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Rev Inv Vet Perú 2003; 14(2): 119-133

1 Facultad de Agronomía, Universidad Hermilio Valdizán, Huánuco2 Laboratorio de Microbiología y Parasitología Veterinaria, FMV-UNMSM3 [email protected] Laboratorio de Patología Aviar y Producción Avícola, FMV-UNMSM

USO DE ANTICUERPOS MONOCLONALES PARA CARACTERIZARTUMORES LINFOIDES AVIARES

Richard Tasayco A.1, Raúl Rosadio A.2,3, Eliana Icochea D’A.4 y Hermelinda Rivera G. 2

ABSTRACT

Macroscopic and histological tests were compared with presence of cell marker teststo better differentiate between Marek’s Disease (MD) and Lymphoid Leukosis (LL) toimprove the diagnosis criteria on avian lymphoid tumors. These tests were carried out on40 laying hens affected with tumors from commercial farms on the North coast of Peru(Trujillo, Lima and Chincha). Initially, using macroscopic criteria (age and affected organ)it was determined that 60% (n=24) were affected from MD and the other 40% (n=16) fromLL. Subsequently, presence of infiltrated pleomorphyc lymphocytes in histopathologicaltests (HP), was a criteria used to determine that 45% (n=18) of the tumors were caused byMD and the other 22 had histological characteristics corresponding to LL (presence ofhomogeneous lymphoblasts forming nodules). In this way, the direct immunofluorescencetest (IF) using monoclonal antibodies (MoAb) that was developed to identify lymphocyteT markers (CD3+), confirmed that only 50% (9/18) of the animals histologicaly diagnosedwith MD had transformed T cells. Similarly, the MoAb for lymphocyte B (Ig M+), detectedthat only 54.6% (12/22) had transformed cells corresponding to lymphocyte B. Surprisingly,in 12/40 hens with nodular lymphoid tumors neither cell T nor cell B markers could beidentified and in 9/40 cell markers for both kinds of cell (T and B) were able to be identifiedin the tumors. Also, in 3/18 and 2/22 of the samples diagnosed histopathologicaly withMD and LL respectively, the presence for myelocites was found suggesting the presenceof avian leukosis virus subgroup J. Kappa and McNemar statistic tests showed that forMarek’s Disease had low concordance between HP and IF (-0.045); however, both methods(HP and IF) had a reasonable rate of concordance (0.314) for lymphoid leukosis. It is,concluded that the immunofluorescence test using the cell markers detection formonoclonal antibodies allows a more exact and efficient differential diagnosis than thehistopathological test on avian lymphoid tumors. However, the histopathological andthe immunofluorescence test are not mutually replaceable.

Key words: Marek’s disease, lymphoid leukosis, lymphoid tumors, immunofluorescencetest

RESUMEN

Con el objetivo de mejorar los criterios diagnósticos en tumores linfoides aviares, secompararon exámenes macroscópicos, histopatológicos y presencia de marcadores celu-lares para diferenciar enfermedad de Marek (EM) y leucosis linfoide (LL). Se utilizaron 40gallinas ponedoras afectadas por tumores, procedentes de granjas comerciales de lacosta del Perú (Trujillo, Lima y Chincha). Inicialmente, utilizando criterios macroscópicos

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(edad y órganos afectados), se determinó que el 60% (n=24) padecían de EM y las 16restantes de LL. Posteriormente, la presencia de linfocitos infiltrantes pleomórficos enexámenes histopatológicos (HP) en estas mismas aves, fue usado como criterio paradiagnosticar que el 45% (n=18) correspondían a EM y las 22 restantes tenían caracterís-ticas histológicas correspondientes a LL (presencia de linfoblastos homogéneos for-mando nódulos). La prueba de inmunofluorescencia (IF) directa y utilizando anticuerposmonoclonales (AcMo) desarrollados para identificar marcadores de linfocitos T (CD3+),confirmó que solamente el 50% (9/18) de animales histológicamente diagnosticados comoEM, contenían células T transformadas. Similarmente, el AcMo para linfocitos B (Ig M+)detectó que solamente el 54.6% (12/22) tenían células transformadas correspondientes alinfocitos B. Sorprendentemente, en 12/40 (30%) de las aves con tumores linfoides, no selogró identificar marcadores de células T ni de B y en 9/40 se logró identificar marcadoresde ambas células (T y B) en los tumores. Por otro lado, en 3/18 y 2/22 de las muestrasdiagnosticadas histopatológicamente como EM y LL, respectivamente,microscópicamente se encontró, además, la presencia de mielocitos, sugiriendo la pre-sencia del virus de leucosis aviar tipo J. Las pruebas estadísticas de Kappa y Mc Nemarmostraron que para la enfermedad de Marek, la concordancia es baja entre HP e IF (-0.045); sin embargo, para leucosis linfoide, ambos métodos (HP e IF) presentan un índiceregular de concordancia (0.314). Finalmente, se concluye que la inmunofluorescenciamediante la detección de marcadores celulares, usando anticuerpos monoclonales, per-mite un diagnóstico diferencial más preciso y es más eficiente que el examenhistopatológico en tumores linfoides aviares; sin embargo, el examen histopatológico yla inmunofluorescencia no son mutuamente reemplazables.

Palabras clave : Enfermedad de Marek, leucosis linfoide, tumores linfoides, prueba deinmunofluorescencia

INTRODUCCIÓN

Los tumores linfoides o linfomas son lasenfermedades neoplásicas más comunes delas aves. Estos tumores son producto de in-fecciones virales, generalmente por herpes-virus y retrovirus. El virus de la enfermedadde Marek (MDV), miembro de la familiaHerpesviridae, produce linfomas usualmenteen linfocitos T. Las infecciones retroviralesque se describen en aves son producidos porlos denominados virus exógenos agrupadoscomo retrovirus de la leucosis aviar (ALV).Estos retrovirus producen una gama de tu-mores de origen linfocitario de células B(leucosis linfoide), eritroideo (eritroblastosis)y mieloide (mieloblastosis y mielocitomatosis),pudiendo además ocasionar infiltracionestumorales en una variedad de tejidos parenqui-matosos (tumores sólidos). Por otro lado, sedescribe al retrovirus de la retículoendoteliosis

(REV) con capacidad de causar linfoma decélulas B en pollos y células T en otras espe-cies de aves (Payne y Mc Kay, 1999).

En el diagnóstico diferencial de los tu-mores linfoides en aves se utilizan varios cri-terios que incluyen el clínico y las alteracio-nes macro y/o microscópicas, y, usualmente,se busca diferenciar las infecciones aviaresmás prevalentes, como la enfermedad deMarek (EM) y la leucosis linfoide (LL). En-tre las infecciones herpéticas, la enfermedadde Marek (EM) es la más común de las en-fermedades linfoproliferativas de pollos, y secaracteriza por infiltraciones de célulasmononucleares en nervios periféricos y/ogónadas, iris, hígado, bazo, corazón, riñones,proventrículo, pulmón, mesenterio, bursa,timo, glándula adrenal, páncreas, intestino,músculos y piel (Calnek y Witter, 1997). Es-tas infiltraciones producen signos clínicos enpollos que muchas veces, con la excepción

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Uso de anticuerpos monoclonales para caracterizar tumores linfoides aviares

del compromiso neural, son de poca ayudapara establecer un diagnóstico diferencialadecuado (Calnek y Witter, 1997; Muñoz,2000). Las lesiones neoplásicas visceralesmacroscópicas observadas en animales in-fectados por la EM son indistinguibles de laslesiones leucósicas inducidas por infeccionesretrovirales.

El término de leucosis o sarcoma aviares utilizado para describir a una variedad deneoplasias transmisibles en aves que son pro-ducto de infecciones retrovirales. La leucosislinfoide es la forma más común de este gru-po y la más devastadora en las explotacionesavícolas a nivel mundial. Los tumores en estaenfermedad comprometen la bursa, hígado,bazo y otros órganos viscerales con cambiosmacroscópicos que muchas veces no son fá-cilmente distinguibles de las ocasionadas porinfecciones herpéticas. El diagnóstico dife-rencial de los tumores linfoides aviares se hacomplicado por los tumores de origen mieloide(mielocitomatosis y/o mieloblastosis).Macroscópicamente, las células mieloidestransformadas tienden a involucrar a la su-perficie de los huesos y una variedad de ór-ganos viscerales que ayudan a diferenciarlasde otros tipos de tumores, pero estos tipos detumores tienden a coexistir con otras infec-ciones virales (Spencer, 1998).

Los tumores asociados a infecciones porel virus de la leucosis aviar son blandos, lisosy brillosos. Al corte son de color ligeramentegris a blanco acuoso con áreas de necrosis.El crecimiento puede ser nodular, miliar, difu-so o combinado. En la forma nodular varíande 0.5 a 5 cm de diámetro y pueden ser po-cos o numerosos. La forma miliar consisteen numerosos nódulos menores a 2 mm dediámetro, distribuidos en forma uniforme. Enla forma difusa el órgano está agrandado uni-formemente, ligeramente gris y usualmentemuy friable (Payne y Fadly, 1997).Microscópicamente los tumores están forma-dos por grandes células linfoides, con unamembrana citoplasmática pobremente defi-nida, núcleo vesicular y condensación de la

cromatina y uno o más nucléolos acidofílicosnotorios.

Tradicionalmente, la EM y la LL se handiagnosticado asociando criterios clínicos ycambios macro y/o microscópicos. En estecontexto, el criterio clínico de la edad de lainfección, los órganos y el tipo de lesióntumoral observada, son utilizados como cri-terios de tamices iniciales en el diagnósticode tumores linfoides. La presencia de unapoblación linfocitaria de diferente tamaño ymaduración (pleomórfica) y su forma de in-filtración difusa, son criterios para el diag-nóstico de la EM. En cambio, el diagnósticode la LL se basa en la presencia de una po-blación de linfoblastos grandes y homogéneos(monomórficos) agrupados formando folículos(Neumann y Witter, 1979; Randall, 1990;Torriani, 1997).

Estos criterios diferenciales son muchasveces insuficientes y causante de frustraciónentre los especialistas, sobre todo cuando lostumores linfoides de diferente etiología, infec-tan los mismos órganos viscerales y/o com-prometen a aves en un mismo periodo de edad.Esto se ve agravado con la posibilidad de pro-ducirse coinfecciones virales, desencadenan-do infiltraciones neoplásicas que muchas ve-ces imposibilita una adecuada caracterizaciónmicroscópica.

Estas dificultades diagnósticas puedensuperarse gracias a la prueba de inmuno-fluorescencia directa utilizando anticuerposmonoclonales (AcMo) específicos para loslinfocitos B y T aviares. Su aplicación se fun-damenta en que el virus productor de la EMinfecta y transforma en un 90% a linfocitosT mientras que el virus de la LL lo hacen ensimilar proporción a los linfocitos B (Fadly,1997). En tal razón, el presente estudio re-porta el diagnóstico diferencial en 40 avescon tumores linfoides, en el que además delos criterios clinicos, macro y microscópicos,se utilizó AcMo para los linfocitos T y B paraestablecer un diagnóstico más preciso de lostumores linfoides aviares.


R. Tasayco et al.

MATERIALES Y MÉTODOS

Lugar de estudio

La necropsia de gallinas ponedoras serealizó en el Laboratorio de Patología Aviarde la Facultad de Medicina Veterinaria de laUniversidad Nacional Mayor de San Marcos(UNMSM) en Lima (Perú), y en las mismasgranjas. Las aves procedieron de granjas delas ciudades de Trujillo, Chincha y Lima. Eltrabajo de histopatología y la prueba deinmunofluorescencia se llevó a cabo en loslaboratorios de Histopatología y Virología dela Facultad de Medicina Veterinaria de laUNMSM.

Examen de necropsia y toma de muestras

Las necropsias de las aves muertas ylas sacrificadas por sospechas de presentarenfermedad tumoral, se realizaron siguiendola técnica convencional (Perusquia, 1985).Las muestras para análisis histopatológicosprocedieron de órganos que macroscópica-mente presentaban formaciones tumorales(órganos agrandados, con decoloracióngrisácea difusa o formaciones nodulares enel parénquima del hígado, bazo, corazón o ri-ñones; o con alteraciones morfológicas en eltamaño y color, tales como engrosamiento delproven-trículo o intestino, agrandamiento delovario en forma de coliflor, bursa aumentadao atrófica, así como agrandamiento de los pul-mones o páncreas (Perusquia, 1985; Inga,1991; Calnek y Witter, 1997).

Histopatología

Las muestras conservadas en formalinaal 10% fueron sometidas al procesohistológico empleando la coloraciónhematoxilina/eosina. Los cambios citológicoscompatibles con LL están referidos a la ho-mogeneidad de las células tumorales con pre-sencia de mitosis, atipia celular, presencia delinfocitos grandes (linfoblastos) y uniformes(homogéneos). Los linfoblastos presentan una

membrana citoplasmática pobremente defi-nida, mucho citoplasma basofílico y un nú-cleo vesicular prominente en el cual haymarginación y condensación de la cromatina,y uno o más nucléolos acidofílicos.

Los cambios asociados a EM corres-ponden a presencia de células atípicas ypleomorfismo linfocitario (variación en tama-ño y maduración de los linfoblastos de pe-queños a medianos). La proliferación es enforma difusa con figuras mitóticas (“célulade Marek”), característica patognomónica.Estos linfocitos transformados son grandesy, en muchos casos, están en proceso demuerte celular con evidencias de cariorrexisy cariólisis.

Inmunofluorescencia (IF)

Las muestras para la prueba de IF fue-ron cortadas con el micrótomo de congela-ción. Los tejidos tumorales fueron sometidosal proceso de congelamiento antes y duranteel proceso de corte para obtener tejidos de 4micras de espesor. Cada pieza de tejido con-gelado fue depositada en una láminaportaobjetos y, posteriormente, fijada enacetona refrigerada por 15’ y guardada encongelación antes de ser sometido a la prue-ba de IF. En cada corte de tejido se aplicó elanticuerpo monoclonal respectivo marcadocon fluoresceína (Southern BiotechnologyAssociates, Inc. USA). Para la identificaciónde los linfocitos B, el anticuerpo monoclonal(anti Ig M) se diluyó con PBS, en una pro-porción de 1:100 para obtener una concen-tración de 5 µg/ml. Para los linfocitos T, elanticuerpo monoclonal (anti CD3) se diluyócon PBS en una proporción de 1:50 para ob-tener una concentración de 10 µg/ml. Losconjugados respectivos se agregaron al teji-do y fueron incubados en estufa a 37 °C por35’ (en cámara húmeda). Terminada laincubación, las muestras fueron lavadas conPBS y cubiertas con glicerina. Las muestrasfueron observadas en el microscopio de fluo-rescencia buscando la distribución del mar-cador en la superficie de las células tumorales.



La muestra se consideraba positiva alinfocitos B (LL), cuando al aplicar el conju-gado anti-Ig M, se notaba el color amarilloverdoso formando masas que correspondíana las células tumorales. La positividad alinfocitos T (MD) se determinaba cuando alaplicar el conjugado anti-CD3, se apreciabael color amarillo verdoso correspondiente.

Análisis estadístico

Los cambios macroscópicos observadosfueron comparados con los hallazgos de losexámenes histopatológicos y con los resulta-dos de la prueba de IF directa. El grado deconcordancia entre los resultados del examenhistopatológico y de inmunofluorescencia fueutilizado para determinar si uno de los exá-menes es excluyente mediante la prueba deKappa y Mc Nemar.

RESULTADOS

Examen de necropsia

En el examen de necropsia se detectarontumores en el hígado (Fig.1), bazo, proventrículo,corazón, ovarios, riñones, pulmones, mesente-rio, intestino, nervio, bursa, páncreas, timo, piely músculo. El hígado, el bazo y el proventrículofueron los órganos afectados con mayor fre-cuencia (67.5, 52.5 y 47.5%, respectivamente.Cuadro 1). La piel, el músculo esquelético y eltimo fueron los órganos menos afectados. Lasalteraciones macroscópicas produjeron una evi-dente pérdida de la arquitectura normal de lostejidos afectados. Los tumores en ovario mos-traban una apariencia de coliflor, el proventrículose encontraba generalmente engrosado y labursa presentaba tumores de tipo nodular o en-grosamiento difuso.

Una gallina llegó a presentar ocho ór-ganos con tumores (hígado, bazo, corazón,proventrículo, riñones, pulmones, nervio yovario). Dentro de las aves afectadas, 27/40presentaron entre 2-4 órganos afectados, 7/40 entre 5-8 órganos comprometidos y 6/40con un solo órgano afectado (Cuadro 2).

El hígado, que fue el órgano afectadocon mayor frecuencia, se encontraba agran-dado ocupando gran parte de la región abdo-minal y con zonas de color más claro de lonormal. Cuando el bazo estaba comprometi-do se encontraba aumentado de tamaño enforma homogénea.

El examen de necropsia determinó que24/40 aves examinadas tenían lesiones com-patibles con la enfermedad de Marek y lasrestantes (16/40) con lesiones compatiblescon leucosis linfoide (Cuadro 3). El engrosa-miento de los nervios, tumores en proven-trículo y el carácter difuso del proceso fue-ron evidencias patológicas sugerentes de laGM. Los tumores de tipo nodular afectandoa la bursa, hígado y bazo fueron los aspectosmacroscópicos considerados para arribar aun posible diagnóstico de LL.

Histopatología

El 75% (18/24) de las aves diagnostica-das macroscópicamente como EM teníaninfiltraciones linfoides pleomórficas compati-bles histológicamente con EM, en tanto quelas otras (6/24) poseían cambios histológicosmonomórficos compatibles con LL. Todas lasaves diagnosticadas macroscópicamentecomo LL (16/40) presentaron evidenciashistológicas correspondientes a LL.

En el grupo de aves con cambioshistológicos compatibles con EM se obser-varon las lesiones intestinales caracterizadaspor infiltración difusa de poblacionespleomórficas de linfocitos con figurasmitóticas en todas las capas del intestino (Fig.2). El nervio ciático engrosado estuvo reple-to de células tumorales que distorsionan suestructura y desplazan las neuronas (Fig. 3).En el bazo, la infiltración alteraba los folículosesplénicos y en el páncreas se produjo diso-ciación de los acinos (figs. 4 y 5).

La estructura histológica es diferente enel caso de LL. Las lesiones son focales conpresencia de linfocitos grandes uniformes(homogéneos), encontrándose en la misma


R. Tasayco et al.

etapa de desarrollo primitivo y referidos comolinfoblastos de la leucosis aviar. En el hígado,los tumores fueron multifocales con despla-zamiento y/o compresión de los hepatocitosa causa del crecimiento expansivo de los fo-cos tumorales (Fig. 6). En el ovario con apa-riencia microscópica de coliflor, se apreciagran cantidad de células tumorales monomór-ficas alrededor de los folículos ováricos (figs.7 y 8). Las células tumorales comprimen lascélulas parenquimatosas del órgano afecta-do, no se infiltran entre ellas, tienen una mem-brana citoplasmática pobremente definida,mucho citoplasma basofílico y un núcleovesicular en el cual hay marginación y con-densación de la cromatina y presencia de unoo más nucleolos acidofílicos .

En algunas láminas se observaron ade-más del patrón característico, grupos de cé-lulas identificadas como mielocitos, presen-tes mayormente en hígado y ovarios,sugeriendo la presencia de una infección mixtay generalmente con la enfermedad de Marek.

Inmunofluorescencia

Nueve de los 18 (50%) tumores clasifi-cados por histopatología como enfermedadde Marek, fueron positivos al marcador CD3(células T) en la prueba de inmunofluores-cencia (Cuadro 4). De estos 9 positivos, 6/9solamente fueron positivos para el CD3 y 3/9a ambos marcadores CD3 (células T) e IgM(células B). En los 9/18 restantes se logróobservar que 8/9 fueron negativos a ambosmarcadores CD3 e IgM, y en 1/9 resultó po-sitivo para IgM (LL). Similarmente, en 12/22(54.6%) diagnosticados por histopatologíacomo leucosis linfoide, se identificaron mar-cadores de células B (IgM+). Seis de estasaves fueron solamente positivos a IgM y lasotras seis presentaron marcadores para am-bos tipos de células. En el resto (10/22) concambios histologicos indicadores de LL, 6/10fueron positivos a marcadores CD3 (célulasT) y los 4 restantes negativos para ambosmarcadores (Cuadro 4).

La prueba de inmunofluorescencia per-mitió la detección más precisa del tipo de tu-mor involucrado. La utilización de esta prue-ba determinó que 12/40 (30%) animales contumores tenían marcadores CD3 (Enferme-dad de Marek), 7/40 (17.5%) eran positivosa IgM (Leucosis Linfoide), 9/40 (22.5%) te-nían ambos marcadores de células T y B (in-fecciones mixtas) y los restantes 12/40 (30%)fueron negativos para ambos marcadores(Cuadro 4).

Todos los casos (4/4) en los que macros-cópicamente estuvo involucrado el nervio re-sultaron positivos a CD3, corroborando queestas alteraciones son típicas de EM. Conexcepción de los tumores detectados en lapiel y el músculo (negativos a ambos marca-dores ), todo el resto de órganos comprome-tidos reaccionaron a los 2 marcadores. Másdel 50% de las lesiones encontradas en losintestinos, bursa y proventrículos fueron po-sitivos a marcadores de células T en tantoque más del 50% de las lesiones encontradasen el mesenterio, páncreas y ovarios fueronpositivos al marcador de las células B. Elúnico tumor detectado en el timo resultó po-sitivo para ambos marcadores de células T yB (Cuadro 5). En total, 7/27 lesiones hepáti-cas, 7/13 cardiacas, 2/6 pulmonares, 2/8 re-nales, 1/21 esplénicas, 1/9 ováricas y 1/19proventriculares resultaron negativas paraambos marcadores.

Las pruebas de Kappa y Mc Nemarmostraron que para la enfermedad de Marek,el grado de concordancia entre histopatologíae inmunofluorescencia es de -0.045 (p>0.05);y para leucosis linfoide el grado de concor-dancia entre ambas pruebas (HP e IF) es de0.314 (p>0.05), por lo que se deduce queambos métodos de diagnóstico no son mu-tuamente reemplazables.

DISCUSIÓN

Los tumores linfoides aviares ocasio-nados por agentes virales son gene ralmente



Figura 1. Hígado aumentado de tamaño en una gallina con tumores linfoides

Figura 2. Intestino delgado con infiltración difusa de células tumorales afectando capamucosa (M) músculo liso (ML) y serosa (S) en la enfermedad de Marek. 10X


R. Tasayco et al.

Figura 3. Nervio ciático con infiltración difusa tumoral de células pleomórficas (flecha) en laenfermedad de Marek. 25X

Figura 4. Bazo con infiltración periarteriolar de células tumorales pleomórficas en la enfermedadde Marek. Arteriola de Maipighi (AM), células tumorales (flecha)



Figura 5. Páncreas con infiltración tumoral difusa de células pleomórficas (flecha)con disociación acinar (A) en la enfermedad de Marex. 40X

Figura 6. Hígado con infiltración multifocal por células tumorales (flecha) de creci-miento expansivo en la leucosis linfoide. Hepatocitos (H). 4X


R. Tasayco et al.

Figura 7. Ovario con amplia proliferación de células tumorales monomórficas detipo linfobásticas perifolicular (flecha) Folículos ováricos (FO). 10X

Figura 8. Ovario tumoral del ave de la Fig. 7. Folículo ovárico rodeado de abundantes célulastumorales monomórficas de tipo linfoblásticas (flecha) en la leucosis linfoide. 45X



Cuadro 2. Número de órganos afectados por ave con tumores linfoides, compatibles con enfermedad de Marek o leucosis linfoide, observados a la necropsia en gallinas ponedoras (n=40) de granjas comerciales en tres ciudades de Lima

Nº de órganos afectados

1 2 3 4 5 6 7 8

Aves afectadas (n) 6 11 8 8 3 3 0 1

Aves afectadas (%) 15.0 27.5 20.0 20.0 7.5 7.5 0.0 2.5

Cuadro 1. Cuantificación de los órganos afectados con tumores linfoides (enfermedad de Marek o leucosis linfoide) observados a la necropsia (n=40) en gallinas ponedoras de granjas comerciales de tres ciudades de Lima

Gallinas ponedoras Órgano afectado

n (%)

Timo 1 2.5 Intestino delgado 4 10.0 Nervios 4 10.0 Piel 1 2.5 Bursa de Fabricio 3 7.5 Hígado 27 67.5 Bazo 21 52.5 Músculo esquelético 1 2.5 Corazón 13 32.5 Proventrículo 19 47.5 Riñones 8 20.0 Mesenterio 5 12.5 Pulmones 6 15.0 Ovarios 9 22.5 Páncreas 3 7.5

Cuadro 3. Resultados comparativos entre alteraciones macroscópicas a la necropsia y prueba de inmunofluorescencia

Resultados de la Necropsia

Enf. de Marek Leucosis linfoide

Total

Prueba de Inmunofluorescencia

n % n % n %

CD3 positivo (EM) 8 33.3 4 25.0 12 30.0 IgM positivo (LL) 4 16.7 3 18.8 7 17.5

6 25.0 3 18.8 9 22.5 CD3 e IgM positivos (infecciones mixtas) CD3 e IgM negativos 6 25.0 6 37.5 12 30.0

Total 24 100.0 16 100.0 40 100.0


R. Tasayco et al.

Cuadro 5. Asociación entre lesiones macroscópicas características de la Enfermedad de Marek y de la Leucosis Linfoide, y presencia de marcadores de células T y B

Total de Marcador de células T Marcador de células B Órgano muestras n % n %

Nervio 4 4 100.0 0 0.0 Piel 1 0 0.0 0 0.0 Proventrículo 19 10 52.6 8 42.1 Corazón 13 5 38.4 3 23.0 Bursa 3 2 66.6 1 33.3 Ovarios 9 3 33.3 5 55.5 Riñones 8 3 37.5 3 37.5 Intestino 4 3 75.0 2 50.0 Mesenterio 5 1 20.0 4 80.0 Páncreas 3 1 33.3 2 66.6 Pulmones 6 2 33.3 2 33.3 Músculo 1 0 0.0 0 0.0 Timo 1 1 100.0 1 100.0 Hígado 27 12 44.4 8 29.6 Bazo 21 12 57.1 8 38.0

Cuadro 4. Resultados comparativos entre alteraciones histopatológicas y prueba de inmunofluorescencia

Diagnóstico por histopatología

Enfermedad de Marek

Leucosis linfoide

Total

Prueba de inmuofluorescencia

n % n % n %

CD3 positivo (EM) 6 33.3 6 27.3 12 30.0

IgM positivo (LL) 1 5.6 6 27.3 7 17.5

CD3 e IgM positivos (infecciones mixtas)

3 16.7 6 27.3 9 22.5

CD e IgM negativos 8 44.4 4 18.2 12 30.0

Total 18 100.0 22 100.0 40 100.0



producto de infecciones retrovirales del gru-po de la LL y el herpesvirus responsable dela EM. Estos tumores linfoides, en forma mi-croscópica son generalmente indistinguiblesdificultando su diagnóstico definitivo. El diag-nóstico diferencial usualmente depende de lasobservaciones de cambios histopatológicosasociados con la historia clínica, signosmacroscópicos y ciertas característicascitológicas. La histiogénesis producto de es-tas infecciones indica que el agente retroviralde la LL transforma usualmente a células By la infección herpética a las células T. Estasevidencias han permitido utilizar AcMo diri-gidos a antígenos (marcadores) celulares paraidentificar a los linfocitos B (IgM+) o célulasT (CD3+). Estos AcMo conjugados conisotiocianato de fluoresceína se utilizaron enel presente estudio mediante pruebas deimmnunofluorescencia (IF) directa para ladiferenciación de tumores linfoides aviaresasociados con LL y EM.

El análisis histopatológico fue utilizadopara agrupar ciertos cambios celulares des-critos como pleomorfismo linfocítico con pre-sencia de mitosis, cariorrexis y/o cariolisisdentro de los patrones asociados con la EMy la presencia de linfoblastos homogéneoscomo características histológicas de LL. Conestos criterios se clasificó al 45% de los tu-mores como lesiones compatibles como EMy el 55% restante dentro de la denominadaLL. Este criterio histopatológico fue utilizadopara ser contrastado con la presencia demarcadores celulares mediante los AcMo ypoder diferenciar a los linfocitos B de las cé-lulas T. En algunos casos la presencia de cé-lulas compatibles con mielocitos infiltrando losórganos, fueron tomados como una posibleinfección o superinfección del virus de laleucosis tipo J (Hihara et al., 1998; Fadly,1999; Zavala, 2000).

Los resultados de la prueba de IF con-firman la dificultad en el diagnóstico definiti-vo de las causas de los tumores linfoides enlas aves. Por un lado, se confirma que lahistopatología es una herramienta adicionalmuy importante en el diagnóstico del tipo de

neoplasia linfoide en órganos tumorales, perofundamentalmente se deberá tener en cuen-ta el principal órgano blanco transformado,como nervios en la EM y bursa en LL (Julian,1998; Payne y Mc Kay, 1999). En este estu-dio, los 4/40 casos en los que los nervios es-tuvieron involucrados resultaron serhistológicamente e IF positivos a la EM. Esto,sin embargo, no lo fue para casos sospecho-sos de LL (1/3 de casos en los que la bursaestuvo involucrada, la IF fue positiva alinfocitos B y el resto dio positivo a linfocitosT). Esto es contrario a lo expresado por va-rios autores que indican que la lesión de labursa es patognomónica de leucosis linfoide(Fadly, 1997; Payne y Mc Kay, 1999), perosin lugar a dudas, refuerza el concepto de lahabilidad en la lectura e interpretación de loscambios citológicos. La bursa puede ser to-mada por células tumorales de origen B (LL)y células T (EM), y la diferenciación depen-de del tipo de infiltración tumoral. Se men-ciona que LL infiltra focal o nodularmente,mientras que EM lo hace interfolicularmentecomprometiendo además a la plica bursal.

El análisis estadístico indica que para LL,existe una concordancia regular entre lahistopatología e IF, mientras que para la EMhay una pobre concordancia entre los dosparámetros. Esto se explica porquemicroscópicamente, es posible una identifi-cación más precisa de poblaciones celulareshomogéneas de leucosis linfoide concordan-do con el resultado de IF, a diferencia de ladifícil identificación microscópica de las cé-lulas pleomórficas de la enfermedad deMarek.

Las dificultades diagnósticas de tumo-res linfoides en aves radica en la habilidad deambos agentes virales de comprometer a másde un órgano anatómico. Las neoplasias aso-ciadas a LL y la EM suelen ocurrir en losmismos órganos viscerales y aún durante elmismo periodo de edad. Esta dualidadinfectiva ha podido ser identificada en el es-tudio, ya que con excepción de lesiones en-contradas en piel y músculo (negativos aambos marcadores), todos los órganos fue-

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ron positivos a uno o a ambos marcadoresanalizados (Cuadro 5). Las habilidades viralesde infectar un mismo órgano refuerza la ne-cesidad de realizar exámenes microscópicos;sin embargo, esto no es definitivo, pues mu-chas veces un acertado diagnóstico depen-derá de la habilidad en la lectura de los cam-bios histopatológicos y sobre todo de encon-trar las características apropiadas en las cé-lulas tumorales involucradas (Wakenell, 1997;Payne y Mc Kay, 1999). Por estas razones,la prueba de IF representa una alternativaviable para el diagnóstico diferencial ya quetiene la capacidad de distinguir entre linfomasde células B y T, debido a que utilizaanticuerpos monoclonales específicos paraantígenos de superficie celular de linfocitosT y B (Jeurissen et al., 2000).

Si bien es cierto que la prueba de laidentificación de marcadores celulares paralos linfocitos B y T son de ayuda en el diag-nóstico diferencial de los tumores linfoidesen aves, estos deben ser aceptados como he-rramientas adicionales en el diagnóstico, puesel retrovirus causante de LL transforma fun-damentalmente a los linfocitos B. En esteconcepto, el tumor con cambios histopa-tológicos altamente compatibles con EM ypositivos a células B no deben ser totalmentedescartados como EM (Cuadro 4). En todosestos casos sería necesario implementar he-rramientas moleculares a fin de precisar odescartar la presencia de un determinadoagente viral.

Doce de las 40 (30%) lesiones tumoralesevidenciaron infecciones mixtas. El mayorporcentaje de estos casos (8/12) correspon-dieron a casos que histopatológicamente fue-ron clasificados como EM (Cuadro 4). Estosresultados refuerzan las evidencias sobre in-fecciones concurrentes entre el virus de laleucosis aviar y cepas muy virulentas del virusde la EM en el desarrollo de tumores másintensos que cuando actúan de manera sepa-rada (Witter, 1998; Alzamora, 2000; Zavala,2000). La intensidad de los tumores no hasido evaluada en el presente estudio pero tam-poco descarta esta posibilidad de ocurrencia

en nuestro medio. La coexistencia de infec-ciones virales en lesiones con tumores ennuestro medio se refuerza, además, por lapresencia de evidencias histopatológicas (hí-gado y ovario) de infección del virus de laleucosis aviar del tipo J (Zavala, 1999).

Llama la atención que 12/40 (30%) delos casos tumorales fueron negativos para am-bos marcadores. Esto evidenciaría que estostumores pueden tener origen no linfoide o losAcMo no fueron capaces de identificarantígenos celulares. Se debe mencionar, ade-más que las lesiones tumorales encontradasen la piel y músculo fueron negativas a losmarcadores empleados en el estudio. Lanegatividad en todos los casos puede deber-se a un inadecuado muestreo o la especifici-dad del anticuerpo monoclonal empleado.

El uso combinado de cambios histopato-lógicos y la presencia de marcadores de loslinfocitos B y T han sido utilizados en el diag-nóstico diferencial en 40 casos de linfomasaviares. Los cambios citológicos evidencia-ron que 18/40 (45%) tenían lesiones compa-tibles con EM y el restante (22/40), cambioscorrespondientes a LL. Se encontró ademásque 5/40 (12.5%) casos tenían infiltracionescelulares mixtas de células linfoides ymielocitos sugiriendo la presencia de infec-ciones del virus de la LL tipo J. La prueba deIF directa confirmó que el 50% (9/18) decasos clasificados como EM tenían marca-dores de células T y 12/22 (54.6%) de loscasos agrupados como LL tenían marcado-res de linfocitos B. En ambos grupos se en-contraron infiltraciones linfoides mixtas, 3/9(EM) y 6/12 (LL) fueron positivos a ambosmarcadores celulares para células B y T. Porotro lado en 12/40 (30%) casos no se logra-ron detectar marcador linfoides en lasinfiltraciones tumorales. Estos resultados su-gieren la presencia de más de un retrovirusinvolucrado en procesos tumorales aviaresincluyendo el LL tipo J y probablemente elretrovirus de la reticuloendoteliosis. Sugierenademás, que las infecciones mixtas de virusde la LL y el herpesvirus de la EM son másprevalentes de lo sospechado. Las dificulta-

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des diagnósticas de estos tipos de tumoresaltamente prevalentes en el país muestran lanecesidad de implementar pruebas mole-culares (PCR) adicionales para arribar a undiagnóstico más preciso.

Agradecimientos: Los autores agradecena los médicos veterinarios de las diversasgranjas que permitieron el muestreo de lasaves estudiadas. Agradecen también a losLaboratorios de Patología Aviar y Virologíade la FMV, UNMSM, por el apoyo incondi-cional para la realización de las pruebas utili-zadas en el trabajo.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Calnek, B.W.; R.L. Witter. 1997.Marek’s Disease. En: Disease of poultry.10th ed. B.W. Calnek; H.J. Barnes Saif(eds). Iowa State University Press. Ames,I.A. p 361-413.

2. Fadly, A.M. 1997. Criteria for thedifferential diagnosis of viral lymphomasof chickens: A review. Avian TumorViruses Symposium. 40th Annual MeetingAAAP. USA.

3. Fadly, A.M. 1999. Una revisión de la in-fección y enfermedad producida por elvirus de la Leucosis Aviar subgrupo J enpollos de carne. Memorias XVI Congre-so Latinoamericano de Avicultura. Lima,Perú. p 75-77.

4. Hihara, H.; K. Imar; K. Tsukamoto;K. Nakamura. 1998. Isolation ofserotype 2 Marek’s disease virus from acell line of avian lymphoid leukosis. J. Vet.Med. Sci. 60: 143-148.

5. Inga, E. 1991. Análisis estadístico re-trospectivo de las principales enfermeda-des diagnosticadas en el laboratorio depatología aviar en los últimos 10 años.Tesis de Bachiller. Facultad de MedicinaVeterinaria, Universidad Nacional Mayorde San Marcos. Lima, Perú. 52 p.

6. Jeurissen, S.H.; E. Claassen; A.G.Boonstra-Blom; L. Vervelde; E. Mar-ga Jonse. 2000. Immunocytochemicaltechniques to investigate the pathogenesis

of infectious microorganisms and theconcurrent immune response of the host.Dev. Comp. Immunol. 24: 141-151.

7. Julian, R.L. 1998. Leukosis/SarcomaGroup. En: Resumen Curso Internacio-nal de Postgrado. Diagnóstico Patológi-co en Aves. FMV, UNMSM. Lima.

8. Muñoz, R. 2000. Control de Marek. Ind.Avícola. Diciembre. p 22-25.

9. Neumann, U.; R.L. Witter. 1979.Differential diagnosis of lymphoidleucosis and Marek´s disease by tumor-associated criteria. I. Studies onexperimentally infected chickens. AvianDis. 23: 417-425.

10. Payne, L.N.; A.M. Fadly. 1997.Leukosis/sarcoma group. En: Disease ofPoultry. 10th ed. Calnek, B.W. (ed). IowaState University. Press Ames, I.A. USA.p 426-456.

11. Payne, L.N.; J.C. Mc Kay. 1999. Diag-nóstico diferencial de las leucosis aviaresy el linfoma de la enfermedad de Mareky los procedimientos para erradicar losvirus exógenos de la leucosis aviar. Me-morias XVI Congreso Latinoamericanode Avicultura. Lima. p 68-73.

12. Perusquia, M.T. 1985. Necropsia enaves. EJ. Trillas. México.

13. Randall, W. 1990. Atlas a color de lasenfermedades de las aves de corral.Interamericana. México.

14. Spencer, J.L. 1998. Erradicación delvirus de la leucosis aviar. Prevención.XXXV Symposium de la WPSA.EXPOAVIGA 98. España. p 33-43.

15. Torriani, J. 1997. Confirmación deleucosis aviar en un lote de reproductoraspesadas. Mundo Avícola & Porcino 23: 55.

16. Wakenell, P. 1997. An overview ofproblems in diagnosis of neoplasticdiseases of poultry. Avian Tumor VirusesSymposium. 40th Annual Meeting.AAAP. USA.

17. Zavala, G. 2000. The status of AvianLeukosis infection in meat-type chickens.Proceedings 2000 Georgia InternationalPoultry Course. Georgia Center forContinuing Education. Univ. of Georgia,GA, USA.

uso de anticuerpos monoclonales para caracterizar … · 119 rev inv vet perú 2003; 14(2): 119-133...

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