universidad tÉcnica de ambato facultad de ciencias...
TRANSCRIPT
i
UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
“EFECTO ANTIMICROBIANO IN VITRO DEL ACEITE
ESENCIAL DE EUCALIPTO (Eucalyptus spp.) SOBRE CEPAS
CERTIFICADAS DE Escherichia coli Y Staphylococcus aureus”
“Documento Final del Proyecto de Investigación como requisito para
obtener el grado de Médico Veterinario Zootecnista”
AUTOR: MARÍA JOSÉ MOROCHO NÚÑEZ
TUTOR: DRA MAYRA MONTERO
CEVALLOS-ECUADOR
2018
ii
DECLARACIÓN DE ORIGINALIDAD
“La suscrita, MARÍA JOSÉ MOROCHO NÚÑEZ, portadora de la cédula de identidad
número: 180448308-7 libre y voluntariamente declaro que el Informe Final del Proyecto
de Investigación titulado: “EFECTO ANTIMICROBIANO IN VITRO DEL ACEITE
ESENCIAL DE EUCALIPTO (Eucalyptus spp.) SOBRE CEPAS CERTIFICADAS DE
Escherichia coli Y Staphylococcus aureus.” es original, auténtico y personal. En tal
virtud, declaro que el contenido es de mi sola responsabilidad legal y académica,
excepto donde se indiquen las fuentes de información consultadas”.
………………………………
MARÍA JOSÉ MOROCHO NÚÑEZ
C.I. 180448308-7
iii
DERECHOS DE AUTOR
“Al presentar este Informe Final del Proyecto de Investigación titulado “EFECTO
ANTIMICROBIANO IN VITRO DEL ACEITE ESENCIAL DE EUCALIPTO
(Eucalyptus spp.) SOBRE CEPAS CERTIFICADAS DE Escherichia coli Y
Staphylococcus aureus.” como uno de los requisitos previos para la obtención del título
de grado de Médico Veterinario Zootecnista, en la Facultad de Ciencias Agropecuarias
de la Universidad Técnica de Ambato, autorizo a la Biblioteca de la Facultad, para que
este documento esté disponible para su lectura, según las normas de la Universidad.
Estoy de acuerdo en que se realice cualquier copia de este Informe Final, dentro de las
regulaciones de la Universidad, siempre y cuando esta reproducción no suponga una
ganancia económica potencial.
Sin perjuicio de ejercer mi derecho de autor, autorizo a la Universidad Técnica de
Ambato la publicación de este Informe Final, o de parte de él”.
………………………………
MARÍA JOSÉ MOROCHO NÚÑEZ
C.I. 180448308-7
iv
“EFECTO ANTIMICROBIANO IN VITRO DEL ACEITE ESENCIAL DEEUCALIPTO (Eucalyptus spp.) SOBRE CEPAS CERTIFICADAS DE Escherichia
coli Y Staphylococcus aureus ”
REVISADO POR:
………………………………………………
Dra. Mg. Mayra Montero
TUTOR
………………………………………………
Dr. Mg. Pedro Díaz
ASESOR DE BIOMETRÍA
MIEMBROS DEL TRIBUNAL DE CALIFICACIÓN:
FECHA
………………………... ………..Ing. Mg. Hernán ZuritaPRESIDENTE DEL TRIBUNAL DE CALIFICACIÓN
………………………... ………..Dr. Mg. Pedro Díaz.MIEMBRO DEL TRIBUNAL DE CALIFICACIÓN
……………………… ………..Méd. Diana Avilés, PhDMIEMBRO DEL TRIBUNAL DE CALIFICACIÓN
v
ÍNDICE
Portada ............................................................................................................................... i
Declaración de originalidad .............................................................................................. ii
Derechos de autor ............................................................................................................ iii
Indice ................................................................................................................................ v
Indice de tablas ..............................................................................................................viii
Resumen........................................................................................................................... ix
Summary........................................................................................................................... x
Capítulo I .......................................................................................................................... 1
Introducción ...................................................................................................................... 1
Capítulo II ......................................................................................................................... 4
Revisión de literatura o marco teórico .............................................................................. 4
2.1. Antecedentes investigativos................................................................................... 4
2.2. Categorías fundamentales o marco conceptual...................................................... 7
2.2.1. Aceites esenciales ........................................................................................... 7
2.2.2. Cepas bacterianas............................................................................................ 9
2.2.3. Medios de cultivo.......................................................................................... 11
2.2.4. Métodos de estudio de la sensibilidad .......................................................... 12
2.2.5. Unidad de análisis ......................................................................................... 13
Capítulo III...................................................................................................................... 15
3.1 Hipótesis ............................................................................................................... 15
3.2. Objetivos.............................................................................................................. 15
3.2.1. Objetivo general:........................................................................................... 15
3.2.2. Objetivos específicos: ................................................................................... 15
Capítulo IV ..................................................................................................................... 16
Materiales y métodos ...................................................................................................... 16
4.1. Ubicación geográfica ........................................................................................... 16
4.2. Características del lugar....................................................................................... 16
4.3. Equipos y materiales ............................................................................................ 16
4.3.1. Material experimental ................................................................................... 16
4.3.2. Agentes biológicos........................................................................................ 16
vi
4.3.3. Equipos ......................................................................................................... 17
4.3.4. Materiales de laboratorio .............................................................................. 17
4.3.5. Sustancias o reactivos ................................................................................... 17
4.4. Factores en estudio............................................................................................... 18
4.5. Tratamientos ........................................................................................................ 18
4.6. Diseño experimental ............................................................................................ 19
4.7. Manejo de la investigación .................................................................................. 19
4.7.1. Obtención del material biológico.................................................................. 19
4.7.2. Obtención del material experimental ............................................................ 20
4.7.3. Elaboración de las concentraciones de aceite de eucalipto........................... 20
4.7.4. Elaboración de medios de cultivo................................................................. 20
4.7.5. Activación de las cepas................................................................................ 20
4.7.6. Preparación de discos de sensibilidad........................................................... 20
4.8. Variables respuesta .............................................................................................. 21
4.8.1. Concentración mínima inhibitoria (cmi)....................................................... 21
4.8.2. Concentración mínima bactericida (cmb)..................................................... 22
4.8.3. Sensibilidad bacteriana ................................................................................. 22
4.9. Procesamiento de la informacion......................................................................... 22
Capítulo V....................................................................................................................... 23
Resultados y discusión.................................................................................................... 23
5.1. Resultados............................................................................................................ 23
5.1.1. Concentración mínima inhibitoria (cmi)....................................................... 23
5.1.2. Concentración mínima bactericida (cmb)..................................................... 24
5.1.3. Prueba de difusión por disco......................................................................... 24
5.2. Discusión ............................................................................................................. 25
Capítulo VI ..................................................................................................................... 27
Conclusiones, bibliografía y anexos ............................................................................... 27
6.1. Conclusiones........................................................................................................ 27
6.2. Referencias bibliográficas.................................................................................... 28
6.3. Anexos ................................................................................................................. 36
Capitulo VII .................................................................................................................... 43
Propuesta......................................................................................................................... 43
7.1. Datos informativos............................................................................................... 43
vii
7.2. Antecedentes de la propuesta............................................................................... 43
7.3. Justificación ......................................................................................................... 43
7.4. Objetivos.............................................................................................................. 43
7.5. Análisis de factibilidad ........................................................................................ 44
7.6. Fundamentación................................................................................................... 44
7.7. Metodología, modelo operativo ........................................................................... 44
7.8. Administración..................................................................................................... 44
7.9. Previsión de la evaluación ................................................................................... 45
viii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Condiciones meteorológicas ............................................................................. 16
Tabla 2. Cepas y concentraciones del aceite de eucalipto (Eucalyptus spp.) ................. 19
Tabla 3. Número de tratamientos y repeticiones para Echerichia coli y Staphylococusaureus subsp. aureus....................................................................................................... 19
Tabla 4. Concentraciones del aceite esencial de Eucalipto (Eucalyptus spp.) ............... 20
Tabla 5. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del aceite esencial de eucalipto(Eucaliptus spp.) ............................................................................................................. 23
Tabla 6. Determinación de la Concentración Mínima Bactericida (CMB) del aceiteesencial de Eucalipto (Eucaliptus spp.) .......................................................................... 24
ix
RESUMEN
El objetivo del proyecto de investigación fue evaluar in vitro el efecto antimicrobiano
del aceite esencial de Eucalipto (Eucalyptus spp.) sobre cepas certificadas de
Escherichia coli ATCC25922 y Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC292113; en
el cual se evaluaron diluciones del aceite de eucalipto 30%, 60% y 90% con etanol al
98%. Se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria utilizando el método de
microdilución en caldo, cada inóculo bacteriano fue estandarizado al 0,5 de la escala de
MacFarland en el espectofotómetro, obteniendo como resultado que los tubos al 60% y
90% de aceite de eucalipto no presentaron turbidez para Escherichia coli, característica
similar que presentó la cepa Staphylococcus aureus subsp. aureus en las diluciones al
60% y 90%, también se determinó la Concentración Mínima Bactericida por medio de
la siembra de las diluciones mencionadas anteriormente en el agar Mueller-Hinton en la
cual no se observó crecimiento de colonias al 60% y 90% para las dos cepas evaluadas.
La prueba de difusión por disco mostró la sensibilidad de las cepas evaluadas al aceite
de eucalipto, presentando para Escherichia coli un halo mínimo de 10,25mm al 30% y
un diámetro máximo de 10,95mm al 90% mientras que para la cepa Staphylococcus
aureus subsp. aureus obtuvimos como valor mínimo 10,95mm al 30% y un valor
máximo 14,45mm al 60% de dilución. El aceite esencial de eucalipto (Eucalyptus spp.)
presenta propiedades antibacterianas para bacterias Gram negativas Escherichia coli y
Gram positivas Staphylococcus aureus sbsp.aureus.
Palabras claves: Concentración Mínima Inhibitoria, Concentración Mínima
Bactericida, MacFarland, Mueller-Hinton, espectrofotómetro.
x
SUMMARY
The objective of the research project was to evaluate in vitro the antimicrobial effect of
Eucalyptus essential oil (Eucalyptus spp.) on certified strains of Escherichia coli
ATCC25922 and Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC292113; in which dilutions
of eucalyptus oil were evaluated 30%, 60% and 90% with 98% ethanol. The Minimum
Inhibitory Concentration was determined using the broth microdilution method, each
bacterial inoculum was standardized to 0.5 of the MacFarland scale in the
spectrophotometer, obtaining as a result that the 60% and 90% eucalyptus oil tubes did
not present turbidity for Escherichia coli, similar characteristic that presented the strain
Staphylococcus aureus subsp. aureus in the 60% and 90% dilutions, the Bactericidal
Minimum Concentration was also determined by seeding the dilutions mentioned above
in the Mueller-Hinton agar in which no growth of colonies was observed at 60% and
90% for the two strains evaluated. The disc diffusion test showed the sensitivity of the
evaluated strains to eucalyptus oil, presenting for Escherichia coli a minimum halo of
10.25mm at 30% and a maximum diameter of 10.95mm at 90% while for the
Staphylococcus aureus strain subsp. aureus obtained a minimum value of 10.95mm at
30% and a maximum value of 14.45mm at 60% dilution.
Eucalyptus essential oil (Eucalyptus spp.) Has antibacterial properties for Gram-
negative Escherichia coli and Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus
sbsp.aureus.
Keywords: Minimum Inhibitory Concentration, Bactericidal Minimum Concentration,
MacFarland, Mueller-Hinton, spectophotometer.
1
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN
El empleo de sustancias naturales en el tratamiento de procesos patológicos, constituye
en la actualidad un desafío en la medicina, sin duda el reino vegetal ofrece variedad de
sustancias potencialmente útiles (Stockwell, 1988). Entre los productos naturales, los
aceites esenciales y las plantas medicinales han recibido especial atención como
posibles agentes naturales para la conservación de los alimentos (Burt, 2004). De hecho,
se ha informado que los aceites esenciales y sus componentes principales poseen un
amplio espectro de actividad antimicrobiana (Gachkar et al., 2007).
En las últimas décadas, la demanda de productos derivados de plantas para usos
terapéuticos se ha incrementado (Hermann, & Von Richter, 2012). Países en vías de
desarrollo utilizan plantas aromáticas en la atención primaria de salud en las zonas
rurales siendo las más utilizadas salvia, tomillo, orégano, canela y también el eucalipto
(Kamatou, 2005). El 80% de las poblaciones de los países en desarrollo utilizan estos
recursos tradicionales (Begossi, 1996), con la utilización de plantas medicinales se hace
énfasis en la fitoterapia como una alternativa al tratamiento de procesos patológicos, ya
que hace mucho tiempo las plantas medicinales son vistas como medicamentos no
químicos de la naturaleza (Veiga-Junior 2008). El uso de aceites esenciales tiene fines
clínicos de gran importancia en la investigación científica y la aplicación industrial por
sus diferentes actividades biológicas como antimicrobianos (Lo Cantore et al., 2009),
antioxidantes (Dutra et al.,2008) y antiinflamatorios (Chao et al.,2005).
El eucalipto es un árbol de la familia Myrtaceae, que incluye 140 géneros y unas 900
especies y subespecies (Vecchioet et al., 2016), las especies de eucaliptos son bien
conocidas como una fuente rica en aceites esenciales, se las obtienen por medio del
método de arrastre de vapor o de hidrodestilación (Singh et al. 2012; Marzough et al.
2011). El efecto biológico de gran interés investigativo que presenta el eucalipto es la
actividad antimicrobiana, propiedad que radica en su composición química al contener
el compuesto 1,8-cineol (Tyagi & Malik, 2011).
2
La resistencia a los antimicrobianos plantea una grave amenaza para el tratamiento
efectivo de infecciones causadas por bacterias, hongos y virus, en todo el mundo, la
resistencia a los antibióticos está aumentando en bacterias como Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, informaron una susceptibilidad
antibiótica reducida, que excedió el 50% en la mayoría de los países que proporcionaron
datos al Informe mundial de vigilancia de la resistencia antimicrobiana de la OMS
(OMS, 2014). Con el aumento de la resistencia de patógenos al utilizar antibacterianos
sintéticos y la tendencia actual por parte de los consumidores de no adquirir productos
con este tipo de sustancias, se ha generado un interés considerable en la investigación de los
aceites esenciales como agentes antimicrobianos (Yáñez & Cuadro 2012). Esta resistencia
creciente ha generado la necesidad de desarrollar nuevos agentes antimicrobianos, los
aceites esenciales son buenos candidatos y sus compuestos aislados, incluidos terpenos
y terpenoides (1,8-cineol, carvacrol) y compuestos aromáticos (cinamaldehído y
eugenol) tienen actividad antimicrobiana contra una amplia gama de patógenos, con
diversos espectros de actividad (Bassole & Juliani 2012).
Se define como aceite esencial a una mezcla compleja de componentes como
hidrocarburos, que presentan alta volatilidad evaporándose al hacer contacto con el aire
(Bello, 1999), se los obtiene a partir de las diferentes partes de las plantas flores,
semillas, hojas, yemas, ramas , corteza, frutos y raíces (Burt, 2007), a los aceites
esenciales se les considera productos del metabolismo secundario de las plantas como
alcaloides, flavonoides, saponinas y taninos (Bandoni et al., 2009; Madsen & Bertelsen
1995). La actividad bactericida y antifúngica de estas sustancias está estrechamente
relacionada con los fenoles y monoterpenos que poseen, debido a que son capaces de
tener una interacción directa con el citoplasma del patógeno o bien, gracias a su
hidrofobicidad pueden incorporarse a los lípidos de la membrana celular bacteriana en
donde se da lugar a una fuga de iones y otros compuestos de la bacteria (Asbahani,
2015). Los efectos antimicrobianos de los aceites esenciales están relacionados con su
composición y efectos citotóxicos que causan daño a la membrana celular, los
compuestos de los aceites esenciales son lipofílicos y pasan a través de la pared celular
y la membrana citoplásmica interrumpiendo la estructura de las capas de polisacáridos,
ácidos grasos y fosfolípidos, haciendo que la membrana sea permeable (Bakkali et al.,
2008).
3
El presente trabajo de investigación tiene como propósito comprobar la actividad
antimicrobiana in vitro del aceite esencial de Eucalipto (Eucaliptus spp.) sobre las cepas
bacterianas de Escherichia coli y Sphylococcus aureus subsp. aureus.
4
CAPÍTULO II
REVISIÓN DE LITERATURA O MARCO TEÓRICO
2.1.ANTECEDENTES INVESTIGATIVOS
Según Reyes et al., (2012), en su investigación sobre los aceites esenciales como
alternativa de antimicrobianos naturales, demostraron que los aceites derivados de las
plantas poseen efectos antibacterianos, descubriendo que los componentes químicos
como el 1,8-Cineol, carvacrol, eugenol son los responsables de este efecto y entre los
métodos más usados para la evaluación antimicrobiana se incluye: dilución, difusión,
caja Petri invertida y cámara hermética.
Brochot et al., (2017) mostró que en las mezclas de aceites de diferentes plantas
incluida el aceite esencial de eucalipto (E. globulus) a 3.52% poseen una actividad
altamente antibacteriana contra las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas,
presentando concentraciones inhibitorias para Staphylococcus aureus 0,38% y para
Escherichia coli 0,75%, mientras que las concentraciones bactericidas mínimas fueron
de 0,38% para S. aureus y 1,5% para E. coli.
Wayne (2015), menciona que para determinar la actividad antibacteriana de los aceites
esenciales se puede usar el método de difusión en placa para demostrar la
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) por microdilución en caldo teniendo en cuenta
los estándares de la NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards)
M2-A7 y NCCLS M 27-A2 respectivamente.
Yáñez y Cuadro (2012) identificaron los compuestos mayoritarios presentes en el aceite
esencial de Eucalyptus globulus, encontrando como componente primordial el 1,8-
Cineol o Eucaliptol al 77 y 82%, el cual actúa en sinergia con otros principios activos
antibacterianos, tales como: α-Pineno, Limoneno, α-Terpineno, α-Copaeno, Guaiol, β-
Terpinen-4-ol y α-Terpineol.
5
En el estudio de Ait-Ouazzou et al.,(2011) el aceite esencial extraído de Eucalyptus
globulus presentó un solo compuesto, el 1,8-cineol, que representó el 79,85% del aceite
que es el compuesto que se relaciona con el efecto antibacteriano, aunque se
identificaron otros 18 compuestos: limoneno, p-cimeno y α-terpineno, también se
encontraron en el aceite de Eucalyptus globulus como componentes principales, por lo
tanto, este aceite esencial también mostró un alto contenido de monoterpenos
oxigenados (80,65%).
Según Burt (2007), la composición química del aceite esencial del eucalipto es muy
diverso teniendo como componente principal el cineol o eucaliptol, el mismo que le da
la acción bactericida además encontraron: terpineol, carburos terpénicos, alcoholes
alifáticos, aldehídos y cetonas.
En el estudio de Safaei-Ghomi & Ahd (2010), la CMI del aceite de la mayoría de
especies de eucalipto se halla en el rango de 100 a 1000 ppm para la mayoría de
bacterias, debido a las diferencias en composición de los diferentes aceites, el método
utilizado contra la cepa de Escherichia coli muestra una la CMI de 500 ppm, contra
Bacillus subtillis la CMI de 125 ppm, Staphylococcus aureus 250 ppm y finalmente
Candida albicans de 125 ppm.
Según Gilles et al.,(2010), de las cinco concentraciones de aceite esencial que
analizaron (20%, 40%, 60%, 80% y 100%) en el estudio de la actividad antibacteriana,
a partir del método de difusión en disco el AE de la especie Eucalyptus. globulus en una
concentración del 40%, obtenido por el método arrastre de vapor y con hojas secas, bajo
las condiciones estipuladas del estudio, demostró poseer mayor eficacia en cuanto a la
actividad antibacteriana frente a las cinco cepas de interés: Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Bacillus subtilis y Enterococcus faecalis; el
aceite esencial foliar de la especie Eucalyptus globulus presentó la CMI más bajas
frente a las bacterias Gram positivas, tales como: E. faecalis, B. subtilis y S. aureus con
valores de 23.4 μg/mL, 16.5 μg/mL, 12.4 μg/mL respectivamente.
Según Vieira et al.,(2017), los resultados obtenidos del método de difusión en disco de
agar contra Staphylococcus aureus reportaron un valor de 36mm y para la cepa de
6
Escherichia coli los halos formados tuvieron un valor de 9mm utilizando el aceite de
Eucalyptus globulus Labill, todos los aceites esenciales utilizados para este estudio
presentaron actividad antimicrobiana contra las bacterias probadas, con la excepción de
los aceites esenciales de R. officinalis, F. vulgare y F. vulgare que no mostraron ningún
efecto contra P. aeruginosa ATCC 27853.
Domingo (2010), menciona que los aceites esenciales elaborados con hoja de eucalipto
tienen un compuesto orgánico volátil llamado eucaliptol o 1,8-cineol el mismo que le
da propiedades antisépticas eficaces contra patógenos respiratorias en humanos.
Medina et al., 2013, determinaron la susceptibilidad de las cepas de Escherichia coli
ATCC25922 y Staphylococcus aureus ATCC25933, bacterias Gram negativas y Gram
positivas respectivamente ante aceites esenciales de Allium sativum , Cinnamomum
verum y Dysphania ambrosioides que presentan una composición química similar a la
del aceite esencial de eucalipto que son responsables del efecto antimicrobiano de los
extractos estudiados en la mencionada investigación, para tal objetivo se realizaron
ensayos de susceptibilidad antimicrobiana mediante la metodología de difusión radial
en placa de agar y consistió en medición del halo de inhibición del crecimiento
bacteriano de acuerdo a las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI).
Salazar et al., (2009), determinó en 10 productos herbolarios que contenían A. sativum,
Peumus boldus, Eucalyptus globulus, Mentha piperita, ninguno de ellos presentó
actividad contra Escherichia coli con la máxima concentración analizada (1000
mg/mL), mientras que por otro lado seis productos que contenían P. boldus, E. globulus
y S. officinalis fueron los más activos contra Staphylococcus aureus con valores de MIC
500 a 62.5 mg/mL.
Patra y Saxena (2010), mencionan que adicionar en el alimento concentraciones de
aceite esencial de eucalipto (Eucalyptus spp.), eneldo (Anethum graveolens), orégano
(Origanum vulgare), canela (Cinnamomum verum), hinojo (Foeniculum vulgare),
enebro (Juniperus communis), pino insigne (Pinus mugos), clavo (Syzygium
7
aromaticum) o tomillo (Thymus vulgaris), inhibe el crecimiento de algunas bacterias
metanogénicas del rumen (Methanobrevibacter smithii, M. ruminantium.
Methanosphaera stadtmanae) referencia significativa para el efecto antibacteriano de
los aceites esenciales derivados de plantas.
Pecarski et al., (2014), en el estudio de evaluar y comparar la actividad antimicrobiana
de cuatro aceites esenciales que pertenecen a la familia Lamiaceae (salvia, orégano,
tomillo) y aceite de eucalipto (Eucaliptus globules), muestra que todos los aceites
esenciales presentan un gran potencial de actividad antimicrobiana contra varias
bacterias y levaduras de Cándida albicans, utilizando la difusión de agar método con
pozos.
Elaissi (2012), la actividad de los aceites esenciales de Eucalyptus varia
significativamente dentro de las especies y dentro de las cepas, la fuerte actividad
antimicrobiana se relaciona no solo con un alto contenido de un componente principal
como 1,8-cineol, las bacterias Gram positivas S. aureus y Enterococcus faecalis son las
más sensibles, mientras que las bacterias Gram negativas P. aeruginosa y Escherichia
coli son las más resistentes, el aceite de eucalipto tiene una perspectiva interesante en la
aplicación terapéutica para el tratamiento de algunas infecciones bacterianas.
2.2.CATEGORÍAS FUNDAMENTALES O MARCO CONCEPTUAL
2.2.1. ACEITES ESENCIALES
Los aceites son sustancias olorosas obtenidas a partir de plantas mediante destilación en
corriente de vapor o por expresión del material vegetal, los aceites esenciales se
caracterizan por ser una mezcla compleja de varios compuestos de aromas volátiles
pertenecientes a diferentes clases de la química orgánica: hidrocarburos, alcoholes,
aldehídos, cetonas, esteres, éteres y fenoles. (Bakkali et al., 2008). Los AE son el
producto final del metabolismo secundario de las plantas aromáticas, constituidos por
terpenos con actividad y composición variada; después de la extracción generalmente
son líquidos y rara vez sólidos o pastosos, diversas investigaciones han permitido
establecer su actividad antibacteriana, antimicótica, antiparasitaria, antiviral e
insecticida (Alzamora et al., 2001).
8
EUCALIPTO (Eucalyptus spp.)
Descripción
Eucalyptus (Eucapyptus spp.), es un gran género de la familia Myrtaceae, que incluye
900 especies y subespecies (Vecchio et al 2016). Este árbol alto siempre verde es nativo
de Australia y Tasmania (Elliot, & Jones, 1990). En la antigüedad, la planta de eucalipto
fue utilizada por los aborígenes para diversos propósitos, como medicina y como
alimento, hoy en día, la planta se utiliza en silvicultura (madera, combustible, pulpa de
papel), plantación ambiental (control de la erosión hídrica y eólica), como fuente de
aceites esenciales (aceites medicinales, perfumería) (Elliot, W. R., & Jones, D. L.1990).
Entre todas las especies de eucaliptos australianos, E. globulus, se introdujeron
ampliamente en el extranjero (Damjanović-Vratnica 2011), y se cultivaron en gran parte
en las regiones subtropicales y mediterráneas, se utiliza considerablemente en la
industria de la celulosa, así como para la producción de aceite de eucalipto, se extrae a
escala comercial en muchos países y se adopta en perfumería, cosméticos, alimentos,
bebidas, aromaterapia y fitoterapia (Takahashi, 2004). Las plantas de eucalipto llaman
la atención de los investigadores y ecologistas de todo el mundo porque representan una
fuente de madera de crecimiento rápido, así como una fuente de petróleo utilizada para
varios propósitos, el aceite se extrae de hojas, frutos, cogollos y corteza mostrando
actividades antibacterianas, antisépticas, antioxidantes, antiinflamatorias,
anticancerígenas (Dixit et al.,1997),mientras que (Egawa et al.,1977) describe que por
esta razón se utiliza en el tratamiento de enfermedades respiratorias (Silva 2003 y
Williams 1998).
El aceite esencial de Eucalyptus presenta propiedades antisépticas, bactericidas e
insecticidas; esto último se debe a la presencia de 1,8-cineol, compuesto característico
del género Eucalyptus, que ha sido considerado como un fumigante; además, no es
tóxico para mamíferos, es de bajo costo, constituye un recurso renovable, posee un
manejo que produce abundante follaje como residuo (Mossi et al. ,2011).
Composición Química
El Eucalipto es una rica fuente de compuestos fitoquímicos como flavonoides,
alcaloides, taninos y propanoides de la hoja, el tallo y la raíz de la planta (Dixit et al.,
2012). Varios componentes volátiles como aromadendreno 1,8-cineol (eucaliptol), α-
9
gurjunene, globulol, ß-pinene, pipertone, α-, ß-y γ-terpinen-4-ol, y allo-aromadendrene
tanto en hojas como en brotes, el eucaliptol es, en particular, el componente principal y
el más importante encontrado en el eucalipto, también en brotes de la planta se
encuentra borneol, ácido caproico, citral, eudesmol, fenchone, p-mentano, myrecene,
myrtenol, α-terpineol, verbinona, asparagina, cisteína, glicina, ácido glutámico, ornitina
y treonina (Boulekbache-Makhlouf et al.,2010), el eucaliptol representa el 79.85% de la
composición química total (Stackpole et al., 2011).
Descripción Botánica
Es una especie heliófita que requiere plena exposición para su crecimiento, las hojas son
pecioladas, lanceoladas, desprovistas de vellosidades, tienen una coloración verde mate,
las hojas adultas son peciolos de 1 a 3 cm, miden por lo regular de 12 a 22 cm de largo
por 0,8 a 1,5 cm de ancho, pinatinervias e irregularmente anastomosadas (Brako &
Zarucchi, 1993).
Clasificación Taxonómica del Eucalyptus
Reino: Plantae
Filo: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Orden: Myrtales
Familia: Myrtaceae
Género: Eucalyptus
Especie: Eucalyptus spp.
2.2.2. CEPAS BACTERIANAS
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC292113
Staphylococcus aureus es un patógeno oportunista responsable de un amplio espectro de
enfermedades, que van desde infecciones de piel y tejidos blandos hasta neumonía;
desde su descubrimiento por el médico Alexander Ogston en 1880, Staphylococcus
aureus es considerado uno de los patógenos más relevantes hoy en día por su virulencia,
10
su habilidad para causar distintos tipos de infecciones y su capacidad para adaptarse a
diferentes condiciones ambientales (Cervantes et al., 2014).
Características microbiológicas
El género Staphylococcus está formado por cocos gram positivos, con un diámetro de
0.5 a 1.5μm, agrupados como células únicas, en pares, tétradas, cadenas cortas o
formando racimos de uvas, Ogston introdujo el nombre de Staphylococcus, del griego
staphyle que significa racimo de uvas, para describir a los cocos responsables de
inflamación y supuración, son bacterias no móviles, no esporuladas, no poseen cápsula,
aunque existen algunas cepas que desarrollan una cápsula de limo, son anaerobias
facultativas y la mayoría de los estafilococos producen catalasa (enzima capaz de
desdoblar el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno libre); característica que se
utiliza para diferenciar el género Staphylococcus de los géneros Streptococcus y
Enterococcus que son catalasa negativos (Kuroda et al., 2001).
El género Stahphylococcus es relativamente resistente a altas temperaturas, la
resistencia a la desecación es notable; pueden permanecer infecciosos en el medio
ambiente durante largos períodos (Almeida, 2013).
Características morfológicas
La pared celular del S. aureus contiene polisacáridos, proteínas antigénicas y otras
sustancias, el péptidoglucano suministra el exoesqueleto rígido de la pared celular, el
péptidoglucano es importante en la patogenia de la infección así induce la producción
de interleucina-1 (pirógeno, endógeno) y de anticuerpos opsónicos en los monocitos; y
puede atraer químicamente a los leucocitos polimorfosnucleares, posee actividad
parecida a endotoxina, los ácidos teicoicos, polímeros de glicerol o fosfato ribitol, están
unidos al péptidoglucano de la bacteria, algunas cepas del Staphylococcus aureus
poseen cápsulas que inhiben la fagocitosis por los leucocitos polimorfonucleares a
menos que se encuentren presentes anticuerpos específicos, la mayor parte de las cepas
de Staphylococcus aureus poseen coagulasa, o factor de coagulación sobre la superficie
de la pared celular; la coagulasa se une de manera no enzimática al fibrinógeno y
produce la agregación de las bacterias (Almeida, 2013).
11
Escherichia coli
La E. coli es una bacteria que se encuentra normalmente en el tracto gastrointestinal de
los seres humanos y animales de sangre caliente, debido a su elevada presencia en el
tracto gastrointestinal y en las heces, la Echerichia coli se utiliza como el indicador
principal de contaminación fecal en la evaluación de la inocuidad de los alimentos y el
agua; la mayoría de las Escherichia coli son organismos comensales inofensivos cuando
se encuentran en su hábitat intestinal natural, las E. coli patógenas se distingue de otras
E. coli por su capacidad de provocar enfermedades mediante mecanismos
genéticamente controlados, como la producción de toxinas, la adhesión e invasión de
células huéspedes, la interferencia con el metabolismo celular y la destrucción de tejidos
(Brandl, 2006).
Características microbiológicas
La bacteria E. coli se caracteriza por ser un bacilo Gram negativo, no esporulante,
producción de indol a partir de triptófano, no utilización de citrato como fuente de
carbono y no producción de acetoína además, fermenta la glucosa y la lactosa con
producción de gas. Como todas las bacterias Gram negativas, la cubierta de Escherichia
coli consta de tres elementos: la membrana citoplasmática, la membrana externa y, entre
ambas, un espacio periplásmico constituido por péptido-glucano, vesta última estructura
confiere a la bacteria su forma y rigidez, y le permite resistir presiones osmóticas
ambientales relativamente elevadas, la Escherichia coli es una bacteria mesófila, su
óptimo de desarrollo se encuentra en el entorno de la temperatura corporal de los
animales de sangre caliente (Benvenutto, 2017).
2.2.3. MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros
componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos (Solano, 2005).
a) Medios de cultivo no selectivos
Son aquellos que permiten el crecimiento de una gran variedad de microorganismos(Castro, 2014).
12
Caldo cerebro-corazón.- La infusión de cerebro y corazón ha resultado ser
efectiva en el cultivo de una amplia variedad de microorganismos, incluidos
muchos tipos de patógenos, se ha utilizado como medio base para las nuevas
fórmulas de medios de cultivo cuando se suplementa con sangre o agentes
selectivos (Casado et al., 2012).
b) Medios de cultivo selectivo
Son aquellos que permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos determinado,
inhibiendo el desarrollo de los demás (Castro, 2014).
Agar Manitol salado.- es un medio de cultivo que se utiliza normalmente en
microbiología, permite el crecimiento de un determinado grupo de bacterias
mientras que inhibe el crecimiento de otras, este medio es importante en el
laboratorio clínico debido a que es capaz de distinguir los microorganismos
patogénicos en un corto periodo de tiempo, contiene una alta concentración (-
7.5%-10%) de sal (NaCl), haciéndolo selectivo para Staphylococcus debido a
que el nivel de NaCl es inhibitorio para la mayoría de las bacterias (Casado et
al., 2012).
Agar Mueller Hinton.- es un medio utilizado para realizar las pruebas de
susceptibilidad antimicrobiana en microorganismos aeróbicos por el método de
Bauer-Kirby, debido a su contenido en inhibidores de sulfonamidas,
trimetoprima y tetraciclina es bajo, la mayoría de los patógenos microbianos
crece satisfactoriamente (Rivas, Miliwebsky, & Deza, 2007).
Agar MacConkey.- las sales biliares y el cristal violeta ejercen una inhibición
significativa sobre las bacterias gram positivas, la lactosa y el indicador rojo
neutro permiten comprobar la degradación de ese disacárido; las colonias lactosa
positivas (Escherichia coli) aparecen roja con halo turbio; las lactosas negativas
(Salmonella spp.) son incoloras (Gentilini et al., 2007).
2.2.4. MÉTODOS DE ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD
El estudio de la sensibilidad bacteriana es una de las funciones más importantes de los
laboratorios de microbiología clínica pero la determinación de la sensibilidad no implica
solo realizar un conjunto de técnicas y medir los resultados, es necesario saber
13
interpretar los mismos y darles el significado que realmente tienen, para la
determinación de la sensibilidad se han utilizados métodos cuantitativos que permiten
determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM) y la concentración bactericida
mínima (CBM) y los métodos cualitativos (disco difusión); son aquellos que permiten
clasificar directamente a un microorganismo como sensible o resistente, siendo uno de
los métodos más utilizados en la práctica diaria por la obtención de datos de manera
rápida y la interpretación de los resultados (Wikler, 2006).
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
Es la concentración mínima capaz de inhibir el crecimiento de microorganismos,
cuando la CMI sea menor, la susceptibilidad del microorganismo será mayor al fármaco
usado (Botana, 2002).
Concentración Mínima Bactericida (CMB)
Corresponde a la mínima concentración de antibiótico que elimina el 99,9 % del
número original de bacterias. Refleja la capacidad de un fármaco de disminuir de forma
sustancial el número de bacterias (Botana, 2002).
Método de difusión por disco.
Consiste en depositar, en la superficie del agar de una caja petri previamente inoculada
con el microorganismo, discos de papel secante impregnados con los diferentes
sustancias, tan pronto el disco impregnado de la sustancia se pone en contacto con la
superficie húmeda del agar, el filtro absorbe agua y la sustancia difunde al agar, la
sustancia difunde radialmente a través del espesor del agar a partir del disco formándose
un gradiente de concentración transcurridas 18-24 horas de incubación los discos
aparecen rodeados por una zona de inhibición (Estrada, 2010).
2.2.5. Unidad de Análisis
Cervantes et al., (2014) clasifican taxonómicamente Staphylococcus aureus subsp.
aureus de la siguiente manera:
Taxonomía
Dominio: Bacteria
Filo: Firmicutes
14
Clase: Bacili
Orden: Bacillales
Familia: Staphylococcaceae
Género: Staphylococcus
Especie: S. aureus
Subespecie: aureus
Haugen et al., (2007) clasifican taxonómicamente Escherichia coli de la siguiente
manera:
Taxonomía
Dominio: Bacteria
Filo: Proteobacteria
Clase: Gammaproteobacteria
Orden: Enterobacteriales
Familia: Enterobacteriaceae
Género: Escherichia
Especie: E. coli
15
CAPÍTULO III
3.1 HIPÓTESIS
Las cepas bacterianas certificadas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus
presentan sensibilidad bacteriana al aceite de eucalipto (Eucalyptus spp.).
3.2. OBJETIVOS
3.2.1. Objetivo General:
Evaluar in vitro el efecto antimicrobiano del aceite esencial de eucalipto (Eucaliptus
spp.) sobre cepas certificadas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus subsp.
aureus.
3.2.2. Objetivos Específicos:
1 Determinar la concentración del aceite de eucalipto (30%, 60% y 90%) de mayor
sensibilidad para las cepas bacterianas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus
subsp. aureus.
2 Determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) y la concentración mínima
bactericida (CMB) del aceite esencial de eucalipto (Eucaliptus spp.) sobre cepas
certificadas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus subsp. aureus.
3 Determinar la sensibilidad bacteriana mediante halos de inhibición al aplicar
aceite de eucalipto (Eucaliptus spp.) en las cepas bacterianas de Escherichia coli y
Staphylococcus aureus subsp. aureus.
16
CAPÍTULO IV
MATERIALES Y MÉTODOS
4.1.UBICACIÓN GEOGRÁFICA
La presente investigación se realizó en la Universidad Técnica de Ambato, en la
Facultad de Ciencias Agropecuarias campus Querochaca ubicado a 1km de la vía
Cevallos-Quero de la provincia de Tungurahua con las coordenadas geográficas: Latitud
1°22'3.45"S, Longitud 78°36'30.75"O y una altitud de 2883 msnm.
4.2.CARACTERÍSTICAS DEL LUGAR
La investigación se desarrolló en el laboratorio de Bacteriología de la Carrera de
Medicina Veterinaria y Zootecnia, en el que se maneja un ambiente controlado con
condiciones ambientales de 19 °C y 40 % de humedad. Las condiciones meteorológicas
del campus Querochada se presentan en la tabla 1.
Tabla 1. Condiciones meteorológicas
PARÁMETRO VALOR
Temperatura: 13°
Humedad relativa: 78%
Precipitación: 10mm
Vientos: 11Km/hora
4.3.EQUIPOS Y MATERIALES
4.3.1. Material Experimental
Aceite esencial de Eucalipto (Eucalyptus spp.)
4.3.2. Agentes Biológicos
Cepa bacteriana Staphylococus aureus subsp. aureus ATCC292113
Cepa bacteriana Echerichia coli ATCC25922
17
4.3.3. Equipos
Cámara de flujo laminar
Incubadora
Agitador magnético con calentador.
Refrigeradora
Autoclave
Espectofotometro
4.3.4. Materiales de laboratorio
Utensilios y vidriería de laboratorio.
Pipetas volumétricas de 1 ml, 5 ml, y 10 ml.
Discos en blanco de sensibilidad bacteriana marca OXOID.
Pizeta.
Lámparas de alcohol.
Papel aluminio.
Asas metálicas.
Cajas Petri desechables.
Aspersor (atomizador).
Espátulas.
Algodón.
Gasa.
Cepillos para limpieza de materiales.
Mascarillas.
Mandiles.
Guantes.
Gorros.
Calculadora.
Cuaderno de Apuntes.
Esferos, lápices.
4.3.5. Sustancias o Reactivos
Agar Muller Hinton.
Agar MacConkey.
18
Agar Sal Manitol
Caldo Cerebro- Corazón.
Suero fisiológico estéril.
Tubo # 0.5 de la escala de McFarland.
Etanol al 98%.
Agua destilada.
4.4.FACTORES EN ESTUDIO
El proyecto de investigación tuvo como factores de estudio:
A) Aceite esencial de eucalipto (Eucalytus spp.)
A1. Testigo etanol al 98%
A2. 30% dilución del aceite de eucalipto con etanol
A3. 60% dilución del aceite de eucalipto con etanol
A4. 90% dilución del aceite de eucalipto con etanol
B) Cepas Bacterianas
B1. Staphylococus aureus subsp. aureus ATCC292113
B2. Echerichia coli ATCC25922
4.5.TRATAMIENTOS
La investigación evaluó el efecto antimicrobiano sobre cepas certificadas de: Echerichia
coli ATCC25922 y Staphylococus aureus subsp. aureus ATCC292113 utilizando las
siguientes diluciones (T, 30%, 60% y 90%) de aceite de eucalipto para las dos cepas,
aplicándose en discos de sensibilidad marca Oxoid impregnados con 0,2ml de cada
concentración del aceite de eucalipto y ubicados en la superficie del agar Muller Hinton.
Con un total de 20 repeticiones, repartidas en cuatro discos por cada caja Petri. Los
tratamientos se presentan en la tabla 2 y 3.
19
Tabla 2. Cepas y concentraciones del aceite de eucalipto (Eucalyptus spp.)
Cepas bacterianas Aceite de Eucalipto
T= etanol 98%
B1 Echerichia coli A1= 30 %
B2 Staphylococus aureus subsp. Aureus A2= 60 %
A3= 90%
B=Bacterias, T=Testigo, A=Aceite
Tabla 3. Número de tratamientos y repeticiones para Echerichia coli yStaphylococus aureus subsp. aureus.
Número Tratamientos Descripción
T Etanol 98%
1 B1A1 Se realizó cinco repeticiones con 4 discos desensibilidad empapados cada uno con 0,2ml deaceite de eucalipto al 30 %, 60%, y 90%respectivamente en cada caja petri y para cada cepabacteriana, realizando el mismo proceso para eltestigo empapados de etanol al 98%.
2 B1A2
3 B1A3
4 B2A1
5 B2A2
6 B2A3
B=Bacteria, A=Aceite
4.6.DISEÑO EXPERIMENTAL
El diseño experimental utilizado fue el diseño completamente al azar (DCA) 2X4, con
20 repeticiones. Se realizó el análisis de varianza y la prueba de TUKEY al 5% para
comparar los tratamientos.
4.7.MANEJO DE LA INVESTIGACIÓN
4.7.1. Obtención del material biológico
Las cepas certificadas Echerichia coli ATCC25922 y Staphylococus aureus subsp.
aureus ATCC292113 se las adquirió en el laboratorio MEDIBAC.
20
4.7.2. Obtención del material experimental
El aceite de eucalipto se lo adquirió en la empresa SiFaL, mediante el método de
destilación por arrastre de vapor con una concentración al 100% de pureza.
4.7.3. Elaboración de las diluciones del aceite de eucalipto
Se utilizó etanol al 98% como solvente, las diluciones se calcularon mediante el método
de dilución, las mismas fueron calculadas en 5 ml de volumen, como se observa en la
tabla 4.
Tabla 4. Diluciones del aceite esencial de Eucalipto (Eucalyptus spp.)
DILUCIONES
SUSTANCIAS 30% 60% 90%
ETANOL AL 98% 3,5ml 2ml 0,5ml
ACEITE DE EUCALIPTO 1,5ml 3ml 4,5ml
4.7.4. Elaboración de medios de cultivo
Se prepararon los medios de cultivo para la experimentación según lo recomendado por
la casa comercial.
4.7.5. Activación de las Cepas
Para la activación de las cepas Escherichia coli y Staphylococcus aureus subps. aureus,
se hidrató las cepas bacterianas, según reporta la casa comercial, y se procedió a realizar
la siembra en agar MacConkey para Escherichia coli y agar Manitol Salado para
Staphylococcus aureus subsp. aureus por estriamiento con asa bacteriológica en caja
petri rotulada.
4.7.6. Preparación de discos de sensibilidad
Se ubicaron 20 discos de sensibilidad por cada concentración 30%, 60% y 90%,
comprendidos en 4 discos por cada caja Petri, obteniendo un total de 5 cajas por cada
concentración y un total de 20 repeticiones, posteriormente con ayuda de un pipeta de
21
pasteur se impregno 0.2ml para cada disco con las concentraciones respectivas de aceite
de Eucalipto (Eucalyptus spp.).
4.8.VARIABLES RESPUESTA
4.8.1. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
Se realizó de acuerdo con la metodología usada por Lujan (2006), para lo cual se tomó
cuatro colonias bien aisladas de cada una de las cepas y con la ayuda de un asa
bacteriológica se las transfirió a 5 ml de caldo Cerebro-Corazón y se dejó incubar a
37°C durante 2 horas hasta que se manifestó una turbidez ligeramente visible, mediante
mediciones en el espectrofotómetro, con el fin de obtener un valor de 0.5 de
absorbancia.
Posteriormente los tubos fueron incubados a 37° C por 24 horas y una vez transcurrido
este tiempo los resultados fueron los siguientes:
Cepa Escherichia coli
En el tubo Nº 1 se colocó 1 ml de la dilución de la cepa en caldo Cerebro-
Corazón más 1 ml del aceite esencial de eucalipto al 30 %, obteniendo un valor
de 640nm.
En el tubo Nº 2 se colocó 1 ml de la dilución de la cepa en caldo Cerebro-
Corazón más 1 ml del aceite esencial de eucalipto al 60 %, obteniendo un valor
de 542nm.
En el tubo Nº 3 se colocó 1 ml de la dilución de la cepa en caldo Cerebro-
Corazón más 1 ml del aceite esencial de eucalipto al 90 %, obteniendo un valor
de 539nm.
Cepa Staphylococcus aureus subps. aureus
En el tubo Nº 1 se colocó 1 ml de la dilución de la cepa en caldo Cerebro-
Corazón más 1 ml del aceite esencial de eucalipto al 30 %, obteniendo un valor
de 615nm.
En el tubo Nº 2 se colocó 1 ml de la dilución de la cepa en caldo Cerebro-
Corazón más 1 ml del aceite esencial de eucalipto al 60 %, obteniendo un valor
de 450nm.
22
En el tubo Nº 3 se colocó 1 ml de la dilución de la cepa en caldo Cerebro-
Corazón más 1 ml del aceite esencial de eucalipto al 90 %, obteniendo un valor
de 480nm.
4.8.2. Concentración Mínima Bactericida (CMB)
Se tomó como referencia el procedimiento realizado por Sadiki et al., (2014) donde para
establecer la CMB de las bacterias certificadas de Staphylococcus aureus subsp aureus
ATCC29213 y Escherichia coli ATCC25922, se tomaron los tubos y se sembró en agar
Mueller Hinton dejando incubar a 37°C por 24 horas y posteriormente observando el
crecimiento de colonias, la concentración al 30% identificó desarrollo de colonia para
las dos cepas bacterianas, mientras que las concentraciones al 60% y 90% no existió
crecimiento de colonias.
4.8.3. Sensibilidad bacteriana
Con un asa bacteriológica se tomó cuatro colonias por igual para cada cepa,
posteriormente se inocularon en 5ml de caldo Cerebro-Corazón y se incubaron a 37°C
por 2 horas hasta conseguir la turbidez del tubo N°5 de la escala de MacFarland
evaluado por espectofotómetro y una vez estandarizada la cepa se procedió a cultivar
con ayuda de un hisopo estéril por estriado múltiple en agar Mueller Hinton, dejando
reposar por 15 minutos antes de colocar los discos de sensibilidad OXOID impregnados
con 0,2ml de cada concentración de aceite de Eucalipto y ubicándolos en cada caja
petri. Con ayuda de una pinza estéril se colocó 4 discos de sensibilidad en la superficie
de cada placa distribuidos, de forma que no se produjo superposición de los halos de
inhibición y se llevó a incubación a 37°C por 24 horas y finalmente mediante el uso de
una regleta se realizó la medición de los halos de inhibición.
4.9.PROCESAMIENTO DE LA INFORMACION
El análisis estadístico, se realizó utilizando el Programa SPSS 2017 versión 23.
23
CAPÍTULO V
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1. RESULTADOS
5.1.1. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
Tabla 5. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del aceite esencial de eucalipto(Eucaliptus spp.)
En la tabla 5 se presenta la Concentración Mínima Inhibitoria en las diluciones al 60% y
90% de aceite de Eucalipto para la cepa Staphylococcus aureus subsp. aureus con un
valor de 450nm y 480nm respectivamente, mientras que para Escherichia coli las
diluciones al 60% y 90% presento un valor de 542nm y 539nm respectivamente,
determinando así que el aceite esencial de Eucalipto es eficaz al inhibir el crecimiento
de ambas cepas bacterianas; tanto al 60% y 90% de dilución siendo de mayor
efectividad para Staphylococcus aureus subsp. aureus.
Cepa
Concentración Mínima Inhibitoria
30% 60% 90%
Inóculoestandarizado
Turbidez por espectofotometría
E. coli 650nm 640nm 542nm 539nm
S. aureus 625nm 615nm 450nm 480nm
nm= Nanómetros
24
5.1.2. Concentración Mínima Bactericida (CMB)
Tabla 6. Concentración Mínima Bactericida (CMB) del aceite esencial deEucalipto (Eucaliptus spp.)
Concentración Mínima Bactericida
30% 60% 90%
Cepa Crecimiento de colonias
Escherichia coli + - -
Staphylococcus aureus + - -
Positivo (+), Negativo (-)
En la tabla 6 se demuestra la Concentración Mínima Bactericida (CBM) en la cual no
existió crecimiento de colonias en las diluciones al 60% y 90% del aceite de Eucalipto
para las dos cepas bacterianas Escherichia coli y Staphylococcus aureus subsp. aureus
mientras que la dilución al 30% del aceite presentó un desarrollo de colonias para
ambas cepas de la investigación.
5.1.3. Prueba de difusión por disco
Tabla 7. Sensibilidad bacteriana (mm) del aceite de Eucalipto (Eucaliptus spp)sobre cepas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus subsp. aureus .
CEPAS CONCENTRACIONES
30% 60% 90% E.E Valor de P
E.coli 10,25b 10,65ab 10,95 a 0,1230 <.0,01
S. aureus 10,95b 14,45a 13,65a 0,4820 <.0,001
ab= Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p < 0,05). (E.E= Error estándar.
En la tabla 7 se demuestra el efecto antibacteriano del aceite esencial de eucalipto sobre
ambas cepas bacterianas, siendo más específica para Staphylococcus aureus subsp.
aureus a la dilución del 60% presentando un valor de 14,45mm, mientras que para la
cepa Escherichia coli la dilución de mayor eficacia resulto ser del 90% con un valor de
10.95mm, las diluciones al 30% y 60% no son significativamente diferentes (p < 0,05)
ya que presentan valores de 10,25mm y 10,65mm respectivamente, misma relación que
25
se manifiesta con las diluciones al 60% y 90% con valores de 10,65mm y 10,95mm para
la cepa de Escherichia coli; por otro lado los resultados para la cepa Staphylococcus
aureus subsp. aureus muestra que las diluciones al 60% y 90% no son
significativamente diferentes (p > 0,05) siendo estadísticamente iguales con valores de
14,45mm y 13,65mm respectivamente, en relación al 30% con 10,95mm en los halos de
inhibición.
Al analizar los resultados permiten aceptar la hipótesis planteada con respecto a la
sensibilidad bacteriana del aceite esencial de Eucalipto (Eucalyptus spp.).
5.2. DISCUSIÓN
El aceite de eucalipto utilizado para la presente investigación mostró resultados
positivos al inhibir in vitro el crecimiento de las cepas bacterianas Escherichia coli
ATCC25922 y Staphylococcus aureus subsp aureus ATCC292113; el uso
indiscriminado de los antibióticos ha generado una respuesta de supervivencia por parte
de los microorganismos estableciendo la temática de la resistencia bacteriana (Cabrera
et al., 2007), por lo cual se presenta como alternativa el empleo de productos naturales
para reducir este problema, por lo que existe un gran interés en el efecto antimicrobiano
de los aceites esenciales radicando la importancia en su estructura química (Reyes et al.,
2012), conociendo así que los aceites esenciales son una opción ante la resistencia de
antibióticos de cepas bacterianas muy perjudiciales para la salud (Esquivel et al.,
2010). Al analizar los resultados obtenidos en el método de difusión en agar, podemos
considerar a esta metodología indicada para evaluar de forma cualitativa y cuantitativa
la actividad antibacteriana del aceite de eucalipto misma metodología usada por Yañez
y Cuadro (2012); Sebei et al, (2015); Pecarski et al, (2014) y Ben Hassine et al, (2012),
la cual consiste en la medición de halos de inhibición generado por el agente
antibacteriano al contacto con la cepa bacteriana (Cona, 2002).
En lo que respecta a la determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria se
evidenció un efecto marcado del aceite esencial de eucalipto al emplear diluciones al
30%, 60% y 90% sobre el crecimiento bacteriano de las cepas en estudio,
demostrándose que la utilización de diluciones menores del aceite esencial de eucalipto
como al 25% utilizada por Bachir y Benali (2012), posee la capacidad de reducir la CMI
y la CMB, así como también al 20% empleada por Yáñez y Cuadro (2012), este mismo
comportamiento reporta Brochot et al., (2017), al utilizar 3,52% de cada uno de los
aceites empleados eucalipto, canela, zanahoria y romero, mostrando efecto inhibitorio in
26
vitro sobre S. aureus y E coli. El efecto antibacterial reportado en los estudios antes
mencionados probablemente puede estar relacionado a la presencia de compuestos que
tiene propiedades antimicrobianas, según Marzoug et al., (2011), esta se debe a la
presencia de 1,8-cineol que presenta el aceite esencial de eucalipto, respaldado también
por el estudio realizado por Elaissi et al., (2012) y Bugarin et al., (2014). En el estudio
realizado por Ben Hassine et al., (2012) la actividad antibacteriana del aceite radica en
la hidrofobicidad del mencionado compuesto químico, esta particularidad les permite
estar cerca de la membrana de las células lipídicas de las bacterias, alterando la
estructura celular y haciéndola permeable permitiendo así la fuga de algunos iones y
otros metabolitos, y finalmente responsable de la muerte celular.
La prueba de sensibilidad antibacteriana del aceite de eucalipto sobre Staphylococcus
aureus subsp aureus reportó un valor máximo de 14,45mm, al igual que Ait-Ouazzou et
al.,(2011) presentó halos de 14mm como valor máximo, por otro lado Elaissi, et al.,
(2012) obtuvo halos de 9mm, mientras que Bugarin, et al.,(2014) demuestra que la
actividad antibacteriana del aceite esencial de eucalipto fue más efectivo a una
concentración del 100% de aceite contra esta cepa bacteria mostrando valores de 26mm
de diámetro al igual que Bachir & Benali (2012), reportó un diámetro de 26,2mm
siendo estos valores superior a los encontrados hasta el momento. El halo de inhibición
de mayor diámetro que mostró la prueba de sensibilidad para Escherichia coli fue de
10,95mm, valor superior en comparación al que presentó Elaissi et al., (2012) que
obtuvo un diámetro máximo de 8mm, Vieira et al., (2017) también obtuvo un diámetro
máximo de halos de sensibilidad de 9mm por otro lado Bugarin et al (2014), encontró
halos con valores de 18mm de diámetro, mientras que Ait-Ouazzou et al. (2011) no
reporto halos para esta cepa bacteriana E. coli.
27
CAPÍTULO VI
CONCLUSIONES, BIBLIOGRAFÍA Y ANEXOS
6.1. CONCLUSIONES
Se evaluó in vitro el efecto antimicrobiano del aceite esencial de eucalipto
(Eucalyptus spp.) sobre las cepas certificadas de Escherichia coli y
Staphylococcus aureus subsp aureus, presentando inhibición del crecimiento
bacteriano a partir de la dilución al 30%, 60% y 90% para cada cepa bacteriana
evaluada.
Se determinó la concentración de aceite de eucalipto de mayor sensibilidad para
la cepa de Escherichia coli siendo esta al 90% y para Staphylococcus aureus
subsp aureus la dilución de mayor sensibilidad fue al 60%.
Determinamos la Concentración Mínima Inhibitoria del aceite esencial de
eucalipto (Eucaliptus spp.) sobre la cepa certificada de Escherichia coli
obteniendo el mejor dato al 90% y para Staphylococcus aureus subsp aureus al
60% y la Concentración Mínima Bactericida no reportó crecimiento bacteriano
para las cepas estudiadas.
Se determinó la sensibilidad bacteriana mediante halos de inhibición al aplicar
aceite de eucalipto (Eucaliptus spp.), obteniendo un diámetro eficaz de 14.45mm
sobre la cepa Staphylococcus aureus subsp aureus y para Escherichia coli un
diámetro de 10,95mm.
28
6.2. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Bachir, R. G., & Benali, M. (2012). Antibacterial activity of the essential oils from the
leaves of Eucalyptus globulus against Escherichia coli and Staphylococcus
aureus. Asian Pacific journal of tropical biomedicine, 2(9), 739-742.
Acosta, L. O. (2000). Composición química del aceite esencial de Thymus vulgaris
L.“Tomillo” por Cromatografía de Gases-Espectómetro de Masa GC/MS y
análisis de su actividad antimicrobiana (Doctoral dissertation, Tesis para optar
al título profesional del Químico Farmacéutico. Facultad de Farmacia y
Bioquímica. UNMSM. Lima).
Ait-Ouazzou, A., Lorán, S., Bakkali, M., Laglaoui, A., Rota, C., Herrera, A., Pagán, R.
and Conchello, P. (2011), Chemical composition and antimicrobial activity of
essential oils of Thymus algeriensis, Eucalyptus globulus and Rosmarinus
officinalis from Morocco. J. Sci. Food Agric., 91: 2643–2651.
doi:10.1002/jsfa.4505
Almeida Laz, C. (2013). Incidencia Staphylococcus aureus en la carne de pollo faenado
que se expende en el mercado municipal del cantón Quevedo (Bachelor's thesis,
Universidad de Guayaquil. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia).
Alzamora, L., Morales, L., Armas, L., & Fernández, G. (2001). Medicina tradicional en
el Perú: Actividad antimicrobiana in vitro de los aceites esenciales extraídos de
algunas plantas aromáticas. In Anales de la Facultad de Medicina (Vol. 62, No.
2). Universidad Nacional Mayor de San Marcos.
Bakkali, F., Averbeck, S., Averbeck, D., & Idaomar, M. (2008). Biological effects of
essential oils–a review. Food and chemical toxicology, 46(2), 446-475.
Bandoni, a. l., Retta, d., Di Leo Lira, p. m., & Baren, c. m. v. (2009). Son realmenteútiles los aceites esenciales. Boletín Latinoamericano y del Caribe de PlantasMedicinales y Aromáticas, 8(5).
Bassolé, I. H. N., & Juliani, H. R. (2012). Essential oils in combination and their
antimicrobial properties. Molecules, 17(4), 3989-4006.
Begossi A. Use of ecological methods in ethnobotany: Diversity Indices. Econ Bot
1996; 50(3): 280-9. [http://dx.doi.org/10.1007/BF02907333]
29
Bello, A. (1999). Estudios de aceites esenciales de especie Myrtaceae de la flora dePinar del Río (Doctoral dissertation, Tesis de Maestría de Universidad del Rio].Brasil).
Ben Hassine, D., Abderrabba, M., Yvon, Y., Lebrihi, A., Mathieu, F., Couderc, F., &
Bouajila, J. (2012). Chemical composition and in vitro evaluation of the
antioxidant and antimicrobial activities of Eucalyptus gillii essential oil and
extracts. Molecules, 17(8), 9540-9558.
Benvenutto Vargas, V. P. (2017). Determinación de Escherichia coli enteropatógena
(ECEP) en agua de mar del Circuito de Playas de la Costa Verde.
Boland, D. J., Brooker, M. I. H., Chippendale, G. M., Hall, N., Hyland, B. P. M.,
Johnston, R. D., ... & Turner, J. D. (Eds.). (2006). Forest trees of Australia.
CSIRO publishing.
Botana, L. (2002). Farmacología y Terapeútica Veterinaria. Getafe: McGRAWHILL.
Brandl, M.T. 2006. Fitness of human enteric pathogens on plants and
implications for food safety. Annual Review of Phytopathology, 44: 367–392
Boulekbache-Makhlouf, L., Meudec, E., Chibane, M., Mazauric, J. P., Slimani, S.,
Henry, M., ... & Madani, K. (2010). Analysis by high-performance liquid
chromatography diode array detection mass spectrometry of phenolic
compounds in fruit of Eucalyptus globulus cultivated in Algeria. Journal of
agricultural and food chemistry, 58(24), 12615-12624.
Brako, L., & Zarucchi, J. L. (1993). Catalogue of the flowering plants and
Gymnosperms of Peru. Catálogo de las Angiospermas y Gimnospermas del
Perú. Monographs in Systematic Botany from the Missouri Botanical
Garden., 45, 1-1286.
Brochot A, Guilbot A, Haddioui L, Roques C. antibacterial, antifungal, and antiviral
effects of three essential oil blends. MicrobiologyOpen. 2017;6:e459.
https://doi.org/10.1002/mbo3.459
Bugarin, D., Grbović, S., Orčič, D., Mitić-Ćulafić, D., Knežević-Vukčević, J., &
Mimica-Dukić, N. (2014). Essential oil of Eucalyptus gunnii Hook. as a novel
source of antioxidant, antimutagenic and antibacterial agents. Molecules, 19(11),
19007-19020.
30
Burt, S. (2004). Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in
foods—a review. International journal of food microbiology, 94(3), 223-253.
Burt, S. A. (2007). Antibacterial activity of essential oils: potential applications infood (Doctoral dissertation, Utrecht University).
Cabrera, C., & Gomez, R., & Zúñiga, A. (2007). La resistencia de bacterias a
antibióticos y desinfectantes una manifestación de los mecanismos de
supervivencia y adaptación. Colombia Medica, 38(2), 149-158.
Casado, C., Torrico, G., & Medina, M. (2012). Medios de cultivo en un laboratorio de
microbiología. Revista de Internet.
Cervantes-García, E., García-González, R., & Salazar-Schettino, P. M. (2014).
Características generales del Staphylococcus aureus. Revista Latinoamericana
de Patología Clínica y Medicina de Laboratorio, 61(1), 28-40.
Chao, L. K., Hua, K. F., Hsu, H. Y., Cheng, S. S., Liu, J. Y., & Chang, S. T. (2005).
Study on the antiinflammatory activity of essential oil from leaves of
Cinnamomum osmophloeum. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 53(18), 7274-7278.
Cona, T. (2002). Condiciones para un buen estudio de susceptibilidad mediante test de
difusión en agar. Revista chilena de infectología, 19, 77-81.
Correa, J. S., Monteiro, E. A., Pavanelli, M. F., & Biazon, A. C. B. (2016). Influência
do Extrato Hidroetanólico das Folhas de Tropaeolum majus na Restauração
Tecidual em Lesões Cutâneas. Saúde e Pesquisa, 9(1), 101-109.
Damjanović-Vratnica, B., Ðakov, T., Šuković, D., & Damjanović, J. (2011).
Antimicrobial effect of essential oil isolated from Eucalyptus globulus Labill.
from Montenegro. Czech Journal of Food Sciences, 29(3), 277-284.
Dixit, A., Rohilla, A., & Singh, V. (2012). Eucalyptus globulus: A new perspective in
therapeutics. Int J Pharm Chem Sci, 1(4), 1678-83.
Domingo Santos, J. M. (2010). El Eucalipto y los Suelos bajo clima Mediterráneo.
Dutra, R. C., Leite, M. N., & Barbosa, N. R. (2008). Quantification of phenolic
constituents and antioxidant activity of Pterodon emarginatus vogel
seeds. International Journal of Molecular Sciences, 9(4), 606-614.
31
Egawa, H., Tsutsui, O., Tatsuyama, K., & Hatta, T. (1977). Antifungal substances found
in leaves of Eucalyptus species.Cellular and Molecular Life Sciences, 33(7),
889-890.
El Asbahani, A., Miladi, K., Badri, W., Sala, M., Addi, E. A., Casabianca, H., ... &
Elaissari, A. (2015). Essential oils: from extraction to
encapsulation. International journal of pharmaceutics, 483(1), 220-243.
Elaissi, A., Rouis, Z., Mabrouk, S., Salah, K. B. H., Aouni, M., Khouja, M. L., ... &
Harzallah-Skhiri, F. (2012). Correlation between chemical composition and
antibacterial activity of essential oils from fifteen Eucalyptus species growing in
the Korbous and Jbel Abderrahman Arboreta (North East
Tunisia).Molecules, 17(3), 3044-3057.
Elliot, W. R., & Jones, D. L. (1990). Encyclopaedia of Australian plants suitable for
cultivation. Volume 5. Lothian Publishing Company Pty Ltd.
Esquivel-Ferriño, P., Pedroza-Cantú, G., Sandoval-Montenegro, N., Mata-Martínez, R.
E., Mendoza-Obregón, L., & Balderas-Rentería, I. (2010). Ensayo químico
dirigido y estudio del efecto antimicrobiano in vitro de algunos condimentos
empleados en la cocina mexicana. RESPYN, 10, 23-25
Estapé, J. V., & Zboromyrska, Y. (2012). Brotes epidémicos causados por Escherichia
coli diarreagénicas. Gastroenterología y Hepatología, 35(2), 89-93.
Estrada, S. (2010). Determinación de la actividad antibacteriana in vitro de los extractos
de romero (Rosmarinus officinalis) y tomillo (Thymus vulgaris). Ecuador:
Escuela Politécnica Superior de Chimborazo.
Gachkar, L., Yadegari, D., Rezaei, M. B., Taghizadeh, M., Astaneh, S. A., & Rasooli, I.
(2007). Chemical and biological characteristics of Cuminum cyminum and
Rosmarinus officinalis essential oils. Food chemistry, 102(3), 898-904.
Gentilini, E., Reinoso, E., Echeverría, M., & Leardini, N. (2007).Microbiología
veterinaria. N. O. Stanchi, & P. E. Martino (Eds.). Buenos Aires: Inter-Médica.
Gilles, M., Zhao, J., An, M., & Agboola, S. (2010). Chemical composition and
antimicrobial properties of essential oils of three Australian Eucalyptus
species. Food Chemistry, 119(2), 731-737.
Haugen, B. J., Pellett, S., Redford, P., Hamilton, H. L., Roesch, P. L., & Welch, R. A.
(2007). In vivo gene expression analysis identifies genes required for enhanced
32
colonization of the mouse urinary tract by uropathogenic Escherichia coli strain
CFT073 dsdA. Infection and immunity, 75(1), 278-289.
Hermann, R., & von Richter, O. (2012). Clinical evidence of herbal drugs as
perpetrators of pharmacokinetic drug interactions. Planta médica, 78(13), 1458-
1477.
Kamatou, G. P. P., Viljoen, A. M., Gono-Bwalya, A. B., Van Zyl, R. L., Van Vuuren, S.
F., Lourens, A. C. U., ... & Steenkamp, P. (2005). The in vitro pharmacological
activities and a chemical investigation of three South African Salvia
species. Journal of Ethnopharmacology, 102(3), 382-390.
Kuroda, M., Ohta, T., Uchiyama, I., Baba, T., Yuzawa, H., Kobayashi, I., ... & Lian, J.
(2001). Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus
aureus. The Lancet,357(9264), 1225-1240.
Lo Cantore, P., Shanmugaiah, V., & Iacobellis, N. S. (2009). Antibacterial activity of
essential oil components and their potential use in seed disinfection. Journal of
agricultural and food chemistry, 57(20), 9454-9461.
Lozoya, X., & Cañigueral, S. (2006). Sobre la Fitoterapia. Boletin Latinoamericano y
del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, 5(4), 67.
Luján, C. G. (2006). Actividad antibacteriana de extractos vegetales en cepas
hospitalarias de" Staphylococcus aureus" con resistencia múltiple (Doctoral
dissertation, Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro).
Madsen, H. L., & Bertelsen, G. (1995). Spices as antioxidants.Trends in Food Science& Technology, 6(8), 271-277.
Martínez, R. M., Cerrilla, M. E. O., Haro, J. G. H., Garza, J. R. K., Ramos, J. J. Z., &
Robles, R. S. (2015). Uso de aceites esenciales en animales de
granja. Interciencia, 40(11), 744.
Marzoug, H. N. B., Romdhane, M., Lebrihi, A., Mathieu, F., Couderc, F., Abderraba,
M., & Bouajila, J. (2011). Eucalyptus oleosa essential oils: chemical
composition and antimicrobial and antioxidant activities of the oils from
different plant parts (stems, leaves, flowers and fruits). Molecules, 16(2), 1695-
1709.
33
Medina, D., Mendoza, M., Núñez, L., Pacheco, D. (2013), Actividad Antimicrobiana de
Extractos de Ajo, Canela y Epazote contra Escherichia coli y Staphylococcus
aureus. Ciencias Biologicas y Quimicas de la Salud.
Mossi, A. J., Astolfi, V., Kubiak, G., Lerin, L., Zanella, C., Toniazzo, G., ... & Restello,
R. (2011). Insecticidal and repellency activity of essential oil of Eucalyptus sp.
against Sitophilus zeamais Motschulsky (Coleoptera, Curculionidae).Journal of
the Science of Food and Agriculture, 91(2), 273-277.
Patra, A. K., & Saxena, J. (2010). A new perspective on the use of plant secondary
metabolites to inhibit methanogenesis in the rumen. Phytochemistry, 71(11),
1198-1222.
Pecarski, D. M., Knežević-Jugović, Z. D., Dimitrijević-Branković, S. I., Mihajilovski,
K. R., & Janković, S. M. (2014). Comparative analysis of the chemical
composition and antimicrobal activities of some of Lamiaceae family species
and Eucaliptus (Eucaliptus globules M). Acta Periodica Technologica, (45),
201-213.
Reyes Jurado, F., Palou, E., & López Malo, A. (2012). Vapores de aceites esenciales:
alternativa de antimicrobianos naturales.Temas selectos de Ingeniería de
Alimentos, 6(1), 29-39.
Rivas, M., Miliwebsky, E., & Deza, N. (2007). Manual de procedimientos, Diagnóstico
y caracterización de Escherichia coli O157 productor de toxina Shiga a partir de
especímenes clínicos. Buenos Aires: Instituto Nacional de Enfermedades
Infecciosas.
Sadiki, M. O. U. L. A. Y., Balouiri, M. O. U. N. Y. R., Barkai, H. A. S. S. A. N.,
Maataoui, H. A. J. A. R., Koraichi, S. I., & Elabed, S. O. U. M. Y. A. (2014).
Synergistic antibacterial effect of Myrtus communis and Thymus vulgaris
essential oils fractional inhibitory concentration index. Int J Pharm Pharm Sci,6,
121-124.
Safaei-Ghomi, J., & Ahd, A. A. (2010). Antimicrobial and antifungal properties of the
essential oil and methanol extracts of Eucalyptus largiflorens and Eucalyptus
intertexta.Pharmacognosy magazine, 6(23), 172.
34
Salazar Aranda, R., Rodríguez, T., Yael, C., Alanís Garza, B. A., Pérez López, L. A., &
Waksman de Torres, N. (2009). Evaluación de la actividad biológica de
productos herbolarios comerciales. Medicina universitaria, 11(44), 156-164.
Silva, J., Abebe, W., Sousa, S. M., Duarte, V. G., Machado, M. I. L., & Matos, F. J. A.
(2003). Analgesic and anti-inflammatory effects of essential oils of
Eucalyptus. Journal of ethnopharmacology, 89(2), 277-283.
Singh, H. P., Kaur, S., Negi, K., Kumari, S., Saini, V., Batish, D. R., & Kohli, R. K.
(2012). Assessment of in vitro antioxidant activity of essential oil of Eucalyptus
citriodora (lemon-scented Eucalypt; Myrtaceae) and its major constituents. LWT-
Food science and Technology, 48(2), 237-241.
Solano, C. (2005). Microbiología general (Prácticas). Retrieved March 13, 2017, from
http://www.unavarra.es/genmic/microgral/manual practicas micagral.pdf
Stackpole, D. J., Vaillancourt, R. E., Alves, A., Rodrigues, J., & Potts, B. M. (2011).
Genetic variation in the chemical components of Eucalyptus globulus wood. G3:
Genes, Genomes, Genetics, 1(2), 151-159.
Stockwell, C. (1988). Nature's pharmacy: a history of plants and healing. Random
House (UK).
Sussmann, O., Mattos, L., & Restrepo, A. (2001). Resistencia bacteriana. Hospital
Universitario San Ignacio. Unidad de Infectología. Bogotá–Colombia, 43(1), 91.
Takahashi, T., Kokubo, R., & Sakaino, M. (2004). Antimicrobial activities of
eucalyptus leaf extracts and flavonoids from Eucalyptus maculata. Letters in
applied microbiology, 39(1), 60-64.
Tyagi, A. K., & Malik, A. (2011). Antimicrobial potential and chemical composition of
Eucalyptus globulus oil in liquid and vapour phase against food spoilage
microorganisms. Food Chemistry, 126(1), 228-235.
Vecchio, M. G., Loganes, C., & Minto, C. (2016). Beneficial and Healthy Properties of
Eucalyptus Plants: A Great Potential Use.The Open Agriculture Journal, 10(1).
Veiga-Junior, V. F. (2008). Estudo do consumo de plantas medicinais na Região
Centro-Norte do Estado do Rio de Janeiro: aceitação pelos profissionais de
saúde e modo de uso pela população. Rev bras farmacogn, 18(2), 308-13.
35
Vidal, J. E., Ludewick, H. P., Kunkel, R. M., Zähner, D., & Klugman, K. P. (2011). The
LuxS-dependent quorum-sensing system regulates early biofilm formation by
Streptococcus pneumoniae strain D39. Infection and immunity, 79(10), 4050-
4060.
Vieira, M., Bessa, L. J., Martins, M. R., Arantes, S., Teixeira, A. P. S., Mendes, Â.,
Martins da Costa, P. and Belo, A. D. F. (2017), Chemical Composition,
Antibacterial, Antibiofilm and Synergistic Properties of Essential Oils
from Eucalyptus globulus LABILL. and Seven Mediterranean Aromatic Plants.
Chem. Biodiversity, 14: n/a, e1700006. doi:10.1002/cbdv.201700006
Wayne, P. A. (2015). CLSI. Performance standards for antimicrobial susceptibility
testing; Twenty-second Informational supplement. CLSI document M100-S22.
Clinical and Laboratory Standards Institute.
WHO (World Health Organisation). (2014). Antimicrobial resistance: global report on
surveillance.http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/112642/1/9789241564748_
eng.pd?ua=1. Last accessed 23 December 2016.
Wikler, M. A. (2006). Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria
that grow aerobically: approved standard. CLSI (NCCLS), 26, M7-A7.
Williams, L. R., Stockley, J. K., Yan, W., & Home, V. N. (1998). Essential oils with
high antimicrobial activity for therapeutic use.International Journal of
Aromatherapy, 8(4), 30-40.
Yáñez Rueda, X., & Cuadro Mogollón, O. F. (2012). Composición química y actividad
antibacteriana del aceite esencial de las especies Eucalyptus globulus y E.
camaldulensis de tres zonas de Pamplona (Colombia). Bistua: Revista de la
Facultad de Ciencias Básicas, 10(1).
36
6.3. ANEXOS
Anexo 1. Diluciones del aceite esencial de Eucalipto (Eucalyptus spp.)
Anexo 2. Activación e incubación de las cepas bacterianas: Escherichia coli ySthapylococuss aureus subsp aureus.
37
Anexo 3. Determinación de CMI en el espectofotometro para Escherichia coli yStaphylococcus aureus subsp. aureus.
Anexo 4. Impregnación del aceite esencial de Eucalipto en discos Oxoid
38
Anexo 5. Distribución de discos de sensibilidad con diluciones del aceite de eucaliptosobre la superficie de agar Muller Hinton.
Anexo 6. Medición de halos de sensibilidad utilizando una regleta
39
Anexo 7. Halos de sensibilidad de Escherichia coli al 30%, 60% y 90% del aceite deeucalipto.
Anexo 8. Halos de sensibilidad de Staphylococcus aureus subsp. aureus al 30%, 60% y90% del aceite de eucalipto.
40
Anexo 9. Cajas testigo de Escherichia coli y Staphylococcus aureus subsp. aureus conetanol al 98%
Anexo 10. Cajas testigo sin formación de halos de inhibición de Escherichia coli yStaphylococcus aureus subsp. aureus
41
Anexo 11. Análisis de varianza para la variable sensibilidad antimicrobiana parala cepa Staphylococcus aureus subsp. aureus.
95% de intervalode confianza para
la media
N Media Desviaciónestándar
Errorestándar
Límiteinferior
Límitesuperior
Mínimo Máximo
1,00 20 10,9500 ,75915 ,16975 10,5947 11,3053 10,00 12,00
2,00 20 14,4500 1,53811 ,34393 13,7301 15,1699 11,00 17,00
3,00 20 13,6500 2,00722 ,44883 12,7106 14,5894 10,00 17,00
Total 60 13,0167 2,12724 ,27463 12,4671 13,5662 10,00 17,00
Anexo12. Prueba de Tukey al 5% para la variables de sensibilidad antimicrobianapara la cepa Staphylococcus aureus subsp. aureus.
95% de intervalo deconfianza
Grupos Diferenciade medias
(I-J)
Errorestándar
Sig. Límiteinferior
Límitesuperior
1,00 2,00 -3,50000* ,48205 ,000 -4,6600 -2,3400
3,00 -2,70000* ,48205 ,000 -3,8600 -1,5400
2,00 1,00 3,50000* ,48205 ,000 2,3400 4,6600
3,00 ,80000 ,48205 ,230 -,3600 1,9600
3,00 1,00 2,70000* ,48205 ,000 1,5400 3,8600
2,00 -,80000 ,48205 ,230 -1,9600 ,3600
*. La diferencia de medias es significativa en el nivel 0.05.
42
Anexo 13. Análisis de varianza para la variable sensibilidad antimicrobiana parala cepa Escherichia coli.
95% del intervalode confianza para
la media
N Media Desviaciónestándar
Errorestándar
Límiteinferior
Límitesuperior
Mínimo Máximo
1,00 20 10,2500 ,55012 ,12301 9,9925 10,5075 10,00 12,00
2,00 20 10,6500 ,67082 ,15000 10,3360 10,9640 10,00 12,00
3,00 20 10,9500 ,82558 ,18460 10,5636 11,3364 10,00 13,00
Total 60 10,6167 ,73857 ,09535 10,4259 10,8075 10,00 13,00
Anexo14. Prueba de Tukey al 5% para la variables de sensibilidad antimicrobianapara la cepa Escherichia coli.
95% de intervalo deconfianza
Diferenciade medias
(I-J)
Errorestándar
Sig. Límiteinferior
Límitesuperior
1,00 2,00 -,40000 ,21865 ,169 -,9262 ,1262
3,00 -,70000* ,21865 ,006 -1,2262 -,1738
2,00 1,00 ,40000 ,21865 ,169 -,1262 ,9262
3,00 -,30000 ,21865 ,362 -,8262 ,2262
3,00 1,00 ,70000* ,21865 ,006 ,1738 1,2262
2,00 ,30000 ,21865 ,362 -,2262 ,8262
*. La diferencia de medias es significativa en el nivel 0.05.
43
CAPITULO VII
PROPUESTA
Elaboración de crema a base de aceite esencial de eucalipto para tratar heridas post
quirúrgicas de felinos y caninos.
7.1. DATOS INFORMATIVOS
Las instituciones involucradas en la presente propuesta serán la Facultad de Ciencias
Agropecuarias, Carrera de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Hospital Veterinario de la
Universidad Técnica de Ambato.
7.2. ANTECEDENTES DE LA PROPUESTA
El agente principal de las infecciones bacterianas postquirúrgicas es causada por
Staphylococcus aureus, en el presente trabajo se identificó la actividad antimicrobiana
del aceite esencial de eucalipto y la predilección por bacterias gram positivas, formando
halos de sensibilidad de 10.95mm a 14.45mm ante la bacteria mencionada, confirmando
su efecto al determinar CMI con valores que disminuyen respectivamente del inoculo
estandarizado y determinando la inhibición del crecimiento de colonias mediante la
CMB.
7.3. JUSTIFICACIÓN
La aplicación del aceite esencial de eucalipto en presentación en crema al 60% sobre
heridas postquirúrgicas en felinos y caninos tiene como finalidad la prevención de
infecciones en piel provocadas por bacterias como Staphylococcus aureus, el uso de una
crema directamente sobre las heridas permitirá la absorción directa del principio activo
que es el aceite.
7.4. OBJETIVOS
Aplicar el aceite esencial de eucalipto en crema sobre infecciones postquirúrgicas por
Staphylocossus aureus en felinos y caninos.
44
7.5. ANÁLISIS DE FACTIBILIDAD
La obtención del aceite de eucalipto es de fácil adquisición y extracción usando el
método de arrastre de vapor, el efecto antimicrobiano que presenta es la principal
característica para emplearla como desinfectante, conservante de alimentos y en la
fitoterapia, también posee características antioxidantes, antiinflamatorias, antimicóticas
y antiparasitarias.
7.6. FUNDAMENTACIÓN
En el ambiente de la clínica las infecciones nosocomiales son comunes a causa de
bacterias oportunista como Staphylococcus aureus en las heridas postquirúrgicas, al
aplicar el aceite esencial de eucalipto en crema al 60% se puede tratar o prevenir el
crecimiento bacteriano en tejidos expuestos al medio, el efecto antimicrobiano del
eucalipto inhibe el crecimiento bacteriano evitando de la mano infecciones y el uso
indiscriminado de antibióticos.
7.7. METODOLOGÍA, MODELO OPERATIVO
Promover el uso de aceites esenciales de plantas, de igual manera elaborar un producto
fitofarmacéutico para evitar infecciones post quirúrgicas de caninos y felinos; la
obtención del aceite esencial de Eucalipto se hace mediante destilación por arrastre de
vapor, en el que se obtienen extracto acuoso y aceite y con ayuda de un tubo de
separación se toma el aceite para la formulación de la crema, se utilizará crema
liposoluble de fácil difusión para el aceite hasta obtener la concentración deseada.
7.8. ADMINISTRACIÓN
La Universidad Técnica de Ambato mediante la Facultad de Ciencias Agropecuarias, el
director del Hospital Docente Veterinario, médicos residentes y estudiantes serán
responsables de la realización de esta propuesta que pueda llevar a una adecuada
utilización de aceites mediante investigaciones que complementen el uso de aceites en
animales.
45
7.9. PREVISIÓN DE LA EVALUACIÓN
Por medio de la elaboración de la presente propuesta se pretende evitar infecciones en
heridas posquirúrgicas en felinos y caninos, además de reducir costos se observara la
evolución de los pacientes.