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UtilidadUtilidadUtilidadUtilidad y Valoración y Valoración y Valoración y Valoración de de de de los Test Ilos Test Ilos Test Ilos Test Inmunológicos nmunológicos nmunológicos nmunológicos en el Diagnóstico en el Diagnóstico en el Diagnóstico en el Diagnóstico
de las Enfermedades Difusas del Tejido Cde las Enfermedades Difusas del Tejido Cde las Enfermedades Difusas del Tejido Cde las Enfermedades Difusas del Tejido Conectivo (CTDs)onectivo (CTDs)onectivo (CTDs)onectivo (CTDs)
Antecedentes:
En 1941, Klemperer, Pollack y Baehr fueron los primeros que describieron
Lupus Eritematoso Sistémico (LES) como una de las Enfermedades de Tejido
Conectivo.
Luego en 1948 Malcom Hargrave, Helen Richmond y Robert Morton notaron la
presencia de células LE previamente desconocidas en la médula ósea de un paciente con
LES.(1)
Desde entonces los ANAs han sido divididos en subtipos específicos basándose
en el componente nuclear citoplasmático que atacan. Ejm :anti-DNA, anti-histonas, etc
Niveles elevados de anticuerpos antiDNAds se consideran confirmatorios en el
diagnóstico de LES. Los anti histonas son indicadores de LES indicado por drogas.
Además del DNA e histonas los autoanticuerpos también pueden tener como blanco
otros antígenos nucleares, que fueron llamados ENAs porque originalmente fueron
extraídos del núcleo con salino.
El autoanticuerpo al antígeno Smith (Sm) el cual se considera específico de LES
fue el primer anti-ENA detectado en 1966 .Luego otros subtipos de ENA como
ribonucleoproteínas (RNP), SSA/Ro, SSB/La, Scl 70, Jo-1 y MP1 fueron identificados.
Aunque la mayoría de estos ENA son específicos de enfermedad todavía existe
un solapamiento importante. La sensibilidad y la especificidad también varían
dependiendo del tipo de CTD subyacente.
La presencia de autoanticuerpos en el suero de los pacientes constituye uno de
los criterios usados en el diagnóstico de CTD. Además del diagnóstico clínico los
2
subtipos de ANA también ayudan a identificar un CTD específico. Aunque una batería
de análisis de laboratorio están disponibles para la detección de ANAs ,el test
anticuerpos antinucleares por inmunofluorescencia indirecta (IFI-ANA) y el
inmunoensayo enzimático (EIA)/ensayo inmunosorbente ligado a enzima(ELISA) son
los más comúnmente usados en la práctica diaria. Algunos de ellos son considerados
desactualizados mientras que otros como la citometría de flujo y recientemente la
nanotecnología introducida que envuelve arrays de antígenos están aún en etapas
experimentales.
El IFI- ANA fue diseñado por George Friou en 1957, desde entonces ha sido la
más ampliamente usada para el diagnóstico de CTD .Es barata y fácil de realizar , con
alta sensibilidad y especificidad. El test detecta la presencia de ANAs en la sangre del
paciente los cuales se adhieren a las células del substrato formando diferentes patrones
de fluorescencia que están asociados con ciertas enfermedades autoinmunes. En 1975
las células Hep-2 fueron introducidas porque incrementaban la sensibilidad del test.
Estas eran células cultivadas de carcinoma celular escamoso laríngeo y están
disponibles comercialmente, prefijadas sobre portas de vidrio. La mayoría de
laboratorios alrededor del mundo usan células Hep 2 como sustrato.
La correcta interpretación de los resultados del IFI-ANA es importante y debe
ser siempre correlacionada con los signos y síntomas de paciente. En el informe del IFI-
ANA tres parámetros son evaluados, éstos incluyen el patrón de fluorescencia, sustrato
usado y el título de un test positivo. Un resultado de IFI-ANA negativo esencialmente
excluye la posibilidad de CTD activa. Diferentes patrones de inmunofluorescencia son
reportados y dan una idea de la significancia del ANA y el tipo de CTD.
Los patrones nucleares más comunes: homogéneo, moteado (fino y grueso)
,periférico(rim), nucleolar, centromérico, PCNA (antígeno nuclear de
proliferación),manchas nucleares y, membrana nuclear, y granulado difuso.
Los patrones citoplasmáticos: moteado mitocondrial, ribosomal, aparato de
Golgi, lisosomal, filamentos del citoesqueleto (actina, vicentina y citoqueratina)
3
Los patrones mitóticos: Huso mitótico, centrosomas, Numa (aparato mitótico
nuclear), midbody , CENP-F(proteína del centrómero).
Entre estos los patrones homogéneo, moteado, periférico y nucleolar son los más
comúnmente observados y de importancia clínica.
La intensidad de la fluorescencia debe darse con una escala cualitativa o
semicuantitativa de valores , esta intensidad es generalmente proporcional a la
concentración de anticuerpo y predice la severidad de la CTD.
Los anticuerpos antinucleares (ANA) son los marcadores serológicos del Lupus
Eritematoso Sistémico (LES) descrito originalmente en 1957 usando un ensayo
inmunofluorescente con tejido de hígado de roedor como sustrato.
Los ANAs son una clase específica de autoanticuerpos que tienen la capacidad
de unirse y destruir ciertas estructuras dentro del núcleo de las células. Si bien
cantidades más bajas pueden ser vistos también en población normal, un aumento en los
títulos es visto en pacientes con CTDs. No sólo estos anticuerpos explican la
patogénesis de la enfermedad sino también constituyen la base para el diagnóstico y
tratamiento de los CTDs
Varios métodos de detección están en uso y hay una continua producción de
nuevas técnicas para facilitar el diagnóstico y monitoreo del tratamiento en pacientes
con CTDs.
El título de ANA es directamente proporcional a la concentración de anticuerpos
y expresado con una escala cuantitativa de valores. Un título bajo es menos significativo
que uno alto y puede ser visto en individuos sanos. Muchos estudios han intentado
determinar la dilución óptima de screening en suero para testar ANA. Un título de 1/160
es tomado como significativo para el diagnóstico de CTDs en la mayoría de
laboratorios.
Aunque el IFI-ANA es ampliamente usado y considerado el gold standard,
muchas veces los resultados son malinterpretados, porque reacciones cruzadas entre los
diferentes anticuerpos pueden ocurrir, así mas del 3% de la población normal puede dar
4
falsos positivos. También los títulos de ANAs aumentan cuando los síntomas florecen y
caen frecuentemente a niveles indetectables cuando los síntomas son leves o el paciente
entra en remisión. Además cada CTD tiene anticuerpos específicos asociados con ésta y
a veces es difícil especificar o categorizar un autoanticuerpo. Algunos patrones como
el nucleolar y centromérico están peor definidos para el IFI-ANA. El test IFI-ANA es
usado principalmente como screening más que para diagnóstico de CTD.
La citometría de flujo con microesferas fluorescentes cubiertas de autoantígenos
ha ido ganando popularidad en años recientes, ésta da resultados cuantitativos basados
en la reactividad con un set de microesferas marcadas cada una con una única
combinación de señal fluorescente interna y antígeno. Las técnicas basadas en
microesferas fluorescentes también referidas como Ana réflex, tienen múltiples
ventajas como un testeo simultáneo para reconocimiento de varios antígenos,
automatización, costo efectividad y alta sensibilidad. Frecuentemente las pruebas
múltiples son necesarias debido a que son capaces de informar un repertorio completo
de autoanticuerpos requeridos.
El suero de algunos pacientes con LES puede ser negativo sobre sustratos
animales como riñón de ratón o hígado de rata pero positivos sobre sustrato humano
como células Hep 2.Debido a esta sensibilidad variable con el sustrato usado es esencial
reportar el tipo de sustrato que está siendo usado por el laboratorio.
Desde que diferentes ANAs están asociados a una u otra CTDs, una
aproximación sistemática es seguida mientras se realizan estos test. Un screening inicial
es realizado por IFI ANA o ELISA y si es positivo más pruebas específicas son
realizadas basadas en los hallazgos clínicos y los patrones del IFI ANA.
Los autoanticuerpos para dsDNA son específicos y diagnósticos de LES y sus
niveles están elevados durante la enfermedad activa. Si un caso de patrón homogéneo
sospechoso de LES es observado en el IFI-ANA, test adicionales como CLIF, ELISA,
Test de inmunoblot, etc deben ser hechas para confirmar el dsDNA. Igualmente el Sm
es altamente específico para LES y necesita confirmación por otros test como el
Blotting, pero está presente en sólo el 10% de los casos de LES.
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Los Anti SSA/Ro aunque más comunes en Sindrome de Sjogren también pueden
verse en 30% casos de LES con compromiso cutáneo. Por consiguiente si el IFI-ANA
presenta patrón periférico/ moteado pruebas adicionales como Blotting o MIA son
necesarias para detectar los anticuerpos anti SSA/Ro. La significancia clínica y los
métodos de detección de SSB/La son similares que para SSA/Ro excepto que es menos
frecuente y puede indicar un curso menor de enfermedad. Mientras que la presencia de
estos 2 autoanticuerpos apoya el diagnóstico de Sindrome Sjogren, ellos no son
necesarios para el diagnóstico. EL anti-Scl70 hallado en esclerodermia (SS) da un
patrón moteado fino en el IFI-ANA y puede ser confirmado por técnicas de
inmunodifusión, pero su detección tampoco es necesaria para el diagnóstico.
Los test de ANA no son útiles para confirmar el diagnóstico de artritis
reumatoidea u osteoartritis por lo que no debería ser usado en estas condiciones.
Los test de ANA no están recomendados para evaluar fatiga, dolor de espalda u
otros dolores músculoesqueléticos al menos que esté acompañado por uno o más
síntomas clínicos a favor de CTD. Los test de ANA deben ser solicitados una sola vez.
Los test de ANA positivos no necesitan ser repetidos; los test de ANA negativos
necesitan ser repetidos sólo si hay una fuerte sospecha de CTD envuelta o un cambio en
la enfermedad del paciente que sugeriría una revisión del diagnóstico. Un test de ANA
positivo sólo es importante junto con la evaluación clínica y en ausencia de síntomas y
signos de CTD sólo confunde el diagnóstico. Un test de ANA positivo también pude ser
visto en individuos sanos, particularmente mayores de edad y en un amplio rango de
enfermedades diferentes de CTD, donde no tiene valor pronóstico ni diagnóstico.
Desde su descripción original la técnica ha sufrido considerables cambios
metodológicos y el sustrato de tejido de ratón ha sido reemplazado con líneas celulares
epiteliales humanas tales como las células epiteliales humanas Hep 2. Estas tienen las
ventajas de incrementada sensibilidad, más fácil identificación de diferentes patrones
de reactividad y reconocimiento de anticuerpos específicos que reaccionan con
antígenos asociados de células en división. Los ensayos caseros han sido reemplazados
por kits comerciales. Estos kits contienen portas cubiertos de Hep2 ,conjugados de
anticuerpos y suero de referencia .Algunos incrementos en sensibilidad comprometen
6
especificidad , esto es particularmente importante en el caso de detección de ANA desde
que el test es positivo en una amplia variedad de Enfermedades de Tejido Conectivo
además del LES, tales como Enfermedad Mixta de Tejido Conectivo, Síndrome de
Sjogren primario, artritis reumatoidea y en enfermedades infecciosas y malignas. .(6)
Objetivo:
Determinar la utilidad de los Test inmunológicos de laboratorio en pacientes con
enfermedades difusas de tejido conectivo (CTDs)
Materiales y Métodos
Medición de ANA
Se valoraron 102 pacientes sanos consecutivos que acudieron a la consulta de
medicina preventiva del Hospital General de Castellón (HGC),sin antecedentes
analíticos patológicos y 84 pacientes con enfermedades difusas de tejido conectivo de la
consulta de reumatología del HGC. Todos los sueros fueron testados para ANA
(anticuerpos antinucleares) por la técnica tradicional de IFI (Inmunofluorescencia
indirecta) sobre sustrato de células Hep-2 e Inmunenensayo Multiplexo con
microesferas cubiertas con autoantígenos ( Sistema Athena Multi-lyte)
El sistema Athena Multi-lyte es capaz de evaluar diferentes analitos
simultáneamente en un formato de inmunoensayo multiplexo; puede evaluar en una
misma muestra del paciente una multitud de autoantígenos al mismo tiempo, en un
único pocillo, utiliza la tecnología de citometría de flujo con microesferas de
poliestireno que son cubiertas con los siguientes autoantígenos: SSA/Ro, SSB/La , Scl
70,Jo-1,Sm, U snRNP B/B, U1 snRNP 68, U1 snRNP A, U1 snRNP C, ds DNA y
Centrómero-B, Histona H e Histona HLY.
El método ANA- IFI usado será el NOVA Lite Hep-2 de INOVA Diagnostics,
un set de reactivos que utiliza células Hep-2 como sustrato y una mezcla de
isotiocianato de fluoresceína unida a inmunoglobulinas anti-humanas de ratón (IgG,
IgA, IgM) como anticuerpo secundario o conjugado. Las muestras fueron diluídas 1:20
7
y 1:40 con la solución buffer incluída en el Kit de reactivo (PBS) y si los especimenes
diluidos 1:40 fuesen todavía positivos las muestras serán diluídas de 1:80 hasta 1:5120
para reanalizar. El título de anticuerpos fue expresado como la dilución final donde
todavía se observa fluorescencia. Las muestras fueron teñidas según las instrucciones
del manual operativo y serán examinadas con un microscopio epifluorescente a 40x de
magnificación. Todas las muestras fueron examinadas bajo el microscopio por 2
técnicos de laboratorio, para el control de calidad controles positivos y negativos con
títulos de anticuerpos conocidos serán usados en cada ensayo para asegurar la precisión.
Nosotros analizamos 8 anticuerpos a antígenos nucleares extraíbles específicos
(ENAs) de enfermedad usando un set de reactivos basado en citometría de flujo de
microesferas de inmunoensayo multiplexo con los antígenos indicados: anti-U1 RNP,
anticuerpos anti-Sm; anticuerpos anti- SSA/Ro, anticuerpo anti SSB/La ; anticuerpo anti
Scl – 70, , anticuerpo anti-Jo-1,antiHistona y anticuerpo anti-ds DNA
Selección de pacientes y controles
Se incluyen pacientes sanos para determinar con precisión el intervalo de
referencia, porque es sabido que algunos individuos sanos serán positivos para
anticuerpos antinucleares.
Nosotros incluímos como pacientes sanos en este estudio a 102 pacientes
consecutivos que acudieron a la consulta de Medicina Preventiva del HGC quienes no
exhibían hallazgos anormales en ninguno de los test como análisis de orina, estudio
hematológico de rutina y pruebas de bioquímica sanguínea; pero los ANAs no estaban
incluidos.
Los resultados obtenidos por IFI y el Athena Luminex fueron analizados en
estos individuos.
También examinamos el suero de aprox 84 pacientes con CTD (conective tissue
diseases) que acudieron a la consulta de reumatología del HGC entre Mayo 2008 y
Diciembre 2009.
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Las enfermedades de los pacientes fueron definidas por los criterios
establecidos para cada enfermedad. Los números de pacientes fueron los siguientes:
pacientes 20 con LES; 17 pacientes con Síndrome Sjogren; 3 pacientes con Esclerosis
Sistémica; 5 pacientes con Polimiosistis- Dermatomiositis; 3 con Enfermedad Mixta de
Tejido Conectivo (EMTC) , 17 pacientes con Artritis Reumatoide (AR), 12 con
CREST-Raynaud y 7 con Sd Anticardiolipinas.(ACL)
Después de la separación del suero por centrifugación ,las muestras séricas
fueron almacenadas a –40 ªC. Todas las muestras recogidas de pacientes con CTD e
individuos sanos fueron numeradas aleatoriamente y examinadas de modo ciego para
el IFI-ANA y fueron también analizadas para 8 ENAs específicos de enfermedad por
Inmunoensayo Multiplexo con bolas fluorescentes (Athena Luminex)
Análisis de Datos
Análisis ROC fueron realizados para los grupos de pacientes, utilizando
individuos sanos como grupo de referencia. La sensibilidad,especificidad, VPP, VPN
,LR+ y LR- del IFI-ANA y del Inmunoensayo Multiplexo por el Athena ENA fueron
determinados y se valoraron los cutoff para definir el más adecuado. Para el análisis de
curvas ROC se usó el programa de software estadístico SPSS Versión 15.0.
La correlación entre la positividad del Inmunoensayo Multiplexo por Athena
ENA e IFI-ANA entre pacientes con CTDs fue evaluado por la prueba de coeficiente de
correlación de Spearmam.
La concordancia cualitativa entre los dos métodos fue determinada por la
estadística kappa de Cohen .
9
Resultados:
Distribución de controles sanos por sexo y edad (n=102)
02
28
12
39
18
3
00
5
10
15
20
25
30
35
40
<20 20-40 41-60 > 60
hombre
mujer
Títulos IFI-ANA positivos en controles sanos (n=13)
10
Distribución de Patrones IFI-ANA positivos en controles sanos (n=13),
cutoff≥1/40
7
3
0 0
3
53,80%23% 0% 0 23%
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Mote
ado
Hom
ogéneo
nucleol
ar
centr
ómer
o
cito
plasm
ático
Nª casos
Porcentaje
ENAs positivos en controles sanos (n=10), cutoff≥120
11
Intensidades ENAs positivas en controles sanos (n=10), cutoff ≥120
%
60,9
26
4,3
0
4,3
4,3
120-200
200-400
400-600
600-800
800-1000
>1000
Resultados de los Test inmunológicos en controles sanos (n=102)
12,7
87,3
9,8
90,2
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
IFI% ENA%
positivo
negativo
12
Pacientes con CTD (n=84),distribución según diagnóstico
3,57
20,23
23,8
20,23
5,95
14,28
3,57
8,33
0
5
10
15
20
25
Escl
eroder
mia
Gener
alizad
a
Sjogr
en LES
AR
Poli-de
rmat
omio
sitis
CREST
EMTC
Sd a
nticar
diolip
ina
casos
%
Distribución de pacientes con CTD por sexo y edad (n=84)
0 0 0
18
0
24
9
33
9
75
0
10
20
30
40
50
60
70
80
<20 20-40 41-60 > 60 total
hombre
mujer
13
Distribución de patrones IFI- ANAs positivos en pacientes con CTD (n=65)
Nª casos (n=65)
3220
04
1 1
Moteado
Homogéneo
nucleolar
centrómero
citoplasmático
periférico
Distribución de pacientes con CTD según títulos IFI ANA positivos(n=65)
14
Distribución de ENAs positivos en pacientes CTD (n=45) cutoff≥120
17,5310,3
6,18
19,59
8,25 8,25
19,5810,3
100
0
20
40
60
80
100
SSA
SSB
SM RNP
Scl7
0Jo
-1
Hist
onas
DNAds
Tota
l
%
%
Intensidades ENAs en pacientes con CTD (n=45)
%
52,57
21,65
10,3
8,25
3,09 4,12
120-200
200-400
400-600
600-800
800-1000
>1000
15
Resultados de los Test inmunológicos en pacientes con CTD (n=84)
77,4
22,6
53,58
46,42
0
10
20
30
40
50
60
70
80
IFI% ENA%
positivo
negativo
Titulos de ANA en pacientes lúpicas.(n=20)
16
Patrones de IFI- ANAs en pacientes lúpicas (n=20)
Distribución de ENAs positivos en pacientes con LES.(n=14)
17
Intensidades ENAs positivas en pacientes con LES (n=14)
Resultados de los test inmunológicos en pacientes con LES (n=20)
18
El índice kappa de Cohen fue de 0,482 con un intervalo de confianza del 95% ( 0.3502-
0.6138) .Error Standard de 0.0672.; por lo que la magnitud de la concordancia entre
ambas técnicas (IFI y Athena ENA) para positividad y negatividad fue moderada.
El coeficiente de correlación de Spearman fue significativa r<0.01 , entre la
Inmunoflurescencia indirecta (IFI-ANA) y el Inmunoensayo Multiplexo (ENAs)para
CTDs.
En el caso de Dermato Polimiosistis , EMTC (Enfermedad Mixta del Tejido Conectivo)
y Sd Antifisfolípidos no se valoraron curvas ROC debido al escaso tamaño muestral.
Encontramos que para un cut-off de 1/40 la sensibilidad del IFI-ANA fue de 77.38% y
un VPN de 82.41%. El LR+ fue de 5.92 y el LR- de 0.26. Pero la especificidad es sólo
87%,mientras que aun cutooff de 1/80 la especificidad sube a 95% ,con una pequeña
caída de sensibilidad, por lo que podría ser considerado 1/80 como el mejor punto de
corte para el screening de CTDs por Inmunofluorecencia indirecta sobre Hep-2 para
anticuerpos antinucleares. Esto se corrobora también con el análisis de las curvas ROC.
Para el Inmunoensayo Multiplexo( IMA) para antígenos nucleares extraíbles (ENAs) a
un cut-off de 120, la sensibilidad fue de 53.57% , la especificidad de 90.19%,el VPP fue
de 81.82%,.El LR+ fue de 6.75 y el LR- de 0.51.Pero a un cutoff de 130 la especificidad
sube a 93% con casi la misma sensibilidad, por lo que 130 sería un mejor punto de corte
para los ENAs determinados por IMA .
Sensibilidad Especificidad VPP VPN LR+ LR- IFI 1/80 0,7 0,95 0,92 0,78 14 0,32 IFI 1/40 0,77 0,87 0,83 0,82 5,92 0,26 ena 130 0,52 0,93 0,86 0,7 7,4 0,52
ena 120 0,54 0,9 0,82 0,7 6,75 0,51
19
Curvas ROC
CTDs vs Controles
IFI vs ENA
1 - Especificidad1,00,80,60,40,20,0
Sen
sibi
lidad
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Línea de referenciaANA_NUMERICOENA
Procedencia de la curva
Curva COR
Los segmentos diagonales son producidos por los empates.
Área bajo la curva
Variables resultado de contraste Área
Error típ.(a)
Sig. asintótica(b)
Intervalo de confianza asintótico al 95%
Límite superior Límite inferior
ENA ,777 ,034 ,000 ,710 ,844 ANA_NUMERICO ,860 ,030 ,000 ,802 ,919
La variable (o variables) de resultado de contraste: ENA, ANA_NUMERICO tiene al menos un empate entre el grupo de estado real positivo y el grupo de estado real negativo. Los estadísticos pueden estar sesgados . a Bajo el supuesto no paramétrico b Hipótesis nula: área verdadera = 0,5
20
Coordenadas de la curva
Variables resultado de contraste
Positivo si es mayor o igual que(a) Sensibilidad
1 - Especificidad
ENA 33,00 1,000 1,000
35,50 1,000 ,980
115,00 ,536 ,078
124,00 ,524 ,069
128,50 ,524 ,059
132,00 ,524 ,049
135,50 ,512 ,049
137,00 ,512 ,039
141,00 ,500 ,039
145,50 ,488 ,039
147,50 ,476 ,039
149,00 ,464 ,039
ANA-IFI 0,00 1,000 1,000
40,00 ,774 ,127
80,00 ,700 ,049
160,00 ,571 ,010
21
CTDs excepto AR vs controles
IFI vs ENA
1 - Especificidad1,00,80,60,40,20,0
Sen
sibi
lidad
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Línea de referenciaANA_NUMERICOENA
Procedencia de la curva
Curva COR
Los segmentos diagonales son producidos por los empates.
Área bajo la curva
Variables resultado de contraste Área
Error típ.(a)
Sig. asintótica(b)
Intervalo de confianza asintótico al 95%
Límite superior Límite inferior
ENA ,784 ,037 ,000 ,712 ,857 ANA_NUMERICO ,874 ,032 ,000 ,811 ,937
La variable (o variables) de resultado de contraste: ENA, ANA_NUMERICO tiene al menos un empate entre el grupo de estado real positivo y el grupo de estado real negativo. Los estadísticos pueden estar sesgados . a Bajo el supuesto no paramétrico b Hipótesis nula: área verdadera = 0,5
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Coordenadas de la curva
Variables resultado de contraste
Positivo si es mayor o igual que(a) Sensibilidad
1 - Especificidad
ENA 33,00 1,000 1,000
35,50 1,000 ,980
115,00 ,552 ,078
124,00 ,537 ,069
128,50 ,537 ,059
132,50 ,537 ,049
140,00 ,537 ,039
145,50 ,522 ,039
147,50 ,507 ,039
149,00 ,493 ,039
1237,00 ,000 ,000 ANA_NUMERICO 0,00 1,000 1,000
40,00 ,791 ,127
80,00 ,746 ,049
160,00 ,657 ,010
Curvas ROC LES vs Controles
IFI vs ENA
1 - Especificidad1,00,80,60,40,20,0
Sens
ibilid
ad
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Línea de referenciaANA_NUMERICOENA
Procedencia de la curva
Curva COR
Los segmentos diagonales son producidos por los empates.
23
Área bajo la curva
Variables resultado de contraste Área
Error típ.(a)
Sig. asintótica(b)
Intervalo de confianza asintótico al 95%
Límite superior Límite inferior
ENA ,832 ,058 ,000 ,719 ,945 ANA_NUMERICO ,908 ,050 ,000 ,810 1,007
La variable (o variables) de resultado de contraste: ENA, ANA_NUMERICO tiene al menos un empate entre el grupo de estado real positivo y el grupo de estado real negativo. Los estadísticos pueden estar sesgados . a Bajo el supuesto no paramétrico b Hipótesis nula: área verdadera = 0,5
Coordenadas de la curva
Variables resultado de contraste
Positivo si es mayor o igual que(a) Sensibilidad
1 - Especificidad
ENA 33,00 1,000 1,000
35,50 1,000 ,980
IFI- ANA 0,00 1,000 1,000
40,00 ,850 ,127
80,00 ,800 ,049
160,00 ,750 ,010
115,00 ,700 ,078
124,00 ,700 ,069
128,50 ,700 ,059
132,50 ,700 ,049
143,00 ,700 ,039
24
Curvas ROC Sd Sjogren vs Controles
IFI vs ENA
1 - Especificidad1,00,80,60,40,20,0
Sen
sibi
lidad
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Línea de referenciaANA_NUMERICOENA
Procedencia de la curva
Curva COR
Los segmentos diagonales son producidos por los empates.
Área bajo la curva
Variables resultado de contraste Área
Error típ.(a)
Sig. asintótica(b)
Intervalo de confianza asintótico al 95%
Límite superior Límite inferior
ENA ,903 ,037 ,000 ,831 ,975 ANA_NUMERICO ,862 ,065 ,000 ,734 ,990
La variable (o variables) de resultado de contraste: ENA, ANA_NUMERICO tiene al menos un empate entre el grupo de estado real positivo y el grupo de estado real negativo. Los estadísticos pueden estar sesgados . a Bajo el supuesto no paramétrico b Hipótesis nula: área verdadera = 0,5
25
Coordenadas de la curva
Variables resultado de contraste
Positivo si es mayor o igual que(a) Sensibilidad
1 - Especificidad
ENA 33,00 1,000 1,000
109,50 ,706 ,088
115,00 ,706 ,078
124,00 ,647 ,069
128,50 ,647 ,059
132,50 ,647 ,049
140,00 ,647 ,039
145,50 ,588 ,039
IFI ANA 0,00 1,000 1,000
40,00 ,765 ,127
80,00 ,765 ,049
160,00 ,647 ,010
Curvas ROC Esclerosis Sistémica vs Controles
IFI vs ANA
1 - Especificidad1,00,80,60,40,20,0
Sen
sibi
lidad
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Línea de referenciaANA_NUMERICOENA
Procedencia de la curva
Curva COR
Los segmentos diagonales son producidos por los empates.
26
Área bajo la curva
Variables resultado de contraste Área
Error típ.(a)
Sig. asintótica(b)
Intervalo de confianza asintótico al 95%
Límite superior Límite inferior
ENA ,671 ,073 ,033 ,528 ,814 ANA_NUMERICO ,915 ,055 ,000 ,808 1,023
La variable (o variables) de resultado de contraste: ENA, ANA_NUMERICO tiene al menos un empate entre el grupo de estado real positivo y el grupo de estado real negativo. Los estadísticos pueden estar sesgados . a Bajo el supuesto no paramétrico b Hipótesis nula: área verdadera = 0,5
Coordenadas de la curva
Variables resultado de contraste
Positivo si es mayor o igual que(a) Sensibilidad
1 - Especificidad
ENA 33,00 1,000 1,000
109,50 ,333 ,088
115,00 ,333 ,078
124,00 ,333 ,069
128,50 ,333 ,059
132,50 ,333 ,049
142,00 ,333 ,039
158,00 ,267 ,039
IFI ANA 0,00 1,000 1,000
40,00 ,867 ,127
80,00 ,800 ,049
160,00 ,733 ,010
27
Curvas ROC AR vs Controles
IFI vs ENA
1 - Especificidad1,00,80,60,40,20,0
Sens
ibilid
ad
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Línea de referenciaANA_NUMERICOENA
Procedencia de la curva
Curva COR
Los segmentos diagonales son producidos por los empates.
Área bajo la curva
Variables resultado de contraste Área
Error típ.(a)
Sig. asintótica(b)
Intervalo de confianza asintótico al 95%
Límite superior Límite inferior
ENA ,749 ,063 ,001 ,625 ,873 ANA_NUMERICO ,806 ,069 ,000 ,670 ,941
La variable (o variables) de resultado de contraste: ENA, ANA_NUMERICO tiene al menos un empate entre el grupo de estado real positivo y el grupo de estado real negativo. Los estadísticos pueden estar sesgados . a Bajo el supuesto no paramétrico b Hipótesis nula: área verdadera = 0,5
28
Coordenadas de la curva
Variables resultado de contraste
Positivo si es mayor o igual que(a) Sensibilidad
1 - Especificidad
ENA 33,00 1,000 1,000
109,50 ,471 ,088
115,00 ,471 ,078
124,00 ,471 ,069
128,50 ,471 ,059
132,00 ,471 ,049
135,50 ,412 ,049
137,00 ,412 ,039
144,00 ,353 ,039
156,00 ,294 ,039
IFI ANA 0,00 1,000 1,000
40,00 ,706 ,127
80,00 ,471 ,049
160,00 ,235 ,010
Resumen de AUC para CTDs
AUC
IFI- ANA MIA -ENA
CTD 0,86 0,777
CTD excepto AR 0,874 0,784
LES 0,908 0,832
Sd Sjogren (SS) 0,862 0,903
Esclerosis Sistémica (SSc) 0,915 0,671
Artritis Reumatoide (AR) 0,806 0,749
• En general las AUC del IFI-ANA son mayores que para el MIA-ENA, para el
conjunto de CTDs ,mejorando un poco cuando se excluye la AR, y son más
cercanas a 1 , en LES y Esclerosis Sistémica donde esta prueba diagnóstica
alcanzaría su mejor performance.
29
• Por el contrario la peor AUC para IFI-ANA corresponde a la AR con un valor de
0.805, que correspondería al hecho que este test no es muy útil para el
diagnóstico de esta enfermedad.
• En cuanto al MIA-ENA la mejor AUC corresponde al Sd Sjogren con un valor
de 0.903 y la peor utilidad del test para la Esclerosis Sistémica con un AUC de
sólo 0.671, siendo éste el único caso donde el AUC del MIA-ENA es mayor que
la del IFI-ANA.
• En cuanto a los cutoff o puntos de corte ideales, haciendo un análisis global de
todas las coordenadas de las curvas ROC para las diferentes CTDs se podría
elegir el título de 1/80 como punto de corte para el IFI-ANA debido a que se
mantiene en un margen aceptable de sensibilidad en torno al 70-75% ,con un
buena especificidad en torno al 95%
• En el caso del MIA-ENA, hasta un punto de corte de 140 se obtiene en
promedio una mejor especificidad del 96% a una misma sensibilidad que a
cutoff de 120 y 130 .Por lo que corroboramos que el punto de corte en nuestro
laboratorio para el MIA-ENA debería ser éste y así resolver más rápida y
claramente los casos dudosos que según los cortes dados por el fabricante
estarían entre 100 y 120, para evitar repeticiones innecesarias y ser dados de
modo más fiable como positivos. También ayudaría a resolver los casos donde
múltiples anticuerpos del panel son positivos para un mismo paciente, que en
principio confunde el diagnóstico diferencial de CTDs, pero varios de estos
anticuerpos con valores ligeramente positivos y sólo alguno de ellos con
valores claramente positivos.
30
Discusión:
Nuevas técnicas serológicas y ensayos son desarrollados por laboratorios y la
industria comercial y pueden eventualmente permitir una mejor reproducibilidad en
confirmar un diagnóstico y estimar un pronóstico, mejorando la calidad del cuidado
clínico. Para alcanzar este objetivo la precisión del test debe ser demostrada en estudios
que comprometan poblaciones lo suficientemente grandes antes que un nuevo ensayo
pueda ser aceptado para uso clínico. En el pasado hubieron muy pocos estudios con
diseño prospectivo, multicéntrico, imparcial. Así la precisión clínica de ciertos estudios
de diagnóstico de laboratorio es aún desconocido.
En las enfermedades reumáticas sistémicas generalmente varios criterios deben
ser completados para confirmar un diagnóstico particular .Cuanto más criterios puedan
ser identificados en un paciente particular o grupo de pacientes, es mayor la
probabilidad de que el diagnóstico de la enfermedad sea correcto. Los autoanticuerpos
que ocurran sólo en una enfermedad particular y puedan ser vistos como un marcador
específico de enfermedad suelen ser raros. La presencia de múltiples autoanticuerpos
asociados a enfermedad en un suero único (perfil de anticuerpos) puede ser mejor
indicador que cierto diagnóstico es correcto que la presencia de un único anticuerpo.
Las nuevas tecnologías comúnmente se enfocan en alcanzar una alta sensibilidad
diagnóstica y menos en alcanzar una alta especificidad. La especificidad diagnóstica
generalmente disminuye cuando se alcanza una alta sensibilidad para cierto ensayo.
Nuevos ensayos frecuentemente son comercializados antes que su habilidad para
predecir con precisión un diagnóstico específico sea completamente conocida.
Frecuentemente la correlación entre cierta manifestación de enfermedad y el
anticuerpo asociado es más estrecha que la correlación con un marcador genético (ejm
tipo HLA) o un patrón histopatológico particular.
Los ensayos sensibles pueden llegar a ser clínicamente útiles si el cutoff que
diferencia el suero de pacientes con LES del suero de controles de enfermedad
inflamatoria es reajustado a un valor apropiado que alcance el 90-95% de especificidad
para el diagnóstico de LES .Cuando el cutoff es reajustado la frecuencia de anticuerpos
antiDNAds en una cohorte de pacientes LES se alineará con la frecuencia de nefritis
31
lúpica .ejm 40 –50% .Otra posibilidad es establecer dos límites de positividad, un límite
más alto para uso diagnóstico y otro más bajo para separar individuos sanos de
controles de enfermedad inflamatoria y pacientes con LES inactivo. El área gris entre
los dos límites puede ser usada para el seguimiento de pacientes con LES antiDNAds
positivos, y monitorizar su respuesta serológica a la terapia o la recurrencia de actividad
de enfermedad.
Por años el cutoff para un resultado normal de IFI-ANA fue considerado 1/40.
Pero un estudio internacional multicéntrico reveló que el 32% de individuos normales
fueron positivos a este título .Así un título de 1/160 fue recomendado como un cutoff
más aceptable entre suero normal y anormal.(23)
En el laboratorio clínico de rutina una aproximación por etapas de los test
serológicos puede ser muy productiva. Por ejemplo para el screening de anticuerpos
antiDNAds el primer paso puede ser usar un ELISA. Luego si es positivo un ensayo que
tenga una especificidad diagnóstica más alta puede ser usado como el Farr o el ensayo
IFI de Crithidia luciliae.
Algunos patrones de IFI ANA no requerirían una cascada de screening como el
patrón anticentrómero relacionado estrechamente al fenómeno de Raynaud y la
esclerodermia limitada. En contraste los IFI ANA con patrón nuclear homogéneo o
moteado nucleoplásmico deben ser estudiados adicionalmente para ANA específicos
dirigidos contra antígenos individuales para que los resultados lleguen a ser
clínicamente útiles.
Por la complejidad de la serología autoinmune moderna, los jefes de laboratorio
deberían hacer sugerencias concernientes al uso apropiado y económico de los test
serológicos. Cuando un gran laboratorio provee servicio a áreas más extensas o
poblaciones, guías escritas son requeridas para asegurar un empleo racional y evitar el
uso innecesario de los test. Un test de screening positivo permite referir un paciente al
especialista quien incluirá test serológicos adicionales. Es importante notar que la
probabilidad pretest de detectar un diagnóstico útil de laboratorio se incrementa
dramáticamente con cada síntoma clínico que es incorporado al diagnóstico presuntivo.
32
Un problema mayor es que técnicas de alto rendimiento fáciles de usar están
siendo implementadas en el laboratorio sin una apropiada validación clínica. El
screening para ANAs por ELISA que han absorbido complejos mixtos de autoantígenos
nativos o recombinantes o extractos nucleares es ahora usado por muchos laboratorios
en lugar del IFI para el screening de ANA. Muchos pacientes con Sindrome Sjogren,
Esclerodermia y Poli-dermatomiositis son negativos para ANA usando estas técnicas de
ELISA, los cuales pueden ser identificados por IFI por técnicos experimentados en su
variedad de patrones. Hasta que una mejora adicional en el screening ELISA para ANA
sea alcanzada, el IFI ANA debe permanecer como el gold standard.
Las fortalezas y debilidades de los nuevos test deben ser escrutadas y deben
concordar con la interpretación de resultados discrepantes antes que el test sea
introducido para uso clínico. Los resultados positivos o negativos fuera del contexto de
parámetros clínicos conocidos, deben siempre despertar la sospecha que un test puede
ser poco fiable y requerir reevaluación.
Como nuevos anticuerpos están continuamente siendo descritos, es mejor no
reportar resultados de autoanticuerpos que les falta un valor clínico probado hasta que
su valor haya sido claramente establecido, lo que implica rigurosos estudios
multicéntricos de los nuevos autoanticuerpos descubiertos para establecer su valor o
relevancia clínica.
Como ejemplo el anticuerpo SSA/Ro 52 de tipo IgG puede tener un potencial
fisiopatológico al inducir bloqueo cardíaco congénito en recién nacidos de madres que
portan este anticuerpo después de transferirlo a través de la placenta. Esta seria
complicación prenatal es vista en el 1% de embarazos de mujeres anti SSA-Ro 52
positivas, muchas de las cuales tiene anticuerpos anti SSB/La. Ambos anticuerpos han
sido sugeridos que están envueltos en el mecanismo de daño del nodo auriculo
ventricular y el haz de Hiss. La gran mayoría de madres que tiene bebés con bloqueo
cardíaco congénito tiene anticuerpos anti SSA/Ro 52 y al menos el 60% de éstos tiene
también el SSB/La por métodos de rutina. Métodos más sensibles muestran la presencia
de los dos anticuerpos si uno de ellos ha sido encontrado por un método de rutina.
33
En cuanto a la importancia del diagnóstico temprano los reumatólogos han
presentado un histórico interés en establecer un diagnóstico temprano de la AR lo cuál
les permite iniciar una terapia eficiente que puede detener o retardar significativamente
la progresión de la enfermedad.
Sin embargo antes de iniciar un tratamiento que puede estar asociado a riesgos el
diagnóstico de AR y el grupo pronóstico al cuál el paciente pertenece debe ser
establecido. En el diagnóstico temprano de AR las manifestaciones clínicas y los
marcadores genéticos y de laboratorio que apoyan el diagnóstico e indican el pronóstico
son importantes, como por ejemplo la presencia de a-CCP en un paciente con artritis de
inicio reciente sugiere que el paciente tiene AR temprana y debe ser seguido
estrechamente .Un diagnóstico impreciso puede causar daño al paciente ya sea por
tratamiento inapropiado o por efectos adversos de los medicamentos. La AR es sólo una
de las muchas enfermedades crónicas donde el reconocimiento temprano y un
diagnóstico correcto es mandatorio para prevenir daño de órganos y evitar toxicidad
inducida por drogas.
El pronóstico a largo plazo de cualquier enfermedad reumática sistémica
depende de la categorización precisa de cada paciente en un subgrupo pronóstico y la
aplicación correcta de tratamiento temprano. Los ANAs juegan un rol muy especial en
el reconocimiento de enfermedad reumática temprana donde las manifestaciones
clínicas iniciales son escasas o aún no lo suficientemente diagnósticas. En esta fase
inicial del cuadro clínico la elección de la técnica de screening de ANA es
especialmente crítica. Prácticamente nada se sabe de la eficacia del ELISA ANA para
detectar autoanticuerpos en enfermedad temprana, mientras al menos algo se conoce del
uso del IFI ANA y algunos ANAs específicos, estudiados como consecuencia de
detectar ANA en el procedimiento de screening. Particularmente en el diagnóstico
clínico temprano el hallazgo de un autoanticuerpo puede ser muy útil. Los test de
laboratorio inapropiados como el test en panel son costosos y potencialmente puede
producir error en el trabajo diagnóstico. Un cálculo de los costos a largo plazo
relacionados a un diagnóstico y tratamiento preciso y temprano, comparados a una falta
o un error en el diagnóstico , con o sin tratamiento tiene que ser realizado para resaltar
el valor del diagnóstico de laboratorio de alta calidad.
34
En reumatología los autoanticuerpos son considerados que reportan daño abierto
o subclínico de órganos o tejidos. El perfil de anticuerpos puede servir como una
herramienta racional para enfocar la atención en los órganos o tejidos envueltos usando
herramientas diagnósticas clásicas tales como la histopatología, técnicas de imagen y
test de función de órganos. Guías clínicas que faciliten la comunicación entre clínicos y
laboratoristas pueden ser formuladas, algoritmos aceptados mutuamente para solicitar
los test , reglas para el informe de resultados y algoritmos para el uso óptimo de los
resultados de laboratorio deben ser adoptados. Una compensación entre la sensibilidad y
especificad diagnóstica debe ser siempre revisada antes que un test sea colocado en el
programa de laboratorio. Los valores de cutoff para positividad que son dados por los
fabricantes de los kits principalmente separan cierta entidad nosográfica de la población
sana. Esto no es ideal para diferenciar entre enfermedades que están relacionadas
clínicamente. Por consiguiente los pacientes dispuestos a donar sangre para optimizar el
diagnóstico diferencial son absolutamente necesarios para lograr un diagnóstico fino en
reumatología
.
La tecnología fácil de usar no debe reemplazar a la antigua bien establecida,
hasta que su utilidad clínica haya sido evaluada a fondo. Sólo si hay acuerdo que la
nueva técnica es mejor o al menos tan buena como la antigua para el cuidado del
paciente podría ser cambiada.
Los resultados del presente trabajo deben ser vistos como una orientación
destinada a mejorar la calidad de los resultados de los Test de autoinmunidad en el
diagnóstico de las CTDs en nuestro laboratorio y aportar a un diagnóstico diferencial
más preciso de las mismas. Nuevos trabajos que incluyan un mayor número de
pacientes deberían llevarse a cabo con miras a tratar de fijar los puntos de corte del
MIA-ANA aún no valorados para cada clase de CTD para cada autoanticuerpo
específico, así como también definir los cutoffs de éstas y otras técnicas para
diagnóstico y/o seguimiento de las diferentes CTDs y aportar a la formulación de guías
clínicas, algoritmos para la solicitud de los test y reglas para cursar los informes de
resultados como ya se ha mencionado.
35
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