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Universidad Nacional de La Matanza Ciencias de la Salud - MEDICINA AU1 - Formación del Ser Humano Aplicaciones del diagnóstico molecular en Genética Dra. Mariana Herrera. DESORDENES MONOGÉNICOS. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Universidad Nacional de La MatanzaCiencias de la Salud - MEDICINA
AU1 - Formación del Ser Humano
Aplicaciones del diagnóstico molecular en Genética
Dra. Mariana Herrera1
DESORDENES MONOGÉNICOS
Aparecen cuando un gen está alterado en todas las células del organismo
Las alteraciones se deben a mutaciones genéticas que son cambios en las secuencias de los nucleótidos de la
cadena de ADN
HERENCIA AUTOSÓMICA DOMINANTE
HERENCIA AUTOSÓMICA
RECESIVA
HERENCIA LIGADA AL X
HERENCIA MITOCONDRIAL
Patrones de herencia de una enfermedad monogenica
ENFERMEDADES DE ORIGEN POLIGÉNICO
Originadas por la sumatoria de efectos aditivos de varios genes y de factores ambientales que las favorecen
La recurrencia en un grupo familiar se establece en función de tablas estadísticas específicas de cada desorden.
Enfermedades de origen poligénico analizables por Biología Molecular
Diabetes juvenil
Alzheimer
Enfermedad celíaca
Enfermedad cardiovascular
Parkinson
PCR: reacción en cadena de la polimerasa
-ADN total-Taq polimerasa-Mg-Buffer-Primers
Ciclos:
-Desnaturalización
-Hibridación
-Elongación
AMPLIFICACION DEL ADN
PCR
10 rep 20
rep
20 rep
10 rep
Pocas copias de un fragmento
Millones de copias
Hacer copias Hacer copias (extensión)(extensión)
DNA dianaDNA diana5’5’ 3’3’
5’5’
5’5’
3’3’
3’3’Pegador de los Pegador de los
primers primers (annealing)(annealing) 5’5’3’3’
Forward primerForward primer
Reverse primerReverse primer
Separación de las cadenasSeparación de las cadenas
DesnaturalizaciónDesnaturalización
5’5’3’3’
En 32 ciclos se hacen más de 1000 millones de copias (2 n = 2 32 copias)
En 32 ciclos se hacen más de 1000 millones de copias (2 n = 2 32 copias)
Las copias de PCR se incrementan exponencialmente con el Las copias de PCR se incrementan exponencialmente con el número de ciclosnúmero de ciclos
Thermal cycleThermal cycleThermal cycle
Ejemplos de diagnósticos que se hacen por PCR (monogénicas)
- Distonía de torsión temprana (autosómica dominante)
- Ataxia de Friedreich (autosómica recesiva)- Enfermedad de Duchenne (ligada al X)
Distonía primaria (DYT1)
Deleción de tres pares de bases (GAG) en el gen DYT1
Frecuencia 72% de los pacientes con distonía primaria de comienzo temprano
Herencia autosómica dominante
Técnica PCR y corrida electroforéticaen geles de poliacrilamida
Se amplifica un fragmento de 250 pares de bases que contiene al triplete GAG con una PCR radiactiva y se corre en un gel de poliacrilamida.
Distonía primaria (PTD)
250 pb247 pb
Ctrol
N/M
Padre
Madre
Hijo Hija
Se han descripto numerosos casos de aparición de novo de esta deleción
Microsatélites
Son repeticiones de di, tri o tetranucleótidos un número n de veces
dinucleótidos: ---ATATATAT(AT)n--- ---CGCGCGCG(CG)n
trinucleótidos: ---CAGCAGCAG(CAG)n--- ---CCTCCTCCT(CCT)n---
tetranucleótidos: --(CATG)n-- ó --(CCGG)n--
Características:
-Hay alelos con distinto número de repeticiones
-Se heredan mendelianamente
-Muchas enfermedades neurológicas se originan por un incremento anormal del número de repeticiones
Southern Blot
• Extracción de una gran cantidad de ADN genómico total
• Digestión con enzimas de restricción• Corrida electroforética• Transferencia a una membrana de nylon• Identificación de una zona específica del ADN con
sondas marcadas
• Se usa en diagnósticos de enfermedades como la Distrofia Miotónica.
FUNDAMENTOS DE LA TECNICA DE Southern Blot
Corte mediante enzimas deRestricción.
SOUTHERN BLOT
Distrofia Miotónica (DM)
Secuenciación del ADN
• Manual o automática• PCR con nucleótidos especiales• Permite conocer la secuencia exacta
de pares de bases en un fragmento de ADN
• Está basada en la idea de Southern de que Está basada en la idea de Southern de que
moléculas de ADN marcadas pueden ser usadas moléculas de ADN marcadas pueden ser usadas
para analizar otras moléculas de ADN unidas a un para analizar otras moléculas de ADN unidas a un
soporte sólidosoporte sólido
• El “Southern blot” fue el primer array El “Southern blot” fue el primer array
Tecnología de MicroarraysTecnología de Microarrays
• Análisis de expresión hibridando moléculas de ARNm a Análisis de expresión hibridando moléculas de ARNm a librerías de ADNc sobre membranas de nylon librerías de ADNc sobre membranas de nylon
• Dot-blot con sondas ASO Dot-blot con sondas ASO
Estudio de portadores de mutaciones recesivas (Panel Ashkenazi):Tay Sachs, Canavan, Gaucher, Galactosemia, Disautonomía Familiar, Bloom, Nieman Pick, Fibrosis Quística, Mucolipidosis, etc.
Paneles de riesgo para enfermedades complejas:-Enfermedad arterial coronaria-Infarto de miocardio-Fibrilación auricular-Cuadro trombótico-Enfermedad arterial periférica
Al leer el informe de un estudio genético:
• ¿Qué mutación/es se estudió/aron?• Si no se encontró ninguna mutación,
¿se puede descartar la enfermedad?• ¿Qué técnicas se usaron? ¿Es la
técnica adecuada para el/la paciente?• ¿Cuál es el grado de informatividad
del estudio?• ¿Existe una buena correlación
genotipo/fenotipo?
DIFERENCIAS ENTRE POLIMORFISMO Y MUTACIÓN
99.9%
0.1%
94%
6%
TIPOS DE POLIMORFISMO
-----AGACTAGACATT----
-----AGATTAGACCTT----
-----(GATA)(GATA)(GATA)----
-----(GATA)(GATA)----
-----(GATA)(GATA)(GATA )(GATA )----
Polimorfismo de longitudPolimorfismo de secuencia
A los polimorfismos debidos al cambio de una base por otra en la cadenadel ADN se los denomina Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs).
¿Cómo se transmiten los caracteres hereditarios de generación en
generación?
Padres
Hijos
La Herencia de los Genes. La Fecundación
ÓVULOESPERMATOZOIDE +
=
Organismo unicelular. Embrión
n 2n
n
+
HIJO
23 CROMOSOMAS 23 CROMOSOMAS
23 PARES DE CROMOSOMAS
Gen de “la bondad”GAMETAS
FEMENINAS
GAMETAS MASCULINAS
La herencia de los genes
Gen de “la bondad”
“mucha bondad”
“mediana bondad”
“poca bondad”
“excesiva bondad”
Cada variante se denomina alelo.
Imaginando este ejemplo, el gen de “la bondad” presenta cuatro alelos: “mucha bondad” “mediana bondad” “poca bondad” “excesiva bondad”.
“La bondad” de un hijo es el resultado de la interacción de los genes de la bondad que recibió de sus progenitores.
Gen “La bondad” Gen “La Inteligencia” Gen “La Belleza”
Variantes Alélicas
Mucha Bondad Gran Inteligencia Extremada Belleza
Mediana Bondad Inalcanzable Inteligencia Amigable Belleza
Poca Bondad Incomparable InteligenciaMínima Belleza
Excesiva Bondad
En cada individuo este grupo de genes puede presentarse con diferentes combinaciones.
Cuando más loci o genes se investiguen mayor será la caracterización de la persona y menor será la posibilidad de
encontrar dos personas que compartan exactamente las mismas características.
Los estudios de identificación biológica permiten determinar la huella propia de un individuo y reconocer el 50 % heredado de la
madre y el 50 % heredado del padre.
Los STRs
Locus preciso
Un fragmento de ADN se repite n veces “en tandem”. El
número de repeticiones en que se encuentra se corresponde con un
alelo.
Se observan alelos de 2, 3, 4, 5 y 6 repeticiones entre los
individuos.
De acuerdo a las leyes de la herencia, cada
individuo tiene dos alelos, uno heredado de su
madre y el otro de su padre
PCR
10 rep 20
rep
20 rep
10 rep
Pequeñas cantidades de ADN
Grandes cantidades de ADN
Los dos alelos de un STR de
un individuo
Material biológico a partir del cual pueden realizarse los estudios de
identidad.
Óvulo materno
+
espermatozoide paterno
Infinitas divisiones celulares
El niño tiene en todas las células de
su organismo la misma información genética que en la célula originaria
Puede utilizarse cualquier tejido para
analizar su ADN.
Preparación del ADN de las tres personas
Estudio de Paternidad.
LABORATORIOToma de
muestras: sangre, cepillado bucal o
uñas
FORMULARIO Nombre completo
Fecha de nacimiento Nro. de Documento
Relación con el Probando Huella digital Foto
Firma
P H M
P+H+M
ESTUDIO DE PATERNIDAD EN SECUANCIADOR AUTOMÁTICO
ESTUDIO DE MATERNIDAD
Herencia del Cromosoma Y Estudio de la Línea Paterna
Todas las células femeninas tienen dos
cromosomas sexuales X (XX)
Todas las células masculinas tienen un
cromosoma sexual X y uno Y (XY)
Las gametas femeninas (óvulos) llevan siempre un único cromosoma X
Las gametas masculinas (espermatozoides)
llevan o un cromosoma X o un cromosoma Y
X X YX
X
X
Y
+
+
MUJER
VARON
Herencia del Cromosoma Y
X YX X
X Y X YX X X X
X YX Y
ABUELO, HIJOS VARONES, NIETOS VARONES, HERMANOS VARONES, PRIMOS VARONES POR VIA PATERNA, TIO
PATERNO Y SOBRINO, COMPARTEN EL MISMO CROMOSOMA Y
El ADN mitocondrial
presenta pequeñas regiones
diferentes entre las personas
espermatozoide + óvulo fecundación
Primer célula embrionaria que originará todo el
embrión
núcleos
mitocondrias
Herencia Mitocondrial Estudio de la Línea Materna
DNA MIT.1
DNA MIT.1
DNA MIT.1
DNA MIT.1
DNA MIT.1
DNA MIT.2
DNA MIT.3
DNA MIT.4
DNA MIT.5
DNA MIT.5
Está dado por las diferentes variables en que se presenta en la población.
POLIMORFISMO DE UN GEN
TIPOS DE POLIMORFISMO
-----AGACTAGACATT----
-----AGATTAGACCTT----
-----(GATA)(GATA)(GATA)----
-----(GATA)(GATA)----
-----(GATA)(GATA)(GATA )(GATA )----
Polimorfismo de longitudPolimorfismo de secuencia
A los polimorfismos debidos al cambio de una base por otra en la cadenadel ADN se los denomina Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs).
En cada individuo este grupo de genes puede presentarse con diferentes combinaciones.
Los seres humanos compartimos el 99,9% de nuestro genoma. Las diferencias responden a variaciones en tan solo el 0.1 % de la secuencia del ADN.
DIFERENTES ALELOS EN LA POBLACIÓN
PROYECTO GENOMA HUMANO
A partir de la secuenciación completa del genoma humano se ha determinado que existen aproximadamente 30.000 genes.
Se encontraron más de 6.000.000 sitios con SNPsPero lo importante fue entender cómo las diferentes variantes alélicas de un gen polimórfico se relacionan con características particulares de las personas.
AAACCGG Bondad alta AAAACGG Bondad media
TTTGGCC TTTTGCC
Proyecto Genoma Humano
GWAS (Genomic wide association studies)
FarmacogenéticaFarmacogenética
Farmacogenética: reducción de riesgos de la terapiaComparación de riesgos fatales
1 en 107 1 en 106 1 en 105 1 en 104 1 en 103 1 en 102
Incremento del riesgo fatal (anual)
Reacción fatal frente al fármaco prescritoFuente: Consumer Reports
Farmacogenética
Electrocución
Accidente aéreo
Asesinato
Accidente de coche
El genotipo: impacto significativo en el metabolismo de fármacos
Concentraciones de fármaco según Fenotipo Metabolizador
Fenotipo metabolizadorGenotipo Tipo de respuesta a dosis típicas
Lento
Intermedio
Eficiente
Ultrarrápido = Reacciones adversas
= Intervalo terapéutico
= No efectivo
Conc.
Tiempo
Actividad
normal
Actividad
reducida
no activida
d
= Reacciones adversas
= Intervalo terapéutico
= No efectivo= Reacciones adversas
= Intervalo terapéutico
= No efectivo= Reacciones adversas
= Intervalo terapéutico
= No efectivo
Los polimorfismos genéticos también llamados variaciones genéticas se relacionan, entre otras cosas, con el metabolismo de los medicamentos antineoplásicos e influyen en su toxicidad y respuesta a la quimioterapia
en pacientes con cáncer.
Consecuencias de un polimorfismo genético:
La presencia de uno u otro polimorfismo PUEDE RESULTAR INDIFERENTE.
Si afectan a la secuencia codificante PUEDEN PRODUCIR cambios importantes en la estructura de la proteína.
Si afectan a la secuencia reguladora del gen PUEDEN MODIFICAR su expresión.
TIOPURIN METIL TRANSFERASA: TPMT
Thiopurine Methyltransferase (TPMT) Gene
Enzyme Activity Levels in 300 Caucasian Patients
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
low medium high
TPMT Enzyme Activity
% o
f S
ub
jects
a
b
c
Thiopurine Methyltransferase(TPMT) Polymorphism affects6MP Pharmacodynamics
10
8
6
4
2
00 5 10 15 20 25 30
TPMT Activity
2000
1000
0Mut/Mut Wt/Mut Wt/Wt
HPRT
TGNs DNAincorporation
MP MeMPTPMT
toxicityrisk of relapse
myelosuppressionrisk secondary cancer
wt/wt
wt/m
m/m
Leukemia 14:567-72, 2000
Relling & Dervieux Nature Ca Rev 2001;1:99-108
Gene for TPMT hasA common variant thatCauses low activity, High levels of 6MP Metabolites
0
10
20
30
40
50
60
70
80
dose
(mg/d
ay)
mut/mut wt/mut wt/wt
Inherited differences in Metabolism
Inherited differencesIn drug levels
Optimal Dose for Each Child
UDP-glucuronosiltransferasa UGT1
ENZIMA POLIMORFISMO FARMACO CONSECUENCIA
UDP-glucuronosiltransferasa
UGT1
Secuencias TA repetidas
Irinotecan Inestabilidad proteica. Diarrea, mielo depresión.
Dihidropirimidina Deshidrogenasa (DPD)
Mutación Puntual
Fluoropirimidinas Neurotoxicidad, mielo depresión.
Drogas que presentan en sus prospectos la recomendación por la FDA De estudio farmacogenético antes de medicar.
http://www.fda.gov/Drugs/ScienceResearch/ResearchAreas/Pharmacogenetics/ucm083378.htm
REACCIÓN AL MEDICAMENTO
Nombre del medicamento
Análisis genético para: Resultados del análisis
Abacavir Hipersensibilidad El alelo HLA-B*5701 se asocia a mayor riesgo de presentar hipersensibilidad al abacavir.
Antibióticos aminoglucósidos
Pérdida auditiva Polimorfismo asociado a la pérdida auditiva como consecuencia del tratamiento con antibióticos amigo glucósidos.
Cafeína Metabolismo Polimorfismo asociado a ser metabolizador lento de la cafeína, y riesgo de toxicidad y riesgo de sufrir un infarto cardíaco.
Carbamazepina Hipersensibilidad El alelo HLA-B*5702 está asociado a la hipersensibilidad a la carbamazepina.
Clopidogrel Metabolismo Polimorfismo asociado a la respuesta.
Metotrexato Toxicidad Polimorfismo asociado a riesgo de toxicidad inducida por el metotrexato.
LAS PREDICCIONES YA ESTÁN HECHAS
QUÉ FALTA PARA APLICAR ESTOS ESTUDIOS PREVIO AL TRATAMIENTO?
Pacientes con genotipos tratados de acuerdo a las predicciones.
Pacientes sin genotipos y tratamiento clásico
La farmacogenética, mejora la efectividad del tratamiento?
EJEMPLOS DE ASOCIACIONES GENÉTICAS
GEN PPARG (PEROXISOME PROLIFERATOR ACTIVATED RECEPTOR GENE)-El alelo C codifica para una Prolina en el codon 12 en lugar de una Alanina.-PPARG asociado a la reducción de el peso corporal en respuesta a la restricción calorica.-Polimorfismo Pro12Ala asociado a Sindrome Metabolico, Resistencia a la Insulina y diabetes tipo 2 en población sana. GEN APOA-2: GEN DE LA APOLIPOPROTEINA A2-Presencia de una C en lugar de una T en el promotor del gen.-Genotipo C/C :-Influye en la obesidad y el riesgo cardíaco. GEN ADIPOQ: GEN DE LA ADIPONECTINA-Presencia de una G en lugar de una A en la posición -11391 G/A, en el gen ADIPOQ.-Tendencia a recuperar el peso perdido inmediatamente.-Riesgo de Resistencia a la insulina y syndrome metabolico.-Alelo A da protección a la recuperación del peso luego de 32-60 semanas luego de dieta baja en calorías. GEN MCM6: minichromosome maintenance complex component 6.-El a alelo C en lugar del T en la posición -13910 del gen MCM6.-Influye sobre el gen LCT y se asocia a hipolactasia o intolerancia a la lactosa.
SU RESULTADO
MAYOR PROBABILIDAD
Las personas con su mismo genotipo tienen un probabilidad mayor de ser intolerantes a la lactosa y pueden sufrir efectos
secundarios al ingerir lactosa, que es el azúcar que se encuentra en
la leche.
Gen analizado
GENES RELACIONADOS
Su Genotipo
Valor Científico
MCM6-rs498835 C/C ****
EJEMPLO / REACCIONES A ALIMENTOS
La intolerancia a la lactosa es la capacidad de digerir la lactosa, que es el azúcar que se encuentra en la leche y los productos lacteos. Esta condición se debe a la falta de una enzima llamada lactasa. La variante genética rs4988235 está situada cerca del gen de la lactasa (LCT), en el gen MCM6, y se ha demostrado que nivela los niveles de lactasa en el organismo . Las personas con el genotipo C/C (marcador genético rs4988235) tienen una “Mayor probabilidad” de ser intolerantes a la lactosa, mientras que las personas con otro genotipo tienen una “Menor probabilidad” de ser intolerantes a la lactosa.Esta variante se ha asociado con la intolerancia a la lactosa en estudio de personas caucásicas, mientras que otras variantes podrían tener un papel importante en otros grupos étnicos.
INTOLERANCIA A LA LACTOSA
www.SNPedia.com
PMID, acrónimo de «PubMed Unique Identifier», es un número único asignado a cada cita de un artículo de revistas biomédicas y de ciencias de la vida que recoge PubMed.
PubMed es un motor de búsqueda de libre acceso a la base de datos MEDLINE de citaciones y resúmenes de artículos de investigación biomédica. Ofrecido por la Biblioteca Nacional de Medicina de los Estados Unidos como parte de Entrez. MEDLINE tiene alrededor de 4.800 revistas publicadas en Estados Unidos y en más de 70 países de todo el mundo desde 1966 hasta la actualidad.
[PMID 18959602]
Las personas con este mismo genotipo tienen mayor
probabilidad de presentar niveles mas bajos de vitaminas B12 en
sangre. Se puede ajustar el consumo de la vitamina B12
poniéndole ingiriendo alimentos ricos en vitamina B12.
Gen analizado
GENES RELACIONADOS
Su Genotipo
Valor Científico
FUT2-rs602662 A/G ****
En múltiples estudios genéticos se ha identificado a un marcador en el gen FUT 2, que está asociado a niveles bajos de Vitamina B12 en sangre. Esto se puede deber a una absorción deficiente de la vitamina en el intestino. Se recomienda a las personas con genotipos G/G o A/G “Ajustar el consumo” porque es probable que tengan niveles bajos de Vitamina B12. El consumo de cereales enriquecidos con vitamina B12 puede ayudar a obtener niveles adecuados, sobre todo en personas mayores de 50 años.
VITAMINA B12
EJEMPLO / NECESIDADES NUTRITIVAS
AJUSTE EL CONSUMO
ASOCIACIÓN ENTRE LOS NÍVELES DE VITAMINA B12 EN PLASMACON LOS GENOTIPOS DEL GEN FUT2.(MUJERES DEL GWAS Y REPLICA EN OTROS ESTUDIOS)
SNP Association by Study
EDAD N FRECUENCIA DEL ALELO
ESTIMADO (S.E.)
P-VALORCANTIDAD PG/ML
rs602662GWAS
Ser/Ser A/A
Ser/Gly G/A
Gly/Gly G/G
Gly=0.49
NHS CGEMS 59 1,658 489.82 418.67 417.05 -0.08(0.01) 6.54x10-10
Total (Gwas+Grupo replica)
Ante la necesidad de un estudio genético:
-La información siempre debe estar mediada por el médico.-Es el médico quien debe asesorar al paciente respecto de las conveniencias y los riesgos de someterse a una prueba genética.-Explicar muy bien el significado de un estudio de asociaciones. --No caer en la GENOMANÍA. -Recordar que la genética es sólo una parte de lo que somos fenotípicamente y que el medio ambiente juega un rol importantísimo tanto en la expresión de nuestros genes (epigenética) como en los riesgos de desarrollar enfermedades complejas (cáncer, diabetes, enf. Cardíaca, etc).