VALIDACIÓN DE MÉTODOS 1

VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE

ANÁLISIS

VALIDACIÓN DE MÉTODOS 2

Índice

1. ¿Por qué validar un método de análisis?

2. ¿Cuándo validar un método de análisis?

3. Validación de métodos de análisis.

3.1. Selectividad

3.2. Linealidad

3.3. Exactitud

3.4. Precisión

3.5. Límites de detección y cuantificación

3.6. Intervalo de trabajo

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Sólo la utilización de un método validado permite al

analista dar una respuesta fiable al problema analítico

inicialmente planteado

Todas las operaciones de un procedimiento de medida

suponen introducir errores aleatorios y puede que también

sistemáticos, debido a defectos en la instrumentación,

defectos en el operador y defectos en el método de análisis

¿POR QUÉ VALIDAR UN MÉTODO DE ANÁLISIS?

La validación de un método de medida garantiza:

La calidad de la información analítica

La trazabilidad de las medidas

La comparabilidad de los resultados

Facilitar la transferencia de métodos de análisis entre laboratorios.

Apoyar la armonización entre laboratorios.

Reconocimiento mutuo de resultados entre laboratorios.

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Un laboratorio DEBE validar los métodos no normalizados, los métodos desarrollados

en el laboratorio, los métodos normalizados utilizados fuera de su campo de

aplicación previsto, y las ampliaciones o modificaciones de métodos normalizados.

Norma UNE-EN ISO 17025

Un laboratorio NO debe validar los métodos normalizados (ISO, CEN, AENOR)

siempre que su aplicación sea bajo las condiciones estrictamente descritas por

mismos, comprobando que lo aplica correctamente (evaluando la exactitud y la precisión

de sus medidas, u otras propiedades analíticas de interés para la aplicación prevista).

Norma UNE-EN ISO 17025

Métodos oficiales (directivas europeas, BOE, EPA, FDA,…)

Métodos de referencia (ASTM, AOAC, Farmacopeas, …).

¿CUÁNDO VALIDAR UN MÉTODO DE ANÁLISIS?

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Siete parámetros de calidad en una validación:

• Selectividad

• Linealidad

• Exactitud

• Precisión

• Límite de detección

• Límite de cuantificación

• Intervalo de trabajo

Establecer la evidencia documental de que un método conducirá a la obtención de

resultados aceptables dentro de las especificaciones de calidad previamente

establecidas, demostrando ser útil para el fin deseado

Validar un método analítico es documentar su calidad

VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

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Parámetros a ser validados según el tipo de ensayo a realizar

TIPO DE ENSAYO PARÁMETROS

Identificación Selectividad

Selectividad Linealidad Exactitud

Precisión Límite de detección

Determinación cuantitativa

Límite de cuantificación

Selectividad Determinación cualitativa

Límite de detección

Intervalo de trabajo

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Capacidad que tiene un método para medir y/o identificar simultáneamente o

separadamente los analitos de interés, de forma inequívoca, en presencia de otros

componentes que puedan estar presentes en la muestra analizada

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SELECTIVIDAD

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La selectividad es una medida del grado de interferencias que producen los compuestos que acompañan al analito en la muestra

Errores sistemáticos

Error constante

Sustancias presentes en la matriz de la muestra o añadidas durante el proceso analítico.

Se pueden evitar:

- Uso de técnicas de separación (cromatográficas)

- Optimización de las condiciones de operación (interferentes)

- Reacciones de enmascaramiento (interferentes)

- Herramientas quimiométricas

Error proporcional a la concentración del analito

Efectos inespecíficos: efecto de matriz

Se pueden evitar:

- Calibración por adiciones patrón

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SELECTIVIDAD

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VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

SELECTIVIDAD

EVALUACIÓN

DE LA SELECTIVIDAD

Análisis de muestras con

interferencias adicionadas o presentes

Comparación con otros

métodos de referencia

Análisis de

materiales de referencia

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Capacidad del método para proporcionar resultados que son directamente

proporcionales a la concentración del analito en la muestra dentro de un

intervalo de trabajo (una respuesta lineal facilita el trazado, interpolación e

interpretación)

Procedimiento para determinar la linealidad

Estudio a partir de disoluciones patrón según el método de la recta

de calibrado. La linealidad se debe establecer a partir de al menos cinco

niveles de concentración que abarquen todo el intervalo de trabajo y

analizarlos por triplicado

(p.e., tres rectas de calibrado en días distintos para el mismo grupo de patrones )

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LINEALIDAD

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1. Visualización gráfica de la recta de calibrado y de los puntos que la generan.

2. Ecuación de la recta por el método de mínimos cuadrados, coeficiente de correlación (r) y errores de los distintos parámetros de la recta.

3. Análisis gráfico de los residuos.

Criterios de aceptación

• Los puntos de la recta muestran una linealidad adecuada.

El límite de linealidad: punto en que la diferencia entre la señal predicha por el modelo lineal (ŷ) y la señal medida (y) representa el 3% de la señal medida.

• r 0.999 compuestos mayoritarios; r 0.99 compuestos minoritarios.

• Gráfico de residuos muestra una distribución de puntos sin ninguna tendencia

• Test de linealidad: b t sb (intervalo de confianza no debe incluir el cero).

• Test de proporcionalidad: a t sa (intervalo de confianza debe incluir el cero).

- Ordenada en el origen ≤ 2-5 % de la señal media en la recta de calibrado.

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LINEALIDAD: EVALUACIÓN

y = a + bx

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La exactitud es el grado de concordancia entre el resultado de una medida y el

valor real del mesurado

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EXACTITUD

¿Conocemos el valor

verdadero? No, por eso

utilizamos el valor que consideramos como verdadero 100(%)

v

vir

vi

x

xxE

xxE

- Valor certificado de un MRC - Valor obtenido por un

método de referencia - Valor obtenido

por un método alternativo

- Valor añadido a muestras

problema

F

I

A

B

I

L

I

D

A

D

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Una prueba de hipótesis (prueba t de dos muestras) o un análisis de regresión, determina

con un cierto nivel de confianza (95%) que no existen diferencias significativas entre ambos.

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EXACTITUD: EVALUACIÓN

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La precisión indica el grado de concordancia entre los valores de

ensayos independientes obtenidos en unas condiciones bien definidas

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PRECISIÓN

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Repetibilidad

Dispersión de resultados de ensayos mutuamente independientes, utilizando el mismo

método aplicado a alícuotas de la misma muestra, en el mismo laboratorio, por el

mismo operador, usando el mismo equipamiento en un intervalo corto de tiempo. Esta

es una medida de la variabilidad del método y un reflejo de la máxima precisión que el

método puede alcanzar.

Precisión intermedia

Dispersión de resultados entre ensayos mutuamente independientes utilizando el

mismo método aplicado a alícuotas de la misma muestra, en el mismo laboratorio

en diferentes condiciones: distintos operadores, diferente equipamiento o distintos días.

Cabe distinguir: entre días, entre equipamiento y entre operadores.

Reproducibilidad

Dispersión de resultados entre ensayos mutuamente independientes utilizando el

mismo método aplicado a alícuotas de la misma muestra en diferentes laboratorios.

Cabe distinguir: entre días, entre operadores y entre laboratorios. Implica la máxima

dispersión de un mismo proceso analítico.

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PRECISIÓN

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Muestra (s, N<30)

Población (m, N>30)

Desviación estándar

Varianza

Desviación estándar

relativa

Coeficiente de

variación (RSD en %)

xi = valor individual; x = media; N = número de medidas; N-1 = grados de libertad; m = media poblacional

1

1

2

N

xx

s

N

ii

1

1

2

N

xN

ii

m

1

1

2

2

N

xx

s

N

ii

11

2

2

N

xN

i

i m

xsRSD mRSD

100x

sCV 100

m

CV

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PRECISIÓN: EVALUACIÓN

Este parámetro deberá evaluarse en todo el intervalo de trabajo definido para el método de ensayo: - Un mínimo de 3 muestras a 3 niveles de concentración cubriendo el intervalo especificado (9 muestras en total) - Un mínimo de 6 muestras a la concentración nominal * Introducir los intervalos de confianza para cada nivel de concentración

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Uno de los factores que más pueden influir en la precisión de un método

analítico es la concentración del analito, ya que la desviación estándar de

las respuestas obtenidas aumenta al disminuir la concentración del analito

Límites de la DER según la AOAC (1993) y Hortwitz

MétodoIntermediaPrecisión 2 DERDER

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PRECISIÓN: EVALUACIÓN

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VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

LÍMITE DE DETECCIÓN

El límite de detección de un método analítico es la mínima cantidad de

analito presente en la muestra que se puede detectar aunque no

cuantificar bajo las condiciones experimentales descritas para dicho método

0

CLD

0

XLD

XB

XB+3σB

Concentración

Analito

Señal

Analito

Señal

Blanco

Límite de

detección

VALIDACIÓN DE MÉTODOS 19

VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

LÍMITE DE DETECCIÓN

b

σ3LOD B

PROCEDIMIENTOS

PARA DETERMINAR

EL LOD

MÉTODO BASADO EN EL EXAMEN VISUAL

de la mínima concentración detectable

MÉTODO BASADO

EN LA DESVIACIÓN ESTÁNDAR

DE LA RESPUESTA

Y LA PENDIENTE DE LA

RECTA DE CALIBRADO 3

Ruido

SeñalLOD

MÉTODO BASADO

EN LA RELACIÓN

SEÑAL/RUIDO

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VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

LÍMITE DE DETECCIÓN vs LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN

El límite de cuantificación de un método analítico es la mínima cantidad de analito

presente en la muestra que se puede cuantificar bajo las condiciones experimentales

descritas para dicho método, con una adecuada exactitud y precisión

0

CLD

CLC

0

XLD

XLC

XB

XB+3σB

XB+10σB

Concentración

Analito

Señal

Analito

Señal

Blanco

Límite de

detección

Límite de

cuantificación

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VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN

b

σLOD B10

PROCEDIMIENTOS

PARA DETERMINAR

EL LOQ

MÉTODO BASADO EN EL EXAMEN VISUAL

de la mínima concentración detectable

MÉTODO BASADO

EN LA DESVIACIÓN ESTÁNDAR

DE LA RESPUESTA

Y LA PENDIENTE DE LA

RECTA DE CALIBRADO 10

Ruido

SeñalLOD

MÉTODO BASADO

EN LA RELACIÓN

SEÑAL/RUIDO

VALIDACIÓN DE MÉTODOS 22

Intervalo de concentraciones de analito en el que puede obtenerse una exactitud, precisión y linealidad adecuadas al objetivo del método

Concentración

Señal

LOQ

LL

Intervalo de linealidad, intervalo de concentraciones en el que el método presenta una sensibilidad constante.

Intervalo dinámico, intervalo de concentraciones en el que el método proporciona una respuesta que varía con la concentración.

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INTERVALO DE TRABAJO

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BIBLIOGRAFÍA BÁSICA

1. Miller, J.N., Millar, J.C., Estadística y

Quimiometría para Química

Analítica. Prentice Hall, Madrid, 2002.

2. Compañó Beltrán, R., Ríos Castro, A., Garantía de calidad en los

laboratorios analíticos, Editoriall

Síntesis, 2002.

3. Bell, S. Forensic Chemistry, Pearson

International Edition, New Jersey, 2006.