obtenidos.
El cuarto capítulo " incertidumbre" hace referencia a la importancia de la obtención de la
incertidumbre y el procedimiento para estimarla estadísticamente. En él se citan las etapas
para su obtención, muestra la cuantificación de la incertidumbre relacionada a cada fuente
de error y desarrolla la estimación propiamente dicha de la incertidumbre expandida
asociada al resultado de la concentración de ión nitrito reproducido por el método analítico.
En el quinto y último capítulo se muestran las conclusiones del trabajo con relación al
análisis de los resultados para cada etapa de validación y la conclusión sobre el estudio de
la incertidumbre obtenida, contribuyendo a la confiabilidad de los resultados para que el
método en estudio sea reproducido con éxito.
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VALIDACION E INCERTIDUMBRE DEL METODO
NORMALIZADO PARA ION NITRITO EN AGUA
TESIS DE GRADO
LICENCIATURA EN BROMATOLOGÍA
Laura Vanesa Savina
Darragueira 6581, Luján de Cuyo, Mendoza
Cel.: (0261)156122497
Directora de Tesis: Lic. Analía Santi
Co- Directora: Mgter. Ing Agr. Laura Cánovas
Comité evaluador: Presidente: MSc Adriana Bermejillo
Vocal: Dra Lic. Claudia Amadio
Vocal: MSc Lic. Qca. Liliana De Borbon
Vocal suplente: Lic. Nora Martinengo
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AGRADECIMIENTOS
A mis padres y a mis seres queridos por darme fuerza para luchar por el logro de este
objetivo, por el apoyo incondicional que me brindaron a lo largo de toda mi carrera y mis
proyectos.
A mis amigos y compañeros de trabajo que me acompañaron y me alentaron para que
pudiera terminar el texto final.
A la Lic. Analía Santi y Mgter. Ing. Agr. Laura Cánovas quienes me brindaron su tiempo su
amistad y sabiduría, su apoyo fue fundamental en la culminación de la investigación.
Al Ing. Juan Carlos Najul por permitirme difundir los conocimientos obtenidos en el
laboratorio de Servicios y ensayos de INTI Mendoza y permitirme utilizar sus instalaciones,
equipos e insumos.
A todos aquellas personas que en alguna forma participaron en mis estudios y me
enseñaron con su ejemplo y cariño.
Y a Dios que me dio la fortaleza y el empuje para terminar mi carrera.
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RESUMEN
El ion nitrito es una sustancia inorgánica que puede estar presente de forma natural o por
contaminación en aguas destinada para consumo humano. Es potencialmente peligroso
para la salud, afectando fundamentalmente a los lactantes. El Código Alimentario
Argentino, establece como límite máximo la concentración de 1 mg/L-1 NO2-, para no
causar efecto nocivo sobre el hombre, el presente trabajo tiene especial interés en la
validación y estimación de la incertidumbre relacionada a la técnica analítica, para la
determinación de su concentración y así obtener resultados confiables para su
fiscalización.
La determinación química oficial analizada es la colorimétrica 4500-NO2- - B, normalizada
en el Standard Methods, basada en la espectrofotometría uv-visible, para aguas no
coloreadas. El ion nitrito se determina por la formación de un colorante azo púrpura rojizo,
producido a pH 2,0 a 2,5 por acoplamiento de sulfamida diazotizada con clorhidrato de N-
(1naftil)-etilendiamina (diclorhidrato de NED), para concentraciones de nitrito entre 0,084 y
0,657 mgL--1.
Los parámetros que se evaluaron fueron: linealidad, límite de cuantificación, límite de
detección, exactitud y precisión. Los valores obtenidos cumplieron con los criterios de
aceptación establecidos por las normativas y guías de referencia para la validación de
técnicas analíticas. Se estimó la incertidumbre combinada y expandida para la metodología
utilizada.
Con esto se puede concluir que se obtuvo un método confiable para controlar la
concentración de ion nitrito en agua y así poder garantizar la seguridad alimentaria de los
consumidores.
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INDICE Capítulo I: Introducción
1. Introducción
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1.1 Importancia de la determinación de ión nitrito
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1.2 Validación 5 1.2.1 Elección y justificación del método 5 1.2.2 Identificación y descripción del procedimiento de ensayo 9 1.2.3 Definición de los parámetros o criterios de calidad a cumplir 1.2.4 Evaluación y aceptación de los parámetros o criterios establecidos 1.3 Incertidumbre 1.3.1 Error e incertidumbre 1.3.2 La incertidumbre de medida 1.3.3 Incertidumbre y exactitud 1.3.4 Incertidumbre y precisión 1.3.5 Proceso de estimación de la incertidumbre de medida 1.4 Objetivos de la tesis de grado 1.5 Hipótesis del trabajo
10 12
12 13 13 15 16 16
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Capítulo II: Materiales y métodos para la validación 2. Planificación y desarrollo del procedimiento de validación
22 2.1 Introducción
22
2.2 Planificación para el procedimiento de validación 22 2.3 Desarrollo del procedimiento de validación 23 2.3.1 Materiales y método de ensayo 23 2.3.2 Definición de los parámetros de validación Capítulo III: Resultados y discusión para la validación
31
3. Evaluación de los parámetros establecido
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3.1 Determinación de la linealidad 37 3.2 Determinación de el límite de cuantificación 39 3.3 Determinación de el límite de detección 40 3.4 Determinación de la precisión del método 40 3.5 Determinación de la exactitud del método 41
Capítulo IV: Incertidumbre
4. Introducción 44
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4.1 Estimación de la incertidumbre 44 4.1.1 Etapa I: Especificación del mesurando 45 4.1.2 Etapa II: Identificación de las fuentes de incertidumbre 45 4.1.3 Etapa III: Cuantificación de la incertidumbre 47 4.1.4 Etapa IV: Cálculo de la incertidumbre combinada y expandida 55
Capítulo V: Conclusiones 5. Conclusión 6. Bibliografía 7. Anexo I 8. Anexo II
58
59
62 73
8
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Capítulo I: Introducción
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1. Introducción
1.1 Importancia de la determinación de nitrito
El estudio de la importancia del ión nitrito en la naturaleza, sus posibles fuentes y toxicidad,
fueron de especial interés para la realización del presente trabajo de tesis. La relación del
ión con la salud humana motivó la necesidad de poder determinarlo químicamente de
forma confiable y segura.
El nitrito es una especie química inorgánica que puede estar presente en las aguas de
forma natural como consecuencia de la oxidación del amoníaco, como resultado de la
reducción del ión nitrato o por la descomposición natural microbiana de materiales
nitrogenados orgánicos, tales como las proteínas presentes en plantas y animales
(GUIFFRE, 2001). Otras fuentes no naturales del ión nitrito son las originadas a partir de la
actividad humana como el uso de fertilizantes nitrogenados y desechos municipales e
industriales. Estas prácticas hacen que en el planeta, la fijación de nitrógeno por actividad
humana sea mayor que la de los procesos naturales (GUIFFRE, 2003). Las plantas
aprovechan únicamente un 50% del nitrógeno aportado en el abonado orgánico, esto
supone que el exceso de nitrógeno se pierde, ya que es lavado del suelo por el agua y se
filtrará al subsuelo, siendo así arrastrado hacia los acuíferos, ríos y embalses
contaminando las aguas destinadas a consumo humano (GONZALLES, 2011).
Figura 1: Contaminación por fertilizantes un serio problema ambiental. (Monografía. Ing. M.Sc. Fernando S.
González Huiman)
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Otra fuente de contaminación son los acuíferos construidos en la agricultura debido a que
el material de relleno utilizado no cumple con la función de impermeabilidad; la humedad
del agua en tránsito permite disolver agentes contaminantes de fosas sépticas y campos
de cultivos que luego por lixiviación y drenaje van a contaminar otras fuentes de agua
(FERNANDEZ, 2006). En la figura 2 podemos observar la secuencia de contaminación de
un acuífero.
La presencia del ión nitrito se debe considerar como un indicio fundado de una posible
contaminación reciente dada su inestabilidad y su toxicidad.
Figura 2: Contaminación de acuíferos. (Santa Cruz y Silva, 1999)
El ión nitrito es potencialmente peligroso para la salud humana, por ello es importante
conocer los efectos biológicos y la toxicocinética de los mismos, y así poder prevenir su
ingesta.
En el organismo humano, de todos los nitritos ingeridos, solo una fracción es absorbida
mediante transporte activo en la parte superior del intestino delgado y otra por el conducto
gastrointestinal (SILVESTE, 1995).
La biotransformación del ión nitrato a nitrito, se efectúa por medio de una enzima llamada
nitrato reductasa. El ión nitrito generado se distribuye rápidamente por los tejidos y
reacciona con la hemoglobina de la sangre (Hb2+) para formar metahemoglobina (Hb3+). La
metahemoglobina, es la hemoglobina cuyo átomo de hierro ha sido oxidado del estado
ferroso al férrico, perdiendo la capacidad de fijar oxígeno necesario para la respiración
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tisular, provocando efectos nocivos cardiovasculares y respiratorios. Esta manifestación
tóxica se la denomina clínicamente metahemoglobinemia, afecta fundamentalmente a los
lactantes, debido a que su contenido estomacal es poco ácido, lo que facilita la reducción
del ión nitrato a nitrito por las bacterias. Teniendo en cuenta que existen estudios recientes
donde se comprobó que el ión nitrito se bioacumula en tejidos como la leche humana
sumado a lo anteriormente mencionado se considera a los lactantes como grupo
vulnerable. A continuación la figura 3 representa la oxidación de la hemoglobina, la cual se
considera una reacción toxica para el organismo humano (LINDER, 1995).
Figura 3: Oxidación del ión ferroso (Linder Hernest ,1995)
Existen varios mecanismos que contrarrestan la oxidación de la hemoglobina; de ellos el
más importante es el enzimático, llevado a cabo por dos enzimas: NADH deshidrogenasa I
o enzima de Kiese, y la NADH deshidrogenasa II, que constituye un componente de
importancia secundaria. Ambas enzimas requieren la formación de NADH en el ciclo
glucolítico; el mecanismo enzimático anteriormente explicado queda representado por la
siguiente reacción.
Hb3+ + NADH Hb2+ + NAD
Cuando es excedida la capacidad del mecanismo enzimático existe otro proceso
importante de reducción que es no enzimático, el cual es realizado por sustancias
presentes normalmente en las sangre, como el glutatión y el ácido ascórbico. Este
mecanismo resulta importante.
En el caso de los lactantes, carecen tanto de mecanismo no enzimático como de un
sistema enzimático NADH metahemoglobina reductasa desarrollado; por lo tanto ellos no
son capaces de contrarrestar la oxidación del ion ferroso.
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Por lo mencionado anteriormente, es importante contar en nuestro medio con todas las
herramientas analíticas validadas que permitan determinar de forma segura la
concentración de ión nitrito en alimentos como el agua, de manera de comprobar el
cumplimiento de las normativas vigentes, permitiendo un mayor control sobre las fuentes
hídricas y garantizar la seguridad alimentaria de los consumidores (ANAYA, 1999).
1.2 Validación
El analista debe estar capacitado para validar los métodos químicos empleados y estimar
la incertidumbre de los resultados de modo que sean ampliamente reconocidos,
consistentes y de fácil interpretación. El proceso de validación consiste en establecer
previamente requisitos que permiten definir los parámetros o criterios de calidad que debe
cumplir un método para resolver un problema particular. Estos deben ser verificados,
documentados y evaluados (FABRO, 2015).
Para que el proceso de validación se lleve a cabo, es necesario elaborar un programa para
en el cual se debe planificar, en primer lugar, la elección de la metodología a utilizar y
posteriormente evaluar y cumplir con una serie de etapas que serán detalladas a
continuación (QUATTROCCH, 2015).
1.2.1 Elección y justificación del método en estudio
De acuerdo a la naturaleza, a la toxicidad y a la factibilidad de encontrar el ión nitrito en
nuestros reservorios de agua, el Código Alimentario Argentino establece en el capítulo XII,
art. 982, el valor admisible para la concentración del mismo, especificando como límite
máximo 0,1 mgL-1 NO2-. Debido al efecto nocivo del ión nitrito sobre la salud humana, el
presente trabajo tiene especial interés en la validación de la técnica, para la determinación
de su concentración y así obtener resultados confiables para su fiscalización. Para ello se
realizó la búsqueda de la metodología más apropiada a dicho fin. La determinación
química oficial seleccionada es la normalizada en el Standard Methods, basada en la
espectrofotometría uv-visible.
La espectrofotometría uv-visible es una técnica analítica que permite determinar la
concentración de un compuesto en solución. Para hacer este tipo de medidas se emplea
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un espectrofotómetro en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que
pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma.
Las longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber, dependen de
la estructura atómica y de las condiciones del medio tales como: pH, temperatura, fuerza
iónica y constante dieléctrica entre otras.
Cuando la luz es absorbida por una molécula, se origina un salto desde un estado
energético basal o fundamental “E1” a un estado de mayor energía (estado excitado) “E2”
liberando finalmente la energía absorbida hasta el estado inicial. Cada molécula tiene una
serie de estados excitados que la distingue del resto. Esto se representa en la figura 4
Figura 4: Diagrama de niveles de energía en una molécula. (https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/practicasgenerales.htm)
A continuación se puede observar la ecuación que responde a la excitación.
E (E2-E1) = h=h c λ
h = Constante de Planck= 6,63.10-34 Js
= Frecuencia de la radiación= c/ λ
c = velocidad de la luz= 3.1010 cm.s-1
Debido a la existencia de diferentes tipos de energía, tales como la de los electrones en sí,
la de los movimientos vibracionales de las moléculas y la de la rotación de las mismas,
estas pueden interaccionar con radiaciones electromagnéticas de un rango muy amplio de
longitudes de onda, dando lugar a distintos tipos de espectroscopias según las diferentes
regiones. En la figura 5 se puede observar las diferentes longitudes de ondas del espectro.
Estado basal E1
Estado excitado E2
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Figura 5: Espectro electromagnético. (https://www.espectrometria.com/espectro_electromagntico).
Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda e intensidad incide
perpendicularmente sobre una disolución de un compuesto químico que absorbe luz, o de
un cromóforo, éste absorberá una parte de la radiación incidente (Ia) y dejará pasar el
resto (It), de forma que se cumple que la radiación de luz incidente (Io) es igual a la
absorbida ( la) por el compuesto químico más la transmitida (It) por el mismo.
A continuación se muestra la figura 6 la representación de la incidencia de un rayo de luz
sobre la solución química.
Io = Ia + It
Figura 6: Incidencia de un rayo de luz sobre una disolución química a determinada longitud de onda.
(https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/practicasgenerales.htm)
La Transmitancia (T) de una sustancia en solución es la relación entre la cantidad de luz
transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra (It), y la cantidad de
luz que incidió sobre ella (Io); se representa normalmente en porcentaje es decir que:
% T = ( It/Io )x 100
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La relación entre %T y la concentración no es lineal, pero asume una relación logarítmica
inversa.
La Absorbancia (A) es un concepto más relacionado con la muestra puesto que nos indica
la cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T; es decir:
A = log 1/T = -log T = -log It/ Io.
Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales (Io = It), la transmitancia es del
100% e indica que la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda, y entonces
A vale log 1 = 0.
La cantidad de luz absorbida dependerá de la distancia que atraviesa la luz, la solución del
cromóforo y de la concentración de éste. La ley de Lambert-Beer expresa la relación entre
absorbancia de luz monocromática (de longitud de onda fija) y concentración de un
cromóforo en solución:
A l c
La ecuación está integrada por, "" la absortividad molar o coeficiente de extinción molar;
este representa un valor constante para cada sustancia, el valor de "l" representa el
espesor de la cubeta y "c" es la concentración molar de la muestra que es directamente
proporcional a la absorbancia A.
Existen sin embargo distintos factores que afectan al cumplimiento de la ley de Lambert-
Beer, especialmente a concentraciones elevadas. Por ello, antes de proceder al análisis de
una muestra es preciso comprobar experimentalmente el rango de concentraciones en que
dicha ley se cumple, obteniendo la curva de calibración que relaciona las absorbancias con
las concentraciones. La medición de absorbancia de la luz por las moléculas se realiza en
equipos llamados espectrofotómetros. Estos pueden variar en diseño, en especial con la
incorporación de ordenadores para el análisis de datos; hay espectrofotómetros de un solo
haz (con una sola celdilla para alojar la cubeta con la muestra) y de doble haz (con dos
celdillas para dos cubetas); todos ellos constan de una fuente de energía radiante, es decir
de una lámpara de deuterio o tungsteno entre otros.
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En la selección de las radiaciones de una determinada longitud de onda se usa un
monocromador que consta de un sistema de filtros, prismas y redes de difracción. Para
convertir las señales luminosas en señales eléctricas se utiliza un detector de luz con un
amplificador de señal, la misma es registrada y traducida mediante un software a un valor
o resultado (U.C.O, 2017).
De forma más sencilla y mediante un esquema la figura 7 muestra las partes de un
espectrofotómetro estándar.
Figura 7: Espectrofotómetro tipo y partes del mismo. (https://www.elespectrofotometro.com/partes)
Para conocer el funcionamiento del equipo, es necesario verificar el instrumento mediante
mediciones de control, en un período de tiempo relacionado a la actividad del mismo. Estas
determinaciones específicas nos permiten asegurar el funcionamiento adecuado, siempre
que estos cumplan con los parámetros de fábrica y la comparación frente a materiales de
referencia certificados. Los controles del equipo deben quedar documentados para
asegurar la trazabilidad de los resultados de los análisis realizados en el espectrofotómetro
(ISO 9001:2008).
1.2.2 Identificación y descripción del procedimiento de ensayo
El analista debe redactar un procedimiento de ensayo bajo las condiciones del sistema de
gestión de calidad, el cual establezca los límites de aplicación y los objetivos del mismo,
para asegurar que la técnica puede ser realizada por cualquier analista (FABRO, 2015).
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1.2.3 Definición de parámetros o criterios de calidad a cumplir
Validar un método consiste en verificar y documentar determinados requisitos previamente
establecidos para poder resolver el problema analítico en particular. Estos requisitos son
los que definen los parámetros o criterios de calidad que se deben cumplir.
Estos pueden ser de tipo estadístico o bien de tipo operativo /económico. Para el presente
proyecto de validación se decidió utilizar: la linealidad, los límites de cuantificación y
detección, el rango de trabajo, la repetibilidad, la precisión intermedia y exactitud. A
continuación se detallan de acuerdo al orden establecido en el proyecto de validación
(MOLINA, 2012).
En primer lugar se define la linealidad, que es la relación entre la concentración del analito
y la respuesta del método instrumental. Para su determinación se prepara una serie de
diluciones de concentración conocida que corresponden al estándar del analito a analizar;
éstas varían dentro del rango del método. Se deben leer al menos por duplicado cada
concentración para dar origen a la curva de calibración. Para evaluar la linealidad de la
curva de calibración se debe analizar el coeficiente de correlación simple lineal (r), que
representa la medida de asociación lineal entre las variables x e y, y el coeficiente de
determinación (R2), que mide la bondad del ajuste realizado y permite decidir si el ajuste
lineal es suficiente o se debe buscar otro modelo alternativo.
Una vez realizada la evaluación de asociación se debe determinar la curva de regresión
lineal, y = b x + a; esta ecuación permite conocer la pendiente de la curva y su ordenada al
origen (QUATTROCCHI, 2015)
A la concentración mínima que puede reproducir el método de ensayo con un nivel
aceptable de exactitud y precisión, se la denomina límite de cuantificación; éste se debe
determinar midiendo diez estándares independientes del analito a analizar, que
correspondan al primer punto de la curva, para lo cual hay que tener en cuenta que el
máximo valor legislado del analito a ensayar esté incluido en el límite fijado. Sin embargo
para el límite de detección se considera la menor magnitud que puede ser detectada como
respuesta del método instrumental, pero no necesariamente cuantificada con un valor
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exacto. Se determina diluyendo al cincuenta por ciento la concentración establecida para el
límite de cuantificación.
Las series de datos obtenidos por la aplicación del método a validar deben permitir
establecer los parámetros de repetitividad o precisión intermedia, considerando todo el
rango de trabajo definido por el método; éste representa al intervalo de concentración en el
que puede obtenerse la exactitud y la precisión adecuadas al objetivo del método; éste se
confirma una vez obtenidos los resultados después de haberse llevado a cabo la validación
(O.A.A, 2013).
Cuando el método se desarrolla bajo las mismas condiciones, utilizando la misma muestra,
analizada por el mismo analista, en el mismo laboratorio, con los mismos equipos y
reactivos durante una misma sesión de trabajo en un período corto, se dice que se trabaja
bajo las mismas condiciones de repetitividad, para lo cual se realizan una serie de lecturas
repetidas de la mismas concentración del analito y el estadístico que caracteriza a este
estudio es la desviación estándar o en algunos casos el coeficiente de variabilidad. Sin
embargo, si las determinaciones se realizan sobre la misma muestra homogénea pero en
condiciones que aporten variabilidad como: diferentes días, materiales de vidrio y analistas
se pueden obtener, a partir de ello, datos estadísticos de desviación estándar o coeficiente
de variación que me permitan evaluar la precisión intermedia.
La exactitud es el parámetro que indica la capacidad del método analítico para obtener
resultados lo más próximos posibles al valor verdadero. Este parámetro refleja el error
sistemático o la tendencia a él, a diferencia de la precisión que refleja el error aleatorio.
La prueba de t-Student es una herramienta estadística que permite evaluar si la exactitud
cumple con el criterio de aceptación establecido en el programa de validación. Existen
distintos diseños para definir experimentalmente la exactitud del método a ensayar; es
habitual enriquecer por triplicado la muestra con una concentración conocida del analito y
recuperar dicha concentración aplicando la curva de calibración del método (FABRO,
2015)
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1.2.4 Evaluación y aceptación de los parámetros de validación según los criterios de
conformidad establecidos
Es necesario establecer los criterios de conformidad cuando se elabora un programa de
validación; éstos se definen como el valor o requisito asignado para establecer el
cumplimiento de los parámetros de calidad definidos con anterioridad. La decisión de la
aceptación o no de dichos parámetros se basa en la evaluación de los mismos a partir de
herramientas estadísticas, de estudios bibliográficos y/o de normativas vigentes y en
algunos casos en el historial de prácticas de los laboratorios especializados en métodos
de validación. Existen ejemplos que sirven de guía tales como la teoría de Kolthoff y
Hortwitz, que reportan tablas para establecer el coeficiente de variación máximo aceptable
de un método analítico en función del porcentaje del analito en la muestra.
Para el estudio de la precisión intermedia, se analiza el coeficiente de variación que debe
ser igual o mayor que el obtenido en el estudio de repetibilidad, ya que esta práctica
presenta menor fuente de error para la misma cantidad o concentración del analito. Es
importante una vez definidos exhaustivamente todos los parámetros o criterios de calidad
en el programa de validación incluir de forma clara el cumplimiento de éstos a través de los
criterios de aceptación (FABRO, 2015).
1.3 Incertidumbre
La incertidumbre es el parámetro asociado al resultado de una medida que caracteriza la
dispersión de los valores que podrían razonablemente ser atribuidos al mesurando.
En análisis químico, el mesurando se refiere al analito o a la propiedad que estamos
determinando, por lo tanto éste debe interpretarse correctamente para considerar todas las
fuentes de incertidumbre asociadas al análisis.
Hoy en día cada vez es más importante que los resultados analíticos vayan acompañados
de su incertidumbre, debido a que el resultado de una medición es sólo una aproximación
o estimación del valor verdadero y está completo cuando va acompañado por la
incertidumbre de esta estimación. El conocimiento de ésta implica un aumento de la
confianza en la validez del resultado de una medición (MAROTO, 2002).
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1.3.1 Error e incertidumbre
El error y la incertidumbre están relacionados entre sí, ya que la incertidumbre debe
considerar todas las posibles fuentes de error del proceso de medida; pero hay diferencias
importantes entre ambos conceptos. Si diferentes analistas realizan una misma
determinación analítica para una muestra de forma repetida, cometen un error diferente
cada uno de ellos en cada repetición realizada. Sin embargo, la incertidumbre de todos los
resultados obtenidos es siempre la misma ya que se utiliza el mismo método analítico. Por
lo tanto, si la incertidumbre se ha calculado para un método puntual y un tipo de muestra
determinado, todos los resultados obtenidos para todas las muestras de ese tipo, que se
analicen con ese método, tendrán la misma incertidumbre pero no tienen por qué tener el
mismo error asociado. Existen diferentes componentes de errores, que se pueden cometer
en el momento de la validación del método seleccionado. Los errores aleatorios se originan
por variaciones impredecibles de las variables estudiadas; estos efectos no se pueden
corregir pero sí disminuir incrementando el número de observaciones. Sin embargo los
errores sistemáticos, como equipos mal calibrados o como vidrios dilatados por
calentamiento entre otros, son parte del error total que permanece más o menos constante
a lo largo de una serie de mediciones del mismo mensurando; estos son independientes
del número de mediciones, pero se pueden corregir si se conoce su efecto sobre el
resultado de la medición (FABRO, 2015).
1.3.2 La incertidumbre de medida
La incertidumbre se centra en el rango de valores que el analista cree que puede ser
atribuido razonablemente al mesurando.
Al estimar la incertidumbre global puede ser necesario tomar cada fuente de incertidumbre
y tratarla de forma separada para obtener la contribución de esa fuente particular. Cada
una de las contribuciones separadas a la incertidumbre es un componente y existen dos
tipos de evaluaciones para su estudio, la tipo A y la tipo B.
La tipo A se relaciona con los errores aleatorios y pueden ser evaluados a partir de
distribuciones estadísticas de serie de resultados, que pueden caracterizarse por
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desviaciones estándar (EURACHEM/CITAC, 2016). La tipo B, se evalúa mediante un
procedimiento distinto al análisis estadístico de una serie de observaciones. En este caso,
la estimación de la incertidumbre se basa en otros conocimientos científicos, tales como
fuentes de información externa u obtenida por experiencia; éstas pueden ser: certificados
de calibración, manuales del instrumento de medición, especificaciones de fabricación del
instrumento, Normas o literatura, valores de mediciones anteriores o conocimiento sobre
las características o el comportamiento del sistema de medición, entre otros (FABRO,
2015).
Si se realiza la estimación mediante la propagación de errores con base en las
incertidumbres individuales, y se suman cuadráticamente estamos calculando la
incertidumbre combinada "µc(y)", si la base de las incertidumbres individuales es la
estándar, se la denomina incertidumbre combinada estándar. Sin embargo, para la mayor
parte de los propósitos en química analítica se debe utilizar la incertidumbre expandida "U",
la cual proporciona un intervalo en el que se cree que está el valor del mensurando con un
mayor nivel de confianza. La incertidumbre expandida se obtiene multiplicando la
incertidumbre estándar combinada o incertidumbre combinada, por un factor de cobertura
k. La elección del factor k se basa en el nivel de confianza que se desea. Para un nivel
aproximado de confianza del 95%, k es igual a 2 (EURACHEM/CITAC, 2016).
Para calcular la incertidumbre estándar a partir de la expandida, de un componente como
fuente de incertidumbre individual, se debe adoptar una distribución de probabilidad. Se
puede asociar a una distribución normal cuando los resultados de una medición repetida,
afectada por una o más magnitudes de influencia aleatoria, siguen generalmente una
buena aproximación a una distribución normal; como el caso de los certificados de
calibración que presentan valores de incertidumbre expandida "U". Para obtener a partir de
ellos la incertidumbre estándar se debe dividir "U" por el factor de cobertura k. Sin
embargo, si se asocia a una distribución rectangular responde a que cada valor de un
intervalo dado tiene la misma probabilidad de ocurrencia. La función de probabilidad es
constante en este intervalo, entonces para obtener la incertidumbre estándar se debe
dividir "U" por √3. Cuando hay evidencia de que la probabilidad es más alta para los
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valores del centro del intervalo y se reduce hacia los límites, es adecuado basar la
estimación de la incertidumbre en una distribución triangular. Para obtener la incertidumbre
estándar a partir de la incertidumbre expandida "U" hay que dividir "U" por √6 (FABRO,
2015).
A continuación la figura 8 representa las diferentes distribuciones de probabilidad
anteriormente detalladas.
Figura 8: Distribución de probabilidad. (Mabel Fabro, 2015).
Para el análisis de la incertidumbre se deben evaluar las distintas contribuciones a la
misma, se identifican todas las posibles fuentes de incertidumbre asociadas con el proceso
de medición, incluido el estudio de los resultados de precisión y exactitud o veracidad.
1.3.3 Incertidumbre y exactitud
La exactitud de un resultado se define como el grado de concordancia entre el valor medio
medido, obtenido a partir de una serie de resultados de ensayo, y un valor de referencia
aceptado. La incertidumbre y la exactitud están muy relacionadas entre sí ya que, si no se
ha verificado la exactitud de un resultado, no se puede garantizar que se hayan corregido
todos los posibles errores sistemáticos del mismo y, por lo tanto, es imposible asegurar
que el intervalo valor estimado ± Incertidumbre contenga al valor considerado verdadero
con una determinada probabilidad (FABRO, 2015).
Por lo tanto, al expresar un resultado analítico como valor estimado ± Incertidumbre, el
analista debería verificar que el Valor estimado no contenga un error sistemático.
16
1.3.4 Incertidumbre y precisión
La precisión intermedia de una serie de resultados tiene en cuenta la variabilidad de los
mismos debido a las condiciones en que se hace el análisis, tales como día de ensayo,
ensayos por duplicados, diferentes analistas, o como la calibración del equipo instrumental.
Sin embargo, la incertidumbre no solamente incluye esta variabilidad sino que también
debe incluir el error asociado a la estimación de los errores sistemáticos. Esto hace que la
incertidumbre siempre sea mayor que la variabilidad de los resultados debida a la precisión
intermedia. Es decir que cuanto más preciso es el método menor es la incertidumbre de los
resultados (MAROTO, 2002).
1.3.5 Proceso de estimación de la incertidumbre de medida
Para obtener la estimación de la incertidumbre de medida asociada a un resultado, existen
una serie de pasos relacionados con los datos obtenidos durante el estudio de la
validación. Hay diferentes guías que se pueden consultar para calcular la incertidumbre,
una de ellas es la Guía para la Expresión de Incertidumbres de la Medición (G.U.M.) que
muestra un diagrama de varios pasos a seguir para completar el proceso de estimación y
otra es la Adecuación al uso de los métodos analíticos (EURACHEM/CITAC) que cita un
esquema que consta una serie de ítems que están agrupados en cuatro etapas. Esta
última es una guía práctica y clara; por lo tanto se eligió de referencia para el presente
trabajo. Las etapas se detallan a continuación.
1.3.5.1 Etapa I: Especificación del mesurando
En esta etapa se debe escribir una declaración sobre qué es lo que se va a medir,
incluyendo la relación entre el mesurando y las magnitudes de entradas. La especificación
del mesurando requiere una declaración clara y sin ambigüedades de lo que se va a medir,
y una expresión cuantitativa que relacione el valor del mesurando con los parámetros de
los que depende. Se debe tener en cuenta el tipo particular de magnitud que se va a medir,
el material que se va a analizar y, si es necesario, adjuntar información adicional sobre la
posición en el objeto de ensayo.
17
1.3.5.2 Etapa II: Identificación de las fuentes de incertidumbre
En esta etapa se debe realizar una exhaustiva lista de fuentes de incertidumbre. Esto
incluirá las fuentes que contribuyen a la incertidumbre de los parámetros asociados a su
valor especificado en la etapa I; pero debe incluir otras fuentes no relacionadas al
mesurando como por ejemplo tiempo y temperatura. El diagrama de causa y efecto o
llamado también espina de pescado es una forma de listar las fuentes de incertidumbre;
este muestra cómo se relacionan entre ellas e indica su influencia sobre la incertidumbre
del resultado. A menudo se utilizan en la evaluación de las necesidades para ayudar a
ilustrar y/o reflejar las relaciones existentes entre varias causas potenciales (o reales) de
un problema de rendimiento. Los diagramas permiten un análisis en profundidad, evitando
así dejar de lado las posibles causas de una necesidad (o sea las diferencias entre
resultados esperados y reales). Esta técnica es fácil de aplicar y crea una representación
visual clara sobre las categorías de causas y necesidades. La ventaja que presenta la
aplicación del diagramas de causa y efecto sobre la incertidumbre es la de poder visualizar
de forma clara todas las posibles fuentes de error que contribuyen con la misma, sin dejar
pasar a ninguna de ellas por alto. Sin embargo, para el caso en el que se presente un
número mayor de fuentes de incertidumbre en el análisis de la estimación, este diagrama
puede resultar poco claro y se debe tomar la decisión de utilizar otro sistema de
identificación de fuentes de incertidumbres más apropiado (MAROTO, 2002).
Es también habitual en química analítica considerar incertidumbres asociadas con
elementos del desempeño global del método, tales como la precisión y la exactitud. Otras
fuentes típicas que se consideran son el tipo de muestreo, las condiciones de
almacenamiento, los efectos instrumentales, la pureza de los reactivos, el efecto de las
muestras y el modelo de línea recta de una curva de calibración, entre otros
(EURACHEM/CITAC, 2016).
1.3.5.3 Etapa III: Cuantificación de la incertidumbre
Una vez identificadas las fuentes de incertidumbre, el siguiente paso es la cuantificación de
la incertidumbre asociada a ellas; se debe evaluar las mismas de forma individual y
18
finalmente combinar, o se debe determinar directamente la contribución combinada a la
incertidumbre de los resultados, usando los datos proporcionados por el método en
estudio.
Para evaluar la incertidumbre es importante saber que no todos los componentes tendrán
una contribución significativa a la combinada; en la práctica es probable que solo un
pequeño número de ellos la tengan. Se debe hacer una evaluación de la contribución
preliminar de cada componente o de la combinación de ellos y los que no sean
significativos deben ser eliminados. (FABRO, 2015).
1.3.5.4 Etapa IV: Cálculo de la incertidumbre combinada y expandida
Antes de combinar todas las contribuciones de la incertidumbre, las mismas deben estar
expresadas como incertidumbres estándar. Para calcular la incertidumbre estándar
combinada, la forma del término diferencial de la expresión matemática general determina
si las fuentes de incertidumbres son combinadas como varianza simple o varianza relativa.
Si el modelo de ecuación contiene solo adiciones o substracciones, se deben usar las
incertidumbres absolutas o estándar y combinarlas como varianza simple.
La incertidumbre absoluta " Δ A" se define como, dada una medida experimental de una
magnitud, a, y una incertidumbre absoluta Δ A, el valor verdadero, A, debe estar contenido
con razonable certeza, es decir con mayor probabilidad, dentro del siguiente intervalo
a + Δ A ≥ A ≤ a - Δ A.
Sin embargo, si la ecuación contiene sólo multiplicaciones o divisiones, se deben usar las
incertidumbres relativas y combinarlas como desviaciones estándares relativas.
La incertidumbre relativa " ur" es el cociente entre la incertidumbre absoluta y la unidad de
medida, a; ésta es un valor adimensional que nos informa de la precisión de la medida,
19
ur = Δ A/a
Si el modelo de ecuación contiene combinaciones de sumas y/o diferencias, productos y/o
cocientes, la incertidumbre relativa se calcula combinando las reglas anteriormente
mencionadas.
Se puede considerar que los valores de las incertidumbres que son menores a 1/3 de la
total, no contribuyen significativamente a la combinada y pueden ser descartadas.
En la etapa final se debe multiplicar la incertidumbre estándar combinada por el factor de
cobertura escogido para obtener la incertidumbre expandida, la cual se requiere para
proporcionar un intervalo que se espere que comprenda una gran fracción de la
distribución de valores y estos puedan ser atribuidos razonablemente al mesurando.
El avance de la metrología analítica y de los sistemas de calidad en los últimos años está
disminuyendo el riesgo del mal uso del concepto de incertidumbre.
Los químicos están siendo apremiados a reportar el cálculo de la incertidumbre de sus
mediciones. La misma debe ser expresada de manera simple, clara y de forma
internacionalmente aceptada (G.U.M, 2000).
1.4 Objetivo de la tesis de grado
Esta tesis pretende desarrollar un programa fácilmente aplicable para la validación de la
determinación del ión nitrito en aguas, y estimar la incertidumbre de la metodología a partir
del mismo. Para realizar la validación se requiere definir ciertos parámetros y criterios,
basados en evidencias objetivas y en el cumplimiento de éstos.
La metodología para el cálculo de la estimación de la incertidumbre se basa en aprovechar
la información generada en el programa de validación, teniendo en cuenta las posibles
fuentes de incertidumbre halladas durante el proceso de la realización del método en
estudio. Una vez obtenido el cálculo de la misma, es necesario aplicarlo a los resultados
del método, haciendo que los mismos sean seguros y confiables.
Para cumplir la finalidad del presente trabajo, se han planteado los siguientes objetivos:
20
Validar el método 4500-B, aprobado por el Comité de Standard Methods revisión
2011, que desarrolla y cita la metodología oficial para la determinación de ión nitrito en
aguas no coloreadas, con una concentración del ión entre 0,084 y 0,657 mgL-1.
Realizar el cálculo para la estimación de incertidumbre expandida para el método
seleccionado en la validación y evaluar si la misma puede ser razonablemente atribuida al
mesurando, teniendo en cuenta los valores de ión nitrito analizados en muestras de agua
para consumo.
1.5 Hipótesis del trabajo
De acuerdo al estudio de investigación realizado el presente trabajo se plantea como
hipótesis que “Es posible determinar la concentración del ión nitrito en agua no coloreada,
con un contenido de nitrito entre 0,084 y 0,657 mgL-1, mediante el método 4500-NO2- B
colorimétrico por espectrofotometría uv-visible, citado en el Standard Methods.”
21
Capítulo II: Materiales y métodos para la validación
22
2. Planificación y desarrollo del procedimiento de validación
2.1 Introducción
El procedimiento de validación se debe planificar y estudiar rigurosamente antes de llevar a
cabo su ejecución. El material bibliográfico y las normas de control son las bases para su
desarrollo. Es importante evaluar, verificar y revisar cada etapa del proceso, durante su
elaboración, para asegurar el éxito de su aplicación y dejar documentado con evidencias
cada punto con sus modificaciones y ensayos realizados.
Un procedimiento exitoso es aquel que permite a cualquier analista del laboratorio,
reproducir en la práctica su contenido para obtener resultados confiables y seguros.
2.2 Planificación para el procedimiento de validación
En la planificación de un procedimiento de validación se debe estudiar cada etapa y
realizar un esquema de las mismas indicando los objetivos a alcanzar en concordancia a
los objetivos del trabajo y el tiempo estimado para su ejecución. A continuación se
muestra la planificación para la validación del método colorimétrico 4500-NO2- - B, que se
encuentra publicado en el Standard Methods.
Figura 9: Cronograma de actividades para la planificación y desarrollo del procedimiento de validación.
PLANIFICACIÓN PARA EL DESARROLLO DEL PROCESO DE VALIDACIÓN
Etapas
Busqueda y actualización bibliografica x x
Adquisición de insumos y acondicionamiento de equipos x x
Evaluación de la metodología seleccionada x
Evaluación estadística de los parámetros de validación x x
Evaluación estadística de la incertidubre del método a validar x x
Conclusiones y redacción del procedimiento de validación x
x
Aplicación del método seleccionado y realización de la curva
de calibraciónx
Preparación de muestras y de blanco para los ensayos de
validación del método y evaluación de los parámetrosx x
Tiempo planificado: Meses
xCorrecciones y toma de desiciones según los resultados
obtenidos
23
2.3 Desarrollo del procedimiento de validación
Es importante para el desarrollo de un procedimiento de validación dejar evidencias en una
primera etapa de la justificación de la selección del método a validar.
Esta etapa debe ser respaldada por normativas específicas que avalen las razones
perseguidas por la metodología, es decir el impacto del analito en la humanidad.
Se presentaron evidencias, anteriormente mencionadas, de que el ión nitrito en agua se
vuelve tóxico, en concentraciones mayores a las legisladas, causando un efecto nocivo
sobre la salud humana, razón suficiente para la justificación de la validación del método
normalizado colorimétrico 4500-NO2--B seleccionado. El Código Alimentario Argentino
establece como límite máximo un valor de 0,10 mgL-1 de ión nitrito en aguas destinadas
para consumo.
Los expertos del Comité Mixto de la Organización de las Naciones Unidas para la
Agricultura y la Alimentación (F.A.O) y la Organización Mundial de la Salud (O.M.S) en la
actualidad han fijado la dosis diaria admisible para el ión nitrito en 0,113 mgKg-1 corporal.
El agua no es la única fuente en la que normalmente consumimos el ión nitrito está
presente también en vegetales, carnes, conservas y chacinados.
Una vez que se tiene en cuenta los aspectos normativos, se debe proceder a desarrollar la
metodología seleccionada.
2.3.1 Materiales y Métodos
La finalidad de la metodología analítica seleccionada es la determinación de nitrito en
aguas no coloreadas publicada en el Standard Methods; dicha técnica es la colorimétrica
4500-NO2- - B. Es importante aclarar que con el método mencionado se va a estudiar
determinar concentraciones de nitrito entre 0,084 mgL-1 y 0,657 mgL-1, para probar la
hipótesis del presente trabajo.
El ión nitrito se determina por la formación de una solución coloreada azo púrpura rojiza,
producido a pH 2,0 a 2,5 por acoplamiento de sulfamida diazotizada con clorhidrato de N-
(1naftil)-etilendiamina (diclorhidrato de NED).
24
Se debe acondicionar la muestra para la aplicación de la técnica, si presenta sólidos en
suspensión, se debe filtrar a través de un filtro de membrana de 0,45 µg de poro y si el pH
de la misma no estuviera comprendido entre 5 y 9, ajustar a ese valor con ácido clorhídrico
1N o hidróxido de amonio según convenga. Para conservar la muestra a corto plazo, de 1
o 2 días máximo, se debe congelar la misma a -20°C o conservar a 4°C en refrigeración.
Para la ejecución de los ensayos se utilizó como droga patrón nitrito de sodio de alta
pureza (≥ 98 %), disuelto en agua de grado 3 según I.S.O 3696 que la define como,
adecuada para la preparación de soluciones esta puede ser obtenida por destilación
simple, desionización o por osmosis inversa y debe ser usada para trabajos analíticos de
rutina.
El listado de materiales, equipos y preparación de soluciones utilizadas y la valoración de
las mismas, puede consultarse en los puntos 1 y 2 del anexo I.
Preparación de las soluciones de nitrito que darán origen a la curva de calibración.
a) Preparación de la solución madre de nitrito, donde un mL equivale a 0,8214 mg de
NO2- .
Para la preparación de la solución madre, se utilizó una balanza analítica con una
precisión de 0,001 g marca Sartorius. Esta balanza esta verificada bajo el sistema de
control de metrología legal, lo que asegura que la pesada es correcta. Se pesó la cantidad
de 1,232 g de nitrito de sodio (NaNO2) de alta pureza, luego se llevó a 1000 mL en un
matraz calibrado con agua destilada. Para aumentar el tiempo de su conservación se
agregó 1 mL de cloroformo.
25
Figura 10: Balanza analítica marca Sartorius.
Se estandarizó la solución madre preparada; se colocó en un erlenmeyer 50 mL de la
solución de permanganato de potasio (KMnO4) 0,05 N y se agregó 5 mL de ácido sulfúrico
concentrado (H2SO4), finalmente se incorporó 50 mL de solución madre de nitrito. Se agitó
suavemente y se calentó entre 70-80 °C sobre placa calentadora, controlando con un
termómetro calibrado dicha temperatura. Para eliminar la coloración de permanganato de
potasio se agregó 2 porciones de 10 mL de la solución (0,05 N) de oxalato de sodio
(Na2C2O4).
Una vez decolorado el permanganato de potasio, se tituló el exceso de oxalato de sodio
con la solución 0,05 N de permanganato de potasio hasta el punto final rosa pálido
gastando 8 ml.
Paralelamente se preparó un blanco, con agua destilada en lugar de la solución madre y se
realizó el procedimiento tal cual se explicó anteriormente. Se tuvo en cuenta el gasto del
mismo, para hacer las correcciones necesarias en el cálculo final de la estandarización.
26
Figura 11 Figura 12
Figura 11 y 12: Representan la estandarización de la solución madre de nitrito de sodio preparada
Figura 13
Figura 13: Representa el punto final de la titulación
27
En el punto d del anexo I se encuentra detallada la ecuación para el cálculo de la
valoración de la solución madre de nitrito (A) expresada en mg NO2- L-1 que posteriormente
se convirtió a mgL-1 de nitrito, para poder evaluar los resultados respecto al especificado
en el Código Alimentario Argentino.
Una vez preparada y estandarizada la solución madre de nitrito; ésta se utilizó para la
preparación de la solución intermedia.
b) Preparación de la solución intermedia de nitrito, donde un mL equivale a 0,164 mg
de NO2-
En primer lugar se calculó cuantos mL de la solución madre necesito medir para preparar
la solución intermedia utilizando la formula, G=12,5/ (A). El valor de G representa al
volumen necesario para preparar 250 mL de solución intermedia de nitrito.
G=12,5/ 0,2443 mg NL-1
G= 51 ,2 mL
Una vez conocido el volumen a medir de solución madre, se lo colocó en un matraz
calibrado de 250 mL y se llevó a volumen con agua destilada.
c) Preparación de la solución de trabajo de nitrito, donde un mL equivale a 0,0164 mg
de NO2-
La solución de trabajo se preparó a partir de la solución intermedia de nitrito; se midió 10
mL con una pipeta calibrada de doble aforo en un matraz calibrado de 1000 mL de
capacidad, el cual se llevó a volumen con agua destilada libre de nitrito.
Preparación de los patrones de nitrito para la curva de calibración
La curva de calibración permite calcular la concentración de nitrito, expresada en mg NO2-
L-1, presente en la muestra de forma directa.
28
Para preparar la curva de calibración se estableció en una primera instancia el rango de la
misma, es decir los puntos máximos y mínimos, de manera que el valor límite establecido
por el Código Alimentario Argentino para agua potable quede comprendido en él. Por lo
tanto, se utilizaron distintitas concentraciones de patrones estableciendo cuatro puntos:
0,084 mg NO2-L-1; 0,164 mg NO2
-L-1; 0,328 mg NO2-L-1y 0,657 mg NO2
-L-1 dichos puntos se
prepararon como se describe a continuación:
Para preparar la concentración de 0,084 mg NO2-L-1, se midieron 5,2 mL de solución de
trabajo con una pipeta automática calibrada y se diluyó a 1000 mL en un matraz calibrado
con agua destilada. Para el punto de la curva que representa a 0,164 mg NO2-L-1, se
preparó 10 mL de solución de trabajo con pipeta doble aforo calibrada y se diluyó a 1000
mL en un matraz calibrado con agua destilada. Para preparar la concentración de 0,328
mg NO2-L-1, se tomó 20 mL de solución de trabajo con pipeta doble aforo calibrada y se
diluyó a 1000 mL en un matraz calibrado con agua destilada y por último el punto más alto
de la curva que representa el 0,657 mg NO2-L-1, se preparó midiendo 40 mL de solución de
trabajo con pipeta de 20 mL doble aforo calibrada y se diluyó a 1000 mL en un matraz
calibrado con agua destilada. En todos los casos en que se utilizó agua destilada se
verificó que la misma estuviese exenta de nitrito.
Una vez preparadas las distintas concentraciones correspondientes a cada punto de la
curva, se tomó 50 mL de cada una de ellas y se les agregó 2 mL del reactivo colorante. Se
homogeneizó bien para asegurar la formación de la solución coloreada azo púrpura rojiza.
La siguiente figura muestra la escala colorimétrica de los cuatro puntos de la curva de
calibración.
29
Figura 15: Coloración adquirida en la preparación de los cuatro puntos de la curva de calibración, de derecha a
izquierda: 0,084 mg NO2-L
-1; 0,164 mg NO2
-L
-1; 0,328 mg NO2
-L
-1 y 0,657 mg NO2
-L
-1 luego de formación de la
solución coloreada azo púrpura rojiza.
Medidas espectrofotométricas
Para realizar las medidas espectrofotométricas se utilizó un espectrofotómetro uv-visible
marca Shimatzu, que presenta un paso óptico de un centímetro. El equipo realiza un
checklist completo de su funcionamiento antes de empezar a trabajar, comparando los
resultados de los controles con parámetros previamente estandarizados. Para su control
interno, el responsable del equipo debe realizar controles de medición semestrales
mediante el uso de un material de referencia específico, además anualmente se solicita el
control externo a un proveedor calificado para ello. Antes de efectuar la validación del
método se debe realizar los controles de limpieza del compartimento, asegurándose que el
mismo se encuentre en condiciones óptimas de trabajo.
Para la medición se utilizó cubetas de vidrio de 1 cm de espesor que debieron ser
controladas previamente a la lectura. La verificación de las mismas es un control
importante y se basa en colocar agua destilada en ellas y se las debe medir a una longitud
de onda de 543 nm, que es la utilizada en la metodología en estudio. Como criterio se
30
estableció que dichas cubetas no deben presentar entre ellas diferencias superiores a 0,01
unidades de absorbancia.
Para proceder a la lectura de los patrones, se programó el equipo para leer a una
absorbancia de 543 nm, la lectura de los patrones se debe efectuar entre 10 minutos y dos
horas después de añadir el reactivo de color, y se compararon frente a un blanco de 50 mL
de agua destilada libre de nitrito que fue tratado igual que los patrones de la curva de
calibración. El tiempo que detalla el método para dejar las muestras y/o patrones en
contacto con el reactivo colorante se probó, para asegurar que este no influye ocasionando
errores en los resultados finales; los cuales pueden consultarse en el punto 5 del anexo I.
En el caso de las medidas espectrofotométricas de las muestras se debe proceder de igual
forma teniendo en cuenta las mismas precauciones que las descriptas en la lectura de los
patrones de la curva de calibración. Los patrones de la curva de calibración se midieron
por triplicado. Cuando el valor de absorbancia supera el límite máximo del rango lineal de
la curva de calibración, se debe hacer una dilución adecuada y repetir el ensayo.
Es importante verificar la curva de calibración para asegurarnos que los resultados
obtenidos a partir de ella sean confiables. Esto se aconseja realizarlo cada día que se
realiza la determinación, para lo cual se debe utilizar un patrón de nitrito de sodio diferente
al utilizado en la preparación de la curva, y se realiza la misma metodología detallada
anteriormente. El criterio de aceptación que se tiene en cuenta para la verificación de la
curva de calibración es de dos veces la desviación estándar 2s. En el caso que la
verificación no sea aceptable, se prepara una segunda solución del patrón de nitrito de
sodio y se repite la verificación, si la segunda verificación no cumple el criterio de
aceptación, se procede a la realización de una nueva curva de calibración.
La figura 16 muestra el instrumental utilizado en el laboratorio para la medición según la
técnica en estudio.
31
Figura 16: Espectrofotómetro uv-visible, marca Shimatzu.
Expresión de los resultados
Los resultados de la concentración expresados en mg NO2-L-1 fueron calculados, a partir
de la ecuación de la recta de calibración obtenida en la validación del método; la misma se
encuentra detallada en el punto 3.1 del anexo I.
2.3.2 Definición de los parámetros de validación
Existen diferentes guías de referencia que describen los criterios o parámetros, tales como
La unión internacional de química pura y aplicada (I.U.P.A.C), Vocabulario internacional de
metrología- conceptos básicos y general y términos asociados (I.S.O/I.E.C 99:2007) y
Organismo Argentino de Acreditación (O.A.A.) entre otros.
A continuación se detallan cuáles fueron los parámetros elegidos y evaluados para llevar a
cabo la validación del método, basados en las guías anteriormente mencionadas.
Los resultados de los mismos se encuentran expresados en detalle, en el capítulo 3 del
presente trabajo, que se titula " Resultados y discusión de los parámetros establecidos
para la validación".
Linealidad
Para el estudio de la linealidad del método, se realizó la curva de calibración.
Conjuntamente se determinó el rango lineal, que incluye al valor máximo establecido por
32
el Código Alimentario Argentino. Se prepararon cuatro soluciones de concentraciones
conocidas a partir de la solución de trabajo de nitrito de sodio, las cuales fueron 0,084;
0,164; 0,328 y 0,657 mg NO2-L-1, se midió la absorbancia de cada una por triplicado y con
los datos obtenidos se ajustó un modelo de regresión simple lineal, graficando en el eje de
las ordenadas la variable dependiente (concentración en mgL-1 de NO2 -) y en las
abscisas, la variable independiente (absorbancias). Para realizar el estudio de la linealidad
se utilizó una planilla de cálculo de Microsoft Excel, a partir de la cual se obtuvieron los
coeficientes de regresión lineal simple (r) y el coeficiente de determinación (R2); además se
realizó el análisis de residuos estándares, los cuales deben estar comprendidos en un
intervalo de confianza del 95% y se verificó la aleatoriedad de los residuos. Para evaluar la
ecuación del modelo de regresión lineal propuesto y= βo + β1x se realizó una prueba de
hipótesis aplicando la prueba "t".
Para el análisis de éste parámetro se estudiaron diferentes criterios de conformidad y
aceptación basados en guías de referencia; para la curva de calibración se sugiere un
valor de coeficiente de correlación (r) mayor a 0,980 y un coeficiente de determinación
(R2) mayor a 0,990, basados en las diferentes guías (7); (20); (23).
Límite de cuantificación
Para determinar el límite de cuantificación se midieron diez estándares independientes de
nitrito de sodio cuya concentración corresponde al primer punto de la curva de calibración
de 0,084 mg NO2-L-1. Se consideraron como guías de referencia las indicadas por DeSain,
Martin-Smith y Rudd, (2010) los que sugieren que el coeficiente de variación porcentual de
la repetitividad para el límite de cuantificación no debe superar al 2% y se debe asegurar
que el valor asignado sea menor al del límite establecido por el Código Alimentario
Argentino, que es de 0,1 mg NO2-L-1 (7).
33
Límite de detección
El límite de detección se determinó haciendo una dilución al 50% del estándar que
corresponde al límite de cuantificación establecido (0,084 mg NO2-L-1). Se prepararon cinco
estándares de 0,045 mg NO2-L-1 y se midieron en el espectrofotómetro uv-visible.
Para la evaluación de este parámetro se utilizó una planilla de cálculo de Microsoft Excel y
se establecieron como criterio de aceptación que el coeficiente de variación porcentual de
la repetitividad no debe superar al 2%, basado en DeSain, Martin-Smith y Rudd (2010) y
que el límite de detección siempre sea menor al límite de cuantificación. (7).
Precisión
En la determinación de la precisión del método se eligió una concentración de nitrito de
sodio en el rango lineal de la curva de calibración; esta corresponde a 0,084 mg NO2-L-1.
Enriqueciéndose diez muestras de agua libre de nitrito de sodio. Las diez dosificaciones
fueron medidas por espectrofotometría uv-visible y cuantificadas mediante la curva de
calibración obtenida a partir del método en estudio.
Para evaluar este parámetro se utilizó una planilla de cálculo de Microsoft Excel con los
datos de la repetitividad y precisión intermedia, además se estudiaron los diferentes
criterios de conformidad y aceptación entre duplicados basados en guías de referencia
como I.U.P.A.C basada en el empleo de el Test de Fisher y así reconocer si son
estadísticamente semejantes ambas repeticiones, donde el F experimental puede ser
menor o mayor al tabulado y DeSain, Martin-Smith y Rudd,( 2010) los que sugieren que el
coeficiente de variación porcentual de la repetitividad no debe superar el 2% .
Exactitud
En el estudio de la exactitud del método se prepararon tres ensayos a los cuales se
adicionaron tres concentraciones distintas del patrón de nitrito de sodio a partir de la
solución madre; éstas fueron de 0,084; 0,164 y 0,383 mg NO2-L-1. Todas las dosificaciones
se realizaron sobre una muestra de agua destilada libre de nitrito de sodio.
34
El ensayo nº 1, se preparó a partir de la solución madre de nitrito de sodio de 0,840 mg
NO2-mL-1, se hizo una dilución 1:10 de la misma, con material de vidrio calibrado.
Para el ensayo nº 2, se preparó una solución madre de 0,328 mg NO2-mL-1, se hizo una
dilución 1:2 con material de vidrio calibrado y posteriormente se midió 1mL de esta
solución enrasándose en un matraz de 1000 mL con agua libre de nitrito, para obtener una
solución de 0,164 mg NO2- L-1.
Por último se preparó el ensayo nº 3, para el cual se utilizó la solución madre de 0,76 mg
NO2-mL-1 con la cual se hizo una dilución 1:2 con material de vidrio calibrado. Luego se
agregó 1mL de la misma y se colocó en un matraz de 1000 mL, donde se efectuó el
enrase con agua libre de nitrito, para obtener 0,383 mg NO2-mL-1. Una vez preparados los
ensayos se procedió a la lectura de los mismos en el equipo espectrofotómetro uv-visible,
utilizando la curva de calibración del método en estudio para obtener los resultados de
recuperación. Las lecturas se realizaron por triplicado para cada una de las
concentraciones.
Al evaluar las recuperaciones, se realizó una prueba de hipótesis y se aplicó la prueba "t",
se utilizó una planilla de cálculo de Microsoft Excel, para analizar los resultados obtenidos
y establecer el criterio de aceptación a partir de la guía I.S.O/I.E.C 99:2007, y lo
especificado por Fabro M., 2015 los cuales establecen una recuperación mayor al 98%.
Los resultados se encuentran detallados en la tabla del anexo II.
A continuación se presenta un resumen de los criterios de conformidad y aceptación
establecidos en el presente trabajo y como efectuar el análisis de los datos obtenidos para
cada uno de los parámetros de validación analizados.
35
Tabla 1: Representa los criterios de conformidad y aceptación establecidos
SI NO
Coeficiente de correlación
( r ) > 0,990 r = 0,998 x
O.A.A./Fabro,2015/
Quattrocchi
Coeficiente de
determinación (R2) > 0,980 R
2 = 0,997 x O.A.A./Fabro,2015
Prueba de t t exp > t tab pend≠ 0 texp = 55,69 y ttab = 2,228 x Estadís tica
Intervalo de confianza del
intercepto Debe incluir al cero β0 = -0,002 y β1 = 1,077 x Estadís tica
Determinación de 10
estándares
independientes cc < Lím. Lejislación cc= 0,084 mgL-1
< 0,1 mgL-1
x C.A.A.
cv % < 2% x DeSain, Martin-Smith y Rudd
Dilución al 50% del LC LD < LC LD 0,045 mgL-1
< LC 0,084 mgL-1
x Fabro, 2015
cv % < 2% x DeSain, Martin-Smith y Rudd
Repetitividad cv % Técnico 2 dias < 2% 0,60% x DeSain, Martin-Smith y Rudd
cv % Técnico < 2% 11% x DeSain, Martin-Smith y Rudd
Test de fisher "F" Técnico F EXP < F TAB 0,64 < 3,18 x IUOAC
Recuperación % 1 dia > 92% recuperación 101% x
Fabro, 2015/ISO/IEC Guide
99:2007
Prueba de t 1 dia t exp < t tab %R=100% t exp = y t tab = 2,31 x Estadís tica
Intervalo de
trabajo curva de calibración Técnico 1 dia - (0,084 - 0,657) mgL-1
x Estadís tica
CRITERIOS DE ACEPTACION
Exactitud Técnico
Reproducibilidad
(presicion
intermedia)
2 dias
TécnicoLimite de
detección (LD)
Limite de
cuantificación
(LC)
Parámetros ¿Cómo? Responsable
Técnico
Linealidad Técnico
Plazos
1 d
ia
GuiaCriterios de
conformidad
Resultados Conforme
1 d
ia3
se
ma
na
s
36
Capítulo III: Resultados y discusión para la
validación
37
3. Evaluación de los parámetros establecidos para la validación del método
colorimétrico 4500-NO2 - - B publicado en el Standard Methods
Para evaluar los parámetros definidos en la validación del método se utilizaron
herramientas estadísticas y guías nacionales e internacionales en vigencia. Se realizó un
análisis completo de cada parámetro considerando los criterios de conformidad ya
establecidos. A continuación se detallan los resultados y la discusión de los mismos.
3.1 Determinación de la linealidad de la curva de calibración
Al determinar la linealidad del método se elaboró una tabla con las concentraciones
medidas a partir de los patrones de nitrito, por espectrofotometría uv-visible, según las
especificaciones detalladas en el capítulo anterior.
La siguiente tabla representa las doce lecturas de los cuatro patrones seleccionados que
se midieron por triplicado.
Tabla 2: Resultados obtenidos del ensayo de linealidad para el ión NO2- en agua
N° lecturas abs 542 nm CC mg NO2-L-1
1 0,080 0,084
2 0,081 0,084
3 0,080 0,084
4 0,152 0,164
5 0,149 0,163
6 0,151 0,164
7 0,337 0,328
8 0,314 0,327
9 0,298 0,326
10 0,597 0,656
11 0,605 0,657
12 0,623 0,658
Los resultados obtenidos se utilizaron para visualizar mediante un gráfico, el ajuste del
modelo de regresión simple lineal, que se muestra a continuación.
38
Gráfico 1: Representa la curva de calibración del estándar de nitrito para cuatro niveles de concentración
El coeficiente de correlación simple lineal r = 0,998 lo que indicó una alta asociación
positiva entre las variables de absorbancia y la concentración de nitritos. Además cumple
con el criterio de aceptación de ser mayor a 0,990, sugerido por las guías seleccionadas.
La ecuación del modelo de regresión simple lineal resultó y = 1,0779 x - 0,0035. Esta
ecuación permite predecir valores de concentración en función a los valores de
absorbancia entre los límites en que se hizo la determinación.
El coeficiente de determinación (R2) para el ión nitrito fue de 0,997, esto indica que el 99,7
% de la variación de la variable concentración de nitritos (variable y) es explicada por el
modelo y cumple con el criterio de los parámetros de validación establecidos, el cual debe
ser mayor a 0,980.
Se estudió también que el intervalo de confianza del intercepto incluye al cero para cumplir
con el requisito de proporcionalidad, como se exige para la Ley de Lambert-Beer en los
métodos espectrofotométricos.
Tabla 3: Representa el intervalo de confianza que incluye al cero obtenido de planilla de cálculo Microsoft Excel
confianza 95%
Inferior Superior Intercepción -0,017570758 0,01178133
Para evaluar la ecuación del modelo de regresión lineal propuesto se realizó una prueba
de hipótesis sobre el parámetro del modelo β1, es decir para la pendiente de la recta. Se
y = 1,0779x - 0,0035R² = 0,9972
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800
Co
nce
ntr
ació
n N
O2
-m
g/l
Absorvancia nm
39
espera que la pendiente de la recta sea significativamente distinta de cero, ya que es
esencial que los valores de "x" e "y" estén altamente correlacionados.
Se probó la hipótesis científica de que existe regresión simple lineal, por lo tanto se
planteó:
H0 : β1 = 0
H1 : β1 ≠ 0
Con un α = 0,05 los resultados fueron tmuestral = 58,43 y tcritico = 2,228, es decir el tmuestral >
tcritico por lo que se rechaza la hipótesis nula. Esto explica que existe regresión simple lineal
entre ambas variables (absorbancia y concentración), para las condiciones experimentales
evaluadas. En el anexo I se puede consultar la tablat-student en el apartado de tablas
auxiliares.
También se realizó el análisis de los residuos demostrando que se distribuyen en forma
aleatoria sin presentar tendencia alguna, como se muestra en el grafico 2.
Gráfico 2: Diagrama de dispersión de los residuos vs la absorbancia del conjunto de datos completos
3.2 Determinación de él límite de cuantificación (LC)
Se estableció para el LC un valor de 0,084 mgNO2-L-1, debido que es la menor
concentración de la curva de calibración para la cual se evaluaron las diez repeticiones,
teniendo en cuenta el coeficiente de variación de la repetitividad como criterio de
aceptación que corresponde a un valor < 2%. Además se debe cumplir con que el límite de
cuantificación sea menor al legislado por el C.A.A. (0,1 mg NO2-L-1). A continuación en la
tabla 4 se puede observar los resultados finales obtenidos del ensayo para determinar el
límite de cuantificación.
-0,04
-0,03
-0,02
-0,01
0
0,01
0,02
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70
Re
sid
uo
s
Aborbancia nm
40
Tabla 4: Resultados obtenidos del ensayo de límite de cuantificación para el ión NO2- en agua
Nº lecturas 10 ABS nm CC mg NO2-L-1
Media 0,0807 0,084
Desviación estándar 0,0009 0,00048
CV % 1,2 0,6
3.3 Determinación de él límite de detección (LD)
Se diluyó al 50 % la concentración establecida para el límite de cuantificación, y se obtuvo
una concentración de 0,045 mg NO2-L-1, valor que se definió para el LD. Se prepararon
cinco concentraciones y se midieron por espectrofotometría uv-visible. A continuación se
muestran en la tabla 5 los resultados del estudio.
Tabla 5: Resultados obtenidos del ensayo de límite de detección para el ión NO2- en agua
Nº lecturas 5 ABS nm CC mg NO2-L-1
Media 0,039 0,039
Desviación estándar 0,0038 0,0043
CV % 9,8 11,0
Como criterio de conformidad para este parámetro se estableció que el mismo debería
cumplir con un coeficiente de variación para la repetitividad < 2% para poder cuantificarlo.
En la tabla 4, se pueden observar los resultados y que los mismos no cumplen con los
criterios pre establecidos de ser < 2%; Se lo considera un punto que detecta pero no es
reproducible, por lo tanto no se puede cuantificar pero sí cumple que el valor de su
concentración debe ser menor al del límite de cuantificación.
3.4 Determinación de la precisión del método
La precisión del método se estableció a partir de la repetitividad y de la precisión
intermedia del mismo. Los ensayos se pueden observar en detalle en el anexo II, en el
apartado de precisión.
En una primer instancia se analizó el coeficiente de variación para el analista número uno
en condiciones de trabajo del laboratorio. El valor obtenido fue del 0,98%, a partir de las
lecturas de las diez dosificaciones de 0,084 mg NO2-L-1. A continuación se muestran en la
tabla 6, los resultados finales del estudio para la repetitividad del método analítico.
41
Tabla 6: Resultados obtenidos del ensayo de repetitividad para el ión NO2- en agua
Media ( mg NO2-L-1) 0,084
Desviación estándar ( mg NO2-L-1) 0,0008
CV % 0,98
Además de la repetitividad se tuvo en cuenta el análisis de la precisión intermedia. El
coeficiente de variación obtenido a partir de los valores de concentración de nitrito de las
diez determinaciones efectuadas por el analista número uno y de las diez determinaciones
realizadas por el analista número dos, bajo las mismas condiciones de trabajo en días
diferentes, fue de 1,73 %. En la tabla 7 se muestran los resultados obtenidos del análisis
de la reproducibilidad del método.
Tabla 7: Resultados obtenidos del ensayo de reproducibilidad para el ión NO2- en agua
Media ( mg NO2-L-1) 0,084
Desviación estándar ( mg NO2-L-1) 0,001
CV % 1,73
El coeficiente de variación fue aceptable ya que es menor al máximo establecido por
DeSain, Martin-Smith y Rudd que es < 2%.
Se evaluó el test de Fisher “F”, siguiendo la guía de referencia de I.U.P.A.C, con un α =
0,05 para n-1 grados de libertad, los resultados fueron F (9,9;95) = 3,18 y Fexperimental = 0,64.
Esto explica que no hay diferencias estadísticas significativas entre ambas repeticiones, ya
que el F experimental fue menor al F tabulado.
3.5 Determinación de exactitud del método
Para evaluar la exactitud se realizó una prueba de recuperación a partir de tres
concentraciones conocidas de nitrito (0,084; 0,164 y 0,383 mg NO2-L-1) la preparación de
las mismas están detalladas en el capítulo 2, inciso 2.3.2. Se midieron por triplicado cada
una de ellas y se calculó el porcentaje de recuperación para el método analítico.
Los resultados del ensayo se observan a continuación en la tabla 8.
42
Tabla 8: Resultados obtenidos del ensayo de recuperación para el ión NO2- en una muestra enriquecida
Dosificación mg NO2-L-1 Recuperación (%R)
Media 101
DS 2,17
CV% 2,14
Mediante una prueba de hipótesis se comprobó que los valores de recuperación son
cercanos al 100%. En dicha prueba se plantearon las siguientes hipótesis:
H0: µ% R = 100 %
H1: µ% R ≠ 100 %
Se calculó un valor t experimental usando la ecuación citada en el anexo II, en el apartado
de exactitud del mismo.
El t experimental fue de 1,71 el cual resultó menor al t tabular que fue 2,31, para n-1 grados de
libertad, νn-1 = 8 y α/2= 0,025. Entonces se acepta la hipótesis nula planteada y se concluye
que el método presenta la exactitud requerida, es decir, se acepta el supuesto de que no
existen diferencias significativas entre el valor medido y el 100 % de recuperación.
Los datos obtenidos para este ensayo se pueden consultar en la planilla de cálculo de
Microsoft Excel, en el anexo II.
Una vez establecidos y evaluados los parámetros para la validación del método en estudio
se continuó con la estimación de la incertidumbre del mismo.
43
Capítulo IV: Incertidumbre
44
4. Introducción
En el presente trabajo se ha hecho referencia a la importancia de calcular la misma de los
resultados. No obstante, el cálculo de la incertidumbre no es sencillo debido al elevado
número de fuentes de error presentes en un procedimiento analítico. Existen varias
aproximaciones y guías para calcularla.
4.1 Estimación de la incertidumbre
Para el cálculo de la incertidumbre se utilizó como guía el diagrama de proceso citado en
EURACHEM/CITAC y se estableció cuatro grandes etapas que facilitaron el proceso de
estimación.
Figura 17: Esquema del proceso de la estimación de la incertidumbre (EURACHEM/CITAC guide 2016).
45
4.1.1 Etapa I: Especificación del mesurando
Se estableció que el modelo que vincula las variables fue la determinación de la
concentración de nitrito en aguas no coloreadas en asociación con la absorbancia medida
en las distintas muestras. El modelo de medición fue el espectrofotométrico que responde
a la Ley de Lambert- Beer.
Concentración de NO2- mgL-1 = valor mgL-1 medido ± correcciones
4.1.2 Etapa II: Identificación de las fuentes de incertidumbre
Para la identificación de las fuentes de incertidumbre se aplicó el diagrama de causa y
efecto, conocido como diagrama de causa y efecto o diagrama de espina de pescado.
Como primer paso se describió en forma breve y clara la problemática a analizar, luego se
identificó las categorías o causas que se consideraron importantes en el método; se
propusieron tantas como fueron posibles. Una vez que se identificaron las principales
procedemos a preguntarnos; ¿Por qué ha surgido determinada causa principal? Esto nos
permitió identificar las causas secundarias que surgieron a partir de las principales.
Se elaboró un diagrama en tres pasos:
Paso n° 1: Se estudió la valoración de las soluciones, preparación de la solución
intermedia y preparación de la solución madre.
Figura 18: Paso n° 1 representa el diagrama de las posibles fuentes de errores asociadas a la valoración de las
soluciones y a la preparación de la solución intermedia.
46
Paso n° 2: Se analizó el proceso de la preparación de la solución de trabajo, la
preparación de los patrones para la calibración, la exactitud del método, la precisión del
método y lectura espectrofotométrica para la elaboración de la curva de calibración. A
continuación se muestra el diagrama originado a partir del paso nº 2.
Figura 19: Paso n° 2 representa el diagrama de las posibles fuentes de error asociadas a la preparación de la
solución de trabajo y a preparación de patrones.
Paso n° 3: Finalmente, una vez identificadas tanto las causas principales como las causas
secundarias, se procedió al análisis detallado de cada una de ellas para seleccionar las
causas que son las fuentes principales de error y que están en condiciones de corregir
inmediatamente
47
Figura 20: Paso n° 3 representa al diagrama causa-efecto final del análisis de fuentes de errores para el
método colorimétrico 4500-NO2- - B, que se encuentra publicado en el Standard Methods.
Se estudió el diagrama de causa-efecto final y se observó la existencia de cuatro fuentes
de error a analizar: la fuente nº1 asociada a la preparación y valoración de la solución
madre de nitrito, la fuente nº2 asociada a la curva de calibración y la lectura de la misma
en un equipo espectrofotométrico, la fuente nº3 asociada a la precisión del método y
finalmente la fuente nº4 asociada a la exactitud del mismo.
4.1.3 Etapa III: Cuantificación de la incertidumbre
Cada fuente de incertidumbre se analizó por separado; se calculó la incertidumbre
estándar y relativa de cada una y finalmente se combinaron todas las fuentes de
incertidumbre (3); (5).
Fuente de error nº 1: Asociada a la preparación y valoración de la solución madre de
nitrito
En primer lugar se calculó la incertidumbre asociada a la preparación de la solución madre;
para estimarla se estudiaron las características del reactivo de nitrito de sodio, tales como:
la pureza, el peso del reactivo y el uso de la balanza apropiada para la pesada según la
metodología citada. Además se consideró el material volumétrico utilizado en la disolución
de la droga nitrito de sodio empleada. A continuación se detallan los cálculos para la
estimación de la incertidumbre estándar y relativa asociada.
48
Para el análisis de la pureza del reactivo nitrito de sodio se consideró la información
aportada por la hoja técnica del proveedor marca Merck, la cual informó que la
incertidumbre expandida del patrón fue de 0,999 ± 0,001 mg, para poder obtener la
Incertidumbre estándar a partir de ella se la asoció a una distribución de probabilidad
rectangular ya que cada valor de un intervalo dado tiene la misma probabilidad de
ocurrencia. El resultado de la incertidumbre estándar es de 0,001 mg.
µPureza (nitrito de sodio)= 0,001= 0,001 mg √3
A continuación se estudió la incertidumbre aportada por la balanza analítica con la que se
realizó la pesada de 1,232 g del patrón de NO2Na. El certificado de calibración de la misma
estableció que la incertidumbre expandida fue de 0,0001g para un k=2. Para calcular la
incertidumbre estándar se la asoció a una distribución normal, dividiendo la incertidumbre
expandida por el factor k. El resultado de la incertidumbre estándar es de 0,00005 mg. Sin
embargo el fabricante informó que la precisión de la misma es de 0,01 mg considerándola
como incertidumbre estándar; por lo que la suma cuadrática de ambas dieron como
resultado de incertidumbre total 0,05 mg. A continuación se muestran los resultados.
µbalanza= 0,0001 = 5x10-5 g igual a decir 0,05 mg 2
µbalanza= √(0,05)2+ (0,01)2
Ubalanza=0,05 mg
También se consideró el material de vidrio volumétrico, un matraz de 1000 ml identificado
como SV70, con el que se hizo la disolución la droga patrón, con la información del
certificado del fabricante ± 0,35 mL de volumen interno del matraz y considerando que
responde a una distribución normal con un k=2. El resultado de la incertidumbre estándar
es de 0,175 mL.
49
µmatraz 1000ml = 0,35 = 0,175 mL 2
Al observar los resultados de las incertidumbres asociadas a la preparación de la solución
madre de nitrito se descartó la aportada por la pureza del reactivo, ya que en relación a la
pesada y el volumen medido en material de vidrio, ésta fue despreciable.
En segundo lugar se calculó la incertidumbre asociada a la estandarización o valoración de
la solución madre, como etapa final de la estimación relacionada a la fuente de error nº 1.
Para dicho fin se utilizó un volumen de 50 mL de permanganato de potasio 0,05 N, que se
midió en un matráz identificado como SV72 y cuya incertidumbre expandida según su
certificado fue de ± 0,094 mL de volumen interno, para obtener la incertidumbre estándar
se lo asoció a una distribución normal con un k=2. A continuación se muestra el cálculo de
la misma.
µmatraz 50 ml = 0,094 = 0,05 mL 2
Debido que la valoración de la solución madre de nitrito de sodio se realizó sobre 50 mL
que se midieron en el mismo matraz calibrado e identificado como SV72, la incertidumbre
asociada al matraz resultó ser la misma anteriormente calculada.
µmatraz 50 ml = 0,094 = 0,05 mL 2
La reacción química, según las especificaciones de la determinación, debía llevarse a cabo
a una temperatura entre 70-80ºC, para ello se utilizó una plancha calefactora; por lo que se
debió tener en cuenta el efecto de la temperatura sobre el cálculo de la incertidumbre
estándar; se consideró el uso de un termómetro identificado como SV81 de 25 ºC, cuyo
certificado del fabricante indicó una incertidumbre expandida de ± 0,01º C , se lo asoció a
una distribución rectangular ya que cada valor del intervalo dado tenía la misma
50
probabilidad de ocurrencia y se obtuvo la incertidumbre estándar del mismo . El resultado
fue de 0,006 ºC
µtermómetro= 0,01 = 0,006 ºC √3
Para eliminar la coloración de permanganato de potasio se agregó porciones de 10 mL de
la solución 0,05 N de oxalato de sodio (Na2C2O4). Por lo tanto se considero la
incertidumbre aportada por la pipeta de 10 mL de libre escurrimiento, identificada como SV
21 y cuya incertidumbre expandida según su certificado fue de ± 0,07 mL de volumen
interno, para obtener la incertidumbre estándar se lo asoció a una distribución normal con
un k=2.
µ bureta 10 ml = 0,07 = 0,035 mL 2
y finalmente para evaluar el efecto de la temperatura en la dilatación del material
volumétrico, se consideró una variación de temperatura ambiental de ± 10 ºC, respecto a la
temperatura de calibración de la bureta de 25 mL y un coeficiente de expansión del agua
igual a 2,1*10-4/ºC.; dichos datos se los asoció a una distribución rectangular. El resultado
de la incertidumbre estándar es de 0,03 ml, los cálculos de incertidumbre se muestran a
continuación.
µ Temp expansión = 25ml ×10ºC×2,1×10−4
√3 = 0,03 mL
Al analizar esta fuente de incertidumbre nº 1, se debió calcular previamente la estimación
de la incertidumbre estándar de las soluciones de permanganato de potasio de 0,05 N y la
del oxalato de sodio 0,05 N, las cuales fueron utilizadas en la valoración de la solución
madre de nitrito de sodio, pueden consultarse en el anexo I.
51
Antes de realizar la suma cuadrática de todas las incertidumbres estándares involucradas
en esta etapa, se presenta una tabla de resumen relacionado a la estimación de las
distintas incertidumbres estándares y relativas asociadas a la fuente nº1, la que permite
preparar los patrones para la elaboración de la curva de calibración para el método en
estudio.
Tabla 9: Resultados obtenidos de la estimación de la incertidumbre estándar y relativa para la preparación y
valoración de la solución madre de nitrito de sodio.
Descripción
Valor X (unidad de medida)
µ estándar µ relativa
Preparación de la solución de Permanganato de potasio MnO4K
Peso del reactivo 1600 mg 0,05 mg 3,1*10- 5
Material volumétrico 1000 mL 0,175 mL 1,8*10- 5
Preparación de la solución de Oxalato de sodio
Peso del reactivo 3350 mg 0,05 mg 1,5*10- 5
Pureza del reactivo 0,998 g 0,00057 g 5,7*10- 4
Material volumétrico 250 mL 0,155 mL 6,2*10- 4
Valoración de la solución de Permanganato de potasio
Material volumétrico 25 mL 0,08 mL 3,2*10- 3
Termómetro 25 º C 0,006 º C 2,4*10- 4
Efecto de la temperatura en mat. Volumétrico (bureta) 25 mL 0,015 mL 6,0*10- 4
Preparación de la solución Madre de nitrito
Peso del reactivo 1232 mg 0,05 mg 4,1*10- 5
Pureza del reactivo 0,999 g 0,00057 g 5,7*10- 4
Material volumétrico 1000 mL 0,175 mL 1,8*10- 5
Valoración de la solución Madre de nitrito
Volumen de solución de MnO4K 50 mL 0,05 mL 1,0*10- 3
Solución Oxalato de sodio 10 mL 0,035 mL 3,5*10- 3
Solución de nitrito 50 mL 0,05 mL 1,0*10- 3
Termómetro 25 º C 0,006 º C 2,4*10- 4
Efecto de la temperatura en mat. Volumétrico (bureta) 25 mL 0,03 mL 1,2*10- 3
En la tabla 9 se pueden observar los datos de incertidumbre relativa de cada etapa en la
valoración de la solución madre de nitrito de sodio, que se obtiene a partir de la división de
la incertidumbre estándar por la unidad de medida o valor x.
Se consideró la suma cuadrática de las incertidumbres relativas individuales para conocer
la incertidumbre relativa total.
52
𝑢 (𝑝; 𝑞) = (µ/𝑝)2 + (µ/𝑞)2
µ sol. Madre= √(3,1*10- 5)2 + (1,8*10- 5)2 + (1,5*10- 5)2 + (5,7*10- 4)2 + (6,2*10- 4)2 + (3,2*10- 3)2 +
(2,4*10- 4)2 + (6,0*10- 4)2 + (4,1*10- 5)2 + (5,7*10- 4)2 + (1,8*10- 5)2 + (1,0*10- 3)2 + (3,5*10- 3)2 +
(1,0*10- 3)2 + (2,4*10- 4)2 + (1,2*10- 3)2
µ sol. Madre = √ 5,024*10-5
µ sol. Madre = 0,007
Se puede observar que la incertidumbre asociada a la preparación y valoración de la
solución madre es un valor que se lo puede considerar despreciable o muy pequeño.
Fuente de error nº 2: Asociada a la incertidumbre directa de la curva de calibración
medida en el instrumento espectrofotométrico
A partir de la solución madre de nitrito, se prepararon diferentes patrones que participaron
en la creación de la cuerva de calibración. Al obtener la recta de regresión mediante el
método de mínimos cuadrados, se considera que la desviación estándar de una
concentración es la incertidumbre de la misma.
Esta fuente se la consideró como el error de la concentración estimada a partir de la
interpolación de la intensidad de la muestra en la curva de calibración, y se calculó su
incertidumbre a partir de la siguiente ecuación citada en el documento de Entidad Nacional
de Acreditación de Madrid (CEA-ENAC, 2000).
Siendo:
µCal = Incertidumbre del mesurando obtenida por el instrumento calibrado.
SY/X =Desviación estándar residual del cálculo de la regresión lineal.
b= Pendiente de la recta.
m=Número de réplicas de la muestra en estudio.
n=Número de patrones utilizados para obtener la curva de calibración.
Xpred=Concentración del analito leído en la muestra.
µCal= (Sy/x/b) * 1/m + 1/n + (xpred-Xcal)2/ ∑(Xi-Xcal)
2
53
Xcal=Valor medio de las concentraciones de los patrones empleados en cada uno de los
puntos de la curva de calibración.
Xi=Cada una de las concentraciones de los patrones de la curva de calibración.
A continuación se muestra tabla 10, que muestra el resumen de la estimación de la
incertidumbre para la fuente de error nº 2, los cálculos auxiliares pueden consultarse en el
anexo I, punto nº7.
Tabla 10: Resultados obtenidos de la estimación de la incertidumbre estándar y relativa asociada a la curva de
calibración medida en el instrumento espectrofotométrico
Concentraciones de patrones 0,084 mgL-1
0,164 mgL-1
0,328 mgL-1
0,657 mgL-1
µCal (mg/l) 0,009551 0,008405 0,0075098 0,011872
µ relativa 0,1137 0,05125 0,022896 0,018070
Sumatoria cuadrática µ Cal relativa 0,128
Si se suma cuadráticamente las incertidumbres relativas individuales para cada
concentración del patrón nitrito de sodio se obtiene que la incertidumbre relativa total es
igual a 0,128.
Si se observa el valor asociado a la incertidumbre de la lectura de la curva de calibración
en el instrumental, se puede decir que la incertidumbre estimada para esa fuente de error
es considerable y se estima que aportará directamente a la incertidumbre total del método
en estudio.
Fuente de error nº 3: Asociada a la incertidumbre de la precisión del método en
estudio
La incertidumbre asociada al error aleatorio es aquella relacionada a la precisión
intermedia del método; es importante recordar que la reproducibilidad como fuente de error
tiene en consideración la repetición de la técnica por diferentes analistas en días distintos,
bajo las mismas condiciones de ensayo, mediante el análisis estadístico de una esta serie
de observaciones. Se calculó la desviación típica de acuerdo a los datos obtenidos en la
validación y dividiendo por la raíz cuadrada de las 10 determinaciones realizadas, resulta
que la incertidumbre estándar estimada para la precisión intermedia fue de 0,00032 mgL-1.
A continuación se presentan los cálculos.
54
µ =𝐒𝐫
√𝒏=𝟎,𝟎𝟎𝟏
√𝟏𝟎= 0, 0003 mgL-1
La relativización permite visualizar la incertidumbre por unidad de medida para su
obtención se debe dividir la incertidumbre estándar por la concentración medida que es
0,084 mgL-1, lo que resultó como valor de incertidumbre relativa 0,004 adimensional. A
continuación se pueden observar los resultados representados en la tabla 11.
Tabla 11: Resultados obtenidos de la estimación de la incertidumbre estándar y relativa asociada a la precisión
intermedia del método en estudio
µ mgL-1 Concentración mgL-1 µ relativa
0,00032 0,084 0,004
Se puede observar que la incertidumbre relacionada a la precisión intermedia, reflejó un
valor despreciable, es decir se espera que esta fuente de error no aporte a la incertidumbre
total del método en cuestión. Los cálculos de la estimación pueden consultarse en el punto
8 del anexo I.
Fuente de error nº 4: Asociada a la incertidumbre de la exactitud del método en
estudio
Teniendo en cuenta que el análisis de la exactitud en la validación del método se obtuvo a
partir de la recuperación de un patrón de nitrito de sodio de alta pureza dosificado en
concentraciones conocidas, se consideró para el cálculo de la estimación de incertidumbre
asociada a esta fuente a la incertidumbre relativa de la pureza del analito y la desviación
estándar más significativa de la concentración de nitrito de sodio utilizada en la exactitud
del método durante su validación.
La incertidumbre relacionada a la pureza del patrón nitrito de sodio fue calculada para la
fuente asociada a la preparación y valoración de la solución madre de nitrito de sodio; se
puede observar en la tabla 9 de la página 51, su valor hace concluir que la misma es
despreciable; ya que no aportaría significativamente en la incertidumbre total del método.
Sin embargo; la desviación estándar que presenta la exactitud para la recuperación de la
concentración de 0,0164 mgL-1 de nitrito de sodio es de 0,0031 mgL-1 que al relativizarla
55
entregó un resultado de 0,019, fue el valor de incertidumbre que se aceptó como aporte
significativo a la incertidumbre total.
Tabla 12: Resultados obtenidos de la estimación de la incertidumbre estándar y relativa asociada a la exactitud
del método en estudio
Incertidumbre estándar valor x µrelativa
0,00057 g 0,9999 g 0,000570
0,0031 mgL-1 0,1634 mgL-1 0,019
0,019
Los cálculos para la estimación de la incertidumbre pueden observarse en el punto 9 del
anexo I.
4.1.4 Etapa IV: Cálculo de la incertidumbre combinada y expandida
Calcular la incertidumbre combinada del método en estudio
Para poder estimar la incertidumbre total del método, una vez analizadas las distintas
fuentes que aportaron un valor de incertidumbre de forma individual, se deben combinar
las mismas, es decir se deben sumar cuadráticamente cada una y obtener una única
incertidumbre para el método colorimétrico 4500-NO2- - B publicado en el Standard
Methods.
Siendo la Incertidumbre relativa estándar asociada a la fuente de error nº1 (Asociadas a la
soluciones)= 0,007, la asociada a la fuente de error nº2 (Asociadas a la curva de
calibración)= 0,128, la asociada a la fuente de error nº3 (Asociada a la precisión)= 0,004, y
finalmente, la Incertidumbre relativa estándar asociada a la fuente de error nº4 (Asociada a
la exactitud)= 0,019, por lo tanto, la incertidumbre combinada es:
𝑢𝑐 (𝑝; 𝑞) = (µ/𝑝)2 + (µ/𝑞)2
µ C= √(0,007)2 + (0,128)2 + (0,004)2 + (0,019)2
µ C = √ 0.01681
µ C = 𝟎,𝟏𝟐𝟗
56
Se puede observar que la incertidumbre asociada a la preparación y valoración de la
solución madre de nitrito y la asociada a la precisión del método en estudio, reflejaron
valores despreciables, es decir que estas fuentes de errores no aportarán
significativamente a la incertidumbre total del método en cuestión.
Elección del nivel de confianza y cálculo de la incertidumbre expandida
El último paso a obtener es la incertidumbre expandida (U), que se obtiene multiplicando la
incertidumbre combinada final por el factor de cobertura llamado k, asegurando así que el
resultado se encontrará dentro del intervalo establecido con una probabilidad del 95% de
confianza, considerando a k=2 bajo una distribución normal. El cálculo de la estimación
fue
U = µ COMB x k
U = 0,129 x 2
U = 0,26
Se concluye que la mayor fuente de incertidumbre fue la asociada a la lectura de la curva
de calibración en el espectrofotómetro uv-visible. Por lo tanto se puede considerar que la
incertidumbre del método colorimétrico 4500-NO2 - - B publicado en el Standard Methods y
desarrollado bajo las condiciones de la validación es de ± 0,26 por cada unidad de
resultado, es decir, que para obtener el valor de incertidumbre de una concentración dada
se debe multiplicar a ésta por 0,26 y el resultado corresponde al valor de incertidumbre
expandida del método para la concentración obtenida. El cual es un valor razonable
teniendo en cuenta el rango de valores analizados y que los mismos serán expresados con
una confianza del 95%.
El conocimiento de la incertidumbre del método implica un aumento de la confianza del
resultado de medición.
57
Capitulo V: Conclusiones
58
5. Conclusiones
Se logró evaluar una metodología analítica para la determinación del ión nitrito en aguas
no coloreadas, (basada en el método colorimétrico 4500-NO2- - B publicado en el Standard
Methods) mediante el análisis de los parámetros linealidad, límites lineales, precisión,
exactitud y estimación de la incertidumbre.
Bajo las condiciones dadas se pudo establecer una respuesta lineal del método. Se obtuvo
un coeficiente de correlación y un coeficiente de determinación acordes a lo establecido
por las guías y normativas consultadas. El modelo de línea recta propuesto es el adecuado
y los límites lineales fueron aceptados por lo criterios establecidos por DeSain, Martin-
Smith y Rudd y cumpliendo el límite legislado por el Código Alimentario Argentino.
En la determinación de la precisión del método, el CV% obtenido cumplió con lo
establecido por I.U.P.A.C y DeSain, Martin-Smith y Rudd, además con respecto a la
exactitud, los valores de recuperación obtenidos fueron satisfactorios debido a que están
dentro del rango recomendado por la normativa vigente; con lo que se concluye que el
método es preciso y exacto para determinar la concentración de ión nitrito en aguas no
coloreadas para consumo.
La estimación de la incertidumbre total del método se obtuvo exitosamente, dando lugar a
un método confiable para controlar los niveles de concentración de nitrito de sodio
establecidos por la legislación regida en Argentina. Con los resultados obtenidos se puede
concluir que se cumple la hipótesis planteada, ya que fue posible determinar la
concentración en mgL-1 de ión nitrito en aguas no coloreadas para consumos humano
utilizando una metodología analítica validada y de resultados confiables.
59
6. Bibliografía
1. ANAYA, PAJUELO R. 1999. “Investigación de la acción de los nitratos y nitritos
contenidos en algunos vegetales como causantes de metahemoglobinemia”. Vol 2,
número 1. 2-3 p. http:revistasinvestigacion.unmsm.edu.pe. [consulta: 5 de
noviembre 2016].
2. Apunte técnico “Espectrofotometría: Espectros de absorción y cuantificación
colorimétrica de biomoléculas”. Universidad de Córdoba. Departamento de
Bioquímica y biología molecular. 2017. https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/practicasgenerales.htm. [consulta: 20 de noviembre 2016].
3. C.E.N.A.M. Guía para estimar la incertidumbre de la medición. W. Schmid y R.
Lazos, febrero, 2004. http://www.cenam.mx . [Última consulta: 20 de julio 2017].
4. CODIGO ALIMENTARIO ARGENTINO, 2010. Capítulo XII. Art.982 Agua.
http://www.anmat.gov.ar/alimentos/normativas_alimentos_caa.asp. [Última
consulta: 15 de octubre 2017].
5. Documento CEA-ENAC-LC/02, “Guía para la expresión de la incertidumbre de
medida de las calibraciones”. Entidad Nacional de Acreditación. Madrid, 2000.
6. ENRIQUEZ, PEDRO A. Monografía: “Evaluación del riesgo ambiental a la liberación
de plaguicidas”. http://www.monografias.com/trabajos10/evaries/evaries.shtml.
[consulta: 20 de noviembre 2015].
7. EURACHEM/CITAC “La Adecuación al uso de los métodos analíticos – guía del
laboratorio para la validación de métodos y temas relacionados”. 1° Edición 2016.
http://www.eurachem.org. [Última consulta: 6 de agosto 2017].
8. FABRO, MABEL. 2015. “Validación de metodologías analíticas”. Curso Teórico
Práctico dictado el 6 y 7 de abril 2015. INTI Mendoza.
9. FABRO, MABEL. 2015. “Calculo de Incertidumbre en metodologías analíticas”.
Curso Teórico Práctico dictado el 7 y 8 de septiembre 2015. INTI Mendoza.
60
10. F.A.O "Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación".
http://www.fao.org. Fundación 16 de octubre 1945. [Última consulta: 6 de enero
2016].
11. FERNANDEZ, MIGUEL 2006. “Origen de los nitratos y nitritos y su influencia en la
potabilidad de las aguas subterráneas”.
https://revista.ismm.edu.cu/index.php/revistamg/article/view/pdf. [consulta: 20 de
noviembre 2015].
12. GONZALES, FERNANDO 2011. “Contaminación por fertilizantes: Un serio
problema ambiental”. http://fgonzalesh.blogspot.com.ar/2011/01/contaminacion-por-
fertilizantes-un.html. [consulta: 11 de diciembre 2017].
13. GUIFFRE, LIDIA. 2001, “Impacto ambiental en ecosistemas”1° Edición 7-8; 98-100
p.
14. GUIFFRE, LIDIA. 2003, “Impacto ambiental en ecosistemas”. 2° Edición. 176-182 p.
15. G.U.M. “Guías para la Expresión de Incertidumbres de la Medición”. Segunda
impresión INTI, 2000.Traducción INTI-CEFIS. [Última consulta: 16 de agosto 2017].
16. ISO 99: 2007 “Vocabulario internacional de metrología- conceptos básicos y
general y términos asociados”. 1° Edición 2007. Versión corregida 2010.
http://www.iso.org. [Última consulta: 16 de julio 2017].
17. ISO 3696: 1987 “Water for Analytical laboratory use- specification and test
methods”. 1st Edition 1987. http://www.iso.org. [Última consulta: 16 de julio 2017].
18. ISO 9001: 2008 “Sistemas de gestión de calidad- requisitos”. 4° Edición. Suiza. 11-
31p. http://www.iso.org. [Última consulta: 16 de julio 2016].
19. I.U.P.A.C “La unión internacional de química pura y aplicada”. Fundada en 1919
https://iupac.org [Última consulta: 10 marzo 2016].
20. LINDER, ERNEST; (Traducción Torromé Pérez, Aurora). 1995, “Toxicología de los
alimentos”. 2° Edición. 177-184 p.
21. MAROTO, SANCHEZ ALICIA. 2002 Tesis doctoral. “Incertidumbre en métodos
analíticos de rutina”. Facultad de Química Universidad Rovira I Virgili, Tarragona.
España. Bibliografía citada y consultada no expresamente citada.
61
22. MOLINA, I. 2012. Metodología para la determinación de plaguicidas bencimidazoles
en vino por cromatografía líquida de alta resolución. Universidad Nacional de Cuyo,
Facultad de Ciencias Agrarias. Mendoza, Argentina. Bibliografía citada y consultada
no expresamente citada.
23. O.A.A. ORGANISMO ARGENTINO DE ACREDITACION “Guía para la Validación
de Métodos de Ensayo”. Código: GUI-LE-03. Versión n°1. Edición junio 2013.
http://www.oaa.ar>docs. [Última consulta: 16 de julio 2017].
24. O.A.A. ORGANISMO ARGENTINO DE ACREDITACION “Expresión de la
incertidumbre de medida en las calibraciones/ensayos”. Código: GUI-LE-01.
Versión n° 1. Edición junio 2013. http://www.oaa.ar>docs . [Última consulta: 15 de
agosto 2017].
25. O.M.S "Organización Mundial de la Salud”. Fundación Suiza 1948.
http://www.owho.int. [Última consulta: 5 de enero 2016].
26. QUATTROCCHI, O. 2015. Modulo 6: “Validación de metodologías analíticas por
HPLC” Curso Teórico Práctico dictado el 27 y 28 de abril 2015. INV, Mendoza.
27. SILVESTRE, ALEJANDRO A., 1995, “Toxicología de los alimentos”. 1° Edición.
Buenos Aires. 250-254 p.
28. STANDARD METHODOS ONLINE, 2011, “Método colorimétrico- 4500- NO2- B”,
22° Edición. Capítulo IV. 1-2 p. http://www.standardmethods.org. [Última consulta:
20 de noviembre 2017].
62
7. Anexo I
1. MATERIALES
1.1 Equipamiento de laboratorio
Balanza analítica Sartorius.
Heladera Coventry.
Plancha calefactora con agitador magnético.
Material volumétrico calibrado.
Cubetas de vidrio o cuarzo con tapa y con paso óptico de 1cm.
1.2 Equipamiento utilizado
Espectrofotómetro uv-visible. Marca Shimatzu.
1.3 Drogas y reactivos
Agua destilada, exenta de nitritos (grado 3).
Ácido Fosfórico 85%. Ciccarelli.
Sulfanilamida.
Diclorhidrato de N-(1-naftil)-etilendiamina.
Oxalato de sodio. Calidad estándar primario.
Permanganato de potasio, grado p.a,
Nitrito de sodio, grado p.a, calidad estándar primario.
2. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES
a) Solución de reactivo colorante: Añadir a 800ml de agua destilada, 100 mL de ácido
fosfórico 85% y 10 g de sulfanilamida, disolver y añadir 1 g diclorhidrato de N-(1-
naftil)-etilendiamina, disolver y enrasar a 1000 mL.
b) Solución de oxalato de sodio 0,05 N: Pesar 3,350g +/- 0,01g de Na2 C2O4 y
colocarlo en matraz de 100 mL. Disolver y enrasar con agua destilada.
63
c) Solución de permanganato de potasio 0,05 N: Disolver 1,6g de KMnO4 en 1L de
agua destilada. Guardar en un frasco color caramelo por lo menos una semana
antes de ser usado.
Estandarizar: Pesar de 100 a 200 mg +/- 0,1mg de Na2 C2O4 varias muestra, añadir
100 mL de agua destilada y agitar hasta que se disuelva. Añadir 10 ml de acido
sulfúrico 1+1 y calentar rápidamente entre 90°C y 95 °C, no dejar que la
temperatura descienda por debajo de 85°C y agitando constantemente. Titular
rápidamente con la solución de permanganato de potasio que se va a estandarizar,
hasta un punto final de un ligero color rosa que ha de persistir durante por lo menos
1 minuto. Realizar un blanco a base de agua destilada y ácido sulfúrico. Calcular la
media de los resultados de varias titulaciones.
Molaridad de KMnO4= Xg Na2 C2O4/ (A-B) x 0,33505
Normalidad de KMnO4= Xg Na2 C2O4/ (A-B) x 0,067
Siendo
A= mL de reactivo de titulación para la muestra.
B= mL de reactivo de titulación para el blanco.
Gasto ml Gramos Molaridad Gasto ml Factor
31,825 0,10655 0,010 0,1 1,00
Titulación permanganato de potasio 0.01M
solucion Blanco
64
d) Preparación de solución inicial o madre de nitrito de sodio: Ecuación para el
cálculo de la estandarización de la solución madre de NO2-
1,00 mL solución = 250 µg N = 0,8214 mg NO2-.
(A)= [(B x C) - (D x E)]x 7/F
Siendo:
(A)= mg NO2- NmL-1 en la solución madre de NaNO2.
B= total de mL-1 utilizados de KMnO4 0,05 N.
C= Normalidad de KMnO4 patrón.
D= total de mL adicionados del reductor patrón, de Na2 C2O4 0,025 M.
F= mL de solución madre de NaNO2 tomados para titular.
Cada 1 mL de KMnO4 0,05 N consumido por la solución de Na2 C2O4 0,05 N
corresponde a 1750 µg NO2-N.
3. CÁLCULOS
3.1 Expresión de los resultados
Para calcular la concentración de nitritos en la muestra de agua directamente a partir de la
curva de calibración, se utiliza la siguiente expresión:
C= K x Abs + B
C= valor de la concentración expresado en mg NO2-L-1.
K= pendiente de la curva patrón.
B= ordenada al origen de la curva patrón.
Gasto ml ml Oxalato mg Nitritos en sol Gasto ml ml Oxalato mg Nitritos en sol
58 20 0,2660 3,1 50 0,0217 0,2443
Titulación de solución Madre
solucion Blanco mg de nitritos
reales en solucion
65
3.2 Criterio de aceptación de resultados
La diferencia entre los dos ensayos duplicados, debe ser menor o igual al 20%, de la
media obtenida a partir de dichos resultados.
4. ACCIONES CORRECTIVAS
Si los resultados efectuados por duplicado, no se encuentran dentro de los valores
establecidos, se aplican las siguientes acciones correctivas:
Controlar los reactivos empleados.
Controlar las cubetas empleadas.
Controlar el ajuste del espectrofotómetro.
Repetir el ensayo.
5. VERIFICACION DE LA NO VARIACION DE LA LECTURA
ESPECTROFOTOMETRICA CON RESPECTO AL TIEMPO TRANSCURIDO
Primera lectura media hora después de haber agregado el reactivo colorante a una
muestra de concentración 0,084 mg NO2-L-1 a 542 nm.
Media hora después de haber agregado el reactivo colorante
Abs cc
0,080 0,084
Una hora más tarde del agregado del reactivo colorante
Abs cc
0,081 0,084
66
Dos horas más tarde del agregado del reactivo colorante
Abs cc
0,080 0,084
Tres horas más tarde del agregado del reactivo colorante
Abs cc
0,081 0,084
6. ESTIMACIÓN DEL CÁLCULO DE INCERTIDUMBRE ESTÁNDAR PARA LAS
SOLUCIONES DE PERMANGANATO DE POTASIO 0,05 N Y OXALATO DE SODIO 0,05
N UTILIZADAS EN LA VALORACIÓN DE LA SOLUCIÓN MADRE DE NITRITO DE
SODIO
Preparación y valoración de la solución de permanganato de potasio
Para preparar la solución de permanganato de potasio (MnO4k) 0,05 N, se pesó 1,6 g de
MnO4k en 1000 mL. Se utilizó una balanza analítica cuyo certificado de calibración
establece que la incertidumbre es de 0,0001g, para un k=2, considerando una distribución
normal y una incertidumbre de precisión de la balanza de 0,01 mg.
µbalanza= 0,0001 = 5x10-5 g igual a decir 0,05 mg 2 µbalanza= √(0,05)2+ (0,01)2
µbalanza=0,05 mg
Considerando la verificación del material volumétrico para la preparación de la solución de
permanganato de potasio: se utilizó un matraz de 1000 mL (SV70), con certificado del
fabricante, ± 0,35 mL de volumen interno del matraz, se supone una distribución normal
con k=2.
67
µmatraz 1000mL = 0,35 = 0,175 Ml 2
Para preparar la solución de oxalato de sodio (Na2C2O4) 0,05 N, que se utilizó en la
valoración del permanganato de potasio y para la valoración de la solución madre, se pesó
3350 mg de Na2C2O4, se utilizó una balanza analítica cuyo certificado de calibración
establece que la incertidumbre es de 0,0001g, para un k=2, considerando una distribución
normal y una incertidumbre de precisión de la balanza de 0,01 mg.
µbalanza= 0,0001 = 5x10-5 g igual a decir 0,05 mg 2 µbalanza= √(0,05)2+ (0,01)2
µbalanza=0,05 mg
Para la pureza del oxalato de sodio, se consideró la información aportada por la hoja
técnica de Merck. 0,998 ± 0,001. Por lo que se supone una distribución rectangular.
µPureza (oxalato de sodio)= 0,001
√3 = 0,00057mg
Considerando la verificación de el material volumétrico, para la preparación de la solución
de oxalato de sodio: se usó matraz de 250 mL (SV62), con certificado del fabricante, ±
0,31mL de volumen interno del matraz, se supone una distribución normal con k=2.
µmatraz 250 ml = 0,31 = 0,155 mL 2 La incertidumbre de la bureta de 10 mL identificada como SV53 fue calculada, a partir de la
información otorgada por el certificado del fabricante, con ± 0,08 ml de volumen interno y
se la asoció a una distribución normal con k=2.
µbureta 25 ml= 0,08 = 0,04 mL 2
Considerando la verificación de el termómetro (SV81 de 25º C), usado para la medición de
la temperatura de reacción (90-95ºC), para la valoración de la solución de permanganato
de potasio. Se realizó la verificación usando el certificado del fabricante ± 0,01 º C de
corrección de temperatura, se supone una distribución rectangular.
68
µtermómetro= 0,01
√3 = 0,006 º C
El efecto de la temperatura en la dilatación del agua, con una variación de temperatura
ambiental de ± 10 ºC, respecto a la temperatura de calibración de la bureta de 25 mL. El
coeficiente de expansión del agua es 2,1*10-4/ºC. Se considera una distribución
rectangular.
µ Temp expansión = 25 mL x 10 º C x 2,1 x 10-4 = 0,03 √3 7. FUENTE DE ERROR Nº 2 ASOCIADA A LA INCERTIDUMBRE DIRECTA DE LA
CURVA DE CALIBRACIÓN MEDIDA EN EL INSTRUMENTO
ESPECTROFOTOMÉTRICO
µCal= (Sy/x/b) * 1/m + 1/n + (xpred-Xcal)2/ ∑(Xi-Xcal)
2 (ecuación 1.3)
Referencias:
µCal = Incertidumbre del mesurando obtenida por el instrumento calibrado.
SY/X =Desviación estándar residual del cálculo de la regresión lineal.
b= Pendiente de la recta.
m=Número de réplicas de la muestra en estudio.
n=Número de patrones utilizados para obtener la curva de calibración.
Xpred=Concentración del analito leído en la muestra.
Xcal=Valor medio de las concentraciones de los patrones empleados en cada uno de los puntos de la curva de calibración.
Xi=Cada una de las concentraciones de los patrones de la curva de calibración.
69
Concentración de los patrones de la curva de calibración
Xi = 0,084 0,164 0,328 0,657
Sy/x = 0,0125 0,0125 0,0125 0,0125
b = 1,077 1,077 1,077 1,077
m = 3 3 3 3
n = 12 12 12 12
Xpred = 0,084 0,164 0,328 0,657
Xcal = 0,3083 0,3083 0,3083 0,3083
(Xpred-Xcal)2 = 0,05031049 0,02082249 0,00038809 0,12159169
(Xi-Xcal)2 = 0,05031049 0,02082249 0,00038809 0,12159169
∑(Xi-Xcal)2 = 0,19311276 0,19311276 0,19311276 0,19311276
(Xpred-Xcal)2/ ∑(Xi-Xcal)2= 0,26052 0,10783 0,00201 0,62964
1/m= 0,333333333 0,333333333 0,333333333 0,333333333
1/n= 0,083333333 0,083333333 0,083333333 0,083333333
Sy/x /b = 0,011606314 0,011606314 0,011606314 0,011606314
1/m+1/n+(Xpred-Xcal)2/ ∑(Xi-Xcal)2 0,67719 0,52449 0,41868 1,04631
√1/m+1/n+(Xpred-Xcal)2/ ∑(Xi-Xcal)2 0,822915895 0,72421835 0,647052024 1,022891762
µCal (mg/l) 0,00955102 0,008405505 0,007509889 0,011872003
concentraciones de patrones 0,084 mgL-1
0,164 mgL-1
0,328 mgL-1
0,657 mgL-1
µCal (mgL-1) 0,00955102 0,008405505 0,007509889 0,011872003
Relativizar 0,113702621 0,051253082 0,022896003 0,018070019
Cuadráticamente 0,012928286 0,002626878 0,000524227 0,000326526
sumatoria cuadrática 0,016405917
8. FUENTE DE ERROR Nº 3 ASOCIADA A LA INCERTIDUMBRE DE LA PRECISIÓN
DEL MÉTODO EN ESTUDIO
Se evalúan mediante el análisis estadístico de una serie de observaciones,
calculando la desviación típica en condiciones de reproducibilidad, de acuerdo
a los datos obtenidos en la validación resulta que:
Referencias:
Sr= Desviación estándar obtenida en las muestras en condiciones de reproducibilidad.
n= número de repeticiones que se realizan por cada serie.
µ =Sr
√𝑛=
0,001
√10= 0,0003 mg/l
70
Relativizando:
µ mg/l concentración mg/l µrelativa
0,00032 0,084 0,004 µ r precisión= 0,004
9. FUENTE DE ERROR Nº 4 ASOCIADA A LA INCERTIDUMBRE DE LA EXACTITUD
DEL MÉTODO EN ESTUDIO
Desviación estándar del patrón nitrito de sodio para una concentración de 0,0164 mg/l, en
la validación del método.
Dosificación mg/l Abs 543 nm
Resultados cc mg/l Recuperación (%R)
0,164 0,157 0,166 101
0,164 0,155 0,164 100
0,164 0,151 0,160 98
Media
0,1634 100
DS
0,0031 1,877
CV%
1,8843 1,884
La incertidumbre asociada a la pureza del patrón de nitrito de sodio fue tomada de la tabla
8 del presente trabajo, por lo tanto los cálculos finales para la incertidumbre relativa total de
la exactitud es:
Incertidumbre estándar valor x µrelativa
0,00057 g 0,9999 g 0,000570
0,0031 mgL-1 0,1634 mg/l 0,019
0,019
71
10. TABLA DE DISTRIBUCIÓN T-STUDENT
72
11. TABLA DE FISHER
73
8. Anexo II
N° lecturas abs 542 nm CC mg N/l CC mg NO2-/l
1 0,080 0,03 0,084
2 0,081 0,03 0,084
3 0,080 0,03 0,084
4 0,152 0,05 0,164
5 0,149 0,05 0,163
6 0,151 0,05 0,164
7 0,337 0,10 0,328
8 0,314 0,10 0,327
9 0,298 0,10 0,326
10 0,597 0,20 0,656
11 0,605 0,20 0,657
12 0,623 0,20 0,658 0,99858
Linealidad
Grafico N°1: Ajuste con el modelo de regresión simple lineal. Curva de
calibración del estándar de nitrito de sodio para cuatro niveles de
concentración.
coeficiente de correlación lineal simple=
DETERMINACION DE NITRITOS.SM4500NO2--B
Tabla de Resultados obtenidos del ensayo de linealidad para NO2- en agua
y = 1,0779x - 0,0035R² = 0,9972
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800
Co
nce
ntr
ació
n N
O2-
mg/
l
Absorvancia nm
Resumen
Estadísticas de la regresión
Coeficiente de correlación múltiple 0,998506772
Coeficiente de determinación R^2 0,997015774
R^2 ajustado 0,996717351
Error típico 0,013148675
Observaciones 12
F > Fcrit Se rechaza H 0
ANÁLISIS DE VARIANZA
Grados de libertad Suma de cuadradosPromedio de los cuadrados F Valor crítico de F Fcrit < F
Regresión 1 0,577609374 0,577609374 3340,952357 5,83177E-14 hay regresion lineal
Residuos 10 0,001728876 0,000172888
Total 11 0,57933825
Coeficientes Error típico Estadístico t Probabilidad Inferior 95% Superior 95%
Intercepción -0,002894716 0,006586682 -0,439480116 0,669658769 -0,017570758 0,01178133
Variable X 1 1,077246564 0,01863717 57,80097194 5,83177E-14 1,03572036 1,11877277
contiene al cero
Análisis de los residuales
Observación Pronóstico para Y Residuos Residuos estándares
1 0,083285009 0,000714991 0,057031496
2 0,083285009 0,000714991 0,057031496
3 0,083285009 0,000714991 0,057031496
4 0,160846762 0,003153238 0,251519196
5 0,157615022 0,006384978 0,509300099
6 0,159769515 0,004230485 0,337446164
7 0,360137376 -0,032137376 -2,563449602
8 0,335360705 -0,007360705 -0,58712935
9 0,31812476 0,00987524 0,787702129
10 0,640221483 0,016778517 1,33834459
11 0,648839455 0,008160545 0,65092885
12 0,668229893 -0,011229893 -0,895756564
0,012536769
1,077
0,011640454
desviacion estandar SX/Y
pendiente de la curva b
SX/Y/b
74
Cálculo de t para β 1 (α=0,05)
n° de Obs Absorbancia (X) Concentracion (Y) X² Y² X . Y
1 0,080 0,084 0,006400 0,0070560 0,006720
2 0,081 0,084 0,006561 0,0070560 0,006804
3 0,080 0,084 0,006400 0,0070560 0,006720
4 0,152 0,164 0,023104 0,0268960 0,024928
5 0,149 0,163 0,022201 0,0265690 0,024287
6 0,151 0,164 0,022801 0,0268960 0,024764
7 0,337 0,329 0,113569 0,1082410 0,110873
8 0,314 0,328 0,098596 0,1075840 0,102992
9 0,298 0,327 0,088804 0,1069290 0,097446
10 0,597 0,656 0,356409 0,4303360 0,391632
11 0,605 0,657 0,366025 0,4316490 0,397485
12 0,623 0,658 0,388129 0,4329640 0,409934
∑ 3,467 3,698 1,498999 1,7192320 1,604585
(ΣX*ΣY) 12,820966
Sumatorias al cuadrados 12,020089 13,675204
Datos utilizados
Ecuación de la recta= y= 1,0779x- 0,0035
n= 12
β1= 1,0779
β0= -0,0035
grados de libertad n-2 = 10
(Syy-β1*Sxy)= 0,001692766
Ecuaciones utilizadas
Sxy=(∑(X*Y)- (∑X*∑Y/n) 0,536171167
Sxx= ∑X²- (∑(X²)/n) 0,497324917
SYY= (∑Y²)- (∑(Y²)/n) 0,579631667
σ² = (SYY- β1*Sxy)/ n-2 0,000169277
var (β1)= σ² /Sxx 0,000340374
Desv.Típ. (β1)=√σ² /Sxx 0,018449235
(tα/2; n-2)
Para β1= 0
t muestral= (β1/Sβ1)
t muestral= 58,42518584
tcrítico= tabular (tα/2; n-2)
tcrítico= 2,228
tm > tcSe rechaza la hipotesis nula que
β1= 0= 0
Tabla para Prueba de hipotesis para evaluar la ecuacion de regresión lineal
75
Concentración= 0,084 mg NO2-/l
Tabla de Resultados obtenidos del ensayo de limite de cuantificación para NO2- en agua
N° lecturas ABS nm CC mg NO2-/l
1 0,08 0,084
2 0,082 0,085
3 0,082 0,085
4 0,080 0,084
5 0,081 0,084
6 0,080 0,084
7 0,080 0,084
8 0,080 0,084
9 0,080 0,084
10 0,082 0,085
Muestra 10 10
Media 0,0807 0,084
desviación estándar 0,0009 0,00048
CV % 1,2 0,6
Concentración= 0,042 mg NO2-/l 50% de 0,084 mgNO2
-/l
N° lecturas ABS nm CC mg NO2-/l
1 0,04 0,042
2 0,038 0,0370
3 0,045 0,045
4 0,035 0,035
5 0,037 0,036
Media 0,039 0,039
desviación estándar 0,0038 0,0043
CV % 9,8 11,0
Limite de cuantificación
Limite de Detección
Tabla de Resultados obtenidos del ensayo de limite de detección para NO2- en agua
Límites lineales
76
Tabla de Resultados obtenidos del ensayo de repetividad para NO 2- en agua para analista 1
Analista 1 Determinación Lectura abs Concetración
1 0,079 0,083
2 0,08 0,083
3 0,079 0,083
4 0,08 0,084
5 0,079 0,083
6 0,079 0,083
7 0,08 0,084
8 0,08 0,084
9 0,081 0,085
10 0,081 0,085
0,084
0,0008
0,98
0,0023
Analista 2 día 2
Tabla de Resultados obtenidos del ensayo de repetividad para NO2- en agua para analista 2
Determinación Lectura abs Concetración
1 0,080 0,084
2 0,083 0,087
3 0,080 0,084
4 0,080 0,084
5 0,083 0,087
6 0,080 0,084
7 0,080 0,084
8 0,082 0,085
9 0,079 0,083
10 0,084 0,088
0,085 mg NO2-L-1
0,001 mg NO2-L-1
1,18
0,0028
Desviación estándar mg NO2-L-1
CV%
CV%
Repetividad límite, r =
Repetitividad límite, r =
PRECISIÓN
s
REPETIVIDAD
Media
Media mg NO2- L-1
77
Tabla de Resultados obtenidos del ensayo de reproducibilidad para NO2- en agua
Lectura abs mg NO2-/l
1 0,079 0,083
2 0,08 0,083
3 0,079 0,083
4 0,08 0,084
5 0,079 0,083
6 0,079 0,083
7 0,08 0,084
8 0,08 0,084
9 0,081 0,085
10 0,081 0,085
11 0,080 0,084
12 0,083 0,087
13 0,080 0,084
14 0,080 0,084
15 0,083 0,087
16 0,080 0,084
17 0,080 0,084
18 0,082 0,085
19 0,079 0,083
20 0,081 0,088
Media 0,084 mg NO2-L-1
Desv. Estándar 0,001 mg NO2-L-1
CV% 1,73
0,00409Reproducibilidad limite, R =
PRESICIÓN INTERMEDIA: Reproducibilidad
Se evaluaron los datos correspondientes a los dos analistas
78
F = S2 (1)
S2 (2)
n-1= 9
Confianza = 95%
F (9,9;95) = 3,18
S2 (1) = 0,00000064
S2 (2)= 0,000001
F= 0,64
F EXP < F TAB
Test de Fisher
Precisión: Criterios de aceptación
No hay diferencias estadisticamente significativas
entre las repetibilidades
79
EXACTITUD
Tabla de Resultados de las recuperaciones obtenidas
Dosificacion mgL-1 Abs 543 Resultados cc mgL-1 Recuperacion (%R)
0,084 0,080 0,084 100
0,084 0,081 0,085 101
0,084 0,080 0,084 100
Media 0,0843 100
DS 0,0006 0,6873
CV% 0,6846 0,6846
0,164 0,157 0,1660 101
0,164 0,155 0,1642 100
0,164 0,151 0,1600 98
Media 0,1634 99,6
DS 0,0031 1,8774
CV% 1,8843 1,8843
0,383 0,372 0,3976 104
0,383 0,370 0,3962 103
0,383 0,371 0,3969 104
Media 0,3969 103,6
DS 0,0007 0,1828
CV% 0,1764 0,1764
Media total 101
DS total 2,17
CV% total 2,14
Donde;
El 100 % es el valor verdadero o esperado
R es la recuperación media
CV% es el coeficiente de variación porcentual
n es el número de repeticiones
t exper = 1,71
t tab = 2,31
α 0,05 nivel de confianza
α/2 0,025
v n-1 8 grados de libertad
%
100exp
CV
nRt
80
81