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UNIVESIDAD DE CHILE FAULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y

TECNOLOGÍA QUÍMICA

LABORATORIO DE QUÍMICA DE ALIMENTOS Y

MATERIAS GRASAS.

Patrocinante

Profesora (QF.) Lilia Masson S.

Director (es)

Profesora (Q.) Paz Robert C.

Ing. Sr. Miguel Opazo Q.

Planta Materias Grasas, Fábrica

Maipú. Nestlé Chile S.A.

DESARROLLO DE UN SISTEMA DE INTERESTERIFICACION

ENZIMATICA PARA LA OBTENCIÓN DE BASES GRASAS CON

BAJO PORCENTAJE DE ACIDOS GRASOS TRANS

Memoria para optar al título de Ingeniero en Alimentos.

IVAN ROBERTO GUERRERO RIQUELME

Santiago, Chile

2005

II

DEDICATORIA

A Maria Teresa Riquelme S.M. e Iván Guerrero A.

A Teresa Guerrero R, Marcela Guerrero R. y Felipe Estay G.

A la familia Riquelme, ustedes son mi vida.

III

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad de Chile y su Facultad de Ciencias Químicas y

Farmacéuticas,

A la empresa Nestlé Chile S.A., por su apoyo a la investigación y

desarrollo de tecnologías,

A la empresa Novozymes y su coordinador técnico de Aceites y

Grasas para Latinoamérica Luís Alessandro Volpato M.,

A la profesora Lilia Masson, por su gran aporte, confianza,

conocimientos y apoyo a la investigación,

Al ingeniero Miguel Opazo, por su confianza y consejos,

A la profesora Paz Robert, por su aporte, confianza e iluminación,

Al profesor Eduardo Castro, por su constante apoyo y sabiduría,

A todos los trabajadores de la Planta de Materias Grasas, quienes

dieron todas las facilidades para realizar este trabajo,

A los especialistas y profesionales del departamento de Quality

Assurance de la Fábrica Maipú,

A los académicos, funcionarios y especialistas que trabajan en el

Laboratorio de Química de Alimentos y Materias Grasas de la Facultad de

Ciencias Químicas y Farmacéuticas.

IV

INDICE GENERAL

INDICE DE TABLAS……………………………………...

INDICE DE FIGURAS…………………………………….

INDICE DE GRÁFICOS………………………………….

INDICE DE ANEXOS……………………………………..

NOMENCLATURA………………………………………..

RESUMEN………………………………………………….

SUMARY…………………………………………………...

I. INTRODUCCIÓN……………………………………...

1.1. Antecedentes generales….………………………........

1.1.1. Definición y características…..……………….............

1.1.2. Enzimas y mecanismo de reacción…....…...................

1.1.3. Aplicaciones……………..……………………………

1.1.4. Pérdidas por reacción…….…………….......................

1.2. Características de las materias primas………………….

1.2.1. Aceite de Pescado………………………………….....

1.2.2. Aceite de Soja………………………………………...

1.2.3. Aceite de Maravilla…………………………………...

1.3. Materias grasas de consumo industrial y doméstico……

1.4. Diseño experimental…………………………................

1.5. Objetivos……………………………………………...

1.5.1. Objetivo General……………………………………...

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V

1.5.2. Objetivos Específicos…………………………………

II. MATERIALES Y MÉTODOS……………………….

2.1. Materiales………………………………………… …..

2.1.1. Materias primas……………………………………….

2.1.2. Material de vidrio.…………………………….............

2.1.3. Otros materiales de laboratorio..……………………...

2.1.4. Reactivos y soluciones.……………………….............

2.1.5. Instrumentos y equipos de laboratorio..………………

2.2. Metodología…………………………………………...

2.2.1. Elección de materias primas y determinación de sus

características físicas y químicas………..…………..............

2.2.1.1. Elección de materias primas………………………..

2.2.1.2. Determinación de las características físicas y

químicas de las materias primas…………………………….

2.2.2. Métodos de análisis.……...……...................................

2.2.2.1. Parámetros físicos.………………………...………..

2.2.2.2. Parámetros químicos….……………………...……..

2.2.3. Caracterización de la enzima………............................

2.3. Determinación de las variables dependientes e

independientes del diseño experimental. Optimización de las

condiciones de proceso y requerimientos de catalizador…....

2.3.1. Determinación de las condiciones de proceso..............

2.3.2. Diseño de experimentos....……………………………

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VI

2.3.2.1. Variables de estudio para la reacción de

interesterificación……………………………………………

2.3.2.2. Variables dependientes……………..........................

2.3.2.3. Diseño factorial fraccionario….…………………….

2.3.2.4. Diseño de optimización…….……….………………

2.4. Establecimiento de los modelos matemáticos...............

2.4.1. Obtención del producto óptimo……………………….

2.5. Caracterización del producto óptimo.…………...........

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN..……………………

3.1. Determinación de las características físicas y químicas

de las materias primas……………...………………………..

3.2. Determinación de las condiciones de proceso.….…..….

3.2.1. Etapas para la realización de la reacción de

interesterificación……………...…………………………….

3.2.2. Diagrama de bloques……...………..............................

3.2.3. Esquema del sistema de reacción…………………......

3.3. Características del producto objeto……………………..

3.4. Resultados del diseño experimental………...…………..

3.4.1. Características de combinación de materias primas en

los niveles de diseño aplicado…………………………….....

3.4.2. Diseño factorial bidimensional en tres niveles (32).......

3.4.3. Análisis estadístico de las respuestas del diseño 32......

3.5. Establecimiento de los modelos matemáticos…………..

3.6. Condiciones de obtención del producto óptimo……...…

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VII

3.7. Caracterización del producto óptimo …..………………

3.7.1. Análisis del producto óptimo con y sin


3.7.1.1. Análisis comparativo del producto óptimo con

respecto al estándar establecido……………………………..

3.7.1.2. Análisis de las características texturales por medio

del ensayo de compresión a los productos optimizados…….

3.7.1.3. Análisis de microscopía de luz polarizada…………

3.7.1.4. Análisis del contenido de AGT en materias primas y

productos optimizados……………………………………....

3.7.1.5. Análisis del perfil de TAG ……...………………….

IV. CONCLUSIONES…………………………………...

V. BIBLIOGRAFÍA…………………………………….

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IX

INDICE DE TABLAS

Tabla 1 Niveles de aplicación de las variables en estudio.....

Tabla 2 Niveles experimentales de las variables en estudio..

Tabla 3 Resultados de análisis físicos y químicos de las

materias primas……………………………………………...

Tabla 4 Composición de ácidos grasos de las materias

primas (% ésteres metílicos)………………………………...

Tabla 5 Condiciones óptimas para una materia grasa

comercial…………………………………………………….

Tabla 6 Características físicas iniciales de la mezcla

AFHP/AVL en diferentes proporciones…………………….

Tabla 7 Características físicas iniciales de la mezcla

AFHV/AVL en diferentes proporciones…………...………..

Tabla 8 Resultados del diseño 32, en base pescado con

interesterificación…………………………………..……….

Tabla 9 Resultados del diseño 32, en base vegetal con


Tabla 10 Resumen de valores P y F del análisis ANOVA

aplicado a las respuestas del diseño en base pescado………

Tabla 11 Resumen de valores P y F del análisis ANOVA

aplicado a la respuesta del diseño en base vegetal...……….

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VIII

Tabla 12 Comparación entre las respuestas del modelo

matemático y las respuestas experimentales para la base de

pescado………………………………………………………

Tabla 13 Comparación entre las respuestas del modelo

matemático y las respuestas experimentales para la base

vegetal……………………………………………………….

Tabla 14 Condiciones experimentales para el producto

óptimo en base pescado y base vegetal.…………………….

Tabla 15 CSG y PF para la mezcla optimizada en base

pescado y base vegetal………………………………………

Tabla 16 Parámetros texturales de las mezclas óptimas en

base pescado y base vegetal…..………………………..........

Tabla 17 Resultados análisis de contenido de AGT por

cromatografía GLC y espectroscopía IR.……………………

Tabla 18 Perfil de triglicéridos, determinado por HPLC

para AVL, AFHV, y mezclas optimizadas con base vegetal

con y sin interesterificación…………………………………

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X

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Tríada catalítica del sitio activo de una lipasa…………

Figura 2. Intercambio de ácidos grasos debido a la acción de una

lipasa 1,3 específica, entre dos triglicéridos diferentes…………...

Figura 3. Representación de la hidrólisis de una molécula de

TAG por presencia de agua en la reacción enzimática…………...

Figura 4. Diagrama de bloque, reacción de interesterificación….

Figura 5. Esquema del sistema de reacción de interesterificación

a nivel de laboratorio……………………………………………...

Figura 6. Microfotografías de luz polarizada para AFHP, MOBP

y MOBPI, con un aumento de 10X……………….........................

Figura 7. Microfotografías de luz polarizada para AFHV,

MOBV y MOBVI, con un aumento de 10X. …………………….

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XII

INDICE DE GRÁFICOS

Gráfico 1. CSG para las materias primas en función de la

temperatura…………………………………………………….

Gráfico 2. CSG para las mezclas con base pescado

interesterificadas en función de la temperatura………….…….

Gráfico 3. CSG para las mezclas con base vegetal

interesterificada en función de la temperatura………………...

Gráfico 4. CSG para las mezclas optimizadas con base

pescado en función de la temperatura…………………………

Gráfico 5. CSG para las mezclas optimizadas con base

vegetal en función de la temperatura………………………….

Gráfico 6. Curvas de compresión para la mezcla óptima en

base pescado sin interesterificar (MOBP) y con

interesterificación (MOBPI)………………………………...…

Gráfico 7. Curvas de compresión para la mezcla óptima en

base vegetal sin interesterificar (MOBV) y con

interesterificación (MOBVI)...……………………………...…

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XII

INDICE DE ANEXOS

ANEXO 1 Tablas de Análisis de Varianza y Coeficientes de

Correlación para Respuestas del Diseño Bidimensional factorial

en 3 niveles (32)………………………………………………….

ANEXO 2 Superficie de Respuesta del Diseño de Optimización

de Respuesta Múltiple…………………………………………….

ANEXO 3 Microfotografías de luz Polarizada con aumento de

40X………………………………………………………………..

ANEXO 4 Composición de Ácidos Grasos en Mezclas

Optimizadas……………………………………………………….

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XIII

NOMENCLATURA

AGT: Ácidos Grasos Trans

AFHP: Aceite full Hidrogenado de Pescado

AFHV: Aceite full Hidrogenado Vegetal

AVL: Aceite Vegetal Líquido

CSG: Contenido de Sólidos Grasos

DS: Desviación Estándar

GLC: Cromatografía Gas-Líquido

HPLC: Cromatografía Líquida de Alta Resolución

IR: Espectroscopía Infra Roja

MOBP: Mezcla Óptima Base Pescado

MOBPI: Mezcla Óptima Base Pescado Interesterificada

MOBV: Mezcla Óptima Base Vegetal

MOBVI: Mezcla Óptima Base Vegetal Interesterificada

PF: Punto de Fusión

RBD: Neutro, Blanqueado y Desodorizado

TAG: Triacilglicerol

x: Promedio

XIV

RESUMEN

Se ha estudiado la aplicación del proceso de interesterificación

enzimática, con la finalidad de desarrollar un sistema que permita la

obtención a escala industrial de bases grasas alternativas, que contengan un

bajo porcentaje de ácidos grasos trans (AGT).

Las materias primas utilizadas fueron mezclas de aceite de pescado

“full” hidrogenado (AFHP) con aceite vegetal líquido (AVL) para la

mezcla con base pescado, y aceite vegetal “full” hidrogenado (AFHV) con

AVL para la mezcla con base vegetal. El catalizador empleado fue una

lipasa 1,3 específica al 4% y 70 ºC. Las variables estudiadas fueron: % de

materia prima en la mezcla (AFHP o AFHV) y tiempo de reacción. El

efecto se midió sobre las variables punto de fusión (PF) y contenido de

sólidos grasos (CSG) a diferentes temperaturas.

Se aplicó un diseño factorial bidimensional en tres niveles, 32,

como diseño de optimización del proceso, encontrándose como resultado

un tiempo de reacción de 5 horas (tiempo máximo) para ambas mezclas y

una proporción de 43,9% para AFHP en la mezcla con base pescado y

36,8% para AFHV en la mezcla con base vegetal.

Se establecieron los modelos matemáticos para PF y CSG a

diferentes temperaturas.

Se determinó el contenido de AGT mediante IR y GLC, estructura

cristalina por microscopía de luz polarizada, características texturales

mediante análisis de compresión y cambios en el contenido de triglicéridos

para la base vegetal mediante HPLC.

XV

SUMARY

“DEVELOPMENT OF AN ENZYMATIC INTERESTERIFICATION SYSTEM FOR OBTAINING LOW TRANS FATTY ACIDS BASES”

The enzymatic interesterification process has been applied with the

purpose to develop a system for obtaining alternative fatty bases with low

percentage of trans fatty acids (AGT) for industrial production.

The raw materials used were full hydrogenated fish oil (AFHP) and

liquid vegetal oil (AVL) for the fish blend and full hydrogenated vegetal oil

(AFHV) with AVL for the vegetal blend. The catalyst used was 4% 1,3

specific lipase, temperature 70 ºC. The variables studied were: % of raw

material in the blend (AFHP or AFHV) and reaction time. The effect was

measured by melting point variable (PF) and solid-fat content (CSG) at

different temperatures. A 3 levels factorial bidimensional design, 32, for

process of optimization was applied. The results were maximum reaction

time 5 hours for both mixtures and a proportion of 43.9% for AFHP in the

fish base mixture and 36.8% for AFHV in the vegetal base mixture.

The mathematical models for the PF and CSG at different

temperatures were established. AGT, crystalline structure, textural

characteristics and changes in the triacylglicerol content for the vegetal

blend were determined by IR and GLC, polarized light microscopy,

compression analysis and HPLC, respectively.

INTRODUCCIÓN

1

I. INTRODUCCIÓN

El aspecto nutricional de las grasas y los aceites siempre ha sido un

punto de discusión. Junto con la atención focalizada en la reducción del

nivel de grasa saturada existente en los productos alimenticios, en la

actualidad ha surgido un gran interés en el contenido de ácidos grasos trans

y el aporte de vitaminas liposolubles naturales de los aceites y las grasas.

Con el objeto de estar siempre acorde con los requerimientos de la calidad

nutricional de las grasas, las tecnologías existentes están en proceso

continuo de mejoramiento y a la vez emergen nuevos procesos. En este

sentido, las modificaciones más conocidas son: fraccionamiento,

hidrogenación e interesterificación, siendo la hidrogenación selectiva la que

aporta aproximadamente el 80% de los isómeros trans en la dieta (Kellens,

1997; Amadori, 1995).

El rol biológico que cumplen los ácidos grasos trans en el organismo

animal ha sido controversial. Se ha demostrado que estos ácidos grasos

trans pueden comportarse como un ácido graso saturado, pudiendo incidir

en un aumento de las enfermedades coronarias. Estudios realizados en los

años noventa, han demostrado que la ingesta de ácidos grasos trans

incrementa la concentración plasmática del colesterol LDL de una manera

similar al efecto que ejercen los ácidos grasos saturados (Mensink y Katan,

1990; Judd et al., 1994). Además, en contraste con otros tipos de materia de

materias grasas, los isómeros trans disminuyen el colesterol HDL (Troisi et

al., 1992). Así, el incremento de la razón colesterol LDL/colesterol HDL es

INTRODUCCIÓN

2

casi el doble del producido por los ácidos grasos saturados (Zock y Katan,

1992).

Se ha estimado que el 90-95 % de los ácidos grasos trans de los

alimentos se genera en el proceso de hidrogenación, lo cual otorga

firmeza a las margarinas y a las grasas plásticas de pastelería

(Shortenings) por saturación de algunos de los dobles enlaces y

cambiando otros a configuración trans. Las margarinas pueden tener un

contenido de ácidos grasos trans entre 30 y 45 % (Valenzuela y Nieto,

1994).

La presencia de un doble enlace en la estructura de un ácido graso

determina en éste un plano de simetría muy particular. Por ejemplo, en un

C18:1 omega-9, el doble enlace puede establecer un plano en el cual los

dos segmentos de la cadena hidrocarbonada pueden quedar hacia un

mismo lado del plano de referencia o pueden quedar en posiciones

contrarias en este mismo plano de referencia. En el primer caso se origina

una isomería cis y la molécula corresponderá al ácido oleico (C18:1

omega-9 cis). En el segundo caso, se trata de una isomería trans y dará

origen a un ácido graso con propiedades físicas muy diferentes al ácido

oleico. Se trata del ácido elaidico (C18:1 omega-9 trans) (Valenzuela y

Nieto, 1994).

De esta forma, la industria de alimentos utiliza procedimientos de

interesterificación química y enzimática de las grasas y aceites con el

propósito de mejorar sus características nutricionales, así como también

sus propiedades de fusión y contenido de grasa sólida. Debido a que los

INTRODUCCIÓN

3

procedimientos de interesterificación química presentan algunas

limitaciones e inconvenientes, la aplicación de tecnologías que utilizan

enzimas aparece como muy prometedora para el desarrollo de nuevos

tipos de grasas y aceites. Las reacciones de interesterificación catalizadas

por lipasas permiten la modificación estructural de los lípidos al cambiar

en forma selectiva la composición de los triglicéridos bajo condiciones de

reacción muy suaves y controladas (Valenzuela y Nieto, 1994).

La gran ventaja de las enzimas como catalizadores es que ellas

permiten que los ácidos grasos, durante el proceso, se reordenen en la

molécula de glicerol en posiciones determinadas constituyendo una

selectividad por posiciones determinadas, según la enzima utilizada. Esta

selectividad no se puede conseguir en la interesterificación con

catalizadores químicos.

Los principales atractivos de estos catalizadores se refieren a la

especificidad que presentan sobre las posiciones 1, 3 y 2 de la molécula

de glicerol. Además, se trata de productos naturales que, en las

reacciones que participan, operan a temperaturas relativamente bajas o

menores, entre 40 y 60 °C (Amadori, 1995). Por otro lado, las enzimas se

pueden clasificar como catalizadores de grado alimenticio y se pueden

utilizar de forma sencilla, sin necesidad de disponer de un gran

equipamiento como medio de reacción.

INTRODUCCIÓN

4

1.1. Antecedentes generales

1.1.1. Definición y características

En general, la reacción de interesterificación se divide en tres tipos:

acidólisis, alcohólisis e intercambio éster-éster (transesterificación).

El intercambio éster-éster puede efectuarse en forma aleatoria, es

lo que se conoce como interesterificación al azar, o bien, como

interesterificación dirigida, en la cual, se realiza una separación de los

radicales ácidos de acuerdo a su grado de insaturación y largo de cadena

(Swern, 1982).

La reacción de interesterificación al azar, se aplica considerando

que las materias grasas en sí mismas, o sus mezclas, presentan un grado

de organización en lo que respecta a la distribución de sus ácidos grasos.

La interesterificación química dirigida se realiza por debajo del punto de

fusión de la materia grasa, de modo que las fracciones de mayor punto de

fusión, los glicéridos trisaturados, precipiten, y así, la reacción tenga

lugar en la fase líquida (Swern, 1982).

El proceso de interesterificación modifica la distribución natural,

consistente en un intercambio de los ácidos grasos en el mismo TAG y

entre las moléculas de TAG, produciéndose así un reordenamiento. La

composición porcentual de los ácidos grasos permanece idéntica a la de

la materia grasa o mezcla original, pero la composición en TAG y las

propiedades físicas, como punto de fusión, contenido de grasa sólida y

forma de cristalización, se modifican.

INTRODUCCIÓN

5

Entre los procedimientos de interesterificación se cuenta el simple

calentamiento de los aceites y grasas a temperaturas que bordean los

300ºC, pero la reacción a esta condición es lenta y normalmente

acompañada de descomposición y polimerización de los TAG.

En la práctica, se requiere de un catalizador, que puede ser químico

o enzimático. Los catalizadores más usados son los metales alcalinos y

sus derivados, siendo el metóxido de sodio el más empleado, debido a sus

ventajas de costo y temperatura de reacción, que puede ser reducida a un

rango entre 30-90ºC (Solís et al., 2001).

Cuando se trata de una reacción enzimática, se utilizan lipasas,

enzimas hidrolíticas del enlace éster. Éstas presentan una especificidad

para los ácidos grasos ubicados en las posiciones 1 y 3, mientras que

otras, actúan sobre los radicales acilos ubicados en las posiciones 1, 2 y

3. Se utilizan normalmente inmovilizadas, y representan una buena

herramienta para la producción de nuevos tipos de triglicéridos

(Valenzuela y Nieto, 1994).

1.1.2. Enzimas y mecanismo de reacción

Las enzimas son catalizadores complejos, constituidas por

proteínas globulares, que a temperaturas en torno a 37 °C, aceleran la

velocidad de las reacciones químicas por un factor de 1012 a 1020 respecto

a la de las reacciones no catalizadas (Fennema, 2000).

Aunque las enzimas se encuentran sometidas a las mismas leyes

naturales que gobiernan el comportamiento de otras sustancias, se

INTRODUCCIÓN

6

diferencian de los catalizadores químicos ordinarios en varios aspectos

importantes:

• Velocidades de reacción más elevadas

• Condiciones de reacción más suaves

• Mayor especificidad

• Capacidad para la regulación

Dentro de las enzimas, las lipasas se encuentran ampliamente

difundidas, y existen en plantas, animales y microorganismos. Además,

se presentan en numerosos fluidos biológicos, células, semillas y varios

otros tejidos (Voet y Voet, 1995). Las lipasas hidrolizan los enlaces éster

de los TAG en una interfase aceite/agua.

Los recientes avances en la tecnología de las enzimas han

conducido a la preparación de enzimas inmovilizadas que, en principio,

pueden ser usadas repetidamente en operaciones discontinuas o

continuas. En este sentido, la inmovilización se puede llevar a cabo

mediante cinco métodos generales:

• Enlace covalente a una matriz insoluble.

• Inclusión entre las mallas de un gel o (micro)-encapsulación con

membranas semipermeables.

• Adsorción sobre una matriz insoluble.

• Entrecruzamientos para formar agregados insolubles.

• Adsorción seguida de entrecruzamiento.

Las principales fuentes de lipasas de origen animal son el tejido

comestible del primer estómago de terneros, cabritos y corderos, y tejido

INTRODUCCIÓN

7

pancreático animal, las cuales se utilizan principalmente en el desarrollo

de aromas en la fabricación de queso (Fennema, 2000).

Las lipasas con fines comerciales se obtienen a partir de la

fermentación de microorganismos tales como Aspergillus oryzae,

Rhizopus niveus, Rhizopus oryzae, Thermomyces lanuginosus

(inmovilizada) y Rhizomucor miehei (inmovilizada), las cuales actúan

sobre las posiciones sn-1,3 de los TAG, mientras que lipasas obtenidas

de microorganismos como Pseudomonas sp, Arthrobacter sp, y Candida

antarctica, actúan sobre la posición sn-2, sin embargo también presentan

actividad sobre las posiciones sn-1,3 (Chandler, 2001).

El mecanismo de acción de una lipasa es análogo al de la

quimiotripsina y consiste en una fase de acilación en la que se forma un

intermediario covalente acil-enzima, con liberación del primer producto

(diglicerato), y una fase de desacilación en la que una molécula de

diglicerato diferente rompe el intermediario con liberación del segundo

producto, un nuevo TAG. Todas estas enzimas tienen un centro activo

formado por tres aminoácidos; Serina (Ser 195), Histidina (His 57) y

ácido Aspártico (Asp 102), que en conjunto reciben el nombre de “tríada

catalítica” (Figura 1) (Fennema, 2000).

INTRODUCCIÓN

8

Figura 1. Tríada catalítica del sitio activo de una lipasa.

En la Figura 2 se muestra el intercambio de ácidos grasos en

posiciones 1 y 3 entre dos triglicéridos, por acción de una lipasa 1-3

específica comercial.

Figura 2. Intercambio de ácidos grasos debido a la acción de una lipasa 1-3 específica, entre dos triglicéridos diferentes.

1.1.3. Aplicaciones

La interesterificación enzimática se presenta como una muy buena

alternativa para la industria de modificación de materias grasas, en lo

referente a la elaboración de bases para margarinas, mantecas plásticas

(Shortenings) y materias grasas modificadas.

En este sentido, los estudios realizados sobre el comportamiento y

finalidad de uso de las lipasas aplicadas a una mezcla de bases grasas,

INTRODUCCIÓN

9

apuntan en su mayoría a la obtención de margarinas en base a derivados

de la palma.

Así, Zainal y Affandi (1999) utilizaron la interesterificación

mediante lipasa inmovilizada de Rhizomucor miehei (Lipozyme IM60)

para lograr adecuadas propiedades físicas en la mezcla de estearina de

palma y oleína de palmiste, reduciendo además el contenido de isómeros

trans a un 0,5%.

Por otro lado, Zhang et al., (2001) estudiaron la interesterificación

de estearina de palma y aceite de coco, con Lipozyme TL IM 1, 3

específica, en reactores pilotos tipo “Batch” de capacidades desde 1 a

300 kg.

Chu et al., (2001) encontraron que sus mezclas de estearina de

palma y oleina de palmiste, interesterificadas con Lipozyme IM60,

presentaban una estructura cristalina �´ más abundante que en muestras

de margarinas domésticas comunes.

Torres et al., (2002) realizaron la interesterificación enzimática

utilizando Lipozyme Tl IM al 10 %, en mezclas de aceite de maíz y

triestearina. En su trabajo observaron una reducción de la triestearina de

6 a 0,5 % en solo 30 minutos.

Zhang et al., (2004) evaluaron mediante un modelo matemático

exponencial dos grupos de mezclas de aceites (estearina de palma/aceite

de coco y aceite de soja “full” hidrogenada/aceite de soja) trabajando

con una concentración de enzima Lipozyme TL IM al 4 % (p/p) y 70 ºC.

Mediante este modelo se pretendió predecir cambios en el contenido de

INTRODUCCIÓN

10

grasa sólida para las mezclas trabajadas, obteniéndose un coeficiente de

correlación de 0,99.

1.1.4. Pérdidas por reacción

Las pérdidas de materia grasa se producen debido a su retención en

los gránulos de sílica que protegen la enzima inmovilizada. El valor de

retención estimado es de aproximadamente 1 kg de aceite/kg enzima. De

acuerdo a esto se puede estimar que en cada reacción se pierden 20 g de

aceite si se trabaja con 500 g de aceite y un 4% de enzima.

Podría mencionarse también dentro de este ítem, las pérdidas por

hidrólisis, debido a la humedad presente en las bases grasas sometidas a

reacción. En este sentido, la figura Nº3 representa la hidrólisis de un

TAG producida por la presencia de la molécula de agua, con el

consiguiente aumento de la acidez y la aparición de diglicéridos o

monoglicéridos.

Figura 3. Representación de la hidrólisis de una molécula de TAG por presencia de agua en la reacción enzimática.

INTRODUCCIÓN

11

1.2. Características de las materias primas

1.2.1. Aceite de Pescado

Chile es uno de los principales productores de aceite de pescado a

escala mundial aportando cerca de 195.263 Ton el año 2004 (Sernapesca,

2004). Esta cifra puede variar debido (entre otros factores) a la aparición

del fenómeno “El Niño” en las costas del Océano Pacífico.

Esta materia prima se utiliza en Chile por la industria de

margarinas para alimentación humana como aceite parcialmente

hidrogenado de origen animal. En este sentido, un 34% del aceite de

pescado es consumido por este tipo de industrias. Del total restante, se

estima que un 54% va a la industria de la acuicultura, un 10% a

elaboración de productos industriales y un 2% es utilizado en la industria

farmacéutica (Fundación Chile, 2003).

El aceite de pescado que se emplea en la industria chilena es

básicamente un producto común de jurel, sardina, anchoveta y salmón,

en el que se presenta una composición ponderada del perfil de ácidos

grasos, que por ser de origen marino, se estima que el orden dentro de las

moléculas es similar (Eisner, 1998).

Desde un punto de vista estructural, los aceites de pescado se

diferencian de la grasa animal y de los aceites vegetales por su alto

contenido de ácidos grasos poliinsaturados omega 3 (AGPI-�3) de

cadena larga de hasta 26 átomos de carbono; siendo los más frecuentes

los de C20 y C22 (Masson y Mella, 1985).

INTRODUCCIÓN

12

1.2.2. Aceite de Soja

Los principales proveedores de aceite de soja para Chile son

Argentina y Bolivia, abasteciendo el 40% del total de aceite importado

por nuestro país, que se estima en 8.559 Ton en el período Enero-Agosto

del año 2004 (ODEPA, 2005). Esta situación de abastecimiento ha ido

cambiando debido a que se autorizó la importación de mezclas de aceites

donde se combinan principalmente aceite de girasol o maravilla, con soja

u otros aceites, pasando a significar esta mezcla el 85% de las

importaciones (Iglesias, 2001).

El aceite de soja es el más importante de los aceites vegetales

producidos en el mundo, debido a su disponibilidad y bajo costo.

Este aceite presenta muchas ventajas, pero también algunas

desventajas. Dentro de las ventajas se encuentra su alto nivel de

insaturación, además, puede ser hidrogenado selectivamente, la remoción

de fosfátidos, metales y jabones no presenta grandes dificultades y tiene

una buena presencia de antioxidantes naturales (tocoferoles). Entre las

desventajas cabe mencionar sus cantidades relativamente altas de

fosfátidos (superior al 2%) y cantidades altas de ácido linolénico (7-8%),

responsable de la reversión de su sabor y olor.

El aceite de soja posee un contenido de ácido linoleico de

alrededor del 50%, mientras que el ácido oleico se encuentra cerca del

22%. Su contenido de ácido linolénico cercano al 7% lo diferencia de

otros aceites, otorgándole adecuadas propiedades nutricionales (Masson

y Mella, 1985).

INTRODUCCIÓN

13

1.2.3. Aceite de Maravilla

Chile no tiene producción interna de oleaginosas (solo es capaz de

cubrir cerca del 10% del mercado local), es por esto que se abastece de

materia prima importada para sus refinerías. En este sentido, Argentina

abastece a la industria chilena cubriendo el 95% de las necesidades de

aceite crudo, siendo el resto de origen boliviano (García, 2001). En este

sentido, el total de aceite de maravilla importado fue de 1.124 Ton para

el año 2004, en su mayoría como aceite refinado.

El aceite de girasol (maravilla) tradicional posee una elevada

proporción de ácido linoleico, cercana al 70% (Masson y Mella, 1985),

lo que hace que el proceso de hidrogenación pueda ser mejor controlado.

Por el contrario, el alto contenido en este ácido graso puede provocar

auto oxidación y desarrollo de rancidez.

Es por esto que se han desarrollado híbridos de girasol tradicional

con la finalidad de aumentar el contenido de ácido oleico (alto oleico) y

conferir así mayor estabilidad y valor agregado en la prevención de

diversas patologías (Izquierdo y Aguirrezábal, 2002).

1.3. Materias grasas de consumo industrial y domestico

El empleo de una materia grasa dependerá del uso final que se le

asigne. En este sentido, los “shortenings” o mantecas plásticas deben

producir emulsiones estables bajo el efecto de la temperatura de horneo.

Las bases grasas destinadas a la elaboración de helados deben generar

emulsión, facilitar la aireación y formar parte de su estructura. En el caso

de los productos de panificación, su función es la de formar un complejo

INTRODUCCIÓN

14

con el almidón y las proteínas de la harina, de manera de otorgar buenos

rendimientos en cuanto al volumen del producto por mayor incorporación

de aire, aumentar su calidad organoléptica e incrementar la vida útil.

Una sustancia es plástica cuando presenta la propiedad de

comportarse como sólido y resistir pequeños esfuerzos, pero ceder y fluir

como un líquido cuando se la somete a un esfuerzo de deformación por

sobre cierto valor mínimo.

La plasticidad de una margarina es función de su contenido de

sólidos a distintas temperaturas, razón por la cual el parámetro de

contenido de sólidos grasos (sólid fat content, SFC o CSG), es un buen

indicador del rango plástico de una grasa. Cuando una materia grasa

plástica se incorpora a una masa, es capaz de extenderse para formar

mínimas láminas que lubrican grandes superficies y favorece la

formación de una estructura homogénea (Swern, 1982).

Para que este tipo de productos cumpla con los parámetros de

calidad exigidos, deben regirse por las disposiciones del Reglamento

Sanitario de los Alimentos (Ministerio de Salud, 2000), el cual en el

Titulo X, de las grasas y aceites comestibles, indica:

“El contenido de humedad y materias volátiles, no deberá ser

mayor a 0,2% en los aceites comestibles y no más de 0,5% en las

mantecas o grasas. No deberán contener más de 0,25% de acidez libre,

expresada como ácido oleico, y no más de 100 ppm de jabón. A la fecha

de elaboración, el límite máximo de peróxidos será de 2,5 meq de

oxigeno peróxido/kg de grasa y 10 meq de oxígeno peróxido/kg de grasa

en su período de vida útil……”.

INTRODUCCIÓN

15

Por otro lado, en el Artículo 259 se indica:

“Mantecas modificadas son los productos obtenidos de aceites

vegetales o marinos que han sido sometidos a procesos de hidrogenación

y eventualmente a transesterificación, interesterificación y

fraccionamiento. Su punto de fusión máximo será de 45ºC. En materias

primas se permiten puntos de fusión mayores”.

1.4. Diseño experimental

Antes de realizar un trabajo experimental, deben establecerse todas

las propiedades del sistema que se va a estudiar (variables dependientes),

los factores que afectan a estas propiedades (variables independientes),

los factores que permanecerán constantes, la cantidad de experiencias a

realizarse, repeticiones y de que forma deben realizarse.

El diseño experimental permite obtener la máxima información de

un proceso de la forma más rápida, económica y simple posible. Consiste

en planificar los experimentos de manera racional, de tal modo que los

datos obtenidos puedan ser procesados adecuadamente.

Los diseños experimentales del tipo factorial se aplican cuando

existe el interés de estudiar el efecto de 2 o más factores sobre alguna

respuesta a estudiar en experiencias de laboratorio.

Los planes experimentales 3n, corresponden a diseños cuadráticos,

que se utilizan para calcular los coeficientes de modelos cuadráticos, los

cuales permiten encontrar el punto óptimo de una superficie de respuesta

(López, 1997).

INTRODUCCIÓN

16

1.5. Objetivos

1.5.1. Objetivo General

Desarrollar un sistema de interesterificación de tipo enzimático,

utilizando mezclas de materias grasas altamente hidrogenadas (“full”

hidrogenado) de origen pescado y vegetal, con aceites vegetales líquidos

para la obtención de bases grasas con adecuadas propiedades

tecnológicas y un bajo contenido de ácidos grasos trans.

1.5.2. Objetivos Específicos

• Desarrollar un proceso de interesterificación enzimática sobre la

base de materias grasas hidrogenadas y aceites líquidos en

presencia del catalizador enzimático Lipozyme TL IM.

• Optimizar el proceso de interesterificación enzimática de las

mezclas de materias grasas mediante la aplicación de un diseño

experimental, utilizando para ello la metodología de superficie de

respuesta.

• Evaluar las principales propiedades físicas y químicas de las

materias primas, las propiedades físicas de las mezclas de aceites y

de las mezclas optimizadas antes y después de la

interesterificación; así como también las propiedades tecnológicas

de las bases grasas optimizadas.

INTRODUCCIÓN

17

• Establecer un modelo matemático, asociado al comportamiento de

las mezclas, que permita formular y establecer condiciones de

proceso para obtener un producto con las cualidades físicas

buscadas.

MATERIALES Y MÉTODOS

18

II. MATERIALES Y METODOS

2.1. Materiales

2.1.1. Materias primas

• Aceite Vegetal Líquido (AVL) mezcla girasol/soja en relación

60/40, RBD.

• Aceite “full” Hidrogenado Pescado (AFHP). Origen aceite de

Salmón, RBD.

• Aceite “full” Hidrogenado Vegetal (AFHV). Mezcla girasol/soja

en relación 60/40, refinado, neutro y blanqueado.

2.1.2. Material de vidrio

• Reactor de vidrio con doble camisa de calefacción y paleta de

agitación (media luna, teflón), confeccionado especialmente para

pruebas de laboratorio a partir del modelo Novozymes. Capacidad

700 ml aproximadamente.

• Matraz Kitazato 1000 ml, pipeta graduada 20 ml, tubos de RMN,

tubos de colorímetro, matraces Erlenmeyer 250 ml, matraces

esmerilados 250 ml, tubos capilares.

2.1.3. Otros materiales de laboratorio

• Termómetro digital (precisión 0,1ºC) marca EXTECH

INSTRUMENTS, modelo 421305, termómetro certificado

A.O.C.S.


19

2.1.4. Reactivos y soluciones

• Enzima Lipasa Inmovilizada, Lipozyme TL IM ® de Novozymes.

• Hexano p.a, Merck

• Acetona p.a, Merck

2.1.5. Instrumentos y equipos de laboratorio

• Balanza granataria marca METTLER TOLEDO, modelo VIPER

SW 6.

• Balanza analítica marca SARTORIUS, modelo 1265 MD.

• Refractómetro, Karl Zeiss.

• Equipo RMN marca BRUKER, modelo Minispec pc 120 s.

• Placa calefactora con agitación marca Torrey Pines Scientific.

• Baños termoregulados marca HAAKE.

• Motor con regulador de velocidad de giro marca JANKE &

KUNKEL IKA-WERK, modelo RW 20 DZM.

• Bomba de vacío marca LEYBOLD-HERAEUS, modelo TRIVAC.

• Baño termorregulador con recirculación marca HAAKE, modelo S

fisons y cabezal modelo F3 fisons.

• Fotocolorímetro marca LOVIBOND, modelo AF710-2.

• Texturómetro Lloyd Instruments, modelo LR-5K, Hampshire,

England.

• Microscopio de luz polarizada Nikon Optiphot II con cámara

Nikon Microfelet de 35-mm.


20

2.2. Metodología

El procedimiento de reacción se adaptó a las indicaciones

establecidas por Novozymes mediante comunicación personal (Volpato,

2004).

2.2.1. Elección de las materias primas y determinación de sus

características físicas y químicas.

2.2.1.1. Elección de las materias primas

La elección de las materias primas se realizó de acuerdo a las

necesidades y disponibilidad real de la planta de materias grasas de

Nestlé Chile S.A., Fábrica Maipú.

El almacenamiento de los aceites “full” hidrogenados se realizó en

tambores de 200 L; mientras que el aceite vegetal se almacenó en envase

plástico de 20 L, cerrado, a temperatura ambiente y oscuridad.

2.2.1.2. Determinación de las características físicas y químicas de las

materias primas

La caracterización de las materias primas se efectuó mediante las

metodologías analíticas que se especifican más adelante.

Antes de realizar los análisis de caracterización de las bases grasas

“full” hidrogenadas, éstas se fundieron en estufa a 70 ºC.


21

2.2.2. Métodos de análisis

Los análisis, tanto químicos como físicos, se realizaron por

triplicado, sólo con la excepción en que se especifique otra cosa.

2.2.2.1. Parámetros físicos

• Humedad. Método Oficial AOCS Ca 2b-38, 1993.

• Punto de fusión. Método Oficial AOCS Cc 1-25, 1993.

• Contenido de Grasa Sólida (CSG), Resonancia Magnética

Nuclear Pulsante. Método Oficial AOCS Cd 16-81, 1993.

• Color. Método Oficial AOCS Cc13b-45, 1993.

• Índice de Refracción. Método Oficial AOCS 7-25, 1993.

• Curva de Compresión, equipo Universal Lloyd LR 5K

(Rodríguez et al., 2001).

• Microscopía de luz polarizada (Rousseau et al., 1996).

2.2.2.2. Parámetros químicos

• Ácidos Grasos Libres. Método Oficial AOCS Ca 5a-40,

1993.

• Jabones. Método Oficial AOCS Cc 17-79, 1993.

• Índice de Yodo. Método Oficial AOCS Cd 1-25, 1993.

• Índice de Peróxido. Método Oficial AOCS Cd 8-53, 1993.

• Determinación de Ácidos Grasos Trans por Espectroscopía

Infrarroja, método oficial AOCS Cd 14-61, 1993 y

Cromatografía Gas-Líquido (GLC), método oficial AOCS

Ce 2-66, 1993.


22

• Determinación de Perfil de Triglicéridos por Cromatografía

Líquida de Alta Resolución (HPLC). Método Oficial AOCS

Ce 5b-89, 1993.

• Determinación de Perfil de Acidos Grasos por

Cromatografía Gas-Líquido (GLC). Método Oficial AOCS

Ce 2-66, 1993.

2.2.3. Características de la enzima

La enzima utilizada fue una lipasa 1, 3 específica inmovilizada en

gel de sílice, proveniente de Thermomyces lanuginosus producida

mediante fermentación sumergida de un microorganismo de Aspergillus

oryzae genéticamente modificado. Esta enzima es producida por

Novozymes bajo el nombre de Lipozyme TL IM y se presenta como un

granulado de sílice con un tamaño de partícula entre 300 y 1000 �m.

2.3. Determinación de las variables dependientes e independientes

del diseño experimental. Optimización de las condiciones de proceso

y requerimientos de catalizador

2.3.1. Determinación de las condiciones de proceso

En esta etapa se establecieron las condiciones de proceso para el

correcto trabajo con el catalizador enzimático, aplicando los

procedimientos de la empresa proveedora de la enzima. Se determinó el

tiempo de secado de la materia prima, acondicionamiento del catalizador

enzimático, condiciones de agitación, vacío, temperatura de trabajo y


23

concentración del catalizador. Las etapas del proceso, así como las

condiciones de trabajo se resumen en el diagrama de bloques que se

presenta en la figura 4.

Junto con esto, se establecen las características físicas de la mezcla

objetivo que se espera obtener.

2.3.2. Diseño de experimentos

Establecidos el control del proceso y la caracterización de las

materias primas, se fijaron las variables y el rango dentro del cual se

estudiaría su incidencia sobre las propiedades físicas de la materia grasa.

2.3.2.1. Variables de estudio para la reacción de interesterificación

Las variables independientes establecidas para el proceso son:

• Proporción de las materias grasas a utilizar en las mezclas,

representadas como AFHP (Aceite “full” Hidrogenado Pescado) y

AFHV (Aceite “full” Hidrogenado Vegetal), establecidas como

porcentaje.

• Tiempo de reacción, establecido en horas de reacción.

El estudio del efecto que ejercen las variables, se realizó por medio

de un diseño experimental que permite integrar los distintos niveles de

estudio en un conjunto de experiencias limitadas, como una medida para

el buen aprovechamiento del tiempo de trabajo experimental y

disponibilidad de material.


24

El rango de estudio de las variables, nivel superior (1), inferior

(-1) y centro (0), fueron establecidos en base a ensayos preliminares

realizados y a literatura existente, el cual se presenta en la Tabla 2.

La Tabla 1 muestra los niveles de aplicación de las variables

independientes del estudio.

Tabla 1. Niveles de aplicación de las variables en estudio

Variable Nivel Superior

(1)

Nivel Central

(0)

Nivel Inferior

(-1)

AFH… (%) 80 50 20

Tiempo (h) 5 3 1

Los parámetros constantes del proceso se aplicaron según las

recomendaciones de los proveedores de la enzima, quienes proponen el

trabajo a 70ºC y una concentración del 4% (p/p) para el catalizador

enzimático.

2.3.2.2. Variables dependientes

Las variables dependientes consideradas como respuestas al trabajo

realizado fueron: PF y CGS a las temperaturas de 10; 21,1; 26,7; 33,3 y

37,8 de acuerdo al método AOCS Cd 16-81, 1993.

2.3.2.3. Diseño factorial fraccionario

Teniendo dos variables se obtiene un diseño factorial fraccionario

de nueve experimentos, para cada experiencia.


25

Todos los experimentos se realizaron en duplicado con el fin de

establecer la reproducibilidad de los ensayos y calcular el error

experimental sigma extremo (σ. E.).

Donde: σ. E: Sigma extremo

Y1, Y2: Repeticiones de un mismo experimento

N: Número de repeticiones

Los resultados obtenidos como respuestas se introdujeron en el

programa estadístico Statgraphics 5.0, en el cual se realizaron los análisis

de varianza destinados a conocer cual es el efecto que tienen las variables

consideradas como independientes sobre las variables dependientes. Las

diferencias significativas se consideraron a un nivel de 5% de confianza

(P<0,05).

La Tabla 2 muestra los niveles experimentales aplicados a las

variables en estudio. En esta, se presentan los números “prima” como

repeticiones de los experimentos correspondientes al diseño aplicado. La

variable AFH… indica cualquiera de las dos bases grasas utilizadas en

este estudio, base pescado con AFHP y base vegetal con AFHV.

σσσσ. E. = √√√√[��(Y1 – Y2)2] 2 ⋅⋅⋅⋅ N


26

Tabla 2. Niveles experimentales de las variables en estudio

Experimento AFH… (%) Tiempo (h)

1 y 1’ - 1 (20) - 1 (1)

2 y 2’ - 1 0 (3)

3 y 3’ - 1 1 (5)

4 y 4’ 0 (50) - 1

5 y 5’ 0 0

6 y 6’ 0 1

7 y 7’ 1 (80) - 1

8 y 8’ 1 0

9 y 9’ 1 1

2.3.2.4. Diseño de optimización

La realización de un diseño de optimización permite establecer las

variables que tuvieron un efecto significativo mayor sobre los resultados

y poder así encontrar un modelo matemático con el cual se puedan

establecer los parámetros y condiciones para elaborar un producto

determinado. A partir de esta optimización, se realizaron triplicados del

producto óptimo.

2.4. Establecimiento de los modelos matemáticos

Los resultados encontrados para las variables de respuesta fueron

procesados en el programa estadístico Statgraphics 5.0. Mediante éste se

aplicaron las funciones correspondientes a los diseños de superficie de

respuesta con la finalidad de analizar el impacto de las variables sobre los


27

resultados obtenidos, mediante análisis de varianza y la obtención de las

ecuaciones que representarán el comportamiento de cada una de ellas,

por medio de una regresión múltiple.

En la determinación del análisis de varianza, se consideró como

criterio de error, el sigma extremo, calculado a partir de las repeticiones

de los experimentos.

Luego de realizado el análisis de varianza respectivo, se obtuvieron

los coeficientes de correlación (r2) los cuales representan la proporción o

grado de ajuste de los datos al modelo obtenido.

Finalmente se presentan los modelos obtenidos que presentaron

los mejores ajustes y un efecto significativo sobre los resultados a un

nivel del 5% de significación (P<0,05).

2.4.1. Obtención del producto óptimo

Las respuestas entregadas por los modelos matemáticos fueron

analizadas comparándolas con los resultados experimentales obtenidos.

Se utilizaron estos modelos para estimar las condiciones de trabajo

necesarias para disminuir el tiempo de reacción y encontrar las

proporciones de bases full hidrogenadas que, al trabajarlas en distintas

proporciones, entreguen valores de PF y CSG cercanos a los establecidos

como estándar.


28

2.5. Caracterización del producto óptimo

Con el propósito de visualizar los cambios experimentados por las

mezclas de las materias primas utilizadas en el proceso de

interesterificación, se compararon las mezclas de los productos

optimizados sin reacción contra los productos optimizados con reacción.

Con este fin se estudiaron los parámetros PF, CSG, respuesta frente a

ensayos de compresión y estructura de la red cristalina por

microfotografías de luz polarizada y perfil de TAG.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

29

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. Determinación de las características físicas y químicas de las

materias primas.

En la Tabla 3 se presentan los resultados de los análisis físicos y

químicos de las materias primas utilizadas en la reacción de

interesterificación.

Tabla 3. Resultados de análisis físicos y químicos de las materias primas.

AVL AFHV AFHP Análisis x ± DS x ± DS x ± DS

Í. Refracción (40ºC) 1,4651 0 1,4639 0 1,4515 0 AGL ( % ác. oleico) 0,04 0,01 0,67 0,02 0,47 0,04 Jabón 0 0 0 Color (5 ¼") Lovibond 35 / 2,8 18 / 2,0 35 / 4,0 Índice de Yodo 128* 5,9 9,4 Índice de Peróxidos (mEqO2/Kg) 1,44 0,08 O,98 0,07 1,22 0,08 AGT (IR) (%) 2,96 0,62 4,28 0,21 6,46 0,19 Punto de Fusión (ºC) - 66,7 0,05 56 0,05 CSG (RMN) (%)

10 ºC 4,5 96,4 94,2 21,1 ºC 2,3 95,8 92,6 26,7 ºC 0 95,7 92,4 33,3 ºC 0 96,1 91,6 37,8 ºC 0 95,7 88,7

* calculado de acuerdo a la composición en ácidos grasos determinada por GLC

Las bases grasas con alto nivel de saturación ó bajo nivel de índice

de yodo presentaron valores de punto de fusión superior a 45 ºC, por lo

que no representarían un alimento comestible de acuerdo al Reglamento

Sanitario de los Alimentos (2000). Sin embargo, podrían ser utilizadas

como materias primas para la producción de otros alimentos.


30

Los parámetros de calidad tales como son humedad, AGL e índice

de peróxidos, se encuentran dentro de los valores recomendados por el

proveedor de la enzima, cumpliendo con los requerimientos para ser

utilizadas en la reacción de interesterificación. Los valores estimados por

parte de Novozymes para estos parámetros son:

• AGL (%): lo mas bajo posible.

• I.P: < 2 mEq de oxigeno peróxido/kg de grasa.

• Humedad: < 0,05%

El cumplimiento de estas condiciones permite evitar la reacción

entre el sitio activo de la enzima y compuestos de oxidación secundarios.

Por otro lado, se evita la hidrólisis de los ácidos grasos y por consiguiente

el aumento de la acidez en el producto final.

Finalmente, el contenido de AGT, medido por espectroscopía

infrarroja indica valores levemente superiores para las grasas “full”

hidrogenadas en comparación con el aceite vegetal líquido.

La Tabla 4 muestra la composición en ácidos grasos de las

materias primas utilizadas en el estudio.


31

Tabla 4. Composición de ácidos grasos de las materias primas (% ésteres metílicos).

Ac. Grasos AVL AFHP AFHV

% ésteres metílicos

C 12:0 Ac. Láurico 0,00 0,09 0,00

C 14:0 Ac. Mirístico 0,23 5,36 0,44

C 15:0 Ac. Pentadecanoico 0,88 0,56 0,09

C 16:0 Ac. Palmítico 8,50 24,34 8,53

C 18:0 Ac. Esteárico 4,53 33,06 87,25

C 20:0 Ac. Araquídico 0,31 13,32 0,89

C 22:0 Ac. Behénico 0,54 17,18 1,04

C 24:0 Ac. Lignocérico 0,20 1,28 0,27

Total Saturados 15,20 95,18 98,50

C 16:1 Ac. Palmitoleico 0,83 0,70 0,12

C 18:1 t (w 9) Ac. Eláidico 0,77 0,69 0,58

C 18:1 c (w 9) Ac. Oleico 22,19 0,26 0,42

C 20:1 c Ac. Eicosaenoico 0,20 0,44 0,00

C 22:1 Ac. Docosaenoico 0,00 0,58 0,00

Total Monoinsaturados 23,98 2,67 1,11

C 18:2 Ac Octadecadienoico (trans-9, trans-12) 0,10 0,40 0,00

C 18:2 Ac Octadecadienoico (cis-9, trans-12) 0,63 0,00 0,00

C 18:2 Ac Octadecadienoico (trans-9, cis-12) 0,11 0,00 0,00

C 18:2 Ac. Octadecadienoico (cis-9, cis-12) 56,44 0,20 0,39

C 18:3 Ac. Octadecatrienoico (cis,cis,cis -9,12,15) 3,27 0,00 0,00

Total Poliinsaturados 60,55 0,59 0,39

No identificados 0,27 1,55 0,00

Total 100,0 100,0 100,0

Total AGT 1,61 1,09 0,58


32

El ácido graso presente en mayor proporción en AFHV es el ácido

esteárico (18:0) seguido del ácido palmítico (16:0), representando ambos

el 90% del total de ácidos grasos saturados. Para el caso de AFHP, se

suman a los mencionados anteriormente, valores altos de ácido

araquídico (20:0) y ácido behénico (22:0), aportando todos ellos, cerca

del 90% de los ácidos grasos saturados. Por el contrario, AVL presenta

un grado de saturación bastante bajo (15,2%) representado

principalmente por el ácido palmítico y el ácido esteárico. Dentro de los

ácidos grasos monoinsaturados y poliinsaturados de AVL, el ácido oleico

(18:1, w9) y ácido linoleico (18:2, w6), respectivamente, son los que se

encuentran en mayor porcentaje.

Los valores de AGT de las materias primas determinados por GLC

se encuentran en un rango entre 0,5 y 2%, menores a los encontrados por

IR, con una diferencia cercana a los 4 puntos porcentuales.

En el Gráfico 1 se muestran las curvas de CSG para las materias

primas en función de la temperatura a partir de los resultados presentados

en la Tabla 3.


33

0102030405060708090

100

10 15 20 25 30 35 40

Temperatura (ºC)

CS

G (

%)

AFHP AFHV AVL

Gráfico 1. CSG para las materias primas en función de la temperatura.

A partir del Gráfico 1 es posible observar una tendencia plana en el

rango de temperaturas para CSG en las tres materias primas utilizadas en

este estudio. Así, AFHP se comporta como una grasa levemente más

“blanda” que AFHV, lo que coincide con su menor valor de PF. En este

sentido, el comportamiento del contenido de sólidos se podría explicar

por la morfología de la red cristalina asociada a la estructura propia de

cada base hidrogenada, donde los cristales con morfología definida se

distribuyen de una forma más ordenada (como es en el caso de AFHV)

provocando así una estructuración más fuerte. Una forma no definida,

como en AFHP, provoca la estructuración de una red cristalina más débil

y por lo tanto más fácil de romper que AFHV. En adelante es posible

observar la estructura de la red cristalina mediante el análisis de

microfotografías de luz polarizada.


34

El aceite vegetal líquido (AVL), como se esperaría, no presenta PF

ni tampoco un contenido de sólidos apreciable, aunque es posible

observar un pequeño porcentaje a las temperaturas más bajas de

medición de CSG (10 y 21,1ºC) debido a la presencia de ácidos grasos

saturados (15,2%).

Como se verá más adelante, la tendencia plana que presentan las

curvas de sólidos de las materias primas se mantiene en la mezcla antes y

después de la interesterificación, otorgando un comportamiento

característico de la curva de sólidos dependiendo de la tendencia de las

materias primas.

En cuanto a la presencia de sólidos en AVL a las temperatura mas

bajas de medición de CSG, Grimaldi et al. (1998) midieron CSG en

muestras de aceites vegetales hidrogenados, utilizados como base para la

fabricación de margarinas, mediante los métodos AOCS y IUPAC. A

partir de sus resultados, encontraron que los valores obtenidos por el

método IUPAC fueron mayores que los obtenidos por el método AOCS,

sólo a las temperaturas de 10 y 21,1 °C, por lo que los valores

encontrados en esta medición podrían ser mas bajos cuando se aplica el

método IUPAC.

3.2. Determinación de las condiciones de proceso

3.2.1. Etapas para la realización de la reacción de interesterificación

• Montaje total del equipamiento requerido, ajuste de temperatura de

trabajo y condiciones de agitación (Figura 5).


35

• Llenado de reactor con 500 g de AVL, acondicionado a una

temperatura de 70ºC.

• Dosificación de enzima a utilizar para las reacciones de

interesterificación. Dicha cantidad fue de 20 g.

• Acondicionamiento de la enzima con AVL. Esta etapa tiene como

objetivo remover aire y humedad (� 5%) contenidos en el gel de

sílica. La ausencia de este paso provoca un aumento de acidez en

el producto. Este acondicionamiento inicial se llevó a cabo por 30

minutos de agitación a 300 rpm y 70 °C, y fue repetido en tres

ocasiones. En total fueron realizados cuatro acondicionamientos.

• Finalizada la etapa de acondicionamiento de la enzima, se procedió

a evacuar el contenido del reactor mediante filtración con retención

solo de la enzima inmovilizada, para luego agregar la primera

mezcla a interesterificar en cantidad de 500 g. La reacción se llevó

a cabo por 5 horas seguidas a 300 rpm de agitación y 70 °C, y se

tomaron muestras a tiempo 1, 3 y 5 horas para luego realizar los

análisis respectivos de CSG y PF. Para la toma de muestras fue

necesario detener la agitación del sistema con el fin de decantar

totalmente la enzima y evitar mediciones inapropiadas. La toma de

muestra fue realizada mediante pipeta graduada de 10 ml.

3.2.2. Diagrama de bloque

En la Figura 4 se muestra el diagrama de bloque para la reacción

de interesterificación y las condiciones necesarias para el

funcionamiento.


36

Figura 4. Diagrama de bloque para la reacción de interesterificación.

3.2.3. Esquema del sistema de reacción

A continuación, la Figura 5 muestra el esquema del sistema de

reacción utilizado en la reacción de interesterificación a nivel de

laboratorio.

AFHP / AFHV (20%, 50% y 80%) AVL (80%, 50% y 20%)

Carga de reactor 20 g enzima, 500 g AVL para acondicionamiento de enzima (70 °C, 300 rpm y 30 min.)

Análisis CSG, PF, AGT y otros

Mezcla materias primas (70-80 °C)

Descarte AVL acondicionamiento. Carga con 500 g mezcla de reacción.

Reacción de Interesterificación 70 °C, 300 rpm y 4% enzima (1, 3 y 5 horas de reacción)


37

Figura 5. Esquema del sistema de reacción de interesterificación a nivel de laboratorio.

3.3. Características del producto objeto

Es primordial plantearse un producto objeto antes de conocer los

resultados obtenidos y así tener una base comparativa entre lo que se

espera y lo que se obtiene a partir de los cambios producidos en la

reacción enzimática. Es así como en la Tabla 5 se muestran las

condiciones óptimas para una materia grasa comercial. Estas condiciones

representan el CSG a diferentes temperaturas de manipulación y

Matraz receptor

Motor agitador

Baño termorregulador

Reactor enzimático

Bomba de vacío


38

almacenamiento, y el PF para una materia grasa estándar para la

producción de margarinas.

Tabla 5. Condiciones óptimas para una materia grasa comercial.

Temp. (ºC) CSG (%)

10 54-59

21,1 33-38

26,7 23-26

33,3 9-12

37,8 0-3

PF(ºC) 35-37

3.4. Resultados del diseño experimental

3.4.1. Características de la combinación de materias primas en los

niveles de diseño aplicado.

En las tablas 6 y 7, se muestran las características físicas iniciales

de las mezclas a las que se les aplicó el diseño experimental. Con estas

mezclas, se puede realizar una comparación entre la mezcla inicial y la

mezcla obtenida luego de la reacción de interesterificación.


39

Tabla 6. Características físicas iniciales de la mezcla AFHP/AVL en diferentes proporciones.

AFHP/AVL

20/80 50/50 80/20 T (ºC)

CSG (%)

10 21,1 51,4 77,6

21,1 20,1 48,9 76,8

26,7 18,8 46,7 74,5

33,3 16,0 43,2 70,8

37,8 13,0 38,9 67,8

PF (ºC) 47,9 51,8 54,5

Tabla 7. Características físicas iniciales de la mezcla AFHV/AVL en diferentes proporciones.

AFHV/AVL

20/80 50/50 80/20 T (°C)

CSG (%)

10 22,2 52,0 78,3

21,1 21,7 51,3 79,6

26,7 20,7 49,8 78,1

33,3 18,4 47,0 75,9

37,8 15,8 43,5 73,7

PF (ºC) 58,2 63,4 66,3


40

3.4.2. Diseño factorial bidimensional en tres niveles (32).

En la Tabla 8 se muestran los resultados asociados al diseño

factorial bidimensional en tres niveles, realizado con una repetición para

la mezcla AFHP/AVL en diferentes proporciones y tiempos de reacción.

Tabla 8. Resultados de experimento 32, en base pescado con interesterificación.

Matriz de diseño PF (ºC) CSG (%)

Exp. AFHP (%) tiempo (h) x ± D.S. 10ºC 21,1ºC 26,7ºC 33,3ºC 37,8ºC

1a 20 1 47,9 0,06 22,1 19,0 17,3 13,6 10,1 1b 20 1 47,1 0,15 22,9 19,3 17,6 13,2 10,1 2a 50 1 51,8 0,06 52,2 46,2 42,6 37,6 32,8 2b 50 1 50,7 0,20 52,8 46,9 43,4 38,8 33,9 3a 80 1 54,5 0,00 77,4 76,8 73,6 68,4 64,4 3b 80 1 53,6 0,06 74,8 74,1 70,9 65,7 61,4 4a 20 3 45,5 0,01 21,6 16,7 14,6 10,4 7,0 4b 20 3 45,0 0,00 19,5 15,6 14,5 11,2 8,0 5a 50 3 49,3 0,10 45,5 42,9 36,6 29,8 24,6 5b 50 3 49,5 0,10 47,6 43,8 38,7 32,7 27,4 6a 80 3 53,5 0,20 76,9 76,6 72,7 65,2 60,0 6b 80 3 53,2 0,00 74,0 73,1 69,8 62,3 57,0 7a 20 5 43,9 0,00 19,5 14,6 11,7 7,9 4,4 7b 20 5 43,9 0,10 17,6 13,1 11,9 8,9 6,2 8a 50 5 47,7 0,11 43,4 38,3 31,8 23,8 19,5 8b 50 5 48,4 0,20 44,8 41,0 34,5 27,7 22,4 9a 80 5 53,2 0,00 77,4 75,6 71,9 62,6 56,4 9b 80 5 52,8 0,15 73,8 71,1 68,4 59,5 53,4

a y b representan las repeticiones de cada experimento.


41

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

10 15 20 25 30 35 40

T (ºC)

CS

G (

%)

Exp 1a

Exp 1b

Exp 2 a

Exp 2 b

Exp 3 a

Exp 3 b

Exp 4 a

Exp 4 b

Exp 5a

Exp 5b

Exp 6 a

Exp 6 b

Exp 7a

Exp 7b

Exp 8 a

Exp 8 b

Exp 9 a

Exp 9 b

Gráfico 2. CSG para las mezclas con base pescado interesterificadas, en función de la temperatura.

Del gráfico Nº 2, es posible apreciar el cambio del contenido de

sólidos grasos (CSG) en las mezclas con base pescado (AFHP, AVL),

trabajadas con el fin de realizar la optimización del proceso de

interesterificación. Las tendencias de las curvas son, en la mayoría de los

casos, paralelas entre ellas y presentan una desviación mayor a los 37,8 ºC

de medición del CSG.

En la Tabla 9 se muestran los resultados para la mezcla en base

vegetal (AFHV/AVL) en diferentes proporciones y tiempos de reacción.


42

Tabla 9. Resultados del diseño 32, en base vegetal con interesterificación.

Matriz de diseño PF (ºC) CSG (%)

Exp. AFHV (%)

tiempo (h) x ± D.S. 10ºC 21,1ºC 26,7ºC 33,3ºC 37,8ºC

1a 20 1 55,0 0,10 20,9 21,2 19,6 17,2 14,2 1b 20 1 58,2 0,06 22,2 21,7 20,7 18,4 15,8 2a 50 1 62,7 0,06 46,4 49,6 47,4 43,2 38,9 2b 50 1 63,1 0,00 49,2 50,8 49,2 45,4 42,3 3a 80 1 65,2 0,06 78,1 80,3 79,0 75,8 72,8 3b 80 1 65,1 0,00 77,5 79,7 78,5 75,9 73,0 4a 20 3 53,0 0,11 16,4 16,6 15,3 12,9 9,9 4b 20 3 55,5 0,15 15,5 18,3 16,5 14,0 11,7 5a 50 3 60,9 0,20 43,6 48,3 42,9 37,1 31,7 5b 50 3 62,2 0,11 47,3 50,8 48,6 43,8 40,0 6a 80 3 64,8 0,00 78,3 77,6 80,3 73,6 69,3 6b 80 3 64,8 0,00 77,8 80,4 79,6 74,9 71,6 7a 20 5 50,5 0,11 14,3 12,4 10,7 8,3 6,1 7b 20 5 52,4 0,20 14,7 15,5 13,9 11,0 9,1 8a 50 5 59,1 0,15 42,2 47,5 40,1 33,4 28,3 8b 50 5 61,8 0,06 46,8 50,3 47,2 41,9 37,0 9a 80 5 64,4 0,06 79,6 76,5 81,2 71,7 66,5 9b 80 5 64,3 0,10 77,6 77,1 80,1 73,3 69,4

a, b representan las repeticiones de cada experimento

Del gráfico Nº 3, es posible apreciar el cambio del CSG en las

mezclas con base vegetal, trabajadas con el fin de realizar la optimización

del proceso de interesterificación. Las tendencias de las curvas son, en la

mayoría de los casos, paralelas entre ellas y presentan una desviación

mayor a los 37,8 ºC de medición del contenido de sólidos grasos. Los

cambios más favorables se aprecian a concentraciones del 50% de AFHV.


43

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

10 15 20 25 30 35 40

T ("C)

CS

G (%

)

Exp 1a

Exp 1b

Exp 2a

Exp 2b

Exp 3a

Exp 3b

Exp 4a

Exp 4b

Exp 5a

Exp 5b

Exp 6a

Exp 6b

Exp 7a

Exp 7b

Exp 8a

Exp 8b

Exp 9a

Exp 9b

Gráfico 3. CSG para las mezclas con base vegetal Interesterificada, en función de la temperatura.

3.4.3. Análisis estadístico de las respuestas del diseño 32

En este punto se presenta un resumen de los resultados de los

análisis de varianza (ANOVA) aplicados a las respuestas, con el objetivo

de conocer el efecto de las variables independientes.

En el Anexo 1 se presentan las tablas de ANOVA individuales,

con los efectos no significativos eliminados, de manera de obtener el

coeficiente de correlación (r2) que corresponde a cada ajuste.


44

Tabla 10. Resumen de valores P y F del análisis ANOVA aplicado a la respuesta del diseño en base pescado. Pto.Fusión CSG 10°C CSG 21,1°C CSG 26,7°C CSG 33,3°C CSG 37,8°C

Efectos F P F P F P F P F P F P

A % AFHP 2256,5 0,0000 2197,2 0,0000 3843,6 0,0000 2423,7 0,0000 1588,7 0,0000 1760,9 0,0000 B tiempo 167,4 0,0000 13,2 0,0039 25,8 0,0004 26,0 0,0003 34,5 0,0001 47,5 0,0000

AA 0,0 0,8673 0,2 0,6964 7,9 0,0170 24,9 0,0004 24,2 0,0005 37,2 0,0001 AB 29,6 0,0002 1,4 0,2567 1,9 0,1913 1,6 0,2337 0,1 0,7649 1,2 0,3066 BB 0,3 0,6180 0,5 0,5016 0,0 0,8884 0,0 0,8830 0,1 0,7512 0,3 0,5915 r2 0,9955 0,9951 0.9972 0,9956 0,9934 0,9941

Tabla 11. Resumen de valores P y F del análisis ANOVA aplicado a la respuesta del diseño en base vegetal. Pto.Fusión CSG 10°C CSG 21,1°C CSG 26,7°C CSG 33,3°C CSG 37,8°C

Efectos F P F P F P F P F P F P

A % AFHV 1667,7 0,0000 36658,3 0,0000 6111,5 0,0000 19225,7 0,0000 19525,4 0,0000 15389,7 0,0000

B tiempo 50,8 0,0000 67,0 0,0000 22,8 0,0006 28,7 0,0002 124,3 0,0000 142,7 0,0000

AA 185,5 0,0000 1,2 0,3017 16,2 0,0020 1,8 0,2018 0,0 0,9139 4,2 0,0655

AB 19,4 0,0011 73,2 0,0000 3,9 0,0729 65,0 0,0000 15,2 0,0025 2,2 0,1647

BB 0,0 0,9730 10,0 0,0091 0,1 0,2893 0,2 0,6842 0,0 0,8797 0,0 0,9064

r2 0,9943 0,9997 0,9982 0,9994 0,9994 0,9993

En estas tablas 10 y 11, los valores de P<0,05 y F>4 indican efecto

significativo de las variables sobre las respuestas.

De acuerdo a este análisis se tiene que ambas variables, % aceite

“full” hidrogenado y tiempo de reacción, ejercen un efecto significativo

sobre los resultados. De esta forma es como llegan a establecerse los

modelos matemáticos correspondientes a cada respuesta, considerando

aquellas variables o combinación de variables que tengan un efecto

significativo en las respuestas del diseño.


45

3.5. Establecimiento de los modelos matemáticos

A continuación se presentan los modelos matemáticos y los

coeficientes de correlación (r2) que han sido calculados para cada una de

las ecuaciones mostradas, donde A1=%AFHP, A2=%AFHV y B=Tiempo

de reacción (h). La entrada de datos debe realizarse en forma absoluta, es

decir, con el valor numérico correspondiente válido para un rango de

trabajo entre 20 y 80% de AFHP o AFHV, un tiempo de 1 a 5 horas de

reacción, y en condiciones de trabajo de 70ºC y 4% de catalizador

enzimático.

Modelo para la Mezcla Optimizada Base Pescado (MOBP).

P.F = 45,7465 + 0,1055�(A1) - 1,0146�(B) + 0,0094�(A1)�(B) r2 = 0,9954

CSG 10ºC = 5,2153 + 0,9197�(A1) - 1,0708�(B) r2 = 0,9941

CSG 21,1ºC = 4,6287 + 0,7157�(A1) - 1,1917�(B) + 0,00254�(A1)2 r2 = 0,9967

CSG 26,7ºC = 8,9722 + 0,3908�(A1) - 1,4667�(B) + 0,00553�(A1)2 r2 = 0,9949

CSG 33,3ºC = 9,1236 + 0,2542�(A1) - 1,9542�(B) + 0,00631�(A1)2 r2 = 0,9932

CSG 37,8ºC = 8,3259 + 0,1374�(A1) - 2,1�(B) + 0,00715�(A1)2 r2 = 0,9933


46

Modelo para la Mezcla Optimizada Base Vegetal (MOBV).

P.F = 47,1366 + 0,5168�(A2) - 1,1208�(B) - 0,00365�(A2)2 +0,0125�(A2)�(B) r2 = 0,9943

CSG 10ºC = 4,1854 + 0,9363�(A2) - 3,3625�(B) + 0,0279�(A2)�(B) + 0,2188�(B)2 r2 = 0,9997

CSG 21,1ºC = -2,6028 + 1,2744�(A2) - 1,725�(B) + 0,0158�(A2)�(B) - 0,00303�(A2)2 r2 = 0,9982

CSG 26,7ºC = 2,3236 + 0,9510�(A2) - 2,5125�(B) + 0,0379�(A2)�(B) r2 = 0,9993

CSG 33,3ºC = -0,6271 + 0,9612�(A2) - 2,0771�(B) + 0,0173�(A2)�(B) r2 = 0,9994

CSG 37,8ºC = -3,1333 + 0,8978�(A2) - 1,4333�(B) + 0,000944�(A2)2 r2 = 0,9992

En las tablas 12 y 13 que se presentan a continuación, se muestra

la comparación de datos experimentales y calculados a partir del modelo

para la base pescado y vegetal respectivamente.


47

Tabla 12. Comparación entre las respuestas del modelo matemático y las respuestas experimentales para la base pescado.

RESPUESTAS VARIABLES PF (ºC) CSG 10ºC CSG 21,1ºC CSG 26,7ºC CSG 33,3ºC CSG 37,8ºC

Exp. AFHP (%)

Tiempo (h) Exp. Mod. Exp. Mod. Exp. Mod. Exp. Mod. Exp. Mod. Exp. Mod.

1a 20 1 47,9 22,1 19,0 17,3 13,6 10,1 1b 20 1 47,1

47,0 22,9

22,5 19,3

18,8 17,6

17,5 13,2

14,8 10,1

11,8

2a 50 1 51,8 52,2 46,2 42,6 37,6 32,8 2b 50 1 50,7

50,5 52,8

50,1 46,9

45,6 43,4

40,9 38,8

35,7 33,9

31,0

3a 80 1 54,5 77,4 76,8 73,6 68,4 64,4 3b 80 1 53,6

53,9 74,8

77,7 74,1

77,0 70,9

74,2 65,7

67,9 61,4

63,0

4a 20 3 45,5 21,6 16,7 14,6 10,4 7,0 4b 20 3 45,0

45,8 19,5

20,4 15,6

16,4 14,5

14,6 11,2

10,9 8,0

7,6

5a 50 3 49,3 45,5 42,9 36,6 29,8 24,6 5b 50 3 49,5

49,4 47,6

48,0 43,8

43,2 38,7

37,9 32,7

31,8 27,4

26,8

6a 80 3 53,5 76,9 76,6 72,7 65,2 60,0 6b 80 3 53,2

53,4 74,0

75,6 73,1

74,6 69,8

71,2 62,3

64,0 57,0

58,8

7a 20 5 43,9 19,5 14,6 11,7 7,9 4,4 7b 20 5 43,9

43,7 17,6

18,3 13,1

14,0 11,9

11,7 8,9

7,0 6,2

3,4

8a 50 5 47,7 43,4 38,3 31,8 23,8 19,5 8b 50 5 48,4

48,3 44,8

45,9 41,0

40,8 34,5

35,0 27,7

27,9 22,4

22,6

9a 80 5 53,2 77,4 75,6 71,9 62,6 56,4 9b 80 5 52,8

52,9 73,8

73,4 71,1

72,2 68,4

68,4 59,5

60,7 53,4

54,6


48

Tabla 13. Comparación entre las respuestas del modelo matemático y las respuestas experimentales para la base vegetal.

RESPUESTAS VARIABLES PF (ºC) CSG 10ºC CSG 21,1ºC CSG 26,7ºC CSG 33,3ºC CSG 37,8ºC

Exp. AFHV (%)

Tiempo (h) Exp. Mod. Exp. Mod. Exp. Mod. Exp. Mod. Exp. Mod. Exp. Mod.

1a 20 1 55,0 20,9 21,2 19,6 17,2 14,2 1b 20 1 58,2

55,1 22,2

20,3 21,7

19,3 20,7

19,6 18,4

16,9 15,8

13,5

2a 50 1 62,7 46,4 49,6 47,4 43,2 38,9 2b 50 1 63,1

63,4 49,2

49,3 50,8

52,6 49,2

49,3 45,4

46,2 42,3

43,3

3a 80 1 65,2 78,1 80,3 79,0 75,8 72,8 3b 80 1 65,1

65,0 77,5

78,2 79,7

80,4 78,5

78,9 75,9

75,6 73,0

73,0

4a 20 3 53,0 16,4 16,6 15,3 12,9 9,9 4b 20 3 55,5

53,4 15,5

16,5 18,3

17,3 16,5

16,1 14,0

13,4 11,7

10,6

5a 50 3 60,9 43,6 48,3 42,9 37,1 31,7 5b 50 3 62,2

62,4 47,3

47,1 50,8

50,6 48,6

48,0 43,8

43,8 40,0

40,4

6a 80 3 64,8 78,3 77,6 80,3 73,6 69,3 6b 80 3 64,8

64,8 77,8

77,7 80,4

78,4 79,6

80,0 74,9

74,2 71,6

70,2

7a 20 5 50,5 14,3 12,4 10,7 8,3 6,1 7b 20 5 52,4

51,7 14,7

14,4 15,5

15,3 13,9

12,6 11,0

9,9 9,1

7,8

8a 50 5 59,1 42,2 47,5 40,1 33,4 28,3 8b 50 5 61,8

61,4 46,8

46,6 50,3

48,6 47,2

46,8 41,9

41,4 37,0

37,5

9a 80 5 64,4 79,6 76,5 81,2 71,7 66,5 9b 80 5 64,3

64,5 77,6

78,9 77,1

76,4 80,1

81,0 73,3

72,8 69,4

67,3

3.6. Condiciones de obtención del producto óptimo

En la Tabla 14, se resumen las condiciones de reacción que debe

cumplir las combinaciones de AFHP/AVL y AFHV/AVL respectivamente

para lograr el producto óptimo para aplicaciones industriales en base a

resultados obtenidos a partir de la metodología de superficie de respuesta

(ANEXO 2).


49

Tabla 14. Condiciones experimentales para el producto óptimo en base pescado y base vegetal.

% AFHP Tiempo (h) % Enzima Temperatura (ºC)

43,9 5 4 70

% AFHV Tiempo (h) % Enzima Temperatura (ºC)

36,8 5 4 70

3.7. Caracterización del producto óptimo.

3.7.1. Análisis del producto óptimo con y sin interesterificación.

3.7.1.1. Análisis comparativo del producto óptimo con respecto al

estándar establecido.

En la Tabla 15 se muestra el CSG y el PF a las diferentes

temperaturas de medición para las mezclas con base pescado sin

interesterificación (MOBP) y con interesterificación (MOBPI), así como

también para las mezclas con base vegetal sin interesterificación

(MOBV) y con interesterificación (MOBVI).

Como se puede apreciar, en todos los casos el PF excede la

normativa del Reglamento Sanitario de los Alimentos, que se establece

en 45 ºC para mantecas modificadas, pero queda abierta la posibilidad de

ser utilizada como materia prima para su utilización en otros alimentos.


50

Tabla 15. CSG y PF para la mezcla optimizada en base pescado y base vegetal.

CSG (%)

T (ºC) MOBP MOBPI MOBV MOBVI

10 46,2 38,2 39,1 29,9

21,1 42,9 34,1 39,2 32,5

26,7 41,1 27,2 37,6 26,3

33,3 37,7 21,4 34,5 22,6

37,8 33,4 16,5 31,7 18

PF (ºC) 51,3 47,5 61,0 56,9

En los gráficos 4 y 5 se presentan las tendencias en el CSG para las

mezclas optimizadas comparadas con el estándar asumido. El estándar se

presenta en el gráfico como “Optimo”, con el fin de tener una visión de

lo que se tiene y de lo que se busca.

01020304050

60708090

100

10 15 20 25 30 35 40

Temperatura (°C)

CSG

(%)

MOBP PF=51,3°C MOBPI PF=47,5°C Estándar PF=36°C

Gráfico 4. CSG para las mezclas optimizadas con base pescado en función de la temperatura.


51

0102030405060708090

100

10 15 20 25 30 35 40

Temperatura (°C)

CSG

(%)

MOBV PF=61°C MOBVI PF=56,9°C Estándar PF=36°C

Gráfico 5. CSG para las mezclas optimizadas con base vegetal en función de la temperatura.

Como se puede observar, en ambos casos la tendencia de la curva

de CSG es “plana” en comparación con la curva estándar y las mezclas

con interesterificación se comportan de forma “paralela” a las mezclas

sin interesterificar, es decir, se comportan de forma similar a sus materias

primas. El resultado del análisis de CSG por RMN para las mezclas

interesterificadas muestra que a mayores temperaturas de medición, se

produce una marcada disminución del porcentaje de sólidos con respecto

a las mezclas sin reacción. Una tendencia más inclinada reportó

Rodríguez et al., (2001) para la interesterificación química de una mezcla

sebo/aceite de girasol, debido a que el sebo es una materia grasa

naturalmente saturada.

En ambos casos (base pescado y base vegetal) el contenido de

sólidos grasos a las temperaturas de 21,1 y 26,7 ºC para las mezclas

interesterificadas, se encuentra muy cercano a lo establecido como


52

estándar, encontrándose cerca del rango de 33-38 % y 23-26 % para las

temperaturas antes mencionadas. En este sentido, Zhang et al., (2001) en

mezcla de estearina de palma y aceite de coco, encontraron curvas

excepcionales que muestran un rango de sólidos desde un 60,3 % a 10 ºC,

hasta menos de 0,5 % a 40 ºC. Gamboa y Gioielli (2003) trabajaron con

aceite de pescado y grasa de palmiste, indicando que un contenido de

sólidos no superior a 32 % a la temperatura de 10 ºC es imprescindible

para garantizar un comportamiento ideal de esparcimiento a la

temperatura de refrigeración.

Con respecto al cambio en el PF, se logró una disminución

cercana a 4 grados luego de la reacción enzimática tanto para MOBP

como para MOBV. Los resultados se alejan bastante del estándar

estimado de 36 ºC, además de no cumplir con los valores establecidos por

el Reglamento Sanitario de los Alimentos (2000) para una grasa

comercial.

3.7.1.2. Análisis de las características texturales por medio del

ensayo de compresión a los productos optimizados.

Mediante este análisis se pretende estudiar las propiedades de

textura para los productos óptimos de las bases pescado y vegetal, con y

sin reacción de interesterificación, mediante curvas de compresión a

velocidad constante. De estas curvas es posible obtener información tal

como fuerza de ruptura, cohesividad y elasticidad (Rodríguez et al.,

2001).


53

Los ensayos de compresión fueron realizados a temperatura

ambiente de aproximadamente 25ºC con un acondicionamiento o período

de cristalización de 24 horas.

Los gráficos 6 y 7 presentan las curvas de compresión de las

mezclas óptimas con y sin interesterificación. La pendiente inicial que

presentan las curvas, muestran la deformación elástica no recuperable de

las grasas. La zona redondeada que sigue a la pendiente inicial representa

el comportamiento viscoso de las muestras (de Man et al., 1991).

La fuerza de ruptura para MOBP fue de 4,1 N aproximadamente,

mientras que para MOBPI fue de 3,5 N. Por otro lado, para la mezcla

óptima con base vegetal la fuerza de ruptura fue de 3,9 N para MOBV

aproximadamente, mientras que MOBVI no mostró fuerza de ruptura. Es

posible apreciar de su gráfica el cambio en los parámetros texturales de

las bases grasas, pasando de un estado “quebradizo” a un estado más

plástico, requerido al momento del uso de emulsionantes.


54

0

4

8

12

16

20

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Deformación (mm)

Fuer

za (N

)

MOBAI MOBA

Gráfico 6. Curvas de compresión para la mezcla óptima en base pescado sin interesterificar (MOBP) y con interesterificación (MOBPI).

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Deformación (mm)

Fuer

za (N

)

MOBVI MOBV

Gráfico 7. Curvas de compresión para la mezcla óptima en base vegetal sin interesterificar (MOBV) y con interesterificación (MOBVI).


55

Tabla 16. Parámetros texturales de las mezclas óptimas en base pescado y base vegetal.

Mezcla Fuerza Ruptura (N)

Cohesividad (mm)

Elasticidad (N/mm)

MOBV 3,92 5,09 0,77 MOBVI - - - MOBP 4,11 0,75 5,48 MOBPI 3,51 1,17 2,99

La Tabla 16 muestra los resultados de fuerza de ruptura,

cohesividad y elasticidad para las mezclas óptimas en base vegetal sin

interesterificar (MOBV) y con interesterificación (MOBVI), así como

también para las mezclas óptimas en base pescado sin interesterificar

(MOBP) y con interesterificación (MOBPI). La cohesividad representa la

deformación a la cual se produce la fuerza de ruptura, mientras que la

elasticidad se ve representada por la pendiente inicial de la curva, antes

de aplicada la fuerza de ruptura.

Se puede observar que en las mezclas con base pescado, la

elasticidad es alta comparada con la mezcla vegetal, esto se podría deber

a la morfología de los cristales en la red cristalina, la cual es menos

definida para las mezclas con base pescado. En la base vegetal en

cambio, se ve una elasticidad baja para la mezcla sin interesterificar y en

la mezcla interesterificada no es posible apreciar este parámetro,

comportándose como una mezcla viscosa por no presentar fuerza de

ruptura ni deformación.


56

3.7.1.3. Análisis de microscopía de luz polarizada

Por medio de este análisis se realizaron microfotografías a la

estructura cristalina de las materias grasas correspondientes a materias

primas y productos optimizados con y sin reacción de interesterificación.

La preparación de las muestras se lleva a cabo colocando una gota

de la materia grasa sobre un porta objetos, calentando hasta fusión total y

luego superponiendo un cubre objeto sobre la superficie presionando

firmemente.

La amplificación visual fue de 10X y 40X mientras que el tiempo

de exposición fue de 20-40 segundos a una temperatura aproximada de

5ºC (Rousseau et al., 1996b).

En esta sección se discuten las fotografías realizadas con un

aumento de 10X. Las fotografías con un aumento de 40X se presentan en

el ANEXO 3, donde es posible apreciar de mejor forma la estructura de

los cristales.

Las fotografías de las materias primas muestran características muy

distintas en cuanto al tamaño, forma y distribución de los cristales. La

fotografía A de la figura 6 muestra la estructura cristalina del AFHP con

tamaño de cristal promedio de 10 �m, donde no se observa una forma

definida pero su distribución es bastante homogénea presentando cristales

muy pequeños pero sin distribución espacial definida. Por el contrario la

fotografía D de la figura 7 muestra la estructura cristalina del AFHV con

tamaño promedio de 25 �m, en la cual se observa claramente una forma

estrellada (predominante en los cristales de mayor tamaño) y una

distribución más tendiente a la formación de red de grupos.


57

Las fotografías B y C de la figura 6 muestran las mezclas

optimizadas MOBP y MOBPI. En ellas se puede observar un cambio

notable en la estructura cristalina así como también en su distribución

espacial, ocasionado por el reordenamiento de los TAG. También es

posible apreciar un aumento en el tamaño de los cristales después de la

interesterificación (8 �m aprox. para MOBP y 20 �m para MOBPI) y la

presencia de “lagunas” o zonas de grasa líquida, lo que comprueba el

efecto de la reacción sobre los parámetros de PF y CSG. La red cristalina

se presenta muy bien estructurada por lo que se puede deducir buenas

propiedades de plasticidad para esta mezcla. Rodríguez et al. (2001)

luego de la interesterificación de aceite de maravilla, aceites vegetal y

animal parcialmente hidrogenados con sebo, concluyen que un tamaño

pequeño de los cristales eran esenciales para una mejor consistencia y

aceptabilidad del producto final.

En las fotografías E y F de la figura 7 se muestran las mezclas

optimizadas MOBV y MOBVI. En estos casos no se observa un cambio

notable en la estructura o forma cristalina, pero si en su distribución

espacial, también ocasionado por el reordenamiento de los TAG. Se

puede apreciar una disminución fuerte en el tamaño de los cristales (20

�m para MOBV y 10 �m para MOBVI) y la formación de “lagunas” o

zonas de grasa líquida se presenta igual que en el caso anterior, lo que

comprueba el efecto de la reacción sobre los parámetros de PF y CSG.

El cambio físico observable mediante los parámetros de PF y CSG

fue descrito por Rousseau et al. (1996b) como el reordenamiento de los


58

cristales por efecto de las fuerzas de Van der Waals, responsables de la

formación de la red cristalina.

Base Pescado

AFHP

MOBP

MOBPI

Figura 6. Microfotografías de Luz Polarizada para AFHP, MOBP y MOBPI, con un aumento de 10X. La barra blanca representa 50 �m.

A

B C


59

Base Vegetal

AFHV

MOBV

MOBVI

Figura 7. Microfotografías de Luz Polarizada para AFHV, MOBV y MOBVI, con un aumento de 10X. La barra blanca representa 50 �m.

E

D

F


60

3.7.1.4. Análisis del contenido de AGT en materias primas y los

productos optimizados

Tabla 17. Resultados análisis de contenido de AGT por espectroscopía IR y cromatografía GLC.

AGT IR (%) AGT GLC (%) MATERIA PRIMA

x ± D.S. Contenido AVL 2,96 0,62 1,61 AFHV 4,28 0,21 0,58 AFHP 6,46 0,19 1,09

AGT IR (%) AGT GLC (%) MEZCLA x ± D.S. Contenido

MOBV 0 0 0,82 MOBVI 0 0 1,05 MOBP Trazas - 1,12 MOBPI Trazas - 1,05

Trazas: menor a 0,5 %.

En la tabla 17 se presenta el contenido de AGT para las materias

primas utilizadas y para las mezclas optimizadas antes y después de la

reacción de interesterificación. Esta determinación fue realizada tanto por

espectroscopía IR (AOCS Cd 14-61, 1993) como por cromatografía GLC

(AOCS Ce 1c-89).

El principio de la espectroscopía IR radica en que los dobles

enlaces trans, muestran una absorción, en forma aislada, a los 10,3 �m

(965 cm-1) aproximadamente y por consiguiente el contenido de AGT se


61

mide por medio de la intensidad de la absorción comparada con un

estándar 100% trans (Trielaidina).

Los resultados encontrados por espectroscopía IR, muestran un

contenido de AGT, para las materias primas, mayor que la determinación

por GLC (ANEXO 4). En este sentido Adam et al. (2000) recomiendan la

espectroscopía IR para contenidos de AGT mayores al 5%, por lo que la

técnica GLC arrojaría mejores resultados para la determinación de AGT

en estas materias primas.

Para los resultados encontrados en las mezclas optimizadas, se

observa el cumplimiento del objetivo de producir materias grasas con

bajo contenido de AGT. Mediante los análisis respectivos es posible

observar valores muy cercanos a cero para la mezcla con base vegetal, y

cercano al 1% para la mezcla con base pescado. Este mayor contenido de

AGT se explica por el aporte del aceite “full” hidrogenado de pescado

(45% en la mezcla).

3.7.1.5. Análisis del perfil de TAG.

En la Tabla 18 es posible apreciar el perfil de triglicéridos tanto

para las materias primas como para las mezclas optimizadas en base

vegetal. No fue posible realizar esta determinación en mezclas con base

pescado debido a la diversidad de TAG que se pueden encontrar luego de

la reacción de interesterificación.


62

Tabla 18. Perfil de TAG, determinado por HPLC para AVL. AFHV, y mezclas optimizadas con base vegetal con y sin interesterificación.

TAG AVL (%) AFHV (%) MOBV (%) MOBVI (%) LnLnLn 3,7 nd 2,7 0,4 LnLnL 0,7 nd 0,2 0,5 LnLL 0,7 nd nd 1,6 LnLnO 0,3 nd nd 0,3 LLL 23,8 nd 19,8 10,8 LnOL 0,8 nd 0,9 0,6 PLLn 1,5 nd 1,4 0,8 OLL 25,0 nd 21,2 12,5 PLL 11,3 nd 8,4 5,7 MOL 10,0 nd 8,7 4,9 OOL 11,8 nd 11,5 17,7 POL 1,5 nd 0,8 0,9 StPL 2,5 1,2 2,2 1,2 OOO 5,0 nd 4,2 10,8 StOL 1,6 nd 1,0 6,9 PPP Nd 3,9 1,2 0,8 StPM Nd 3,9 0,8 nd POSt Nd 3,7 nd 1,8 PPSt Nd 4,9 1,3 13,5 StOSt Nd 1,6 nd 1,7 PStSt Nd 25,2 5,2 3,5 StStAr Nd 1,9 nd nd StStSt Nd 53,8 8,7 3,1 Total 100,00 100,00 100,00 100,00

nd: no detectado; Ln: ac. Linolénico; L: ac. Linoleico; O: ac. Oleico; St: ac. Esteárico; P: ac. Palmítico; M: ac. Mirístico; Ar: ac. Araquídico.

En la Tabla 18, se puede observar el nivel de interesterificación

en la mezcla antes y después de la reacción. Los cambios más

importantes están representados por PPSt, LLL, OLL y OOL. En general

los ácidos grasos que presentan un intercambio más alto son el ácido

esteárico (C18:0, St), el ácido oleico (C18:1, O) y el ácido palmítico

(C16:0, P).


63

Para el caso de StStSt, se esperaba un valor más alto en su

concentración, debido a la alta presencia de este en AFHV. Es probable

que esto suceda por problemas de solubilidad de la triestearina, o bien,

que la triestearina quede retenida por efecto de la fase móvil utilizada,

bajando el rendimiento de ella en su determinación.

CONCLUSIONES

64

IV. CONCLUSIONES

• A partir de la optimización mediante la Metodología de Superficie de

Respuesta para la reacción de interesterificación de las mezclas de

AVL/AFHP y AVL/AFHV, en diferentes proporciones y tiempos de

reacción, se estableció un 43,9% de concentración para la mezcla en

base pescado y 36,8% para la mezcla en base vegetal, con 5 horas de

reacción a 70°C y 300 rpm de agitación para ambos casos.

• Se logró el objetivo de desarrollar bases grasas con bajo contenido de

AGT. La determinación de AGT mediante los métodos de

espectroscopía IR y cromatografía GLC para las mezclas

optimizadas, muestran niveles cercanos a un 1% por GLC y no

detectado por IR.

• Las curvas de CSG v/s Temperatura para las mezclas AVL/AFHP y

AVL/AFHV presentaron un comportamiento paralelo, antes y

después de la reacción de interesterificación, y una tendencia plana

en comparación con el estándar establecido. La mezcla AVL/AFHP

fue mas blanda con respecto a la mezcla AVL/AFHV.

• Se cumplió el objetivo de obtener modelos matemáticos para las

mezclas AVL/AFHP y AVL/AFHV, los cuales correlacionaron las

variables independientes (% de aceite “full” hidrogenado y tiempo

de reacción) sobre las dependientes (PF y CSG), en las condiciones

experimentales utilizadas.

CONCLUSIONES

65

• Con el análisis del perfil de TAG, Microscopía de luz polarizada y

análisis de características texturales, fue posible apreciar la

efectividad de la reacción de interesterificación.

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66

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