universidad tecnolÓgica de la mixteca · h = ancho del pico medido al 50% de la altura total del...

Cromatografía de líquidos de alta resolución

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA

Dra. Beatriz Hernández Carlos

NOVIEMBRE 2013Análisis Químico Cuantitativo

Reservorio de la fase móvil

Bomba

Filtro

Medidor de presión

Columna

Sistema de datos

Introducción de la muestra

Registrador Detector

Colector de fracciones

Sistema cromatográfico

Análisis Químico Cuantitativo

Sistema CLAR isocrático típico


MECANISMOS DE SEPARACIÓN


FASE NORMAL VS FASE REVERSA

LAS SUSTANCIAS MÁS POLARES ELUYEN AL FINAL EN FASE NORMAL Y ELUYEN PRIMERO EN FASE REVERSA


ADSORCIÓN PARTICIÓNMECANISMO DE SEPARACIÓN


SUSTANCIAS POLARES COMO EL FENOL INTERACCIONAN MEJOR CON LA FASE POLAR DE SÍLICA GEL QUE EL FENOL TRISUSTITUIDOAnálisis Químico Cuantitativo

Schematic of the analyte distribution between mobile phase, adsorbed organic layerand adsorbent surface in the presence of ionic and ionpairing equilibria. B: neutral formof basic analyte; BH+: protonated basic analyte; BH−A: ion-paired protonated basicanalyte; Subscript (a) denote adsorbed acetonitrile layer; subscript (s) denoteadsorption on the surface of adsorbent.


Mecanismos de retención en Cromatografía de líquidos

de alta resolución

Fase móvil Fase móvil Fase móvil

Fase estacionaria

Capa adsorbida

de ACN o MeOH

B BH+

BHA

Ba BHa+ BHAa

Bs BHs+ BHAsBs BHs+ BHAs

B BH+ BHA

B BH+ BHA

partición

B BH+ BHA

B BH+ BHA

adsorciónadsorción

adsorción


Las moléculas pequeñas entran al laberinto de conductos de las ciclodextrinas mientras que las grandes pasan de largo y salen primero de la columna


Cromatograma típico

tR = tiempo de retención

t´R = tiempo de retención para el pico no retenido

t´R = tR - tM = tiempo de retención ajustado

wh = ancho del pico a ½ de la altura del pico

Wb = ancho del pico determinado en la base


wb = ancho del pico en la base (wb = 4s)

wh = ancho del pico medido al 50% de la altura total del

pico

wi = ancho del pico medido en el punto de inflexión ej 60.7

% de la altura total del pico


Desviación estándar relativa = s / tR

N = n = (tR/s)2 = 16 (tR/wb)2 = 5.545 (tR/wh)

2

H = L/n altura equivalente para un plato teóricoL = longitud de la columna (mm)


Resolución

Rs = Dt/(wb1 + wb2)1/2 = 2Dt/ wb1 + wb2

Factor de capacidad (factor de retención):

k = t´R/tM = (tR – tM)/tM

Factor de separación o selectividad (describe la

posición relativa de dos picos)

= t´R(B)/t´R(A) = kB/kA


Ejemplo

Se tienen dos columnas de 25 cm x 2.6 mm DI en las cuales el mismo soluto

es analizado.

En la columna A, el tiempo de retención 416.4 s, wh = 1.7 mm ó 10.2 s

En la columna B, el tiempo de retención es 481.2 s y wh = 13.2 s

Prediga cuál es la columna más eficiente

Respuesta

nA = 9241; hA = 0.027 mm

nB = 7369; hB = 0.034 mm


Rs = Dt/(wb1 + wb2)1/2


LA SEPARACION

Para que ocurra la separación deberá ocurrir

1. Los componentes de la muestra deberán ser retenidos en la

columna

2. Los componentes de la muestra deberán ser separados unos

de otros

3. Los componentes de la muestra deberán tener picos

relativamente angostos


Calidad del pico

Desviación estándar relativa = s/tR

porque la forma del pico ó s depende del flujo

N = n = (tR/s)2

Número de platos teoricos = eficiencia de la columna

N = a (tR/w)2

Método a

wb 16

wh 5.54

wi 4


Problema 2. Haddad y colaboradores encontraron los siguientes factores de capacidad para la separación en fase reversa de salicilamida (k´r sal) y cafeína (k´caf)

% v/v metanol

30 35 40 45 50 55

K´sal 2.4 1.6 1.6 1.0 0.7 0.7

K´caf 4.3 2.8 2.3 1.4 1.1 0.9

Explique los cambios del factor de capacidad ¿Qué ventajas tienen el uso de una fase móvil con menor porcentaje de metanol? ¿Existe algún inconveniente?El factor de capacidad muestra el grado de retención de la muestra por la columna, entonces la cafeína tiene mayor afinidad por la fase reversa. El mayor contenido de metanol provoca menor retención de las muestras, por lo que el factor de capacidad disminuye.


Tiempo de retención , t´R ajustadotM tiempo muerto

Constante de distribuciónCs concentración en la fase estacionaria

Factor de retención

Retención relativa

Volumen de retención


Problema 4. Suponga que tiene que separar una mezcla de ácido benzoico, aspartame (en fase reversa) y cafeína en un refresco de soda dietético. Dispone de la información siguiente:

Compuesto tr en fase móvil acuosa tamponada a un pH de

3.0 3.5 4.0 4.5

Ácido benzoico 7.4 7.0 6.9 4.4

Aspartame 5.9 6.0 7.1 8.1

cafeína 3.6 3.7 4.1 4.4

PreguntA 1. Explique el cambio del tiempo de retención de cada compuestoRespuesta: El pKa del ácido benzoico determina la concentración de formas ácida o básica del analito, a pH más ácidos se retiene más la muestra porque la concentración de forma ácida (RCOOH) del ácido benzoico se incrementa y ésta es más afín a la C18 que la forma básica (RCOONa), la cual es más afín al agua o bufferPregunta 2. Represente el tiempo de retención en relación con el pH de cada componente en una misma gráfica e identifique el pH con el que se logrará una separación aceptable (siguiente página)


0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5

separacion en buffer

Ácido benzoico Aspartame cafeína

pH

tR

La separación de los tres analitos será en pH de 3 o 3.5, pero no de 4 porque los tR de dos son iguales y los picos salen juntos, así como a pH de 4.5.


Problema 3. La concentración de residuos de plaguicidas en productos agrícolas como, por ejemplo, en las naranjas , puede determinarse con GC-EM. Los residuos de plaguicidas se extraen de la muestra usando cloruro de metileno y los extractos se concentran hasta un volumen muy pequeño. La calibración se hace usando antraceno como patrón interno. En un estudio para determinar las ppb de heptaclor epóxido en naranjas, se trituro una muestra de 50 g de corteza de naranja y se extrajo con 50 mL de diclorometano. Tras eliminar los materiales insolubles, se redujo el volumen y se adicionó el patrón interno, finalmente se diluyo a 10 mL. El análisis de la muestra demostró una relación pico área (Aanal/Aint) de 0.108. Un conjunto de patrones de claibración , todos con la misma cantidad de antraceno que la muestra, dio el siguiente resultado.

Ppb epóxido de heptaclor Aanal/Aint

20 0.065

60 0.153

200 0.637

500 1.554

1000 3.198

Indique la concentración de epóxido de heptaclor (en nanogramos/gramo) en las naranjas Análisis Químico Cuantitativo

y = 311.85x + 6.291R² = 0.9997

0

200

400

600

800

1000

1200

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

Ppb epóxido de heptaclor

ppb

Aanal/Aint

39.97 ppb39.97 mg/1000 g39.97 ng/g


Representación esquemática de las contribuciones a la

anchura de los picos y el resultado cromatográfico

Desigualdad del flujo:

A1 Efecto del tamaño de partícula

A2 Efecto de la no uniformidad del

empaque

Difusión

B1 Flujo muy bajo

B2 Flujo típico

Transferencia de masa

C1 en una partícula grande

C2 En una partícula pequeña


Gráfica de van Deemter

u = promedio de la velocidad lineal de la fase móvil

H = altura del plato


FASE ESTACIONARIA


MODO DE ANALISIS

CROMATOGRÁFICO

FASE

ESTACIONARIA

FASE MOVIL

SOLUBILIDAD POLARIDAD O ACIDEZ

Insoluble en

agua

No polar

Moderadamente polar

Polar

Partición(fase unida)

Fase reversa

C18 Metanol o

ACN/agua

Agua /ACNC18

Adsorción Sílica gel

n-heptano/CHCl3Fase normal Sílica gel

desactivada

Partición

(fase

unida)

Fase

reversa

C8 Agua/ACN

Fase

normal

CN n-

heptano/isopropa

nol


MUESTRAMODO DE ANALISIS

CROMATOGRÁFICO

FASE

ESTACIONARIA FASE MOVIL

SolubilidadPolaridad o acidez

Solu

ble

en

agu

aBásico

Fuerte Intercambio iónico

Intercambiador catiónico

Na2HPO4 0.01-0.1 M

Débil Partición, fase reversa

Fase unida C18 Agua + ácido hexanosulfónico0.005M/MeOH

ÁcidoFuerte Intercambio

iónico

Intercambiador aniónico

Na2HPO4 0.01-0.1 M

Débil Partición, fase reversa

Fase unida C18 Agua + hidróxido de tetrabutilamonio0.005M/MeOH


Columnas de nueva generación: con soporte de centro fundido de silicaque da una resolución (separación de analitos) comparada a un soporte de tamaño de partícula de 2 micras pero sin la desventaja de desarrollar presiones muy elevadas en el sistema cromatográfico


www.phenomenex.com/kinetex


PrevailÁrea superficial 350m2/gCarga C18 15-17%

EconosphereÁrea superficial 200 m2/gCarga de C18 10%

Cromatogramas de la separación de los glicósidos de M. helleri en columnas C18 tipo Econosphere (superior) y Prevail (inferior). Columnas 250 x 4 mm, 5 micras, MeOH/H2O (55:45), 0.5 ml/min


Disolventes


Serie elutrópica


Capacidad de intercambio de intercambiadores iónicos en función del pH


Fase móvil

Tamaño de

partícula

mm

D.I. Columna

mm

Fase móvilViscosidad de la fase móvil

mPa.s

Presiones típicas

mPa lb/in2

5 4.6 Agua 1.0 10-15 1450-2175

10 2.6 10-12 1450-1740

10 4.6 2.5 290-725

37 2.6 0.5-2 72.5-290

5 4.6 N-hexano 0.33 3-5 435-725

10 2.6 3-4 435-580

10 4.6 0.7-1.6 101-232

37 2.6 0.2-0.7 29-101

1mPa.s = 1 cP1 Pa = Newton/m2 =1 x 10-5 bar; 1 bar = 0.9869 atm = 14.5038 psi = 1.0197 kg/cm2


Capacidad de intercambio de intercambiadores iónicos en función del pH


MODO Fase

estacionariaSuperficiefuncional

Fases móviles comunes

Aplicaciones típicas

Ad

sorc

ión Sílica gel

Hexano, cloroformo, isopropanol

éteres, esteres,porfirinas, micotoxinas, vitaminas liposolubles

AlúminaHexano,cloroformo, isopropanol

Aminas

Si O Si

OHOH

Al O

OH

Al

OH

Fases estacionarias y fases móviles frecuentemente usadas


MODO Fase




Par

tici

ón

Fase

no

rmal

Amino -NH2 Hexano,

cloroformo,

isopropanol

Azucares. Esteroides,

nitrocompuestos

Ciano -CN Hexano,

cloroformo,

isopropanol

Nitrocompuestos,

aminoácidos

Diol Glicildoxietil

metoxi-silano

Agua, Na2HPO4

0.1M

Proteínas, péptidos,

surfactantes acuosos

Fase

rev

ersa

RP-2 Dimetilsilano Agua, acetonitrilo,

metanol

Aminas, fenoles,

vitaminas solubles en

agua

RP-8, C8 Octilsilano Agua,

acetonitrilo,

metanol

Catecolaminas,

esteroides, aceites

esenciales

RP-18, ODS Octadecilsilano Agua,

acetonitrilo,

metanol

Analgésicos, ftalatos,

poliaromáticos


MODO Fase




Inte

rcam

bio

ión

ico

Intercambiador

catiónico fuerte

Ácido sulfónico Na2HPO4 0.01-0.1M Vitaminas solubles en

agua, purinas,

aminoácidos,

nucleósidos.

Intercambiador

aniónico fuerte

Amina cuaternaria Na2HPO4 0.01-0.1M Nucleótidos

Intercambiador

aniónico débil

-NH2 Na2HPO4 0.01-0.1M Colorantes de

alimentos,

carbohidratos

Excl

usi

ón

Gel acuoso Divinilbencensulfo

nato

agua Proteínas, péptidos,

azúcares

Gel orgánico Divinilbenceno Cloroformo,

tetrahidrofurano

Polímeros

Sílica de poro

controlado

Silica gel Tetrahidrofurano,

alcoholes, agua

Polímeros,

compuestos

biológicos

Vidrio de poro

controlado

Vidrio poroso Tetrahidrofurano,

alcoholes, agua

Compuestos

biológicos


Tipo Grupo funcional del empaque

Muestras Rangotípico del pH

Anión Fuerte Sal de amonio cuaternaria

Aniones libres de ácidos o salesbásicas

1-10

Débil Sal de amina Ácidos fuertes y moderadamente fuertes, bases débiles

4-8

Dietil amino etil Proteínas 1-13

Catión Fuerte Sal sódica del ácido sulfónico

Cationes libres de ácidos o sales de bases

1-10

Débil Ácido carboxílico Bases fuertes y moderadamentefuertes, ácidos débiles

4-8

Carboximetil Proteínas 1-13

Separaciones de intercambio iónico


Separaciones en tres columnas diferentes de 5 mezcla de derivados aromáticos (a, b, c, d y e). Columna de PBBColumna de C18 y Columna F13C9Todas de fase reversa


OBJETIVOS

DECISIONES

DETECTOR COLUMNA FASE MOVIL CONDICIONES PREP.

MUESTRA

PREC. Y

EXACTITUDRESOLUCIÓN VELOCIDAD SENSITIVIDAD REPRODUC.

APLICACIÓN


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