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Usodeunaceleradorlinealde6MVparalairradiacióndemodelosbiológicoseninvestigaciónpre‐clínica

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TabladeContenido

1 INTRODUCCIÓN .....................................................................................................................4

2 ANTECEDENTES.....................................................................................................................6

2.1 Aceleradoreslinealesdeusoclínico ................................................................................................. 6

2.2 Componentesdeunaceleradorlineal .............................................................................................. 6

2.3 Sistemadecolimaciónmultihojas .................................................................................................... 82.3.1 ElmMLCdeBrainLAB ....................................................................................................................... 9

2.4 Radiocirugíaconaceleradorlineal .................................................................................................. 102.4.1 Modalidadesdetratamiento.......................................................................................................... 112.4.2 Arcoscirculares............................................................................................................................... 112.4.3 Hacesconformados ........................................................................................................................ 112.4.4 Arcosconformados......................................................................................................................... 122.4.5 IntensidadModulada(IMRT).......................................................................................................... 12

2.5 Sistemasdedetecciónymedidadeladosis.................................................................................... 122.5.1 Cámaradeionizacióndededal....................................................................................................... 12

2.5.1.1 Recoleccióndeiones .............................................................................................................. 152.5.1.2 Medidadelaexposición ......................................................................................................... 162.5.1.3 MedidadelaDosis.................................................................................................................. 16

2.5.2 PelículaRadiográfica....................................................................................................................... 162.5.2.1 DensidadÓptica...................................................................................................................... 172.5.2.2 Curvascaracterísticas ............................................................................................................. 182.5.2.3 Medidadedosisrelativayabsoluta ....................................................................................... 19

2.6 Algoritmosdecálculodeladosis.................................................................................................... 192.6.1 Algoritmodehazdelápizdiferencial ............................................................................................. 202.6.2 MétodosMonteCarlo .................................................................................................................... 21

2.7 Ensayosinvivo/invitro .................................................................................................................. 222.7.1 Lacurvadesobrevidainvitroylarelacióndosis‐respuesta........................................................... 24

2.8 Irradiacióndemodelospre‐clínicos ................................................................................................ 252.8.1 Equilibriodepartículacargadaenlairradiacióndecultivoscelulares........................................... 26

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3 DOSIMETRÍA,CÁLCULOSMONTECARLOEIRRADIACIÓNDECULTIVOSCELULARES ................................................................................................................................. 27

3.1 Dosimetría:CálculosMonteCarloyMedidas ................................................................................. 273.1.1 MedioHomogéneo......................................................................................................................... 293.1.2 ArregloexperimentalInvitro.......................................................................................................... 29

3.2 Calibracióndelapelícularadiográfica ............................................................................................ 303.2.1 Calibraciónutilizandocamposseparados ...................................................................................... 30

3.3 Extrapolacióndevaloresdedosisenlaregióndeincrementoconpelícularadiográfica ................. 31

3.4 TécnicadeirradiaciónInvitro:Irradiaciónyensayoclonogénico.................................................... 333.4.1 TécnicadeirradiaciónInvitro:Análisisdedatos............................................................................ 33

3.5 Irradiaciónconcamposdeintensidadmoduladaencultivoscelulares............................................ 333.5.1 Descripcióndelageometríadeirradiación .................................................................................... 34

3.6 Validacióndeldiseñoexperimental................................................................................................ 34

3.1 Calibracióndecamposcontiguosconintensidadvariable .............................................................. 35

4 RESULTADOSDELASIMULACIÓNMONTECARLOEIRRADIACIÓNCONCAMPOSUNIFORMES............................................................................................................... 37

4.1 ValidacióndelasimulaciónMC ...................................................................................................... 37

4.1 Calibracióndelapelícularadiográfica ............................................................................................ 40

4.2 Dosisenlaregióndeincrementoconpelícularadiográfica............................................................. 41

4.3 Irradiacióndelcultivocelular ......................................................................................................... 43

4.4 Irradiacióndelalíneacelular:fraccióndesobrevida ...................................................................... 44

5 RESULTADOSDELAIRRADIACIÓNCONCAMPOSDEINTENSIDADMODULADA 46

6 CONCLUSIONES ................................................................................................................... 47

7 BIBLIOGRAFÍA..................................................................................................................... 49

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1 IntroducciónLabaselógica,elpapelylosresultadosdelusoderadiaciónionzanteparaeltratamientode patologías cerebrales en lamodalidad demúltiples sesiones con bajas dosis ha sidoestudiado en detalle por numerosos investigadores. Frecuentemente, el conocimientoresultante de estos estudios no se aplica a la radiocirugía, dado que ambas técnicasdifierenenvarias características;éstaúltimaesuna técnicaen la cual seentregaenunsólo evento de exposición una dosis alta de radiación en el blanco de interés,generalmente de volúmen pequeño y consiguiéndose fuera de la región anatómica deinterésungradientehaciadosisbajasmuyimportante.

El conocimientode losefectos combinadosde la terapia con radiación ionizanteaaltasdosisyalgunosagentesradiosensibilizadores,asícomodelatoleraciadetejidosanobajoel efectos de estos fármacos aún presenta interrogantes importantes. Además, ésta esuna situación que puede continuar, ya que actualmente se ecuentran en desarrollodiversos agentes quimoterapéuticos con posibles efectos radiosensibilizadores, con lafinaldadensumayoríadeavanzarenel tratamientodelcáncer.Parapredecirmejor losefectosdelaradioterapia/radiocirugía,asícomoparaoptimizarestostratamientos,talesefectoshandeserestudiadosenmodelos invitroyenmodelosanimalesenetapaspre‐clínicas. En este trabajo se estudian métodos para determinar la dosis absorbida enestudios pre‐clínicos, en condiciones que dosimétricamente implican un reto, una vez ,por las pequeñas dimensiones que típicamente encontramos en estos sistemasexperimentales, es frecuente el caso de requerir el valor de dosis que corresponda ablancos localizados en regiones donde no se alcanza equilibrio electrónico de partículacargada. Determinar la dosis de manera precisa es fundamental para poder obtenerrelacionesdosis‐respuestaconfiables.

Porotrolado, lacapacidaddeentregarunadosisderadiaciónsuficientementealtaparaconseguircontroltumoralmáximoestálimitadaporladosisqueeltejidosanoyquelosórganosderiesgopuedentolerar.Paraconseguirestosobjetivos,losavancestecnológicoshanllevadoalusoclínicodelaradioterapiaconintensidadmodulada(IMRT),por loqueactualmentesellevanalcaboexperimentosinvitroencaminadosadeterminarelimpactoradiobiológicodeestatécnica.Así, larespuestaa laradiaciónpuedesercomparadaconmodelosteóricosparaluegodefinirsiesnecesariomodificarlos,porloquelamedidadelarespuesta de las células irradiadas como función de la distribución espacial de la dosisadquieregranrelevancia.EnestetrabajotambiénsedescribeelusodepatronesdeIMRTgeneradosporrayosXde6MVparalairradiacióninvitrodelíneascelularescultivadasen

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frascosdeproliferaciónenplaca inmersasenmediodecultivo,y ladeterminaciónde ladosisabsorbidaenelplanodeproliferacióncelular.

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2 Antecedentes2.1 Aceleradoreslinealesdeusoclínico

Eldesarrollodemáquinasdealtovoltajeyradioisótopospararadioterapiaexternatienesus inicios en 1945. Desde entonces se han producido cambiosmuy importantes en laprácticade la radioterapia, permitiendoquealrededordelmundoahora seaposibleunmejorcontroldemuchostiposdecáncer.Graciasalaconstanteevolucióndelaaplicacióndelaradiaciónionizanteeneltratamientodeenfermedades,hoysetienelaexpectativade mejorar la tasa de cura con el refinamiento de estos dispositivos mediante mayorprecisiónmecánicaydosimétrica.

Por aproximadamente dos décadas, el equipo de mayor demanda fue la Unidad deCobalto‐60, instalándose la primera en 1950. Actualmente todavía cientos de centroscuentan con este tipo de dispositivo alrededor del mundo. Estas unidades han sidosustituidas poco a poco o complementadas con el uso de aceleradores lineales de altaenergía. Cabemencionar que en algúnmomento también se utilizaron lasUnidades deCesio‐137, mismas que inclusive fueron utilizadas para la irradiación experimental deratones(Cunningham et al. 1965).

2.2 ComponentesdeunaceleradorlinealUnacelerador lineal (linac)esundispositivoqueutilizaondaselectromagnéticasdealtaenergía para acelerar partículas cargadas (como electrones) y alcanzar altas energías atravésdeuntubolineal.Elhazdeelectronesdealtaenergíaporsímismopuedeutilizarseparael tratamientodealgunaspatologías, comoporejemplo tumoressuperficiales.Porotro lado, los electrones pueden hacerse incidir en un blanco para producir rayos X defrenadoyserutilizadoseneltratamientodetumoresoregionesdeinteréslocalizadasamayor profundidad. Los linacs utilizados en radioterapia aceleran electrones medianteondaselectromagnéticasestacionariasoviajerasdefrecuenciaenlaregióndemicroondas(≈3000MHz).Ladiferenciaentreel tipodeondadeaceleraciónestá relacionadocon laestructura del tubo. En relación con la función, la estructura que utiliza ondas viajerasrequieredeunapiezaterminalocarga,con lafinalidaddeabsorber lapotenciaresidualen lapartefinalde laestructura,detalmaneraquesepuedaprevenir lageneracióndeuna onda reflejada. La estructura que utiliza ondas estacionarias provée de máximareflexióndelasondaselectromagnéticasenambosextremosdelaregióndeaceleración,de tal formaque la combinación de ellas viajando en ambos sentidos da lugar a ondasestacionarias. En esta modalidad, el dispositivo de generación de microondas seencuentradentrodelaestructuramediantecavidadesvecinasacopladas;estediseñoeselmásfrecuente,yaunqueesmáscaro,tambiénesmáseficiente.

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Los rayos X de frenado se producen cuando los electrones inciden en un blanco dematerial de número atómico alto, como por ejemplo alguna aleación de tungsteno. Elblancoesdegrosorsuficientecomoparaabsorberlamayoríadeloselectronesincidentesy está asociado con un sistema de enfriamiento. Como consecuencia de la pérdida deenergíadeloselectronesconformepenetranenelblanco,seobtieneunhazdefotonescon un espectro de energía continuo. Este espectro tiene energía máxima igual a laenergíadeloselectronesincidentes.Laenergíapromediodelhazesaproximadamenteunterciodelaenergíamáxima.

Comosemencionóconanterioridad,en losaceleradores linealesdeusoclínicotambiénsepuedeutilizar el hazdeelectronesdirectamente. En lamodalidadde irradiación conelectrones, el haz se hace incidir en una “hoja dispersora” con la finalidad tanto dedispersar el haz como de alcanzar una fluencia uniforme a lo largo del campo detratamiento. El grosor de la hoja es tal que la mayor parte de los electrones sondispersadosenlugardesufririnteracciónporfrenado.Sinembargo,unapequeñafracciónde estos cede su energía para generar rayos X de frenado, lo que se convierte encontaminacióndelhazdeelectronesporfotones.

Enlasalidadelhazderadiación,secolocandispositivosdecolimaciónparadarlealgunaformaespecífica, con el objetivode irradiar el volumenblanco con el haz primario y almismo tiempo proteger el tejido circundante. Estos colimadores pueden ser bloques,cuñas,conosodispositivosmultihojas.

Los aceleradores lineales de uso clínico se construyen de tal forma que la fuente deradiación colocada en el cabezal puede rotar alrededor del eje horizontal. Mientras elcabezalrota,elejedelcolimador(quecoincideconelejecentraldelhaz)semueveenunplano vertical. Al punto de intersección del eje del colimador y el eje de rotación delcabezalseleconocecomoisocentro.

Figura2‐1Figuradeunaceleradorlineal.Seilustralacapacidadquetieneelcabezalderotaralrededordelisocentro

localizadodentrodelpaciente.

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2.3 SistemadecolimaciónmultihojasLoscolimadoresmultihohjas(MLCs)seutilizanparaentregartratamientosquerequierendefluenciascomplejasdelhazprimario.Alinicio,elMLCpermitióelusodemasángulosde tratamiento respecto de que lo que era posible en RT convencional con camposcuadrados utilizando bloques. Además hizo posible reducir significativamente la dosis atejidosano,yaquepermiteconseguiralasalidadelhazunaformamuycercanaaladelalesiónencadaplanodeincidenciadeltratamiento(Figura2‐2).

El mayor potencial de este tipo de dispositivos se consigue con la radioterapia deintensidad modulada (IMRT), mediante la cual es posible alcanzar de mejor forma losobjetivos terapéuticos en términos de cobertura a los blancos de tratamiento y deprotección al tejido circundante cuando se trata de casos con geometrías complejas, loquehaceposibleestudiarposiblesescalamientosdedosisenlostratamientos.Elusodesegmentos múltiples o campos pequeños están involucrados en la construcción de losmapas de fluencia, de tal forma que el uso de sistemas de cómputo se ha vueltoindispensable.

LosMLCscongrosordehojasdealrededorde1cmsonunaherramientamuyprecisaparaentregartratamientosconformalesydeIMRTenregionesextracraniales.LasvariacioneseneldiseñoestándardeMLCs incluyenmini‐MLCymicro‐MLC(mMLC),quetienehojasdehasta3mmdegrosorproyectadasenel isocentro.Ladiferenciaprincipalentreestosmodelosrecáeenlamaneraenquesesigueladivergencianaturaldelhazderadiación,enel númerodehojas y enel grosorefectivode lashojasenel planodel isocentro. Estascaracterísticassonindependientesysuconfiguraciónestádeterminadaporelsitioenqueseencuentralapatologíaatratar.

El MLC permite grandes aperturas, así como también el uso de diferentes técnicas detratamiento,desdelasconformalesestáticashastalaIMRT.ElmMLCestádiseñadoparasu uso en blancos pequeños y de formas irregulares, generalmente para lesionesintracraniales.

Actualmentesepuedenencontrarlinacsdedicadosaltratamientodelesionesdelsistemanerviosocentral.Estasmáquinastienenundispositivodecolimaciónqueestácolocadodeformapermanentealasalidadecabezal.Elsistemadecolimaciónconelquecuentanesdel tipo mMLC, cuyas dimensiones son seleccionadas para conseguir un alto grado deconfomación en lesiones pequeñas típicamente de localización intracranial. Uno de losequiposdedicadosesel linacNovalisde6MV,fabricadoporVarianMedicalSystemsencolaboraciónconBrainLAB(Figura2‐4).

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Figura2‐2Sistemadecolimaciónmultihojas.Mientraselhazderadiaciónincidedesdemúltiplesdirecciones,permiteconseguiralasalidadelhazunaformamuycercanaaladelalesiónconlafinalidaddeconseguirladosisdeseadaen

elvolumenblanco,mientrasseprotejeeltejidosanocircundante.

Figura2‐3FotografíadeunaceleradorlinealNovalisde6MVparatratamientosdelsistemanerviosocentral(Instituto

NacionaldeNeurologíayNeurocirugíadelaCiudaddeMéxico.

2.3.1 ElmMLCdeBrainLABElmMLC fabricado por lamarca BrainLab, consiste de 26 pares de hojas fabricadas detungstenoycontroladaspormotoresdepasosacopladosaunacomputadora(Figura2‐4).Elarreglosemontaalasalidadelhazderadiaciónparacambiarlacolimacióndelhazentiempodetratamiento.

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Eltamañodecampomáximoesde10.0cmx10.2cm.Elanchodelashojasproyectadoenelplanodelisocentro(distanciafuente‐ejedelisocentrode100cm)esde3mmparalos14parescentrales,4.5mmparalossiguientes3paresacadaladodelasprimerasylos6paresrestantessonde5.5mm(3pares/lado).Lascarasde lashojastienenformacurvaparaminimizarlasvariacionesdebidasalapenumbrarespectoalaposicióndelashojas.Las hojas se posicionan en el campodesignadomediante pequeñosmotores eléctricos.Cadaposicióndehojapuedeextendersehasta5cmapartirdelalineacentraldelcampoyhasta4.69cmcruzandolalíneadecampo.

Figura2‐4ColimadormMLC.Consistede26paresdehojascontroladaspormotoresdepasosacopladosauna

computadoraquesemontaalasalidadellinac.

Conestaconfiguraciónesposibleobtenercamposdinámicosqueproducenaltosgradosdeconformalidadenlosvolúmenesblanco,asícomounareducciónenladosisquerecibeeltejidosano.Engeneral,sesabequeelmMLCrepresentaundispositivocompletamentefuncional que puede ser programado para colocar sus hojas de manera precisa encualquierposicióndentrodelintervaloespecíficodeterminadoporlaaperturamáximadecampo. Se ha encontrado que sus características dosimétricas son consistentes con laexperiencia obtenida previmente con los MLCs de hojas mas gruesas (Xia et al. 1999, Milan et al. 1974).

2.4 RadiocirugíaconaceleradorlinealEnsentidoestricto,laradiocirugíanoesunacirugíacomolaconocemostradicionalmente,yaquenoserealizaincisiónalgunaenelcuerpohumano.Pudierasermejoretiquetarestametodología como entrega de radiación enfocada estereotácticamente. Los métodosmodernospararadiocirugía,sinimportarlafuentederadiaciónqueseutilice,engeneralincluyenlassiguientescaracterísticas:seentregaunadosisderadiaciónalta(usualmenteenunasólaexposición)enelblancodeinterés,seconsigueungradientededosistratandodesimularunafunciónescalón,ycomoconsecuencialostejidoscircundantesalaregiónanatómica de interés reciben dosis bajas, en todos los casos, menores a las dosis que

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radiobiológicamente está demostrado que podrían producir daño permanente. Losmétodos estereotácticos se utilizan para identificar la localizacióndel blanco, utilizandoademás cálculos dosimétricos mediante programas de cómputo y la entrega deltratamientoserealizacongranprecisiónmecánica.

El sitio en el que se entrega la dosis alta de radiación se denomina volumenblancodeplaneaciónPTV(porsussiglaseninglésPlanningTargetVolume).Comoenradiocirugíaladosisseentregaenunasolasesión,seutilizantécnicasdecolimacióndelhazydeentregadeltratamientodegranprecisión.Latécnicadetratamientoesnormalmenteisocéntrica,haciendousodearcosocamposconformadosestáticosmúltiples.

2.4.1 ModalidadesdetratamientoEnradiocirugía/radioterapia,losblancosdetratamientosonengeneraldeformairregulary representan un reto muy especial para el uso de tratamientos con un isocentro, enespecialcuandosehaceusodecamposcircularesgeneradosconcolimadorescilíndricos,incluso con colimadores de varios diámetros. Se sabe que la toxicidad en tejido seincrementacuandolosnivelesdedosisempleadosaumentanyconelvolumendetejidoirradiado.Desdehace pocomas de unadécada se utilizan tratamientos con colimaciónesférica a partir de isocentros múltiples, lo que ha permitido conformar blancosrelativamente grandes a costa de incrementar el tiempo de tratamiento y lainhomogeneidadenladosis,loquepuedeincrementar,latoxicidadnodeseadaentejidosano(Shiu et al. 1997).

Existen varias modalidades de tratamiento utilizando el linac: arcos circulares nocoplanares,hacesconformados,arcosconformadoseIMRT.

2.4.2 ArcoscircularesEstamodalidadserealizautilizandocolimadoresdetipocónico,con losqueseproyectaenlasuperficiedeirradiaciónunhazcircular.Conestopodemosconseguirdistribucionesde dosis aproximadamente esféricas. Estos colimadores son accesorios al linac y secolocanexternamenteacoplándosea la salidadel cabezal. Sepuedenutilizardiferentesdiámetrosdecolimación,desde3mmhasta20mmdefinidosenelplanodelisocentro.

2.4.3 HacesconformadosParaestatécnicadetratamientoseusanhacesestáticosconfomadosapartirdemúltiplesdireccionesdeincidencia.SeutilizalacolimacióndelhazprovistaporunMLC.Lasláminasdel colimador secolocanalbordede la lesióndeterminadaparaunplanoespecíficodeincidenciaysebuscaconseguir la formamascercanade lafronteradelblanco, limitadoporlasdimensionesfísicasdelMLC.

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2.4.4 ArcosconformadosEnestatécnicadetratamientoseutilizaelMLCparacambiarlaformadelaproyeccióndelblanco conforme se describe el arco definido, abarcando desde un ángulo inicial hastaotrofinal,siempreirradiandomientrasrotaelcabezal.

2.4.5 IntensidadModulada(IMRT)Laradioterapiaconintensidadmoduladaesunatécnicadetratamientoenlaqueseutilizaun sistema de cálculo y planeación conocida como planeación inversa, esto es, elalgoritmodecálculotomacomocondiciónalaentradaladostribucióndedosisesperadayel cálculo arroja como resultado el movimiento que tendrán que realizar las hojas entiempodeirradiaciónparaconseguirunafluenciadelhazderadiaciónvariableytratandode conseguir lasmetas planteadas inicialmente. Estasmetas estan relacionadas con losobjetivosterapéuticos:dosisalblancoyprotecciónaltejidonormal.LashojasdelMLCsemueven de forma continuamodificando la intensidad del haz a lo largo del campo deradiación mientras el haz se encuentra activo en múltiples posiciones estáticas delcabezal.

2.5 Sistemasdedetecciónymedidadeladosis

2.5.1 CámaradeionizacióndededalElprincipiobajoelquefuncionaunacámaradeionizacióndededalseilustraenlaFigura2‐5, en la que se muestra un volumen esférico de aire con una cavidad en su centro.Supongamosqueestaesferadeaire se irradiauniformemente conunhazde fotonesyqueladistanciaentrelaesferaexteriorylacavidadinterioresigualalalcancemáximodeloselectronesgeneradosenaire.

Sielnúmerodeelectronesqueingresanalacavidadeselmismodelosquesalendeella,se dice que existe equilibrio electrónico. Supongamos también que somos capaces demedir la carga por ionización que se produce en la cavidad por los electrones que seliberanenelairequerodeaa lacavidad.Entonces,alconocerelvolumeno lamasadelairedentrodeella,podremoscalcular lacargaporunidaddemasaolaexposiciónenelcentrodeella.Ahora,silapareddeairesecomprimieraenunacubiertasólida(Figura2‐5‐B), obtenemos una cámara de ionización de dedal. Aunque la pared de esta cámara essólida,estambiénaireequivalente,esdecir,sunúmeroatómicoefectivoeselmismoqueaqueldelaire.Además,elgrosordeestaparedestalqueocurreelequilibrioelectrónicodentro de la cavidad a la que rodea, como se describió antes, así que el grosor debetambiénserigualomayorqueelalcancemáximodeloselectronesliberadosenlapared.

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Figura2‐5Diagramaqueilustralosfundamentosdeunacámaradeionizacióndededal.A)Cavidaddeaireconfronteradeaire.B)Cubiertadeairesólidaconcavidaddeaireensuinterior.C)Cámaradeionizacióndededal.

Unacámaradededal seconstruyeconpareddeaproximadamente1mmomenorysecomplementa conun capuchónque rodea a la paredde Plexiglas o algúnplástico paraalcanzar el grosor necesario para el equilibrio electrónico para el haz de radiación encuestión.

Lapareddeestascámarastieneformadededal(dedondevieneelnombre).Lasuperficieinternaserecubreconunmaterialespecialparahacerlaconductoraelectricamente.Conestoseformaunelectrodo.Elotroelectrodoesunabarradematerialdenúmeroatómicobajotalcomografitooaluminioquesecolocaenelcentrodelvolumeninternoalaparedperoelectricamenteaisladodeella.Seaplicaunadiferenciadepotencialadecuadaentreamboselectrodosparacolectarlosionesproducidosenlacavidaddeaire.Lamayorpartedelaionizaciónproducidaenlacavidaddeaireprovienedeloselectronesqueseliberanenlapared(Figura2‐5‐C).

Unacámaradeionizaciónsepuedeutilizarparamedirdirectamentelaexposiciónsifueraequivalenteaaire,sielvolumendesucavidadseconocieraconprecisiónysielgrosordesu pared fuera suficiente para proveer equilibrio electrónico. Bajo estas condiciones, laexposiciónXestádadapor:

X=(Q/ρ.ν)(1/A), Ec.2‐1

dondeQ es la carga liberada en la cavidadde aire de densidadρ y volumenν; A es la

fraccióndelafluenciadeenergíaquesetransmiteatravésdelaparedaire‐equivalentey

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grosordeequilibrio.ElvalordeAesligeramentemenorque1.00yseutilizaparacalcularla exposición debida a una fluencia de enrgía que existiría en el punto de medida enausenciadelacámara.

Aunqueserequiereungrosoradecuadoparaconseguirelequilibrioelectrónico,laparedproducealgodeatenuacióndelhazdefotones(Figura2‐6).Cuandoelgrosordelaparedesmuchomenorqueelrequiridoparaelequilibriooionizaciónmáxima,segeneranmuypocoselectronesenellayentonceslarespuestadelacámaraesbaja.Sielgrosorexcedelonecesarioparaelequilibrio,larespuestadelacámaradenuevosevereducidadebidoala atenuación del haz en la propia pared. La exposición real (sin atenuación) se puedeobtenermediante laextrapolación linealde lacurvadeatenuaciónmasalladelmáximohaciagrosorcero.

Figura2‐6Esquemadelefectodelgrosordelaparedenlarespuestadelacámara.

Si la respuesta de la cámara se normaliza a la lectura máxima, entonces, el valorextrapoladoparagrosordeparedceronosdaelvalordelfactordecorrección1/Aqueseusa en la ecuación anterior. Este valor de corrección es inherente en el factor decorrección que se obtiene cuando la cámara ionización se compara con cámaras deionizacióndeairelibreenlaboratoriosestandarizados.Así,cuandoelfactordecalibraciónseaplicaalalecturadelacámara(corregidaporcambiosentemperaturaypresiónenlacavidaddeaire),ésteconvierteelvalorenexposiciónrealenairelibre(comoenausenciade la cámara). Entonces el valor de exposición obtenido está libre de atenuación en laparedodeperturbacionesporinfluenciadelapresenciadelacámara.

Lacámaradeionizaciónseconectaaunelectrómetroparaobtenerlamedidadelacargagenerada en la cavidad. El electrómetro se conecta al electrodo central de la cámaramediateuncabledesoporte.

Grosor de la pared (cm)

Re

sp

ue

sta

de

la

cá

ma

ra

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2.5.1.1 RecoleccióndeionesLacargageneradaenlacámaradeionizaciónseveafectadaporcondicionesambientalesydefuncionamientodelacámaramisma.

Conformeladiferenciadepotencialaplicadaaloselectrodosseincrementa, lacorrientepor ionización también lo hace, al principio casi de forma lineal y después maslentamente.Finalmentelacurvavoltajeaplicadovs.corrientegeneradaalcanzaunvalorde saturaciónparauna tasade exposicióndada (Figura 2‐7). El incremento inicial de lacorrienteconelvoltajeescausadaporlarecoleccióndeionesincompletaavoltajesbajos.La cámara entonces debiera ser utilizada en la región de saturación de tal forma quecambiospequeñosquesepudieranpresentarenelvoltajenoinfluyanenelresultadodelalecturadelacorriente.

Figura2‐7Esquemadesaturacióndeunacámaradeionización.

Porotro lado, la lecturaen lacolecciónde ionestambiénsepuedeverafectadapor losefectos de polaridad en la cámara. Algunas veces se presenta que para una exposicióndada,lacargaiónicacolectadaporunacámaracambiasumagnitudconformelapolaridaddelosvoltajesseinvierte.Conunacámaradeionizaciónquefuncionaencondicionesdesaturación,algunasdelasrazonesmasimportantesporlasqueelcambioenlapolaridadafectalalecturason:

A. LoselectronesdealtaenergíacomolosgeneradosporefectoComptondebidosafotones de alta energía, generan una corriente independiente del gas deionización.Estopuedeabonaroreducirlacorrientecolectada,dependiendodelapolaridad en los electrodos. Un valor real de la ionización se puede obtenermediante la lectura promedio de las corrientes obtenidas con la inversión de lapolaridad.

B. Lacorrienteextracámaraquesegeneracuandosecolectanelectronesgeneradosfueradelvolumensensiblede lacavidad.Estacorrientesepuedegenerarpor la

Voltaje en la cámara

Co

rrie

nte

de

io

nes

en

la

cá

mara

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irradiacióndelcableconectorentrelacámarayelelectrómetro.Estoserroresenla lectura pueden ser minimizados mas no eliminados por completo, al tomarlecturas promedio por ambas polaridades de funcinamiento en la cámara deionización.

Lascondicionesambientalestambiéninfluyenenlalecturadelacorriente,unavezqueladensidaddelairedependedelatemperaturaypresióndelambiente.Loslaboratoriosdereferencia calibran las cámaras de ionización bajo condiciones estándar de presión ytemperatura (760 mm Hg y 22ºC). Si las medidas de la ionización se realizan encondicionesqueno son lasde referencia, la correcciónpor condicionesatmosféricas setienequeconsiderar.

2.5.1.2 MedidadelaexposiciónLa exposición en unidades de roentgen se puede medir de manera absoluta con unacámaradeionizacióncontandoconunfactordecalibraciónparalaexposiciónNcqueseatrazable al National Institute of Standards and Technology para una calidad de haz deradiación específica. Si suponemos que se obtiene una lectura M para una exposicióndada,éstasepuedeconvertiraroentgenscomo:

X=M⋅Nc⋅C, Ec.2‐2

dondeCeselfactordecorrecciónporcondicionesambientalesydefuncionamientodelacámaradeionización.

2.5.1.3 MedidadelaDosisExistenprotocolosinternacionales (Almond et al. 1999)pararealizarladosimetríaclínicaencondicionesdereferenciaparahacesexternosderadiaciónutilizandohacesdefotonescon energías nominales desde la de haces de 60Co hasta 50 MV. La mayoría de ellosutilizanlaslecturasobtenidasconlascámarasdeionizaciónconfactoresdecalibracióndedosisabsorbidaaagua (ND,w,

60Co),mismosquesontrazablesa laboratoriosprimarios.La

ecuaciónmediantelaquesepuedeobtenerelvalorabsolutodedosisabsorbidaenaguaes:Dw,Q=M⋅kq⋅ND,w,

60Co,dondeQeslacalidaddelhazdeinterés,Dw,Qesladosisabsorbida

en agua en el punto de medida en el que se coloque la cámara de ionización bajocondicionesdereferencia,Meslalecturadelacámaradeionizacióncorregidaportodoslosfactoresnecesariosdiscutidosantesykqesel factordeconversiónpor lacalidaddelhaz.

2.5.2 PelículaRadiográficaLaspelículas radiográficasbasadasenemulsionesdehalogenurodeplata (AgH) seusanámpliamenteparadosimetríarelativadehacesdetratamientoconradiaciónexternaenelintervalo de energía de megavoltaje. Estas películas proveen registro permanente dedistribucionesdedosisespacialesintegradas (Pai et al. 2007).

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En años recientes, la dosimetría fílmica se ha convertido en una herramientaindispensable para verificar distribuciones de dosis en tratamientos con radiaciónutilizandotécnicasmodernascomolosonRadioterapiaconIntensidadModulada(IMRT)yradiocirugíaestereotáctica.

La naturaleza bidimensional de las películas, ofrece la opción de selección de laorientaciónde lapelícularelativaa ladistribucióndedosisy,dadoqueesundosímetrointegrador, ayuda en la medida de distribuciones de dosis entregadas de maneradinámica.

Ladosimetríafílmicaofreceunmétodorápidoyapropiadoparaobtenerdistribucionesdedosis bidimensionales a partir de las que se pueden extraer conjuntos de curvas deisodosis en el plano de la película. La independencia de la energía de algunos tipos depelículasepuedeexplicarporelhechodequelarazóndepoderesdefrenadoporcolisiónen la emulsión y en el agua varía lentamente con la energía de los electrones, sinembargo, su aplicación para dosimetría de haces de fotones de megavoltaje es mascomplejo.Estoesresultadodelhechoquelasensitividadfílmicavaríaporqueelespectrodeenergíadelosfotonesenmaniquíes,varíacomofuncióndeltamañodecampoydelaprofundidad.Losdatosexistentesenrelaciónalainfluenciadelageometríadeirradiaciónenlacurvasensitométricasoncontradictorios.

Las técnicasde radioterapiamodernascomo la IMRTy la radioterapiaestereotácticadeintensidad modulada, utilizan dosis tiempo‐dependientes y por lo tanto requieren dedosímetrosintegradoresparacuantificarladosisentregadaintegradaototal.

Los retos principales en el uso de película radiográfica como dosímetro de haces demegavoltajeesladependenciadeladensidadóptica(DO)en:

a. Laenergíadelhazdefotones,eltamañodecampoylaprofundidadenelmaniquíb. Elplanodeorientacióndelapelículaconrespectoaladireccióndelhazc. Lasdiferenciasenlasemulsionesentrelaspelículasdelotesdiferentes,delmismo

loteodentrodeunamismapelículad. Lascondicionesdeprocesamiento;ye. Losmétodosdensitométricosylosartefactosrelacionados.

La implicación de estos es que lamisma DO no siempre se asocia con lamisma dosis,haciendolaconversióndeDOadosispotencialmentedifícil.

2.5.2.1 DensidadÓpticaElvalordeopacidaddeunapelículasecuantificaatravésdelfactordetransmisiónT,ysemidemedianteunacantidadllamadadensidadópticaDO.LaDOesunvalorquedescribeelennegrecimientodeunapelículaysemideconundensitómetro:

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DO=‐log10(T)=log(I0/I), Ec.2‐3

donde I0 es la intensidad de luz incidente en ausencia de película e I es la intensidadtransmitidaperpendicularmentealplanode lapelículayatravésdeella.Siαeselárea

promedio (cm2/grano) de un grano de plata revelado y si existen n granos reveladosgranos/cm2delapelícula,entoncespodemosescribiraTcomoT=e‐αn,así:

DO=‐log10(e‐αn)=0.4343αn, Ec.2‐4

Es difícil saber el número de electrones que se necesitan para revelar un grano. Sinembargo,siasumimosqueunsoloelectrónesresponsablederevelarungrano,entoncespodemoscorrelacionar la fluenciadeelectronesφ,quepasaperpendiculara lapelícula,

conladensidadóptica.SiNeselnúmerodegranosdebromurodeplataporunidaddeáreadeunapelículanoexpuesta,entoncesnylaDOsepuedenescribircomo:

n=αNφ Ec.2‐5

DO=0.4343α2Nφ Ec.2‐6

Como la DO es proporcional al número de granos de plata por unidad de área y a lafluenciade fotones, y dadoque la fluenciade fotones y de electrones esta relacionadadirectamentecon ladosisderadiación, ladensidadópticadebieraserunafunciónde ladosis.Larelaciónentreladosisyladensidadópticaseconocecomocurvasensitométrica.

2.5.2.2 CurvascaracterísticasHurteryDriffieldintrodujeronlacurvasensitométricaen1890,alaqueahoraselerefierecomocurvaH&D(Pai et al. 2007).LacurvaH&Deslacurvaderespuestadelapelículadeunaenlaquelog(exposición)segraficaenelejeXylaDOenelejeY.LascurvasH&Dsonimportantesparacuantificarcontrasteyrangodinámicodeunapelícularadiográfica.Lascaracterísticasdelarespuestadelapelículapuedegraficarsedevariasformascomoson:dosisvs.DO,log(dosis)vs.DOolog(dosis)vs.log(DO).

Enradioterapia, la representaciónmasusadaes ladedosisvs.DO, referidacomocurvasensitométrica. La DO es una función de varios parámetros: DO=f(D,RD,R,γ,d,TC,θ,τ)

dondeDesladosisderadiación,RDeslarapidezdedosis,Eeslaenergía,γeseltipode

radiación primaria (rayos‐X, electrones, etc.), d es la profundidad de medida, TC es eltamañodecampo,θes laorientaciónrelativade lapelícula (paralelaoperpendicularal

haz de radiación) y τ se refiere a las condiciones del procesador/revelador (tiempo derevelado,concentracióndelrevelador,etc.).

La curva sensitométrica en radioterapia refleja las características de una película.Típicamente tiene tres secciones: talón, gradiente y hombro. La respuesta de todas laspelículasalaradiaciónsedebeprincipalmenteasutamañodecristalylasvariacionessonsignificativas.

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2.5.2.3 MedidadedosisrelativayabsolutaLa curva sensitométrica debe establecerse para una energía específica, un lote depelículas, tipo de película, orientación y condiciones de procesamiento bajo las que lapelículaseráusada.SiunooperaenlaregióndondelaDOtieneunarelaciónlinealconladosis y se aplica una calibración válida, entonces, se puede obtener una dosimetríarelativaprecisa.Siserequierevaloresdedosisabsoluta,entoncesdebemosestablecerlarelacióndedosisconunvalordepixeloDO.Medianteelprocesamientodeunconjuntode datos de una nueva calibración de película al mismo tiempo que se obtienen laspelículas correspondientes a un experimento, entonces se pueden obtener valoresabsolutosdedosisprecisos.

Recientemente,Kodakdesarrollóunapelícularadiográficaparautilizarseenradioterapiacon rango de dosis amplio, denominada EDR2 (EnhacedDose Rate v.2). La ventaja quepresenta esta película es que tiene un rango lineal de DO mayor, estructuramicrocristalinamaspequeña,contenidodeplatamenoryunarespuesta,queseextiendeadosismayores,quepuedenserhastade3.5Gy.

Las películas deben exponerse inmersas en material que simule tejido (plásticos agua‐equivalente). Se recomienda que se coloquen algunos centímetros de material agua‐equivalentesobreypordebajodelapelículaqueseráexpuesta.Silapelículaseutilizarácontenidaensusobreprotectoryelmaniquíencontactoconelladebepresionarseparaqueseremuevanlasbolsasdeaire.

2.6 AlgoritmosdecálculodeladosisComo en radiocirugía se tratan campos de dimensiones pequeñas (extensiones linealesmáximasdelPTV≤3.5cm)yconunnúmerodecamposmayor,esapropiadosimplificar

los cálculos de dosis en relación con los cálculos que se requieren para campos detratmientos grandes, no‐isocéntricos que comunmente se emplean en radioterapiaconvencional.

En general, la suposición principal de los modelos clásicos para el cálculo de dosisutilizandoestereotaxiaesquelosfotonessecundariosdispersadossepuedenconsiderardesignificacialimitada.Algunosautoreshanpropuestoeinvestigadoestahipótesis(Rice et al. 1987,Luxton et al. 1991)y loscálculosdedosishantenido latendenciaaserunafunción de tres parámetros básicos: razones máximas de tejido, factores de salidarelativosyperfilesdeloshaces.Lacontribuciónporfotonesdispersados(enparticularentejido) se considera implícita a estas medidas, y no varía significativamente con laprofundidad en el medio, mientras éste sea homogéneo. Así, los algoritmos clásicosutilizanequivalenciasdetejidoenprofundidadyrazonesdetejido‐aire,incorporandounacorrección unidimensional donde la densidad a lo largo de la trayectoria a partir de la

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fuentehastaelpuntodecálculoesutilizadaparacorregirladosisabsorbidaporelefectodelaheterogeneidad(Milan y Bentley 1974).Estosmétodosincluyenlarazóntejido‐aireylaleydepotenciasdeBatho(Sontag y Cunningham 1977).Posteriormenteseutilizaronmétodos de corrección por heterogeneidad bidimensionales, en los que se utilizabancorreccionespordispersiónsemi‐empíricas.Talesmétodosincluíanlaequivalenciatejido‐aire y el método de convolución de la transformada rápida de Fourier, en los que lacorrecciónpordispersiónse incluyea travésdeunaaproximación lineal (Boyer y Monk 1985,Boyer y Monk 1986,Boyer et al. 1988,Martel et al. 1992).

Laprecisiónqueproveenlosalgoritmosdecorrecciónantesmencionadosenelcálculodedosis,padecíandelimitantesalmodelarlascomponentesdedosisasociadasalaradiacióndispersa. Inspirado por esta limitante, emerge una nueva generación de métodos decorrecciónenlosqueexplícitamenteserealizaeltrazadodelosrayosparaladispersiónen tres dimensiones. Estos métodos son los de la razón diferencial de aire‐dispersiónpropuestoporCunningham (Cunnigham, 1972)e implementadomas tardeporLarsonyPrasad(Larson y Prasad 1978).Porotrolado,encontramoselmétododelvolumendeltade Wong y Henkelman (Wong y Henkelman 1983), el arreglo de depósito de dosispropuestoporMackieycolaboradores(Mackie et al. 1985)yporúltimoelalgoritmodehazdelápizdiferencialporMohanycolaboradores(Mohan et al. 1986).Enestemétodosemianalítico los efectos por heterogeneidad son considerados directamente por elmodeloyseconvierteeninherentealcálculo.Partedelasuposiciónesquesecuentaconunmodelodeldepósitodeenergíaapartirdelsitiodeinteraccióndeunfotónprimarioenagua. Esta distribución también se conoce como el kernel de dosis por dispersión. ElkernelseajustaparaincluirlosefectosdelaheterogeneidadenladensidadaplicandoelTeoremadeO’Connordeescalamientodedosis(O'Connor 1957),suponiendoquenohaycambios en la composición atómica del paciente sino que solamente cambios en ladensidad.

2.6.1 AlgoritmodehazdelápizdiferencialUn“pencilbeam”ohazdelápizdeferencial(DPB)sedefinecomoladistribucióndedosisrelativaa laposiciónde laprimeracolisión,porunidaddedensidaddecolisión,paraunhaz de lápiz de fotones delgado en unmedio homogéneo infinito de densidad unitaria(Mohan et al. 1986).

Unhazde lápizque incidesobre lasuperficiedeunmaniquíhomogéneoda lugaraunadistribucióndedosisenél.ElnúmerodecolisionesprimariasporunidaddevolumenquesellevanacaboenelpuntoQalolargodelhazsepuedeescribircomo:

ΦQ(E)xµ(E)xexp[‐µ(E)tQ], Ec.2‐7

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dondeΦQ(E)eslafluenciaenQdelaenergíadelosfotonesincidentesdeenergíaE,µes

elcoeficientelinealdeatenuaciónytQeslaprofundidadalolargodelhazdelápiz.

LadosisenelpuntoPsecalculacomo:

DP=∫ ΦQ(E)xµ(E)xexp[‐µ(E)tQ]xDPB(rPQ,θ,E)xdtQ, Ec.2‐8

dondeDPB(rPQ,θ,E)esladistribucióndedosiscomofuncióndelaenergíadelosfotonesy

delaposicióndelpuntodeinterésrelativoalpuntodecolisión;paraunadistribuciónquecorrespondeaunhazmonoenergéticoqueincideenunmaniquísemi‐infinitodedensidadunitaria estádadopor la integral de loshacesdiferenciales con su intensidadatenuadaapropiadamente,ydonderPQesladistanciaentreelpuntodeinterésPyelpuntodondeocurrenlascolisionesprimariasQ.

2.6.2 MétodosMonteCarloUnadelastareasmásimportantesenradioterapiaesdeterminarlasdistribucionesdeladosis absorbida en medios de interés (pacientes y maniquíes). Las técnicas de cálculoutilizandométodosMonteCarlo(MC)handemostradoserlamaneramásexactadehaceresto. Estas técnicas han desempeñado un papel importante en la dosimetría de laradiación(Rogers, 2006),inclusopermitenestimarladosisenlasregionesdonderealizarmedidasconlossistemasdedetecciónconvencionalessoninadecuadas,porejemploenlaregióndeincremento.

Estos algoritmos son considerados comoel puntode referenciade los cálculos teóricosparadeterminareldepósitodedosis.LametologíaMonteCarloescapazdeentregarelvalor de dosis absorbida directamente, eliminando así la necesidad de convertir laionizaciónadosis.Estoesparticularmenteútileimportanteenregionesdondenoexisteelequilibrioelectrónicodepartículacargadayporlotantolosfactoresdeconversiónnosonválidos.Masaún,el“detector”siempreestáhechodelmismomaterialqueelmedio,no tiene paredes y puede definirse tan pequeño como estadísticamente sea posible.Además,comoloscálculosMonteCarlopuedenincorporartodaslasinteraccionesfísicasrelevantes, son ideales para comparar otros modelos de cálculo, así como medidasobtenidas experimentalemente. Utilizando esta metodología es posible separar losfenómenos físicosde los factoregeométricos (sistemadecolimación, fuentede tamañofinito,etc.)ydeteminarlarobustezfísicadelosprincipiosfundamentalesdelmodelo.

SimularlosexperimentosengeometríascomplicadasutilizandolametologíaMonteCarlopuedeconsumircantidadesimportantesdetiempo,unavezquealejectuareltransportederadiaciónseconsiderantodoslosfenómenosfísicospresentespartículaporpartícula.Los fotones tienen un número limitado de interacciones antes de ser absorbidos; estohace posible simular todas las interacciones de manera directa. Por otro lado, en el

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transporte de electrones, el número de interacciones Coulombianas con los núcleosatómicos es tan grande que la simulación directa es impráctica. Esto ha motivado eldesarrollodeloqueseconocecomotécnicasdehistoriacondensadaenlasquediferentesinteraccionesmicroscópicas se clasifican en gruposparaproveerdeuna representaciónmacroscópica detallada del transporte de las partículas. Las técnicas condensadassuponenqueelmedioeshomogéneolocalmente,loquehacenotrivialelestudiodelosefectosdelasinterfasesendetalle.Laimplementacióndeestastécnicassepuedehacerusandodiferentesaproximaciones(Kawrakow y Bielajew 1998,Bielajew y Rogers 1987)convenientesparaelcálculodedosis.

2.7 Ensayosinvivo/invitroLos estudios radiobiológicos utilizan un amplio rango de tumores experimentales dediferentes tiposhistopatológicossehandesarrolladoparaestudios radiobiológicos.Paraproducir un grannúmerode tumores virtualmente idénticos, seusa lapropagaciónportransplantaciónapartirdeunageneracióndeanimalesa la siguiente.En lapráctica, seutilizancepaspurasderatasoratonesparamantener lavariabilidadasociadaalcambiodeanimalesalmínimo.

A partir de un animal donador, el tumor se remueve en condiciones de asepsia y seprepara en una suspensión celular. Para efectuar un transplante, se inoculan de formasubcutanea 104 a 106 células en cada uno de los animales receptores. El sitio deltransplantepuedevariar,aunquelomasfrecuenteesusar laregiónposteriorenlapatatraseradelanimal;enalgunasocasionesseimplantanlostumoresenelcerebro.

En semanas o días, dependiendo del tipo celular que se haya empleado y del animalreceptor,tumoresdetamañopalpablecomienzanaaparecer.Deestamanerasepuedenutilizardecenasdeanimales,detalformaqueseaposiblediseñarestudioscuantitativosyestudiar,porejemplo, la respuesta tumoraladiferentesesquemasydosisde radiación,bajo tratamientos sólo con radiación o combinados con agentes quimoterapéuticos oradiosensibilizadores.

Unnúmerolimitadodelíneascelularessehaadaptadoparaesayosinvivo/invitrodetalformaqueseantransplantablescomountumorenunanimalocomocélulasclonogénicas(viablesparasureplicaciónyformacióndecolonias)enunfrascodecultivo.Estascélulaspuedensertransferidasfácilmentedeensayosinvivoainvitrooviceversa(Figura2‐8).EnunageneraciónpuedencrecercomountumorsólidoenunanimalyenlasiguientecomounamonocapaenunacajadePetri.

Despuésdeltratamientocadatumoresremovidoypreparadoenunasuspensióncelular,se cuantifica la concentración celular. Posteriormente, se pude transferir un número

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conocidodecélulasauncultivocelularquecontengamediodecultivofrescoquefaciliteel crecimiento de las células, así será posible contabilizar la porción de células quepresentanviabilidadparalareplicación.Deestaformasepuedenconstruirlascurvasdesobrevidacelular.

Figura2‐8Principiodeensayosinvivo/invitroutilizandountumorderata.Eltumorsólidoseremuevedelanimalylascélulasdeélensuspensiónsonluegotransferidasalensayoparalaformacióndecoloniasencajasdecultivo

celular,tomadade(Hall & Giaccia, 2006).

Tanto los modelos animales como los estudios in vitro han sido un instrumento en labúsqueda de los procesos bioquímicos y fisiológicos del cáncer y de la propagación deorganismosvivos.Demaneramasimportante,hansidounavíaparaevaluardiagnósticosnuevos y fármacos terapéuticos que eventualmente podrían ser utilizados en la saludhumana. De hecho, actualmente encontramos que el estudio de los efectos de losfármacos y terapias en experimentación es un pre‐requisito para proponer estudiosclínicos en pacientes. Los estudios in vitro y en animales, pueden proveer informaciónfarmacológica y toxicológica; además pueden predecir la eficiencia clínica de nuevosfarmacos,asícomoterapiascombinadas,porejemplo,compuestosnuevosconradiaciónionizantey/ocirugía.

Los estudios in vitro se utilizan en una etapa inicial, una vez que son mas baratos,relativamente fácil de producir y manejar; además, es posible mantener un controlrigurosodelascondicionesbajolasqueserealizanlosexperimentos,loquenospermitealcanzar un grado de reproducibilidad y sistematicidad importante, sin olvidar lavariabilidadintrínsecaalalíneacelularqueseutilice.

Estosestudiospuedenserdegranvalor;losresultadosenanimalesalgunasvecesnosonenteramenteaplicablesaescalahumanadadaslasdiferenciasbiológicasinherentesentre

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lasespecies.Ladecisiónenlaseleccióndeunmodeloexperimentalrelevante,asícomoeldiseño,eldesarrolloylaevaluacióndelosexperimentoshandesermuycuidadosos.Porloqueserecomiendaconservarunespíritucríticoantelasaplicacionesdelosresultadosdeensayospre‐clínicoseneldominioclínico.

2.7.1 Lacurvadesobrevidainvitroylarelacióndosis­respuestaUnacurvadesobrevidaesunagráficadelafraccióndesupervivenciacelularvs. ladosis(porradiación,fármacoscitotóxicosoalgúnotroagentequefavorezcalamuertecelular).LaFigura2‐9muestraquecuandosegraficaenescalaslinealeslacurvadesobrevidaparacélulas irradiadas en un cultivo celular es generalmente una curva sigmoide: tiene unhombro seguido de una curva que se acerca a cero asintóticamente. Para indicar lasensibilidad de las células a la radiación pudieramos extraer la dosis a la que se haconseguidoeliminaral50%delascélulas.

Otra manera de presentar las curvas de sobrevida es en una escala logarítmica, dosrazones son las fundamentales: si lamuerte celular es aleatoria, entonces, la sobrevidaseráunafunciónexponencialdeladosis,yestaseráunalínearectaenunagráficasemi‐logyunaescalalogarítmicanospermitemasfácilmenteverycompararlasobrevidamuypequeñas,análisisqueesnecesarioparaobtenerunareducciónsignificativaeneltamañotumoraloparaelcontroltumorallocal.

AB

Figura2‐9Curvadesobrevidaparacélulasdegliblasmamultiformehumano.A)Muestraquecuandosegraficaenescalalineal,lacurvapresentaformadesigmoide:tieneunhombroseguidodeunacurvaqueseacercaaceroasintóticamente.B)Lafraccióndesobrevidasegraficaenunaescalalogarítmicavs.ladosisenescalalineal.

Las curvas de sobrevida son básicas para entender tanto de la radiobiología como seaposibledeloqueestásucediendoconformesedesarrollanlospasosdelexperimento,enparticular, utilizando las líneas celulares en el cultivo. El término eficiencia de pegadoindica el porcentaje de las células cultivadas que crecen en colonias. La eficiencia depegado se define mediante EP=(Número de colonias cuantificadas/Número de célulascultivadas)x100.

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Este proceso se repite para varios valores de dosis y así estimar la sobrevida que seobtieneparaunintervalodedosisdeinterésclínico.

Para clasificarun fenómenobiológico comoefectode la radiación se requierequeestefenómenonoseavistooseavistoraravezdespuésdedosisceroyvistoenprácticamentetodosloscasosdespuésdeunvalorespecífico(generalmentealto)dedosis.Conformeseincremente la dosis por radiación, en general los efectos se pueden incrementar enseveridad(grado)oenfrecuencia(incidencia)oambas.

2.8 Irradiacióndemodelospre­clínicosLainvestigaciónenanimalespequeñosyencultivoscelularespermiteelestudiodetalladode procesos biológicos, de progresión de enfermedades y de la respuesta de losorganismosaterapias,conelpotencialdeproveerunpuentenaturalalambienteclínico.En particular la terapia con radiación ionizante o radioterapia (RT) ha avanzadoenormemente desde la introdución de los aceleradore lineales. Avances tales como lasfuentes de radiación rotatorias, colimadores multihojas conformales, la RT y suverificación guiadas por imagen y la radioterapia con intensidad modulada (IMRT) sonahora equipos y técnicas de uso común en los centros modernos de radioterapia. Sinembargo, en los laboratorios, los sistemas análogos para el tratamiento de animalespequeños, así como para experimentación en cultivos celulares, carecen demuchos deestos avances, por lo que el conocimiento de los efectos biológicos de la radiación enestudiosdecarácterpre‐clínicoestáretrasadorespectoalasaplicacionesclínicas.

A lo largo de cuatro décadas, los investigadores han utilizado diferentes técnicas deirradiación para experimentos in vitro, cambiando las fuentes de radiación así como elestado del cultivo celular –frascos de diferente geometría, con pozosmultiples, para elcrecimiento en suspensión o en placa‐. Algunas de las fuentes que han sido usadasmayormente son los isótopos radiactivos 137Cs (Bäckström et al. 1971, Grenman et al. 1988,Yoshida et al. 1994,Badie et al. 1999,Tarnawski et al. 2003, Ning et al. 2004),asícomo algunas máquinas de kilovoltaje (Bäckström et al. 1971, Garret et al. 1998,Shibamoto et al. 2004). Las técnicas de irradiación que describen estos autores sonrelativamentesencillasde implementardada laenergíabajade las fuentesutilizadasyaquelosensayosrequeríancamposderadiaciónhomogéneos.

Masrecientemente,losaceleradoreslinealesparaproducirrayosXdealtaenergíaestansiendo utilizados principalmente para estudiar los efectos de la irradación con IMRT encultivos celulares, es decir, además de emplearse en la aplicación clínica, estan siendoutilizados en investigación pre‐clínica (Sterzing et al. 2005, Suchowerska et al. 2005,Bromley et al. 2006,Moiseenko et al. 2007,Mackonis et al. 2007,Bromley et al. 2009,Butterworth et al. 2010).

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Cuando se utilizan haces de mayor energía se presenta el problema de alcanzar elequilibrio electrónico de partícula cargada en la región de interés que, para el caso deenergíasmayores,seencuentraamayorprofundidad.

2.8.1 Equilibrio de partícula cargada en la irradiación de cultivoscelulares

Muchas de las veces los reportes mencionados muestran que se ha realizado un granesfuerzoporpartede losautoresparaalcanzar lascondicionesdeequilibrioelectrónicoen loscultivoscelularesconelobjetivodepoderasignarvaloresdedosisprecisosasusensayos.Cuandonos referimosalusodeenergíasde6MeVomayores, talesesfuerzosson todavíamas importantes, una vez que la profundidad a la que se ha de colocar laregióndeinteréssepuedeextenderamas1.5cmenagua.

Enlaregióndeincremento(dondeelequilibrioelectróniconoseconsigue)elcocientedelpoder de frenado restringido promedio, así como los factores de perturbación en lascavidadesde las cámarasde ionización (fluencia, factoresdepared y electrodo central)cambiansignificativamenteconlaprofundidad;comoconsecuencia,lasmedidasllevadasacaboenestaregión(asícomoenlaszonasdetransicióndemedios)exhibenunasobre‐respuesta en la cámara de ionización provocada por estas perturbaciones (Nilson y Montelius 1986).

Enloscasosenquerealizar lasmedidasconestossistemasdedetecciónes inadecuado,lastécnicasdesimulaciónusandométodosMonteCarlosonconsideradascomolaformamásprecisaparadeterminarladosisabsorbida(Rogers, 2006)yhansidousadascomoelestándaren lavalidacióndemedidasdosimétricasde laradiaciónenelmedio,comosemuestraenalgunosprotocolosinternacionalesdemedidadeladosis(Almond et al. 1999,IAEA 1987). Aunque se han presentado discusiones importantes en relación con lasdiscrepancias entre cálculosMonte Carlo y medidas en la región de incremento, estasaparecenprincipalmentepara irradiacionesconhacesdeenergíamayora6MeV (Ding, 2002). Para el caso particular del uso de un haz de rayos X de 6 MeV, como el queutilizaremosenestetrabajo,Abdel‐Rahmanycolaboradores(Abdel-Rahman et al. 2005)han investigado exhaustivamente estas diferencias y han tenido éxito al explicarlasmediantesimulacionesMonteCarlo.

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3 Dosimetría,cálculosMonteCarloeirradiacióndecultivoscelulares

3.1 Dosimetría:CálculosMonteCarloyMedidasPara poder simular tratamientos con aplicaciones clínicas y/o pre‐clínicas en RT, esnecesario incluir todas las características del sistema físico en el que se aplicará eltratamiento, es decir, necesitamos caracterizar tanto el haz de radiación (espectro deenergía,fluenciadefotones,contaminaciónporelectrones,etc.)conqueseentregaráeltratamientocomoelmedioenelquese requiereel transporte.EsporelloqueenesteproyectoprimerofuenecesariovalidarlasimulaciónefectuadamediantemétodosMCdelafuentederadiaciónqueutilizamospararealizarnuestrosexperimentos.Estavalidaciónserealizapormediodemedidasexperimentalesdedistribucionesdedosis,comparadasen términosdeporcentajesdedosis depositadaenprofundidad yperfiles fueradel ejecentral. Para lasmedidas relativas de dosis en los planos de interés utilizamos películaradiográfica y para obtener las medidas de dosis absoluta en puntos de referenciaempleamosunacámaradeionización.Conesto,obtenemoslasmedidasdirectamentedelos instrumentos antes mencionados y los resultados de las simulaciones mediantemétodosMC al reproducir las condiciones bajo las que se realizaron lasmedidas, paradespuéscompararlosydecidirsilosresultadosdelasimulaciónreproducenlasmedidas.

Estasmedidasnospermitenverificarsieldesempeñodelassimulacionesescorrecto;porlo que primero, la evaluación se lleva a cabo en medios homogéneos para despuésmodificar el sistemae incluir enél las característicasde las condiciones experimentalesreales, queennuestro caso son, la incidenciaperpendicular del haz sobreun frascodecultivocolocadosobreunbloquedemediodispersor.

Para la simulacióndel hazde fotonesque emergedel linacutilizamosel códigoparaeltransportederadiaciónenmateriaBEAMnrc.Laenergíadelhazdefotonesincidenteenelblanco para generar la radiación de frenado y su radio de dispersión se ajustaron paraproducirelmejoracuerdoentredistribucionesdedosismedidasycalculadas.

Tanto las curvas de depósito de dosis en profundidad como las razones fuera del ejecentral a diferentes profundidades en agua se obtuvieron con el código de usuarioDOSXYZnrc.Laenergíacinéticainicialdelhazdeelectronesincidiendoenelblancosefijóen6.1MeVconunaintensidaddedistribucióngaussianade1.2mmyunvalordeFWHM= 10%. Las partículas que salen del blanco se transportaron a través de la línea decomponentesdelaceleradorlineal:colimadoresprimarios,filtrodeaplanadoycámaradeionización. La energía, posición y dirección, carga y peso de las partículas generadas seregistróenunespaciofase.

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ElespaciofasearchivadoseutilizócomoinformacióndeentradaeneltransporteconelcódigodeusuarioDOSXYZnrcparacalcularladistribucióndedosis,primeroenunmaniquíhomogéneoyensegundolugarenelmodeloparalairradiacióndelcultivocelular.Estaspartículasfuerontransportadasatravésdelasquijadasquedefineneltamañodecamposeleccionadoparaelexperimento.Laenergíadecorteparaloselectronesyfotonessefijóen 0.01 MeV. Los cálculos se ejecutan con un número de historias para alcanzar unaincertidumbreestadísticamenoral1%enladosis.

Las simulaciones Monte Carlo se realizaron para un haz de fotones de 6 MV para unacelerador lineal de uso clínico dedicado al tratamiento del sistema nervioso centralNovalis (BrainLAB,Heimstetten,Alemania),equipadoconunmMLCdeBrainLAB,queseencuentraenelInstitutoNacionaldeNeurologíayNeurocirugíadelaCiudaddeMéxico.

Eltamañodecamposeleccionadofuede9.8cmx9.8cmdefinidosa100cmdelafuente,incidenteenunmaniquídeaguade30cmx30cmx30cm;yenlasegundasimulación,incidente en la superficie del medio de cultivo en el sistema de irradiación del cultivocelular.Elplanoderegistrodelespaciofasesecolocóa2cmsobrelasuperficiedelmediodecultivo.Elmaniquísedefiniórodeadoporaire.TodoslosmaterialesseseleccionarondeacuerdoconlosdatosdelICRU‐700.Ladosissecalculóenvoxelesde1mmx1mmx1mmapartirdelasuperficieyhasta2cmdeprofundidad,de1mmx1mmx5mmenelintervalode2cma5cmy,finalmente,de1mmx1mmx10mmde5cma14cm.

Lasmedidasexperimentalespuntualesseobtuvieronutilizandounsistemacontroladoporcomputadora PTW‐Freiburg MPE Therapy Beam Analyzer para medir distribuciones dedosisconunacámaradeionizaciónapruebadeaguade0.015cm3PTW‐PinPoint.

Elsistemadeirradiaciónparacalcular ladosisabsorbidaenelcultivocelularconsistedeunfrascodecultivoparaproliferaciónenplaca,conunasuperficiedelcrecimientode25cm2colocadosobreunbloquedePMMA(dimensiones20cmx20cmx15.5cm)(Figura3‐1‐A).Cincomililitrosdemediodecultivocelular (densidadelectrónicaequivalentedelagua)seránagregadosalfrasco.Elvolumendelmediodecultivoutilizadoformaunacapacon ancho de 3.0 mm sobre el fondo del frasco. El plano de referencia superficial sedefiniósobrelasuperficiedelmediodecultivo.

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Figura3‐1Arregloexperimental:Irradiacióndeunmonocapacelularenunfrascodecultivode25cm2conuncampoabiertode9.8cmx9.8cm.Elcultivocelularseencuentraenelfondodelfrasco.A)Reproducciónesquemáticadelairradiación.Elfrascosecolocadirectamentesobreplacasdeplástico,localizándoseelfondodelfrascoalniveldel

isocentro.Elcentrodelorificioparaintroducirlacámaradeionizaciónseencuentraa5.5cmdeprofundidad,medidosdesdelasuperficiedelplástico.B)Fotografíadelmontajedelarregloexperimentaldescritoantes.Lairradiacióncubre

homogéneamentetodalasuperficiedecrecimientocelular.

3.1.1 MedioHomogéneoLasmedidasdedosisenaguacorrespondenauntamañodecampodeirradiaciónde9.8cm x 9.8 cm con incidencia normal sobre elmedio para el transporte de radiación condimensionesde30cmx30cmx30cm.Losresultadosdelassimulacionessevalidanencomparacióncontralasmedidasdedosisenprofundidadyrazonesfueradelejecentral.

3.1.2 ArregloexperimentalInvitroLaconfiguraciónparala irradiaciónes lamismaqueparalasimulación(Figura3‐1‐B).Lacámaradeionizaciónseposicionadentrodeunmaniquídeplástico(hechodebloquesdePMMA)colocadabajoelejecentraldelhazatravésdeunorificiocilíndricoenunadelasplacasplásticodedimensionesajustadasparaquesepudieraintroducireldispositivo.

Semideladosisenelsistemaparairradiacióndelcultivocelularaunaprofundidadtotaldereferenciaiguala6.1cmpordebajodelasuperficiedelmediodecultivocelular.Estamedida de referencia se utiliza para escalar la distribución de dosis en profundidadobtenida en la simulación MC del sistema de irradiación del cultivo celular y así sedeterminaladosisdepositadaenlasuperficiedecrecimientodelalíneacelular.Todaslasirradiacionesserealizanconunatasadedosisde480UM/min.

Las incertidumbres para nuestras medidas de dosis en profundidad se estimanmultiplicandoelvalordeladosisparaunaprofundidadparticularzcomolaraízcuadradade la suma de las incertidumbres cuadráticas relativas a las señales dosimétricas en laprofundidaddedosismáximayalaprofundidaddeinterész.

30

3.2 CalibracióndelapelícularadiográficaCon la finalidad de utilizar un sistema de detección que nos permita conocer lasdistribuciones de dosis que generemos en los cultivos celulares, específicamente paraevaluar la homogeneidad en el caso de irradiaciones con campos abiertos y para laevaluaciónde la generaciónde camposde intensidadvariableenel casoqueel interésseanlosefectosinducidosporradioterapiadeintensidadmodulada,esnecesarioplantearunametodologíadecalibracióndepelícularadiográfica,unavezqueelusodelapelícularadiográfica como unmétodo para la verificación de dosimetría relativa para haces defotones está completamente estandarizado en el área de radioterapia y constituye unaherramientaderelativobajocostoyfácilempleo(Williamson, 1981; Danciu, 2001).

3.2.1 CalibraciónutilizandocamposseparadosLametodologíadecalibraciónqueutilizamoseslaquesemanejadesdehaceuntiempodemaneraconvencionalpormúltiplesautoresen laqueseutilizauntamañodecampofijo para generar diferentes valores de dosis en la película radiográfica colocadaperpendicularaladireccióndeincidenciadelhazderadiaciónyaunaprofundidadmayoraladedepósitodedosismáxima,dentrodeunmaniquíaunaprofundidadmayoraladedepósitomáximodedosisparaelmareialdelmaterialatenuador; losdiferentesvaloresdedosisseobtienencambiandoeltiempode irradiaciónmanteniendoconstante latasadedosisenellinac.

Utilizamospelícula radiográficaKodakEDR2. Toda lapelículapertenecea lamismacajaentregadaporelproveedorparaminimizarlavariabilidadasociadaalamanufactura.

IrradiamoslapelícularadiográficaconelhazderayosXde6MVantesdescrito.Usamosuntamañodecampode3cmx3cmdeintensidaduniforme.Todas las irradiacionesserealizaronenunapiezadepelículaparaminimizar lavariabilidadporpliegodepelícula,cadacampoirradiadoestáseparadodelsiguientepor2cmdedistanciatantoendirecciónverticalcomoendirecciónhorizontal.Loscamposirradiadoscorrespondenaunintervalodeunidadesmonitordesde0(radiacióndefondo)hasta600,enpasosde20.Colocamoslapelículaaunaprofundidad5cmenunmaniquídeaguasólida(30cmx30cmx15cm)con una distancia fuente a la superficie del maniquí de 95 cm, debajo del agua sólidacolocaremos10cmmasdePMMA.Seperforaunodelosextremosdelsobredelapelícularadiográfica y se ejerce un poco de presión sobre ella para remover el aire dentro delsobre.Elejecentraldelhazincideendirecciónperpendicularalasuperficiedelmaniquí.

El valor de dosis absoluta de referencia se obtieneutilizandouna cámara de ionizaciónque se coloca en la posición de la película radiográfica irradiándose 100 UM, con estevalorasignamoslosvaloresalosdiferentespuntosenelintervalodedosisseleccionado,unavezqueseconocedelarespuestalinealdelacámaradeionizaciónconlasunidades

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monitor aplicadas para los parámetros de operación seleccionados. La cámara deionizaciónesdetiposemiflexde0.135cm3(PTW‐Freiburg).

Una vez irradiada la película procedemos con el proceso de revelado (incluyendo unapelículasinirradiar)parasuposteriorlecturaconundensitómetrodepuntoyasígenerarla curva sensitométrica, misma que utilizamos para realizar un ajuste y obtener unaexpresiónanalíticaquemodeleelcomportamientodeestapelícularadiográficapara lascondicionesdenuestroexperimento.

3.3 Extrapolacióndevaloresdedosisen la regiónde incrementoconpelícularadiográfica

La dosis puede variar considerablemente dentro de los primeros milímetros deprofundidaddebidoalascaracterísticasdelaregióndeincrementodelosrayosX.Comolapelícularadiográficaesunaalternativarelativamentebaratapararealizarestimacionesdedosisensuperficiesbidimensionales,lapodemosemplearparaexplorarelalcancedelempleo de este dosímetro en la región de incremento y así contaremos con unaherramienta para evaluar la dosis entregada en los experimentos con los cultivoscelulares.

Colocamosunaseriedepelículasradiográficasseparadasporplacasdelgadasdematerialequivalente a agua de grosores 1 mm y 5 mm a partir de la superficie del arregloexperimental,obtenemosunaestimacióndeladosisenregionescercanasalasuperficieusado elmétodo de extrapolación adecuado para el número de puntos incluidos en elanálisis. Luego extrapolamos los valores para diferentes profundidades efectivas deinterésenrelaciónconlasprofunidadesenlasqueseráncolocadosloscultivoscelulares.

Comparamos estasmedidas con estimaciones obtenidasmediante simulacionesMC deestearregloexperimental.

UtilizamospelícularadiográficaKodakEDR2.Elarregloexperimentalparalaestimacióndedosisen superficie semuestraen la Figura3‐2. Ladistancia fuente‐superficieesde100cm.Enelplanodelisocentrosecolocóunaplacade1mmdeaguasólida,debajodeellaseencuentraunapiezadepelícularadiográfica,despuésencontramosotraplacadeaguasólida,ahorade5mm,seguimosconesteprocesoconlasdimensionesqueseespecificanenlaFigura3‐2(B).

Enunsegundoexperimentoparalaextrapolacióndeladosisensuperficie,cambiamoslaposiciónrelativadelapelícularadiográficaylasplacasdeaguasólida,estoconlafinalidadde incrementar el número de medidas a diferentes profundidades en la región deincremento.

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Figura3‐2PelícularadiográficaEDR2colocadaentreplacasdematerialequivalenteaaguaenlosprimerosmilímetrosdeprofundidadparaextrapolarvaloresdedosisensuperficie.(A)Arregloexperimental,(B)diagramarepresentativo

deladistribuciónenprofundidaddelapelícularadiográfica.

LadistribuciónparaelsegundoexperimentosemuestraenlaFigura3‐3Esquemadelasposiciones en profundidad de la película radiográfica para el segundo experimento deextrapolaciónensuperficie.

Figura3‐3Esquemadelasposicionesenprofundidaddelapelícularadiográficaparaelsegundoexperimentode

extrapolaciónensuperficie.

Todas las irradiaciones se hicieron utilizando el haz de rayos X producido por un linacNovalisde6MV,conunadistanciafuente‐superficiede100cm.Previoalosexperimentos

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paralaextrapolacióndedosisensuperficie,lapelícularadiográficasecalibróutilizandolametodologíapresentadaenlasección3.2.Laprofundidadrelativamedidaparaelpaquetedepelícularadiográficasetomócomoelpuntomediodecadapaquetecolocadoentrelasplacasdeaguasólida.

El análisis se hizo con un densitómetro de punto de luz visible Victoreen 0010128. Lasconversionesdedensidadópticaadosissehicieronenlaspelículasdeesteexperimentousando los resultados suministrados a partir de la curva de calibración producida en eltamañodecampoapropiadoparalairradiación,queenestecasofuede3cmx3cm.

3.4 Técnica de irradiación In vitro: Irradiación y ensayoclonogénico

Utilizamos la línea celular U373MA dado su origen de un glioma humanomaligno. Lascélulasdeglioblastomamultiforme(GBM)humanoU373semantendrána37ºCen5%deCO2bajocondicionesdeesterilidadenmediodecultivoDulbecco(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO)complementadocon10%desuerofetalbovino.

La curva de sobrevida por exposición a la radiación se genera utilizando un ensayoclonogénico.LascélulasdeGBMU373MAseplantanportriplicadoenfrascosdecultivocelularparaproliferaciónenplacade25cm2contapaderaconfiltro.Lascélulasseirradiancondosisúnicasde0a14Gyatemperaturaambiente.Elnúmerodecélulassembradasporfrascoseajustapordosisabsorbida,detalmaneraqueresulteunnúmerodecoloniascuantificable. Todas las irradiaciones se hacen a 100 cm de distancia fuente‐superficie.Después de 12 d de incubación, las células se fijan con metanol y se cuantifican lascolonias.Losfondosdelosfrascosseanalizanatravésdeunmicroscopiodecontrastedefase.

3.4.1 TécnicadeirradiaciónInvitro:AnálisisdedatosSecalculalafraccióndesobrevida(FS)dadaporFS=númerodecoloniastratadas/númerodecoloniascontrol.TambiénseestimaladosismediadeinactivaciónrepresentadaporeláreabajolacurvadefinidaporlaFSvs.dosisabsorbida.LacurvadeFSsecomparaconloque reportanotrosautores,porejemploBadieycols (Badie, 1999) yNingycols (Ning, 2004),quienesutilizarondiferentestécnicasdeirradiaciónparalíneascelularesdeestirpeglialymalignas.

3.5 Irradiación con campos de intensidad modulada en cultivoscelulares

Para la irradiación con campos de intensidad modulada, utilizamos el colimadormicromultihojasdescritoenlasección2.3paracambiarlaintensidaddelhazqueincideenel cultivo celular mediante el movimiento de las hojas que componen al colimador, la

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irradiaciónserealizaenmodalidaddepaso‐disparo,esdecir,unavezquelashojassehancolocado en la posición deseada el acelerador genera el haz de radiación. Con esto esposiblemodular la dosis a lo largo de los campos de tratamiento para poder entregardosis altas en unas regiones y dosis bajas en otras. Lo que resulte de esta irradiaciónpodríaayudarnosaestudiarefectoslocalesdeladosisyefectosporcomunicaciónefectosquequelaradioterapiaconvencionaldecamposuniformesylosmodelosradiobiológicosaceptadosnoobservannipredicen,comoporejemploelefectoBystander.

3.5.1 DescripcióndelageometríadeirradiaciónUtilizamos un haz de rayos X de 6MV con un patrón demodulación de 9 sub‐camposrectangularescontiguos(tamañodecampototal:9.8cmx9.8cm)(Figura51).

Figura3‐4Representacióndelpatróndemovimientodelashojasdelcolimador.Segeneran9sub‐camposdedimensionesaproximadasde3cmx3cm.Enescaladegrisdemasclaroamasoscurocorrespondedemenoramayor

dosisprogramada.DiseñorealizadoenelprogramaMLCShaper,creadoconlafinalidaddegenerarcamposomovimientosdelmMLC.UsodelprogramaautorizadoenlaUnidaddeRadioneurocirugíadelInstitutoNacionalde

NeurologíayNeurocirugíadelaCiudaddeMéxico

El sistema consistió deun frascode cultivoparaproliferación celular enplaca, conunasuperficie de crecimiento de 75 cm2, colocado sobre unmedio dispersor equivalente aagua(20cmx20cmx10cm).Elvolumendelmediodecultivoformaunacapade4.0mmdegrosorsobreelfondodelfrasco.Lasuperficiedelmediodecultivosecolocóaniveldelisocentro(distanciafuente‐superficiede100cm).

3.6 ValidacióndeldiseñoexperimentalLadistribuciónespacialdedosisseestudióconpelícularadiográficaKodakEDR2colocadadebajodelfrascocultivo.Lacalibraciónabsoluta(a5cmdeprofundidad)ylasmedidasdecarga relativaencadasub‐camposeobtuvieronconunacámarade ionizaciónde0.125

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cm3PTW‐semiflexquesecolocóenelejecentraldelhazdentrodeunmaniquídeaguasólidaatravésdeunorificiocilíndrico.

UtilizamosmétodosMonteCarlo(EGSnrc/DOSXYZnrc)parasimularlageneracióndelhazderadiaciónyeltransportedelmismoenlageometríadeinterés.Lamedidadereferenciase utilizó para normalizar la distribución de dosis en profundidad obtenida de lasimulaciónMonteCarloyasídeterminarladosisdepositadaenlaregióndecrecimientode la línea celular. Los resultados se comparanconmedidasde ladosisen la regióndeincrementorealizadasconpelícularadiográfica.

Ladescripcióndelhazde radiaciónpor sub‐campos seobtieneapartirdelespacio fasegeneradopreviamente.DesarrollamosuncódigodeprogramaciónconMatlabpara leerlas componentesdel archivobinarioque correspondeal espacio fase (tipodepartícula,energía, posición en el plano de registro, dirección, etc.) y con esto seleccionar las 9regionesde interésenquesedividiráelcampototalmedianteunacolimaciónartificial,esto es, generando un espacio fase para cada sub‐campo filtrando solamente lascomponentesdelespaciofaseoriginalquetenganvectoresdeposiciónenelespacioquedefine las fronteras de las regiones de interés.Una vez que contamos con las regionesparagenerarlossubcampos,esnecesariosimulareltransportedecadasub‐campoenlageometríadescritaenestasección,parasumarlosefectosindividualesyasídeterminarladosis depositada por cada uno de los campos en que se dividió el campo total. De loscálculosMonteCarlopodemosextraerlainformacióncorrespondientealosdepósitosdedosisenprofundidaddebajodel“sub‐ejecentral”,asícomolosperfilesdedosisfueradelejecentralenlosplanosdeinterésparasuanálisis.

Conlasmedidasdedosisabsolutaobtenidasconlacámaradeionizacióncolocadadebajodelejecentralenunaprofundidadconequilibriodepartículacargada,yconelresultadodelacargarelativadepositadaporsub‐campopodremosseleccionarlosdiferentespuntosde referencia para normalizar las curvas obtenidas como resultado del cálculo MonteCarlo.

Con esto, es posible asignar valores de dosis absoluta a cada una de las secciones delcampototalconlasqueseirradiaránloscultivoscelularesyconellogenerarregionesdevaloresvariablesdedosisparapoderestudiarelefectodeestavariaciónenlasobrevidadelalíneacelularconcomunicaciónintra‐celularmedianteelmediodecultivocontinuo.

3.1 CalibracióndecamposcontiguosconintensidadvariableDiseñamosunamatrizdecamposderadiacióncontiguosparaobtenerenunsóloeventodinámicodelashojasdelmMLC,diferentesvaloresdedosisparalacurvasensitométrica.Coneldiseñodecamposcontiguos formaremosunamatrízde3x3campos.Paraesto,

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utilizamos el programa MLC Shaper disponible en la Unidad de Radioneurocirugía delInstitutoNacionaldeNeurologíayNeurocirugía.

Elvalordedosisabsolutasemidecolocandolacámaradeionizaciónutilizadaen5.1enelejecentraldentrodelmaniquídeaguasólidasobre10cmdePMMAparaconsiderarlascontribucionesporretrodispersión.Este instrumentosecolocaa5cmdeprofundidadapartirdelasuperficieya95cmdedistanciafuente‐superficiedelmaniquí.

La dosis absorbida para calibrar el evendo de movimiento del mMLC, la obtenemoscolocando lacámarade ionizacióndebajodel sub‐campocentral,esdecir,elcampodelcentrodelarregloalineadoconelejecentraldelhaz,ymediremoslacargageneradaparauneventodinámicocompleto.

Paraasignar losvaloresproporcionalesdedosisdelosrestantes8campos,medimoslosvaloresdecargacolocandolacámaradeionizacióndebajodecadaunodeellosparauneventodinámicodeirradiacióncompletopormedidadecadacampo.Conesto,podemosobtenervaloresdecargarelativosa loquemedimosdebajodelsub‐campocentralyasíasignarvaloresdedosisproporcionales.

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4 ResultadosdelasimulaciónMonteCarloeirradiaciónconcamposuniformes

4.1 ValidacióndelasimulaciónMCEnlaFigura4‐1observamoslosvaloresdedepósitodedosisenprofundidadmedidoconlacámaradeionizaciónycalculadomediantesimulacionesMC,elmedioesagua.Ambascurvascorrespondenauncampoabiertode9.8cmx9.8cmparaelhazdefotonese6MVgenerado por el acelerador lineal dedicado Novalis. Los datos para la curvamedida seobtuvieronutilizandounacámaradeionizaciónPinPointylosvaloresparalacurvaPDDsecalcularonconelcódigodeusuarioDOSXYZnrc/EGSnrc.

Figura4‐1Comparacióndecurvasdedepósitodedosisenprofundidad:medidaconcámaradeionizaciónycalculadaconmétodosMonteCarlo.Elmediodeatenuaciónesagua.Eltamañodecamposeleccionadofuede9.8cmx9.8cmconunadistanciafuente‐superficiede100cm.Semuestraelintervalocompletodemedidaenelejex‐profundidad,

desdelasuperficehasta20cm.

LaFigura4‐2muestrauna reducciónen laescaladelejex‐profundidadparaevaluar lasdiferenciasapartirde1cmdeprofundidad.Observamosunbuenacuerdoentrelacurvamedida y la calculada cuando analizamos las diferencias a partir del punto de depósitomáximodedosis(1.7%dediscrepanciamáxima).

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Figura4‐2Comparacióndecurvasdedepósitodedosisenprofundidad:medidaycalculada.Semuestraenelejex‐

profundidadelintervaloapartirdelaprofundidaddeequilibrio(1cm)hasta14cm.

Porotro lado,en la regiónde incremento, cuya intervalodeprofundidad semuestra lafiguraFigura4‐3,lasdiferenciasentrelasmedidasyloscálculosseencuentranentreel‐7%yel23%,comoeraesperado.

Figura4‐3Comparacióndecurvasdedepósitodedosisenprofundidad:medidaycalculada.Semuestraelintervalo

enelejehorizontalparaenfatizarlasdiferenciasenlaregióndeincremento.

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Algunos autores presentan sus resultados en relación con sus simulaciones utilizandométodos MC (Ding 2002). En la figura Figura 4‐4 comparamos nuestros datos con lasimulación de depósito de dosis en profundidad reportada por Abdel‐Raman ycolaboradores(Abdel-Rahman et al. 2005),lascondicionesdelasimulacióndescritassonsimilares a las de nuestro experimento. Los valores calculados con nuestra simulaciónpresentanunbuenacuerdoconlosdelautorreferido(±1%).

Figura4‐4Cálculosdedepósitodedosisenprofundidad.Losdatosenesteestudiosecomparanconlosdelas

simulacionesreportadasporAbdel‐Rahmanycolaboradores(Abdel‐Rahmanetal.2005)

En base a estos resultados, concluimos que nuestra simulación representaestadísticamente el arreglo experimental, por lo que el cálculo dedepósito dedosis enprofundidadescorrecto.

Otrafuncióndosimétricaqueanalizamosesladelarazónfueradelejecentral(OAR).Paraellocomparamos losvaloresmedidosycalculadosdeperfilesparauncampoabiertodeintensidaduniformede9.8 cmx9.8 cmyendiferentesprofundidades: 1.4, 5 y 10 cm,seleccionadasapartirdevaloresestándarutilizadosenelcomisionamientodeunafuentede radiaciónexternaparausoclínico.En laFigura4‐5Comparacióndeperfilesdedosisentremedidashechasconcámaradeionización(líneapunteada)ycálculosMC(símbolos)para tres profundidades en agua y una distancia fuente‐superficie de 100 cm con uncampo abierto de 9.8 cm x 9.8 cm. se muestra el resultado de esta comparación deperfiles de dosis. Podemos observar que los perfiles de dosis calculados a las tresprofundidadesseempatanalosresultadosdelasmedidas,tantoenlaregiónmascercana

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alejecentraldelhazcomoenelbordedelcampoderadiación(penumbra).En laTabla4‐1semuestranlasdiferenciaspromedioymáximaparacadaprofundidad.

Figura4‐5Comparacióndeperfilesdedosisentremedidashechasconcámaradeionización(líneapunteada)y

cálculosMC(símbolos)paratresprofundidadesenaguayunadistanciafuente‐superficiede100cmconuncampoabiertode9.8cmx9.8cm.

Δ(Perfilmedidovs.calculado)(%)

10cm 5cm 1.4cm

Promedio 0.97 0.85 0.76Máxima 1.98 2.30 1.85

Tabla4‐1Resultadosdelascomparacionesentrelosperfilesdedosismedidosycalculadosparatresdiferentesprofundidades.Lasdiferenciasseexpresanenpocentajespromedioymáxima.

Laseriederesultadospresentadossonsuficientementebuenoscomoparacontinuarconla implementación de las modificaciones necesarias en la geometría del maniquí parasimularelmodeloparalairradiacióndelcultivocelular.

4.1 CalibracióndelapelícularadiográficaEnlaFigura4‐6CurvasensitométricaparapelícularadiográficaEDR2irradiadaconunhazde fotonesde6MVconun tamañodecampode3cmx3 cm. La líneapunteadaeselresultadodelajustedescritoenestasecciónutilizandoelmodelodedoble‐golpedeZhuycolaboradores(Zhu, et al., 2003).semuestralacurvasensitométricaparalapelículaEDR2,estacurvaseobtuvoconelarregloexperimentaldescritoen la sección3.2.Elajusteserealizautilizando lapropuestadedoblegolpedescritaporZhuycolaboradores (Zhu, et al., 2003).Laecuaciónutilizadaparaelajustetienelaforma:

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DO=DO1,max[1‐e‐α1.D(1+α1D)]+DO2,max[1‐e

‐α2.D(1+α2D)] Ec.4‐1

Losparámetrosdelajuste(R=9995)delacurvadecalibraciónobtenidason:

DO1,max 3.3599±0.0281α1 0.0065±0.0001DO2,max 0.1688±0.0185α2 0.1335±0.1098

En el ajuste es posible observar el buen acuerdo que mantiene con los datosexperimentalesinclusoenlaregióndedosismenoresa100cGy;esteacuerdofueposiblegraciasalaformadelaecuaciónpropuestaporZhuycolaboradores,unavezqueantesdeeso, el modelo utilizado era el de golpe‐simple y con él, la predicción del modelosubestimabalosresultadosqueseobservabanexperimentalmente.

Figura4‐6CurvasensitométricaparapelícularadiográficaEDR2irradiadaconunhazdefotonesde6MVconun

tamañodecampode3cmx3cm.Lalíneapunteadaeselresultadodelajustedescritoenestasecciónutilizandoelmodelodedoble‐golpedeZhuycolaboradores(Zhu, et al., 2003).

4.2 DosisenlaregióndeincrementoconpelícularadiográficaEnlaFigura4‐7semuestraelresultadodeladosismedidaconpelícularadiográficaenlaregión de incremento comparado con lo que arroja la simulación Monte Carlo querealizamos del arreglo experimental. La normalización del cálculo se hizo utilizando ladosismedidaconpelícularadiográficaaunaprofundidadde3.47cm.Losresultadospara

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lasprofundidadesefectivasalasqueseencontrabalapelícularadiográficasemuestranenlaTabla4‐2.

Profundidad(cm)Dosismedida

Películaradiográfica(cGy)Dosiscalculada

MC(cGy)Diferencias(%)

0.035 79 53.00 33.000.135 111 96.31 13.230.205 142 130.58 8.040.375 171 167.38 2.110.670 206 209.68 ‐1.780.945 222 219.56 1.091.75 221 225.42 ‐2.00

Tabla4‐2ComparacióndedosisenprofundidadentrepelícularadiográficaEDR2ycálculosMCparalaestimacióndedosisenlaregióndeincremento.

Observamosdiferenciasimportantesenprofundidadesde0.205cmymenores,mientrasque para profundidades mayores las diferencias son menores que el 3%, con esto,podemosconsiderarelusodeestedosímetroen laestimacióndedosisen la regióndeincrementoparaprofundidadesmayoresoigualesque0.375cmsinrequerirdefactordecorrección alguno. Con este resultado se hace posible el uso de película radiográficaKodak‐EDR2paraevaluareldepósitodedosisenlascondicionesquenos interesanparasuaplicaciónencultivoscelularesquepresentenlascondicionesexperimentalesdescritasenestetrabajo.

Figura4‐7ComparacióndedosisenprofundidadenlaregióndeincrementoparaunhazderayosXde6MVentremedidashechasconpelícularadiográfica(círculosblancos)ycálculosMC(círculosnegros)paraunairradiación

conuncampoabiertode3cmx3cm.

43

4.3 IrradiacióndelcultivocelularEn la Figura 4‐8 presentamos la dosis en profundidad calculada para el arregloexperimental descrito en la sección 3.1.2. Los datos corresponden a los resultadosobtenidosalolargodelejecentral.Losvoxelesparaelregistrodeladosisenlaregióndeinterés se definieron de 1mm x 1mm x 1mm.Observamos una curva de incrementodentrode losprimeros4mmpordebajode lasuperficiedelcultivocelular;después,semuestralapresenciadelassiguientescapas,correspondientesadosmediosdistintos:1.5mmdepoliestirenoy1.5mmdeaireentreelfondodelfrascodecultivoylasuperficiedelosbloquesdePMMAcolocadoscomomaterialpararetrodispersión.Entre lacapade1mmdemediodecultivoenel fondodel frascoyelpoliestirenode labasedebajode laanterior,vemosuncambioenelgradientedeldepósitodedosisenprofundidad.Unavezque la capa de aire se alcanza, la curva presenta disminución importante. Superada lapresenciadelaire,segeneradenuevo,unacurvadeincrementoeneldepósitodedosisenprofundidad,ahoraenlasplacasdePMMA,hastaalcanzarlaprofundidaddedepósitomáximo aproximadamente a 1 cm de la superficie del plástico de retrodispersión, paraluegodisminuirdemaneraconsistente.

Figura4‐8Distribucióndedosisenprofundidadenregionesespecíficaslocalizadasalolargodelejecentralenel

modeloparairradiacióndecultivoscelularesconcamposabiertos.

Laprofundidadalaquesemidióladosisdereferenciaquenospermiteasignarlosvaloresdedosisabsolutaenelejeverticalsefijóen6.8cmpordebajodelasuperficiedelmediode cultivo (0.7 cm corresponden a valores en profundidad dentro del frasco de cultivo

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agregándose0.15cmdeairey6.1cmapartirdelasuperficiedelPMMAsobrelacámaradeionización).

Estearreglonospermitiódeterminarladosisenlaprofundidaddeinterés,estoes,enlacapade1mmsobreel fondodel frascodecultivo,dondeseencuentra la superficiedecultivocelular:0.877Gy/100UM±2%.

4.4 Irradiacióndelalíneacelular:fraccióndesobrevidaLa figura Figura 4‐9muestra la curvade sobrevidapara la línea celular de glioblastomamultiformeU373MAcomofuncióndeladosisabsorbida.

Figura4‐9FraccióndesobrevidadeglioblastomamultiformeU373MAirradiadosenunintervalode0a14Gy.Cada

puntocorrespondealpromediodelexperimentoportriplicado.

Enestacurvaesposibleapreciaren laregióndedosisabsorbidapordebajode los2Gy(Figura4‐10)unpatróndehiper‐radiosensibilidadabajasdosis.

EnlaFigura4‐11presentamosunacomparacióncondoscurvasdesobrevidareportadaspara líneas celulares de glioblastomamultiforme:U373MAy SNB‐75 (Badie et al. 1999, Ning y Knox 2004);estascurvasdosis‐respuestaseobtuvieronutilizandounirradiadorde137Cs con una tasa de dosis de 5.94 Gy/min. Observamos un excelente acuerdo connuestrosresultadosylosreportadosporestosautores,condiferenciasmenoresal10%.Esimportanteresaltarquelosresultadosobtenidospresentanestebuenacuerdoapesardelasdiferenciasenlastécnicasdeirradiación.

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Figura4‐10FraccióndesobrevidaparalalíneacelularU373MAdeglioblastomamultiformeirradiadaconunhazdefotonesde6MV.Semuestraelintervalode0a6Gy.Adosispordebajode2Gyseobservaunpatróndehiper‐

radiosensibilidad.

Ladosismediadeinactivaciónparalalíneacelularutilizadaenesteestudiofuede2.2Gy.

Figura4‐11Fraccióndesobrevidacomofuncióndeladosisabsorbidaencultivoscelularesdeglioblastoma

multiformehumano.Loscuadrosnegroscorrespondenalosresultadosdenuestroexperimento;encírculosytriángulossemuestranlosdatosdedosautoresutilizandounirradiadorde137Cs(Badieetal.1999,NingyKnox.

2004).

46

5 Resultadosdelairradiaciónconcamposdeintensidadmodulada

Losresultadosdelairradiaciónconloscamposdeintensidadmoduladaenunarreglode3x3camposdeintensidaduniformedentrodeuntamañodecampototalde9.8cmx9.8cmactualmenteseencuentranenanálisis.

47

6 ConclusionesLosresultadosdelcálculoMCenelmediohomogéneocomparadosconmedicionesen

profundidadesmásalládelaregióndeincrementofuevalidada,permitiéndonosextendersuaplicaciónalageometríadeirradiacióndelfrascodecultivoparaproliferaciónenplaca,dondeencontramosunproblemadosimétricoexperimental.

Ladosisabsorbida,considerandodiferentescapasdemateriales(incluyendocapasdeaire) y mas específicamente la relacionada con la región de incremento, se estimósatisfactoriamente. Este método de determinación de dosis supone que todos losargumentosconsideradosenelprotocolo internacionaledecalibracióndosimétrica IAEATRS‐277,basadoenlaabsorcióndedosisenagua,sonrazonables.

En este trabajo hemos presentado unmodelo de irradiación para cultivos celularesquereproducelascondicionesenlasquesemantienenlascélulasdentrodelosfrascosdecultivo.Elmodelo incluye lasimulacióndel transportederadiaciónutilizandounhazderayosXgeneradoporunaceleradorlinealde6MV.Estehaz,conincidencianormalsobreelfrascodecultivo,generacondicionesfueradeequilibrioelectrónicoenelvolumendeinterés, de tal manera que el uso de métodos dosimétricos convencionales esinapropiado.Bajotalescondicionesexperimentales,estemétodonospermitedeterminarladosis absorbidaen la regiónenqueproliferan las células sobre labasedel frascodecultivo.

Fueposiblemedir ladosisconpelícularadiográficaEDR2en laregiónde incrementopara un haz de megavoltaje dentro del 3% de diferencia respecto a cálculo MC paraprofundidadesmayoresoigualesa0.375cm.

Lareproducibilidaddelapreparacióndelalíneacelularseestudióconelgrupocontrol(desviación estándar de 6%). Todos los frascos irradiados, así como los controles,conteníancélulasdelamismasuspensión.Elgrupocontrolylosfrascosporserirradiadossetomarondeláreadelaboratorioysellevaronalaunidaddeirradiación;lascélulassemantuvieron a temperatura ambiente el mismo periodo de tiempo. La eficiencia deproliferaciónfuede65%,yladosismediadeinactivaciónparaestalíneacelularseestimóen2.2Gy.Esteresultadoestáenexcelenteacuerdoconloquereportanotrosautores[3].

Elmodelodeirradiaciónesfácildemontarybrindabuencontroldeladosisabsorbida(precisión total estimada 2%), por lo que fue posible obtener una curva de dosis‐respuesta de la línea celular de GBM humano U373MA, la cual es comparable con losresultados obtenidos en otros ensayos para estudiar la radiosensibilidad de líneas

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celularessimilares.Ladosismediadeinactivaciónestimadaparaestalíneacelularfuede2.2Gy.

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