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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE NICARAGUA

UNAN-León

FACULTAD DE CIENCIASY TECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

“VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO POR HPLC PARA LA

CUANTIFICACIÓN DE ACETAMINOFEN Y TRAMADOL EN TABLETAS DE INGERIL COMPUESTO”

TESIS PARA OPTAR AL TÍTULO DE LICENCIADO EN QUÍMICA PRESENTADA POR: Br. FERNANDO GALEANO CARRION CATEDRÁTICO GUÍA: MSc. FABIO JOSÉ PALLAVICCINI NARVÁEZ Lic. MANUEL ANTONIO VANEGAS CARVAJAL

LEÓN, NICARAGUA, AGOSTO DEL 2009

UNAN-León, Departamento de Química. Fernando Galeano Carrión

VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO POR HPLC PARA LA CUANTIFICACIÓN DE ACETAMINOFEN Y TRAMADOL EN TABLETAS DE INGERIL COMPUESTO

INDICE I. RESUMEN, 1 II. INTRODUCCIÓN, 2 III. OBJETIVOS, 3 III.1 Objetivo General, 3 III.2 Objetivos Específicos, 3 IV. MARCO TEÓRICO, 4 IV.1 Acetaminofén, 4 IV.2 Tamadol HCl, 6 IV.3 Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC), 7 IV.3.1 Causas que afectan un análisis por HPLC, 9 IV.3.2 Razones por las cuales se utiliza HPLC, 11 IV.3.3 Aplicaciones de HPLC, 11 IV.3.4 Limitaciones, 11 IV.3.5 Campos de uso de HPLC, 11 IV.3.6 Diagrama básico de un sistema de HPLC, 12 IV.4 Validación de Métodos Analíticos, 18 IV.4.1 Jerarquía de la metodología, 18 IV.4.2 Proceso de validación, 20 IV.4.3 Validación general, 20 IV.4.4 Validación para uso específico, 22 IV.4.5 Proceso general para la metodología, 23 IV.4.6 El método de adición patrón, 24 IV.4.6.1 Adición patrón, 25 IV.4.7 Criterios de Eficiencia, 25 IV.4.7.1 Precisión, 26 IV.4.7.2 Exactitud o Bias (sesgo), 26 IV.4.7.3 Límite de detección, 26 IV.4.7.4 Límite de cuantificación, 27 IV.4.7.5 Linealidad, 28 IV.4.7.6 Rango, 28 IV.4.7.7 Selectividad, 28 IV.4.7.8 Sensibilidad, 28 IV.5 Aproximación ISO para el cálculo de la incertidumbre, 29 V. PARTE EXPERIMENTAL, 31 V.1 Equipos y Materiales, 31 V.2 Reactivos, 32 V.3 Procedimientos, 33 V.3.1 Condiciones cromatográficas, 33 V.3.2 Preparación de la fase móvil, 33 V.3.3 Preparación de la curva de calibración normal de acetaminofén y tramadol, 33 V.3.4 Preparación de la muestra, 34 V.3.5 Selectividad del método, 34 V.3.6 Influencia del placebo en la curva de calibración normal, 34 V.3.7 Idoneidad del Sistema, 35 V.3.8 Linealidad del sistema y del método cromatográfico, 35

V.3.9 Precisión del sistema y del método cromatográfico, 36 V.3.10 Exactitud del método, 37 V.3.11 Efecto de matriz, 38 V.3.12 Límite de detección y límite de cuantificación, 38 V.3.13 Repetibilidad de las curvas de calibración normal, 39 V.3.14 Aplicación del método y estimación de la incertidumbre asociada a la cuantificación, 39 VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN, 40 VI.1 Selectividad, 40 VI.2 Influencia del placebo, 43 VI.3 Idoneidad del sistema, 45 VI.4 Linealidad del sistema y linealidad del método, 46 VI.5 Precisión del sistema y precisión del método, 50 VI.6 Exactitud del método, 52 VI.7 Efecto de matriz y exactitud del método, 56 VI.8 Límite de detección y límite de cuantificación, 59 VI.9 Repetibilidad de las curvas de calibración normal, 61 VI.10 Aplicación del método y estimación de la incertidumbre asociada a la cuantificación de acetaminofén y tramadol en tabletas de ingeril compuesto, 63 VI.10.1 Modelo matemático, 63 VI.10.2 Identificación de las fuentes de incertidumbre, 63 VI.10.3 Cuantificación de los componentes de incertidumbre, 64 VI.10.4 Cálculo de los coeficientes de sensibilidad, 65 VI.10.5 Estimación de la incertidumbre combinada, 67 VI.10.6 Estimación de lo incertidumbre expandida, 67 VI.10.7 Cuantificación y estimación de la incertidumbre asociada a la cuantificación de tramadol en tabletas de ingeril compuesto, 68 VII. CONCLUSIONES, 70 VIII. RECOMENDACIONES, 72 IX. BIBLIOGRAFÍA, 73 XANEXOS, 76 X.1 Datos completos de la curva de calibración normal sin placebo, 76 X.2 Datos completos de la curva de calibración normal cargada con placebo, 77 X.3 Flujograma del proceso analítico, 78



1

I. RESUMEN En el presente trabajo se llevo a cabo la validación de un método analítico por HPLC para

la cuantificación de acetaminofen y tramadol en tabletas de Ingeril Compuesto, la cual es

una nueva formulación de los laboratorios CEGUEL, en donde se llevaron a cabo todas las

actividades de adecuación y optimización de las condiciones cromatográficas para de esta

manera lograr el desarrollo de una metodología adecuada para la cuantificación de

acetaminofen y tramadol los cuales son los principios activos de la tableta de Ingeril

Compuesto.

Con el propósito de realizar la validación de esta nueva metodología primeramente se

evaluó la selectividad del método y se analizó la influencia que ejerce el placebo en la

curva de calibración normal, los resultados mostraron que el método es selectivo para los

propósitos previstos y que el placebo no provoca ningún efecto en la curva de calibración

normal, seguidamente se realizó el estudio de la idoneidad del sistema observándose que el

método cumple con los criterios de aceptación propuestos por la USP, posteriormente se

evaluaron los parámetros de validación como: Linealidad del sistema y del método para los

cuales se obtuvieron valores cercanos a la unidad ≥ 0.999, Precisión del sistema y del

método obteniéndose valores de %RSD < 1% es decir tiene muy buena precisión. La

exactitud del método se evaluó por medio del porcentaje de recuperación (%R), los cuales

fueron de 103.20 ± 1.50 y de 105.37 ± 2.01 para acetaminofen y tramadol respectivamente

es decir el método es exacto, se llevo a cabo el estudio del efecto de matriz relacionándolo

con la exactitud del método aquí se encontró que no hay efecto de matriz y se confirmó la

exactitud del método, luego se determinaron el límite de detección obteniéndose valores de

1.80 μg/mL y 0.22 μg/mL para acetaminofen y tramadol respectivamente y el límite de

cuantificación 4.47 μg/mL y 0.68 μg/mL para acetaminofen y tramadol respectivamente,

seguidamente se evaluó la repetibilidad de calidad de la curva de calibración normal.

Posteriormente se estimó la incertidumbre asociada a la cuantificación de acetaminofén y

tramadol en tabletas de Ingeril Compuesto, y finalmente se realizó la aplicación del

método, para la cual se realizó la cuantificación de acetaminofén y tramadol en tabletas

formuladas de Ingeril Compuesto (proyecto piloto), encontrándose valores aceptables de

acuerdo a lo especificado en el empaque de la tableta.



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II. INTRODUCCIÓN

El Acetaminofén es un medicamento usado como analgésico y antipirético en pacientes

sensibles a la aspirina y que experimentan otras reacciones adversas a la aspirina. Raras

veces induce efectos adversos y suele ser bien tolerado por los pacientes sensibles a la

aspirina [1]. Por otro lado el Tramadol es un medicamento que calma el dolor y actúa

reduciendo los efectos de las endorfinas (moléculas que intervienen en la transmisión del

dolor) que se encuentran en el cerebro y en la columna vertebral [2]. La tableta de Ingeril

compuesto es una nueva formulación realizada en los Laboratorios CEGUEL, la cual es un

comprimido que contiene como principios activos estas dos sustancias “Acetaminofen y

Tramadol”. En la industria farmacéutica, el desarrollo de métodos de análisis de los

productos farmacéuticos, son necesarios para asegurar y cumplir diversos parámetros de

calidad, seguridad y eficacia de sus productos formulados. Estos métodos están basados en

las farmacopeas internacionales y son adecuados a normas internas propias del laboratorio

para asegurar el control analítico de un producto farmacéutico.

Debido a que en los laboratorios CEGEL se ha llevado a cabo el desarrollo y optimización

de las condiciones cromatográficas del método por HPLC para la cuantificación de

acetaminofen y tramadol en tabletas de Ingeril Compuesto resulta de suma importancia la

evaluación de los parámetros que definen el buen desempeño de este método para asegurar

tanto la calidad del producto elaborado así como también la salud de la toda la población.

En vista de que este es un método adaptado o desarrollado recientemente, no se encuentran

antecedentes de estudios realizados en Nicaragua, sin embargo se encuentran antecedentes

de estudios realizados respecto a la validación de un método de análisis cuantitativo de

acetaminofén por HPLC [1], por otro lado se han encontrados publicaciones internacionales

de estudios realizados pero por separados de acetaminofén [2] y tramadol en capsulas por

cromatografía de capa fina de alta eficiencia [3].

En el presente trabajo se llevo a cabo la validación del método por HPLC utilizado en los

laboratorios CEGUEL en el departamento de Control de Calidad para la determinación

simultánea de acetaminofen y tramadol en tabletas de Ingeril Compuesto.



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III. OBJETIVOS

III.1. Objetivo General ♦ Validar el método analítico por HPLC para la cuantificación simultánea de

acetaminofen y tramadol en tabletas de ingeril compuesto

III.2. Objetivos Específicos ♦ Evaluar la selectividad del método.

♦ Analizar la influencia del placebo en la curva de calibración normal.

♦ Evaluar la Idoneidad del Sistema.

♦ Evaluar la linealidad del sistema y del método cromatográfico.

♦ Realizar un estudio de la precisión del sistema y del método cromatográfico.

♦ Evaluar la exactitud del método.

♦ Estudiar el efecto de matriz.

♦ Determinar el límite de detección y el límite de cuantificación.

♦ Evaluar la repetibilidad de calidad de la curva de calibración normal.

♦ Aplicar el método estimar la incertidumbre asociada a la cuantificación.



4

IV. MARCO TEÓRICO IV.1. Acetaminofén

El acetaminofén, es un fármaco con propiedades analgésicas y antipiréticas. Ejerce su

acción analgésica inhibiendo la síntesis de prostaglandina en el sistema nervioso central (en

el hipotálamo) y a través de una acción periférica al bloquear la generación del impulso

doloroso, esta acción periférica puede deberse también a la inhibición de la síntesis de

prostaglandinas o a la inhibición de otras sustancias que sensibilizan los receptores

dolorosos a la estimulación mecánica o química. Por otro lado ejerce su acción antipirética

al actuar sobre el hipotálamo en el centro regulador de la temperatura, produciendo

vasodilatación con aumento del flujo sanguíneo a través de la piel, con perdida de

sudoración y calor. Estas acciones se traducen en alivio sintomático del dolor y reducción

de la fiebre, respectivamente. No obstante, carece o tiene mínimos efectos antiinflamatorios

ya que es un inhibidor débil de la ciclooxigenasa en presencia de altas concentraciones de

peróxidos que aparecen en las lesiones inflamatorias, a diferencia de ello su efecto

antipirético puede explicarse por su capacidad de inhibir la ciclooxigensa en el encéfalo [2].

El acetaminofén se puede encontrar por sí solo e en combinación con otros medicamentos

para aliviar los síntomas de la gripe, resfriados, dolores de cabeza y osteoartritis. El tomar

demasiado acetaminofén puede causarle problemas hepáticos, daño a los riñones y anemia.

También se ha visto que puede causar los mismos problemas a los bebés. Por lo tanto, es

importante que no se ingiera más de la cantidad recomendada [4].

Figura No. 1. Estructura de la Acetaminofén



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El Acetaminofén en la actualidad es uno de los analgésicos más utilizados al ser bastante

seguro y no interactuar con la gran mayoría de los medicamentos. Las dosis recomendadas

varían según el paciente; siendo las más usuales: 325 a 650 mg cada 4 ó 6 horas o bien

1000 mg cada 6 a 8 horas, sin exceder 4000 mg por día. En usos pediátricos se recomienda

administrar de 10 mg por cada kg de peso cada 4 horas o 15 mg por kg de peso por cada 6

horas [4].

El Acetaminofén por vía oral se absorbe en el tracto digestivo en un periodo que oscila

entre los 30 y los 90 minutos después de una dosis terapéutica, sin embargo, las

preparaciones líquidas pueden absorberse en un periodo de 20 minutos. Se estima que el

inicio de la actividad analgésica ocurre en aproximadamente 30 minutos, los alimentos

reducen la concentración máxima del acetaminofén en un 40 %, por lo cual no se

recomienda su administración con las comidas. Tiene una baja unión a proteínas

plasmáticas y su vida media de eliminación oscila entre 1 y 3 horas. Se metaboliza

principalmente en el hígado, menos del 5% se elimina en forma inalterada y la mayoría se

excreta por la orina en forma de metabolitos. Ninguna de las conjugaciones metabólicas

que sufre el acetaminofén son potencialmente tóxicas; sin embargo el metabolito N-Acetil-

p-benzoquinonimida (NAPQ1), que aunque posee una vida media corta de alrededor de

unos pocos nanosegundos, se une a la membrana celular hepática causando daño sobre la

bicapa lípidica sino es neutralizado por un antioxidante, como el sistema glutatión. A dosis

terapeuticas el acetaminofén es una excelente droga. Pero fuera de rango es peligrosa [4]



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IV.2. Tramadol HCl El Tramadol es un analgésico de acción central de tipo opioide que alivia el dolor actuando

sobre células nerviosas específicas de la médula espinal y del cerebro.

Tras la administración oral de tramadol se absorbe más de un 90% de la dosis,

independientemente de la ingestión simultánea de alimentos. La biodisponibilidad es

aproximadamente del 70%. El tramadol surte efecto de primer paso, en aproximadamente

un 30% de la dosis administrada [5].

Tramadol posee una elevada afinidad tisular, siendo su unión a las proteínas plasmáticas del

20%. La concentración plasmática máxima se alcanza cinco horas después de la

administración.

Tramadol atraviesa las barreras hematoencefálica y placentaria y en unos porcentajes

mínimos (<0.2%) pasa a leche materna.

Independientemente del modo de administración, la semivida es aproximadamente de 6 h.

La metabolización de tramadol tiene lugar en el hígado. Sufre procesos de O-desmetilación

y N-desmetilación así como por la conjugación de los derivados O-desmetilados con ácido

glucurónico. Únicamente el O-desmetiltramadol es farmacológicamente activo. Existen

considerables diferencias cuantitativas interindividuales entre los demás metabolitos. Hasta

ahora se han identificado 11 metabolitos en la orina. Los estudios realizados en animales

han demostrado que O-desmetiltramadol es 2-4 veces más potente que la sustancia de

origen [5].

Tramadol y sus metabolitos se eliminan casi completamente por vía renal (90%).

El perfil farmacocinético de tramadol es lineal dentro del margen de dosificación

terapéutico. La relación entre las concentraciones séricas y el efecto analgésico es dosis-

dependiente [5].

http://es.wikipedia.org/wiki/Analg%C3%A9sico

http://es.wikipedia.org/wiki/Opioide

http://es.wikipedia.org/wiki/Neurona

http://es.wikipedia.org/wiki/M%C3%A9dula_espinal

http://es.wikipedia.org/wiki/Cerebro

http://es.wikipedia.org/wiki/Biodisponibilidad

http://es.wikipedia.org/wiki/Semivida



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Figura No. 2. Estructura del Clorhidrato de Tramadol

IV.3. Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC) La Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC) es una técnica de separación basada

en una fase estacionaria sólida y una fase móvil liquida. Las separaciones se logran por

procesos de partición, absorción o intercambio iónico según el tipo de fase estacionaria

empleada. Los compuestos que se van analizar en un disolvente adecuado y la mayoría de

las separaciones tiene lugar a temperatura ambiente, la mayoría de los fármacos aun siendo

no volátiles o térmicamente inestables, pueden separarse sin descomposición o sin

necesidad de hacer derivados volátiles [6].

El HPLC consta de un recipiente que contiene la fase móvil, una bomba para forzar el paso

de la fase móvil a través del sistema a alta presión, un inyector para introducir la muestra a

la fase móvil, una columna cromatográfica, un detector y un depósito de correlación de

datos (una computadora o un registrador). Las columnas consta de partículas de fase

estacionaria que permiten un intercambio rápido de los compuestos entre la fase móvil y la

fase estacionaria, reciben y reproducen las señales enviadas por el detector, las

computadoras se emplean para controlar las operaciones y los parámetros cromatográficos

y permiten largos periodos de operación sin necesidad de supervisión [6].



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Los sistemas de bombeo de HPLC administran cantidades exactas de fase móvil desde los

recipientes hasta la columna mediante una tubería y uniones adecuadas para altas presiones,

constan de una o varias bombas reguladoras controladas por computadoras que se

programan para variar la relación entre los compuestos de la fase móvil en corridas

isocráticas controladas con mayor exactitud.

Los compuestos que se van a separar se inyectan en la fase móvil, usando jeringas o

inyectores de espiral. Algunos inyectores automáticos pueden programarse para controlar el

volumen de muestreo, el número de inyecciones y los ciclos de enjuague del espiral, el

intervalo entre las inyecciones y otras variables operativas [6].

Por lo general, las columnas empleadas para las separaciones analíticas tienen diámetros

internos de 2 mm a 5 mm; para la cromatografía preparativa se emplean columnas de

diámetros más grandes. Las columnas pueden calentarse para proporcionar separaciones

más eficaces, pero rara vez se las utiliza a temperaturas por encima de 60° C debido a la

potencial degradación de la fase estacionaria o a la volatilidad de la fase móvil [6].

El PH de la fase móvil, la temperatura, el tipo de ión, la concentración iónica y los

modificadores orgánicos influyen en el equilibrio; estas variables pueden ajustarse para

obtener el grado deseado de separación.

Muchos métodos farmacopéicos de HPLC requieren el uso de detectores, entre los más

usados tenemos:

- Detectores espectrofotometricos

- Detectores de longitud de onda múltiple

- Detectores de red de diodos

- Detectores de refractometría diferencial

- Detectores fluorométricos

- Detectores electroquímicos potenciométricos, voltamétricos o polarográficos

La composición de la fase móvil influye significativamente en el desempeño

cromatográfico y en la resolución de los compuestos de la mezcla que se esta



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cromatografiando. Para el trabajo cuantitativo exacto deben emplearse reactivos de alta

pureza y disolventes orgánicos de grado HPLC. El agua de calidad adecuada debe de tener

una conductividad baja y una absorción UV baja [6].

Los reactivos utilizados con tipos especiales de detectores pueden requerir que se

establezcan tolerancias adicionales para especies que puedan interferir. La composición de

la fase móvil ejerce un efecto mucho mayor que la temperatura en el factor de capacidad,

k´.

IV.3.1 Causas que afectan un análisis por HPLC

Presión Alta

A causa de la Obstrucción de la Columna de HPLC o Guarda Columna por partículas, la

solución es: invertir la Columna y Enjuagar con solvente, teniendo la columna

desconectada del detector. Si esto no funciona reemplace el filtrado a la entrada de la

columna. Si la presión sigue alta reemplace la columna.

Asegurarse que todas las fases móviles se filtren apropiadamente antes que entren a la

bomba de HPLC. También filtre todas las muestras antes de inyectarlas [6].

Pérdida de la Resolución

A causa de la Obstrucción de la Columna de HPLC ó del Guarda Columna por partículas,

la solución es: es necesario filtrar todo antes que se introduzcan las fases móviles en el

sistema de HPLC [6].

Picos Hendidos

A causa de la Obstrucción de la Columna de HPLC o del Guarda Columna por partículas,

la solución es: si es necesario reemplace el fritado de la entrada o la columna, filtrar todo

antes que se introduzcan las fases móviles en el sistema de HPLC [6].



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Variación en los Tiempos de Retención

A causa de aire atrapado en la bomba debido a gases disueltos en fase móvil, la solución

es: que se debe asegurar que la fase móvil esté propiamente y adecuadamente desgasificada [6].

Variaciones de la Línea Base

A causas de Burbujas del aire atrapados en la celda del detector debido a una mala

desgasificación de los solventes de la fase móvil, la solución es: asegurarse que todas las

fases móviles estén debidamente desgasificadas y considerar el uso de un restrictor de la

presión a toma de corriente del detector [6].

Línea Base con mucho Ruido

A causa de aire atrapado en celda del detector o en la bomba, la solución es enjuagar el

sistema y purgar la bomba de HPLC, la solución es: use Solventes desgasificados

adecuadamente para mantener constante la velocidad de flujo de la fase móvil del sistema [6].

Picos Falsos (Detectores Electroquímicos y de Fluorescencia)

A causa de Oxígeno Disuelto, la solución es: desgasificar adecuadamente las fases móviles

para reducir la concentración de oxígeno disuelto o agregar un sistema de filtración al vacío

en línea. Periódicamente chequear el nivel de oxígeno disuelto [6].

Baja ó Ninguna Presión

A causa de trabajar con bombas, sellos ó pistones expuestos por mucho tiempo a partículas

en suspensión en la fase móvil, la solución es: reemplazar los sellos o pistones, si es

necesario [6].



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IV.3.2. Razones por las cuales se utiliza HPLC:

o Gran variedad de configuración operativa.

o Gran cantidad de diferentes sistemas de fase estacionaria.

o Gran numero de fases moviles y modificaciones de ella.

o Amplio campo de uso.

IV.3.3. Aplicaciones de HPLC:

o Para sustancias solubles en un solvente o una mezcla de solventes.

o Sustancias no solubles.

o Sustancias muy polares y/o ionicas.

o Sustancias de alto peso molecular

o Sustancias termolabiles.

IV.3.4. Limitaciones:

o Solubilidad de la sustancia (sustancias poco o no solubles)

o Detectabilidad de la sustancia.

IV.3.5. Campos de uso de HPLC:

o Control de pureza y calidad de producto

o Analisis de medicamentos

o Analisis de sustancias en matrices biologicas.

o Analisis de residuos de plaguicidas.

o Analisis de sustancias toxicas para el medio ambiente.

o Analisis de polimeros sinteticos.

o Separacion y limpieza de biopolímeros.

o Aislamientos de productos sensibles (HPLC preparativa).



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IV.3.6. Diagrama Básico de un Sistema de HPLC

Una instalación HPLC está compuesta de varias unidades especializadas las cuales pueden ser encontradas como entidades separadas o ser integradas dentro de un marco de trabajo común. Un sistema de tuberías de diámetros internos muy pequeños (0.1 mm) asegura la circulación de la fase móvil entre los módulos. Estos tubos de transferencia están hechos de acero inoxidable o de PEEK (Polyether-etherketone), un polímero coloreado y flexible, capaz de resistir los solventes comunes bajo presiones altas (por encima de 350 bares).

Figura No. 3. Esquema de un instrumento HPLC modular.

Un sistema modular permite a los usuarios adaptar la instalación de acuerdo a las

aplicaciones que serán llevadas a cabo. El ensamble vertical de los diferentes módulos

permite una economía de espacio. Aquí el cromatógrafo HP 1200, comprende un auto

muestreador que permite la operación continua y una columna controlada

termostáticamente para mejorar la reproducibilidad de las separaciones.



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Eleccion del solvente [6]

Caracteristicas:

• Disponible comercialmente

• Precio

• Pureza y estabilidad. En la actualidad contamos con productos de calidad de pureza

cromatografica. Bajo contenido de impurezas.

• Disolver la muestra

• Miscible con otros solventes para formar mezclas utiles

• No degradar o disolver la fase estacionaria

• Tener baja viscosidad para reducir las caidas de presion

• Ser compatible con el detector utilizado. Transpariencia optica (cuando se usan

detectores UV).

Filtración y desgasificacion de solventes [6]

Los solventes para HPLC, pueden acumular partículas en suspensión que pueden ser

perjudicial a los componentes del sistema HPLC.

Las partículas pueden ocasionar costosos daños a la bomba HPLC, al guardar columnas, y

en general causar desgaste del sistema de HPLC. Los fabricantes de los instrumentos tienen

en cuenta este problema y recomiendan que se filtre y desgasifique los solventes HPLC

antes de usarlos.

En el instante que se abre una nueva botella de solvente para HPLC se expone el interior

del solvente a la atmósfera y empieza a acumular gases disueltos que se encuentran en la

atmósfera.



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El nitrógeno disuelto puede producir burbujas en la columna de HPLC y cuando el solvente

entra al detector produce picos falsos y desviaciones de la línea base. El dióxido de

Carbono disuelto algunas veces puede ser la causa de los cambios de pH en el sistema de

solvente.

Métodos de filtración de solventes en HPLC [6]

Hay tres metodos comunes que se utilizan hoy para la filtración previa de los solventes

en HPLC:

Filtro a la entrada del Solvente

Filtración al Vacio

Filtración en linea

Métodos de Desgasificación de Solventes en HPLC [6]

Existen cuatro métodos comunes usados para desgasificar solventes en HPLC previos a su

uso:

Sonificación

Burbujear Helio

Desgasificación electrónica en la línea del flujo

Desgasificación al Vacío en línea

Bombas [6]

Requisitos o aspectos más importantes que debe reunir una bomba o sistema de bombeo:

Debe producir presiones estables hasta 6000 psi.

Mantener el flujo libre de pulsaciones

General intervalos de caudales de flujo (0.1 a 10 mL/min.)



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Control y Reproducibilidad del flujo del solvente

Componentes de la bomba resistentes a la corrosion

Programación del Solvente [6]

Existen dos metodos de programación de solventes en HPLC:

Isocrático. Es un término que se utiliza para describir el proceso analítico mediante

el cual no se cambia la composición de la fase móvil.

Gradiente de elución. Es término que se utiliza para describir el proceso mediante el

cual se cambia la composición de la fase móvil.

Sistemas de inyección de muestra [6]

Estos sistemas han variados durante la historia del sistema de HPLC, en un principio se

utilizaba la inyección de la muestra con jeringas de alta presión, las cuales, ya están en

desuso. Hoy se utiliza el sistema de válvulas inyectoras.

Columnas y Fases Estacionaria [6]

Columnas:

El material para la fase estacionaria consiste en particulas esfericas.

Las columnas analiticas son normales de acero o de vidrio con longitudes de 250, 125, 100,

60 milimetros y un diámetro interno de 2, 3, 4 milimetros.

Columnas preparativas pueden tener longitud hasta de un metro con diámetro interno de

hasta 50 milimetros. Para el uso industrial las medidas pueden ser mayores.



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Fases estacionarias [6]

La siguiente tabla muestra las fases estacionarias empleadas comúnmente en cromatografía

de líquida de la modalidad invertida.

Tabla No. 1. Fases estacionarias empleadas comúnmente

Tipo de Cadena -R Tamaño de Partícula

Larga -C18 H37 5 – 10

Intermedia -C8 H17 5 - 10

Los soportes de fases enlazadas poseen grupos funcionales incorporados a la cadena

hidrocarbonada saturada que se enlazan químicamente a la superficie del soporte, este tipo

de cromatografía es la llamada cromatografía de fase inversa (invertida o reversa) que

involucra una fase estacionaria relativamente poco polar como cadenas de hidrocarburos de

8 a 18 carbonos unidas a los grupos silanos del soporte y se utilizan por lo general con fases

móviles muy polares, esta modalidad cromatografía es la de mayor interés e impacto en la

actualidad.

La cromatografía de fase inversa, la retención de un analito dado y la composición de fase

móvil constante puede variar por el cambio de la polaridad de la fase estacionaria

químicamente enlazada. La única manera de que el factor de capacidad del analito de

iguales valores para diferentes columnas es variando la polaridad de la fase móvil.

En fase inversa, los solutos son aludidos en orden de polaridad, siendo eludido primero los

componentes más polares. Se pueden variar el tiempo de retención cambiando la polaridad

de la fase estacionaria o más fácilmente cambiando la polaridad de la fase móvil.

La polaridad de la fase estacionaria esta en dependencia del grupo no polarizado, por

ejemplo C – 8 > C – 18 y del porcentaje del carbono presente.



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La retención de un soluto dado con composición de fase móvil constante aumenta con la

longitud de la cadena alquílica químicamente agregada.

En cromatografía liquida de fase reversa la hidrofobicidad de la fase estacionaria y la del

soluto es la propiedad más importante. La prueba de retención del soluto depende de la

hidrofobicidad de la fase estacionaria en eluyentes semejantes. Los componentes de la fase

móvil por lo tanto pueden ser cambiados para diferentes tipos de fases estacionarias con el

fin de obtener el máximo desarrollo.

Detección [6]

La eficiencia de un detector cromatografico depende de la relacion entre la cantidad fisica

medida y la composición del efluente, asi como tambien de las caracteristicas de la señal

transferida. En farmacia el detector mas utilizado es el de Ultravioleta.



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IV.4. Validación de los métodos analíticos La validación de los métodos analíticos es un tema de considerable interés. Documentos

tales como “Directrices ACS para la adquisición de datos y evaluación de la calidad de los

datos “(1), recomendó el uso de métodos validados. La promulgación de regulaciones

federales al medio ambiente requiere la inclusión de métodos de referencia validados. Las

organizaciones que redactan estándares invierten considerable tiempo en métodos de

pruebas colaborativas que ellos preparan validándolos en aplicaciones típicas y

determinando sus características de resolución. Sin embargo, frecuentemente surgen

preguntas acerca de la convivencia de los métodos y la valides de su uso en situaciones

especificas. Algunas de esas preguntas pueden ser debido a la diferencia en entender tanto

qué significa el proceso de validación.[ 7]

La validación del método es un requisito importante en la práctica del análisis químico.

Validación del método es el “proceso de establecer las características de desempeño y

limitaciones del método y la identificación de los aspectos influyentes que puedan cambiar

estas características así como hasta que punto se puede cambiar”.

La validación de un método es un proceso basado en la confirmación del desempeño o de

que el mismo es consistente con los requerimientos de su aplicación. El laboratorio de

servicio y su personal tiene una clara responsabilidad, la confianza del cliente,

proporcionado la respuesta correcta a la parte analítica del problema en otras palabras debe

demostrarse que los resultados son “adecuados para el propósito” para esto será suficiente

que cualquier decisión que se tome basada en el sea confiable.

De manera que, el desempeño del método debe ser valido, y de igual manera, deberá

estimarse la incertidumbre del resultado y analizar las muestras adecuadas. [7]

IV.4.1 Jerarquía de la metodología La jerarquía de la metodología procede de lo general a lo específico, puede considerarse

como sigue:

Técnica método procedimiento protocolo.



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Una técnica es principio científico que se ha encontrado utilidad para proporcionar

información composicional; la espectrofotometría es un ejemplo.

Un método es una adaptación distinta de una técnica para un propósito de medición

seleccionado.

Un procedimiento consiste en una guía escrita necesaria para utilizar el método.

Los métodos estándares desarrollados por la ASTM y la AOAC, en realidad son

procedimientos estandarizados. Por tanto algún nivel de sofisticación es supuesto para el

usuario de todo el procedimiento publicado; si es muy sofisticado, el usuario solo

contemplara aquel mínimo detalle necesario o viceversa. Sin embargo se debe de notar que

cualquier omisión en la descripción del paso crítico es una fuente potencial de variación o

tendencia (desviación) aún en las manos de un analista muy experto y hábil. Debido a la

flexibilidad intencionada o no intencionada proporcionada al analista, o debido a las

diferencia en las interpretación que es justo decir que las menores /mayores diferencias de

la aplicación se dan aún en los procedimientos definidos con mas precisión. Tales

diferencias frecuentemente ocurren para la variabilidad de Inter.- laboratorio observada en

muchas pruebas de laboratorio colaborativas.

Además en algún punto de desviación del procedimiento publicado resulta un nuevo

método que puede necesitar su propia validación.

El termino protocolo es el nombre mas especifico para un método. Un protocolo es un

conjunto de guías definitivas que deben ser seguidas sin excepción si los resultados

analíticos son aceptados para un propósito dado. Los protocolos pueden consistir de

procedimientos o métodos ya existentes o modificaciones de los mismos o ellos pueden ser

desarrollados para propósitos específicos.

Una cantidad de métodos, procedimientos, y protocolos basados en el mismo principio de

medición puede surgir para una determinación analítica dada. Usualmente ellos son

diferentemente redactados y pueden contener sutilezas o mayores diferencias en los detalles

técnicos.[8]



20

Tabla No 2. Ejemplo de la Jerarquía de la metodología.

Técnica. Principio científico útil para proporcionar información de las composiciones específicas

Cromatografía

Método. Adaptación diferente de una técnica para un propósito de mediciones seleccionado.

Método cromatográfico para la medición de acetaminofén y tramadol en tabletas de ingeril compuesto.

Procedimiento. Guía escrita necesaria para seleccionar el método.

Método de prueba estándar para la determinación de acetaminofén y tramadol en tabletas de ingeril compuesto.

Protocolo.

Conjunto de guías definitivas que deben ser seguidas sin excepción si los resultados son aceptados para un propósito dado.

Método de referencia de los métodos estandarizados de la USP para la determinación de acetaminofén y/o tramadol en tabletas.

IV.4.2 Proceso de validación El proceso de validación verifica que la metodología este basada sobre principios técnicos

firmes y que han sido reducidos a la practica para propósito de medición practicas. Tanto la

necesidad de validar la metodología como el procedimiento a seguir son materia de juicio

profesional. La validación puede ser general o específica.[8]

IV.4.3 Validación general La validación de las técnicas de medición depende de la elucidación de los principios

científicos sobre los cuales ellos están basados. Tales resultados de validación para la

investigación de la comunidad científica y su solidez es evaluada por revisión. La mejor



21

comprensión de los principios de medición puede extender su alcance y mejorar la calidad

de su uso.

Los métodos surgen como resultado de una investigación aplicada, típicamente por

individuos que frecuentemente involucran tanto el entendimiento comprensible de las

técnicas de medición como el alto grado de ingenuidad e innovación en su aplicación. La

comprobación de los métodos en situaciones prácticas típicas juegan un papel clave, tanto

en el proceso de desarrollo como en el de la validación.

Los procedimientos son desarrollados para el uso final de los métodos en situaciones

analíticas prácticas. El usuario de laboratorio comúnmente necesita mas detalle

experimentales que están contenidos en reportes de investigación publicados de un método

para utilizarlos en aplicaciones practicas. Frecuentemente cuando un método gana un uso

extensivo el usuario puede decidir que este necesite ser estandarizado.

Un proceso de revisión completo incluye pruebas colaborativas (ver figura No. 4) en los

cuales los materiales de prueba estable típicos son analizados para verificar la utilidad del

procedimiento y para identificar tanto la debilidad técnica como editoriales.

Figura No. 4. Prueba colaborativa.

Método candidato

Método de referencia de

exactitud conocida

Muestra de referencia Homogéneamente

estable

Composición desconocida

Composición conocida

Precisión e inclinación de la evaluaciónPrecisión de la evaluación



22

Si la composición de la muestra de referencia es conocida, su precisión y su desviación

tanto a nivel intra o ínter laboratorio pueden ser evaluadas. Si un método de exactitud

conocida está disponible, el ensayo colaborativo puede consistir de su comparación con el

método propuesto en cualquier caso tanto la precisión como la desviación pueden ser

evaluadas. Un protocolo es preescrito por Fiat de una organización que requiere un tipo

específico de medición. Presumiblemente resulta de una decisión inteligente basado en el

proceso de validación de la organización o de otros. Esto puede consistir de un ensayo

colaborativo extenso o la publicación de protocolo propuesto para comentario público.

Desafortunadamente el juicio científico ha estado invalidado ante la ausencia de protocolos

defectuosos e invalidados. Los protocolos que han sido especificados en un arreglo

contractual pueden escoger arbitrariamente o a través de un proceso de selección bien

concebido. La verificación de su validez para su uso especifico debe ser de primera

consideración.[8]

IV.4.4 Validación para uso especifico El uso final de la metodología analítica es producir información composicional acerca de

las muestras específicas necesarias para la solución de un problema. El proceso de

validación clásica se ilustra en la figura siguiente.



23

IV.4.5 Proceso general para la metodología

Figura No 5. Evaluación / validación

Cuando las muestras de referencia están disponibles y es similar en todos los aspectos a las

muestras de prueba el proceso es muy simple: consiste en el análisis de un número

significativo de muestras de referencia y comparando los resultados que se esperan o

valores certificados. Antes o durante la práctica, el analista debe demostrar la habilidad del

estado del control estadístico del sistemas de medición para que los resultados puedan ser

realizados sobre otros, representativos a aquellos esperados cuando se utiliza en la

metodología de un sistema de medición. Cuando no se dispone de un material de referencia

apropiado se pueden usar otras técnicas. Una de ellas consiste de la comparación de los

resultados del método propuesto con aquellos de otros métodos conocidos sean aplicables y

Muestra fortificada con analito / Muestras de referencia

Método Independiente

Material Estándar de Referencia

Precisión

Método de exactitud conocida

Ensayo colaborativo

Bias

Método Evaluado validado

Mediciones Replicadas

Control de Calidad

Método Propuesto

Sustituta



24

confiables pero no útil en la situación real debido al costo indisponibilidad del personal o

equipo u otras razones.

Las muestras llamadas “spiked” (fortificada con el analíto) y “surrogated” pueden ser

usadas como muestras de referencia. Esta técnica es menos deseable y menos satisfactoria

debido a la dificultad en la preparación confiable de las muestras y debido a la artificialidad

añadida de materiales tales como “spikes” y “surrogates” que pueden exhibir diferentes

efectos de matrices a aquellas de las muestras naturales. La división de las muestras reales

de ensayos puede ser utilizada para evaluar la precisión de un método o procedimiento,

pero ellas no proporcionan información acerca de la presencia o magnitud de cualquier

“bias” (inclinación) de la medición.

Otra técnica es inferir la metodología apropiada de las mediciones sobre análogos, pero

diferentes orígenes. Se necesita un análisis crítico del analista para decidir la validez de la

interferencia.

En todos los casos las pruebas suficientes se pueden hacer para evaluar la metodología para

una variedad de matrices y rangos de composición esperada dentro del proceso de

medición, comúnmente debería incluir tres niveles de concentración, es decir, los extremos

y el rango medio de composición esperada. Las consideraciones estadísticas sugieren que al

menos seis grados de libertad (ordinariamente siete mediciones) deberían estar

involucrados en cada punto de medición. [8]

IV.4.6 El método de adición patrón Uno de los principales problemas en las determinaciones de los analitos en las muestras es

el efecto de matriz, la cual se define como las interferencias de los diferentes componentes

de la muestra en la determinación del componente principal. Esto significa que la señal

detectada será una respuesta no solamente del componente principal (o analito) sino debido

a otros componentes de la matriz. El efecto de matriz puede aumentar o disminuir la señal

verdadera, lo que trae como consecuencia un error sistemático en la determinación

analítica. Para minimizar las interferencias de la matriz, se ha implementado la curva de

calibración por el método de adición estándar.[7]



25

IV.4.6.1 Adición Patrón Para ganar seguridad en la utilización de las rectas de calibrado, o sea, de la correcta

similitud en el comportamiento de patrones y problemas, es aconsejable el método de la

adición estándar.

Las dudas suelen plantearse en los sistemas analíticos complejos o para las muestras con

matrices difícilmente reproducibles en los patrones, el caso de alimentos, muestras

biológicas o del medio ambiente, y evidentemente cuando concurren las dos circunstancias.

La duda surge al no disponer de muestras de la misma matriz pero sin contaminación del

metal, para utilizarla en la preparación de los patrones de calibración. Una solución es

preparar los patrones con la misma muestra. Para ello se toman varios volúmenes iguales de

la disolución a analizar, añadiendo a algunas de ellas cantidades perfectamente conocidas

de la especie química a determinar y todas las alícuotas se enrazan al mismo volumen. Con

ello se dispone de una serie de preparaciones que contienen, además de la cantidad

problema (no conocida), las cantidades adicionadas, incluyendo la adición cero y valores

que cubren el margen de linealidad. El método de las adiciones se apoya en dos premisas

no siempre válidas; una es suponer que en el sistema analítico los patrones adicionados se

comportan de la misma forma que lo hace la sustancia contenida en la muestra, pues no

podemos asegurar que correspondan a la misma especie o combinación química (estado de

oxidación o de complejación, etc.). Otra suposición es que la relación señal-concentración

mantiene la misma función lineal (concretamente la misma pendiente) fuera del margen

calibrado, pues se deduce la concentración por extrapolación. Si con el método de la

adición patrón se detecta interferencia, se recomienda modificar las condiciones

experimentales o utilizar modificaciones de matriz para eliminar o reducir al mínimo la

interferencia.[9]

IV.4.7 Criterios de eficiencia

Los criterios de eficiencia pueden clasificarse en primarios y secundarios. Los criterios

primarios son:



26

IV.4.7.1 Precisión

Es una medida de que tan cerca están los resultados entre sí y usualmente se expresa por

medio del valor de la desviación estándar, que describe la dispersión, o sea que, describe la

magnitud de los errores aleatorios. [9]

IV.4.7.2 Exactitud o Bias (sesgo)

Que mide la magnitud de los errores sistemáticos.

IV.4.7.3 Límite de detección

Que mide la cantidad mínima que puede diferenciarse de la señal de ruido de fondo. Es la

concentración del analito que produce una señal que es tres desviaciones estándar mayor

que la del blanco.

Uno de los puntos característicos de la recta de calibrado es la señal para la concentración

cero, que puede tener diferente significado si corresponde a la medida realizada sobre los

reactivos sin la muestra (prueba en blanco de los reactivos). O bien, se realiza sobre la

muestra sin alguno de los reactivos esenciales (prueba en blanco de la matriz de la

muestra). Las explicaciones que puedan darse a la desviación desde cero hacia valores

positivos o negativos de la señal para las pruebas en blanco, constituyen un buen índice del

grado de conocimiento que el científico posee del procedimiento analítico. [9]

Ambas señales de las pruebas en blanco suelen acumularse sobre las de la muestra, aunque

de manera diferente a las señales de los patrones, por lo que es más prudente mantener

estos valores en la representación de la recta de calibrado, y sustraer al resultado de

concentración del correspondiente a la prueba en blanco. La señal de la prueba en blanco

10 /29.3. bSbDL = Ec. (1)



27

también presenta errores experimentales y, por lo tanto, una dispersión de valores que

afectan al límite de detección del procedimiento.

Así como la pendiente de la recta de calibrado es un índice de la sensibilidad del

procedimiento analítico, la precisión de esta pendiente y la de la ordenada en el origen

establecen el límite de detección, o sea la cantidad mínima de sustancia detectable

cuantitativamente. El valor del límite de detección se establece con criterios de

probabilidad de cometer error por asignar un valor a la señal de un blanco, o bien por

asignar el valor del blanco (no detectable) cuando en realidad la muestra contiene cantidad

significativa de sustancia. También aquí la estadística proporciona diversos modelos para

establecer estos límites, según el grado de seguridad que se desee alcanzar. En algunas

técnicas instrumentales se llama "ruido de fondo" a la dispersión de la señal del blanco,

estableciéndose como límite de detección la concentración que da una señal doble o triple

respecto a la señal de fondo.

Es incorrecto utilizar expresiones como "no detectable", "ausencia" o "0", como resultado

correspondiente a señales iguales a la prueba en blanco, siendo correcto decir que el

resultado de una señal no diferenciable de la prueba en blanco es "inferior al límite de

detección", cuyo valor se ha determinado previamente.[9]

Los criterios secundarios son los que tienen influencia en los primarios; estos son:

IV.4.7.4 Límite de cuantificación

Es la más baja concentración del analito que puede ser cuantificada con suficiente precisión

y exactitud. También es definido, convencionalmente, como la concentración de analito que

corresponde al blanco de la muestra, más 5, 6 ó 10 desvíos estándar de la media (del

blanco), también se le conoce como “límite de determinación”.

10 /10. bSbCL = Ec. (2)



28

IV.4.7.5 Linealidad

Que describe el comportamiento entre la respuesta y la concentración a través del modelo

de calibración (una desviación del modelo representa un bias).

IV.4.7.6 Rango

Representa el intervalo (niveles inferior y superior del analito)en el cual la relación lineal u

otro modelo de calibración utilizado es correcta. [9]

IV.4.7.7 Selectividad

Este parámetro asegura que la señal medida no es influenciada por otras sustancias

presentes en la muestra y en caso contrario, garantiza la remoción de las mismas, otro

aspecto importante de la selectividad es si el analito puede existir en la muestra de una

forma, tal como enlazado o libre, inorgánico u órgano - metálico, o en diferentes estados de

oxidación. [9]

IV.4.7.8 Sensibilidad

Es el parámetro que mide la magnitud del cambio en la función de respuesta (o señal) con

la concentración y corresponde a la pendiente de la curva de respuesta. [17]



29

IV.5. Aproximación ISO para el cálculo de la Incertidumbre

Para llevar a cabo el cálculo de la incertidumbre comúnmente se divide el proceso de

medida químico en sus partes fundamentales, cada una de estas partes fundamentales se

subdivide a la vez en contribuciones más pequeñas, etc. Posteriormente, se calcula la

incertidumbre de cada una de las partes y se combinan para obtener la incertidumbre global

del proceso de medida química.[10]; [11]; [12]

Figura No. 6, Flujograma para el cálculo de la incertidumbre de un procedimiento según

la aproximación ISO.

Especificación

Aquí debe modelarse el proceso de medida. Es decir, debe establecerse cual es la relación

que existe entre el resultado analítico y los parámetros de los cuales depende.[10]; [13; [14]

Identificación

Una vez modelado el proceso de medida, deben identificarse todas las fuentes de

incertidumbre independientemente de la importancia que pueda tener cada una de ellas en

la incertidumbre final de los resultados. [10]; [11]; [12]

Especificación Modelado del proceso de medida

Identificación Identificación de las fuentes de incertidumbre

Cuantificación Cálculo de la incertidumbre estándar

Combinación Cálculo de la incertidumbre estándar combinada

Cálculo de la incertidumbre expandida



30

Combinación

Los componentes de incertidumbre individuales deben combinarse siguiendo la ley de

propagación del error. De esta forma, se obtiene la incertidumbre total estándar. [10]; [13; [14]

( ) ( ) ( )ij

n

i

n

ij ji

n

ii

ic X

Xc

XcXU

XcU cov.2.

1 1

1

1

2

∑ ∑∑= +=

−

= ∂∂

∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

= Ec. (3)

Donde “c” es el resultado obtenido con el procedimiento analítico, Xi es el parámetro “i”

del que depende el resultado, U(Xi) es la incertidumbre estándar de Xi y cov (Xij) es la

covarianza que hay entre los parámetros Xi y Xj.

Finalmente el cálculo de la incertidumbre expandida, U(c), proporciona un intervalo de

confianza donde se encuentra el valor verdadero con una determinada probabilidad. Esta

incertidumbre se obtiene multiplicando la incertidumbre estándar por un factor de cobertura

“k” . [10]; [11]; [12]

( ) ( )cukcU .= Ec. (4)

el factor de cobertura “k” depende de la probabilidad con la que queremos que se encuentre

el valor verdadero dentro del intervalo c ± U(c) así como de la distribución y de los grados

de libertad asociados a U(c). Normalmente, se utiliza el valor de k = 2. este valor asume

una distribución normal y una probabilidad aproximada del 95.45 % de contener el valor de

“t” tabulado de dos colas para el nivel de significación escogido y los grados de libertad

efectivos, veff, calculados con la aproximación de Welch-Satterthwaite. [10]; [11]; [12]

Ec. (5)

Donde vi es el número de grados de libertad asociados a U(xi).

( )( )∑

=

=n

i i

iffe

vxu

cuv

1

4

4



31

V. PARTE EXPERIMENTAL

V.1. Equipos y Materiales

Tabla No. 3. Equipos y materiales

Descripción Marca Modelo

Agitador ultrasónico. Fisher Scientific FS -30

Balanza analítica. Ohaus Explorer

Balones aforados. Pirex Clase A

Beaker. Pirex -

Bomba de vacío. Welch 2534B-01

Calculadora científica. - -

Columna. Agilent Zorbax SB-C8

Cromatógrafo líquido de alta eficiencia

(HPLC).

Varian ProStar. -

Espátulas - -

Filtro econofiltro. Agilent -

Filtro de membrana de Nylon. Agilent -

Jeringa. Agilent -

Kit de micro filtración. Agilent -

Mortero y Pilón - -

pH-metro Termo Orion 420 -

Pipetas Pirex Clase A

Probeta Pirex -

Viales de 2 mL Varian Varian



32

V.2. Reactivos Tabla No. 4. Reactivos

Descripción Calidad

Fosfato de Sodio Monobásico de Potasio

grado HPLC

Agua destilada

grado HPLC

Trietilamina (TEA)

(p.a.)

Metanol

grado HPLC

V.3. Contenido de la Tableta de Ingeril Compuesto de 650 mg V.3.1. Principios activos Acetaminofen DC 90 361.11 mg equivalente a 325 mg Acetaminofen Tramadol Clorhidrato 37.5 mg

V.3.2. Excipientes (Placebo) Almidón de maíz

Almidón pregelatinizado

Avicel pH-102

Cab-o-sil

Estereato de Magnesio

Vivastar-p



33

V.4. Procedimientos

V.4.1 Condiciones cromatográficas

• Equipo: Cromatógrafo liquido de alta Resolución

• Columna: Agilent Zorbax SB-C8

• Sistema: Binario, Fosfato Monobásico de Potasio (FMK)/Metanol (MeOH) en relación

(60/40)

• Longitud de onda: 270 nm

• Temperatura: ambiente (30 oC)

• Flujo: 1.2 mL/min

• Volumen de inyección: 20 µL

• Tiempo de Retención: 1.2 min (Acetaminofén) y 4.2 - 4.3 min. (Tramadol HCl)

aproximadamente

• Tiempo total de corrida: 5 min.

• Método de calculo: Estándar externo

V.4.2. Preparación de la Fase Móvil

Buffer PH 4.9

Desgasificar 300 mL Metanol. Pesar exactamente 3.4 g de Fosfato Monobásico de Potasio (FMK)

y disolver con 500 mL de Agua destilada, ajustar el PH con una o mas gotas de trietilamina (TEA)

y desgasificar.

Fase Móvil: Buffer PH 4.9 ajustado con trietilamina (TEA), proporción Fosfato Monobásico de

Potasio (FMK)/Metanol (MeOH) en realación 60/40

V.4.3. Preparación de la curva de calibración normal de acetaminofén y tramadol

Tomar 5 matraces volumétricos de 100 mL, limpios y secos, agregarles a cada uno 80, 90, 100,

110, 120 mg de Acetaminofén, seguidamente agregarles exactamente 9.2, 10.3, 11.5, 12.6, 13.8

mg de Tramadol HCl, posteriormente aforar cada uno de los matraces con agua desionizada y

someterlos a una baño ultrasónico por 10 min. Luego tomar 10 mL de cada una de las soluciones

estándar y colocarlos en otros 5 matraces volumétricos de 100 mL y aforar con agua desionizada.



34

V.4.4. Preparación de la muestra

Determinar el peso promedio de 20 tabletas de Ingeril Compuesto posteriormente molerlas hasta

polvo fino. Pesar 200 mg de muestra para obtener de acuerdo a la relación entre peso promedio y

la cantidad existente de activo, un equivalente 100 mg de acetaminofén y 11.5 mg de tramadol.

Luego transferir a un balón de 100 mL y aforar con agua desionizada. Someter a baño ultrasónico

por 30 min. Luego tomar 10 mL de la solución conteniendo la muestra, transferir a un balón de

100 mL y aforar con agua destilada.

Usar una jeringa con filtro 0.2 µm tomar 2 mL de cada solución y transferir a un vial de 2 mL

respectivamente.

V.4.5. Selectividad del método.

Realizar tres inyecciones del solvente utilizado para los análisis y tres inyecciones del

placebo utilizado en la formulación de las tabletas de ingeril compuesto, luego realizar tres

inyecciones de un estándar de acetaminofén y tres inyecciones de un estándar de tramadol

posteriormente realizar tres inyecciones de la muestra a analizar. En todos los casos

observar que no exista ninguna señal cormatográfica que coincida con los tiempos de

retención de los principios activos a estudiar es decir que no deben existir interferencias con

las señales de nuestro interés.

V.4.6. Influencia del placebo en la curva de calibración normal





estándar y colocarlos en otros 5 matraces volumétricos de 100 mL y aforar con agua desionizada.

Posteriormente tomar otros 5 matraces volumétricos de 100 mL, limpios y secos, agregarles a cada

uno 80, 90, 100, 110, 120 mg de Acetaminofén, seguidamente agregarles exactamente 9.2, 10.3,

11.5, 12.6, 13.8 mg de Tramadol HCl, luego adicionar las cantidades necesarias del placebo

descrito en V.3.2 (equivalente al contenido en una tableta) posteriormente aforar cada uno de los



35

matraces con agua desionizada y someterlos a una baño ultrasónico por 10 min. Luego tomar 10

mL de cada una de las soluciones estándar conteniendo placebo y colocarlos en otros 5 matraces

volumétricos de 100 mL para posteriormente aforar con agua desionizada, de éstos se toman 20μL

y se inyectan al cromatógrafo.

Graficar en el mismo plano la curva de calibración normal sin contener placebo y la otra

conteniendo placebo (realizar esto con cada principio activo), luego comparar los resultados

gráficamente, las curvas no deberán cruzarse en ningún punto para que no exista ninguna

influencia del placebo en la curva de calibración normal.

V.4.7. Idoneidad del Sistema





estándar y colocarlos en otros 5 matraces volumétricos de 100 mL y aforar con agua desionizada,

tomar 20 μL e inyectarlos al cromatógrafo.

Seguidamente calcular los parámetros de idoneidad del sistema los cuales deberán de

cumplir con los valores de aceptación sugeridos en la Farmacopea de Estados Unidos

(USP).

V.4.8. Linealidad del sistema y del método cromatográfico

Linealidad del sistema





estándar y colocarlos en otros 5 matraces volumétricos de 100 mL y aforar con agua desionizada

tomar 20 μL e inyectarlos al cromatografo.



36

Linealidad del método



mg de Tramadol HCl, luego adicionar a cada uno 200 mg de una muestra (tableta), posteriormente

aforar cada uno de los matraces con agua desionizada y someterlos a una baño ultrasónico por 10

min. Luego tomar 10 mL de cada una de las soluciones estándar y colocarlos en otros 5 matraces

volumétricos de 100 mL para posteriormente aforar con agua desionizada, de éstos se toman 20μL

y se inyectan al cromatógrafo.

Realizar los gráficos independientes para la linealidad del sistema y del método,

posteriormente calcular los coeficientes de determinación los cuales deberán de ser

mayores o igual a 0.99.

V.4.9. Precisión del sistema y del método cromatográfico

Precisión del sistema

Realizar 5 inyecciones de tres niveles de concentración diferentes: uno bajo, un nivel

intermedio y un nivel alto. Para acetaminofén 80, 100, 120 μg/mL y para tramadol 9.2,

11.5, 13.8 μg/mL. Calcular el factor de respuesta y su desviación estándar relativa

expresada como porcentaje (%RSD) la cual deberá ser menor del 2 %.

Precisión del método

Realizar 5 inyecciones de tres niveles de concentración diferentes: uno bajo, un nivel

intermedio y un nivel alto. Para acetaminofén 80, 100, 120 μg/mL (dopando cada uno con

muestra “equivalente a 100 μg/mL de acetaminofén”) y para tramadol 9.2, 11.5, 13.8

μg/mL (dopando cada uno con muestra “equivalente a 11.5 μg/mL de tramadol”). Calcular

el factor de respuesta y su desviación estándar relativa expresada como porcentaje (%RSD)

la cual deberá ser menor del 2 %.



37

V.4.10. Exactitud del método

La exactitud del método se evaluó de dos maneras, para las cuales se describe a

continuación el procedimiento.

1) Tomar 5 matraces volumétricos de 100 mL, limpios y secos, agregarles a cada uno 80,

90, 100, 110, 120 mg de Acetaminofén, seguidamente agregarles exactamente 9.2,

10.3, 11.5, 12.6, 13.8 mg de Tramadol HCl, posteriormente aforar cada uno de los

matraces con agua desionizada y someterlos a una baño ultrasónico por 10 min. Luego

tomar 10 mL de cada una de las soluciones estándar y colocarlos en otros 5 matraces

volumétricos de 100 mL y aforar con agua desionizada tomar 20 μL e inyectarlos al

cromatografo. Calcular el porcentaje de recuperación (%R) para cada nivel de

concentración de la curva dividiendo la concentración experimental entre la

concentración teórica multiplicado por 100, éste deberá estar entre 90% - 110 %.

2) Curva de calibración normal: Tomar 5 matraces volumétricos de 100 mL, limpios y

secos, agregarles a cada uno 80, 90, 100, 110, 120 mg de Acetaminofén, seguidamente

agregarles exactamente 9.2, 10.3, 11.5, 12.6, 13.8 mg de Tramadol HCl,

posteriormente aforar cada uno de los matraces con agua desionizada y someterlos a

una baño ultrasónico por 10 min. Luego tomar 10 mL de cada una de las soluciones

estándar y colocarlos en otros 5 matraces volumétricos de 100 mL y aforar con agua

desionizada, tomar 20 μL e inyectarlos al cromatografo.

Curva de adición patrón: Tomar 5 matraces volumétricos de 100 mL, limpios y secos,

agregarles a cada uno 80, 90, 100, 110, 120 mg de Acetaminofén, seguidamente

agregarles exactamente 9.2, 10.3, 11.5, 12.6, 13.8 mg de Tramadol HCl, luego

adicionar a cada uno 200 mg de una muestra (tableta), posteriormente aforar cada uno

de los matraces con agua desionizada y someterlos a una baño ultrasónico por 10 min.

Luego tomar 10 mL de cada una de las soluciones estándar y colocarlos en otros 5

matraces volumétricos de 100 mL para posteriormente aforar con agua desionizada, de

éstos se toman 20μL y se inyectan al cromatógrafo.



38

Calcular el porcentaje de recuperación (%R) para acetaminofén y para tramadol

respectivamente, el %R se calcula dividiendo la pendiente de la curva de adición patrón

ente la pendiente de la curva de calibración normal, el %R deberá estar entre 90 % a 110 %.

V.4.11. Efecto de matriz

Curva de calibración normal: Tomar 5 matraces volumétricos de 100 mL, limpios y

secos, agregarles a cada uno 80, 90, 100, 110, 120 mg de Acetaminofén, seguidamente

agregarles exactamente 9.2, 10.3, 11.5, 12.6, 13.8 mg de Tramadol HCl, posteriormente

aforar cada uno de los matraces con agua desionizada y someterlos a una baño ultrasónico

por 10 min. Luego tomar 10 mL de cada una de las soluciones estándar y colocarlos en

otros 5 matraces volumétricos de 100 mL y aforar con agua desionizada, tomar 20 μL e

inyectarlos al cromatografo.

Curva de adición patrón: Tomar 5 matraces volumétricos de 100 mL, limpios y secos,

agregarles a cada uno 80, 90, 100, 110, 120 mg de Acetaminofén, seguidamente agregarles

exactamente 9.2, 10.3, 11.5, 12.6, 13.8 mg de Tramadol HCl, luego adicionar a cada uno

200 mg de una muestra (tableta), posteriormente aforar cada uno de los matraces con agua

desionizada y someterlos a una baño ultrasónico por 10 min. Luego tomar 10 mL de cada

una de las soluciones estándar y colocarlos en otros 5 matraces volumétricos de 100 mL

para posteriormente aforar con agua desionizada, de éstos se toman 20μL y se inyectan al

cromatógrafo.

Graficar las dos curvas (adición patrón y calibración normal) en un mismo plano, para

acetaminofén y para tramadol. Las curvas deberán ser paralelas entre si para que no exista

efecto de matriz.

V.4.12. Límite de detección y de cuantificación

Elaborar dos curvas de calibración normal a concentraciones diluidas cercanas a la señal

del ruido, una para Acetaminofén (0.5, 1.0, 1.5, 3.0, 5.0, 7.0, 9.0 μg/mL) y otra para

Tramadol (0.06, 0.12, 0.17, 0.35, 0.58, 0.81, 1.03 μg/mL). Calcular el LD y el LC

utilizando las ecuaciones 1 y 2.



39

V.4.13. Repetiblidad de las curvas de calibración normal

Elaborar dos curvas de calibración normal, una para Acetaminofén y otra para Tramadol en

el rango de concentración de 80 a 120 μg/mL y de 9.2 a 13.8μg/mL respectivamente,

realizar una curva diariamente durante cinco días, posteriormente realizar el gráfico de

control para el intercepto y la pendiente de las curvas, todos los valores deberán estar

dentro de la zona de aceptación de la elipse.

V.4.14. Aplicación del método y estimar la incertidumbre asociada a la cuantificación

Las muestras a analizar se trataron de acuerdo al procedimiento V.4.4 para luego realizar

los cálculos correspondientes según el modelo matemático. Para evaluar la incertidumbre

primeramente se realizó la deducción del modelo matemático a partir del proceso de

medición analítico, posteriormente se identificaron las fuentes de incertidumbres que

contribuyen a la incertidumbre global del proceso de medición y se cuantificaron cada uno

de estos componentes, seguidamente se calcularon los coeficientes de sensibilidad para

cada parámetro del modelo matemático, a continuación se combinaron las incertidumbres y

se calculó la incertidumbre combinada la cual al multiplicarla por un factor de cobertura de

2 para un nivel de confianza de 95.45 % se obtuvo la incertidumbre expandida con la cual

se reportan nuestros resultados.



40

VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

VI.1. Selectividad

Para realizar el estudio de selectividad del método se analizaron los cromatogramas de: el

solvente, los ingredientes placebos usados en la formulación de la tableta de ingeril

compuesto, así como los cromatogramas de estándares de los dos principios activos de la

tableta y de la muestra (tableta Ingeril Compuesto). Se realizaron tres inyecciones del

solvente y del placebo, tres inyecciones del estándar de acetaminofen y tres inyecciones del

estándar de tramadol así como tres inyecciones de la muestra a analizar. Primeramente se

analizó el solvente con el objetivo de observar que no hubieran interferencias con ninguno

de los picos cromatográficos de interés (fig. 7), seguidamente se analizó el cromatograma

correspondiente al placebo (fig. 8) con el propósito de demostrar que no existen

interferencias debida a los excipientes, tal y como se puede observar en la figura No. 8, no

existe ninguna interferencia, posteriormente se analizaron los cromatogramas de los

estándares de acetaminofen y de tramadol (fig. 9). Finalmente se analizaron los

cromatogramas de la muestra conteniendo acetaminofen y tramadol (Ingeril Compuesto)

para observar la resolución de los picos, como se puede observar en la figura No. 10, los

picos tienen muy buena resolución. Los tiempos de retención obtenidos fueron de 2.15 y de

4.47 para acetaminofen y tramadol respectivamente tal a como se puede observar en la

figura No. 10, el tiempo muerto fue de 1.45. Se logró observar una diferencia adecuada

entre los tiempos de retención, por otro lado no se observó ninguna señal cromatográfica

que pudiera interferir en la determinación o cuantificación de acetaminofen y tramadol en

la tableta de ingeril compuesto, por lo que podemos afirmar que el método es selectivo para

la determinación de los dos principios activos.



41

Figura No. 7.Cromatograma del solvente

Figura No. 8.Cromatograma del placebo (excipientes)

Figura No.9 .Cromatograma de estándares de acetaminofén y clorhidrato de tramadol



42

Figura No.10 .Cromatograma de la muestra (Ingeril Compuesto)



43

VI.2. Influencia del placebo

Este estudio se realizó con el propósito de comprobar la influencia que ejerce el placebo

(interferencia de los excipientes) sobre la curva de calibración normal, ya que muchas

determinaciones se realizan mediante interpolación de la curva de calibración normal la

cual pudiera ser elaborada tomando o no en cuenta el placebo lo cual podría generar un

error en dicha determinación en caso de que éste provoque alguna influencia o algún efecto

en la curva de calibración normal.

Para llevar a cabo dicho estudio se elaboraron dos curvas de calibración normal, una sin

tomar en cuenta el placebo y la otra tomando en cuenta el mismo. Los resultados se

muestran a continuación en la siguiente tabla.

Tabla No. 5. Datos de las curvas de calibración normal con placebo y sin placebo.

Acetaminofen Tramadol

Áreas Áreas Concentración

μg/mL Con Placebo Sin Placebo

Concentración

μg/mL Con Placebo Sin Placebo

80 1492.78 1486.92 9.2 32.50 37.04

90 1725.32 1671.96 10.3 39.40 41.44

100 1948.88 1874.26 11.5 42.22 46.08

110 2084.9 2051.04 12.6 48.00 52.34

120 2284.28 2248.08 13.8 54.30 57.24

r2 0.9922 0.9997 r 2 0.9853 0.9957

A continuación se pueden observar los gráficos elaborados a partir de los datos mostrados

en la tabla anterior, tanto para los estándares de acetaminofen como para los estándares de

Tramadol con y sin placebo.



44

Tramadol

30

35

40

45

50

55

60

8,5 9,5 10,5 11,5 12,5 13,5 14,5

µg/mL

Áre

as

Sin Placebo Con Placebo

Acetaminofen

1200

1400

1600

1800

2000

2200

2400

75 85 95 105 115 125

µg/mL

Áre

as

Sin Placebo Con Placebo

Gráfico No. 1. Gráfico de concentración Vs área para la Acetaminofen con y sin placebo

Gráfico No. 2. Gráfico de concentración Vs área para la Tramadol con y sin placebo

Como se puede observar en los gráficos anteriores no existe ningún efecto provocado por

los excipientes en la curva de calibración normal (estándares puros) ya que las rectas

obtenidas con y sin placebo son paralelas en ambos casos tanto para acetaminofen como

para tramadol. Por tanto la curva de calibración normal podrá ser elaborada tomando en

cuenta o no el placebo.



45

VI.3. Idoneidad del Sistema

La determinación de la Idoneidad del Sistema es un conjunto de ensayos que se realizan

para comprobar que un sistema (analista, reactivos e instrumentos) es adecuado para una

metodología analítica determinada. Este estudio se realiza antes de que un sistema analítico

se utilice por primera vez, y cuando una columna o material de separación de otro

fabricante, sea utilizado por primera vez. Se considera como parte integral del

procedimiento de análisis y requisito previo a su realización.

Con el objetivo de realizar el estudio de la idoneidad del Sistema se elaboraron dos curvas

de calibración normal, una para Acetaminofen y otra para Tramadol, las curvas se

realizaron en el rango de concentración de 80 a 120 μg/mL y de 9.2 a 13.8μg/mL

respectivamente, se realizaron en total 5 puntos para cada curva y tres réplicas por cada

punto, los detalles de las curvas de calibración normal pueden ser observados en los anexos.

Posteriormente se calcularon el tiempo de retención (Tr), el factor de asimetría (T) y el

número de platos teóricos (N) tanto para la curva de acetaminofen como para la curva de

tramadol. A continuación se muestran los datos obtenidos para cada caso.

Tabla No. 6. Tabla de los parámetros de idoneidad para Acetaminofen

Tiempo de retención (Tr)

Factor de Asimetría (T)

Número de platos Teóricos (N)

Promedio 2.15 1.11 4377.98 Desviación Estándar 0.005 0.031 18.51

Criterio de Aceptación USP - ≤ 2 > 2000 Cumple Si/No - Sí Si

Tabla No. 7. Tabla de los parámetros de idoneidad para Tramadol

Tiempo de retención (Tr)

Factor de Asimetría (T)

Número de platos Teóricos (N)

Promedio 4.47 1.22 5108.73 Desviación Estándar 0.011 0.028 24.300

Criterio de Aceptación USP - ≤ 2 > 2000 Cumple Si/No - Sí Si



46

Los resultados de los parámetros de idoneidad obtenidos con las condiciones

cromatográficas establecidas fueron comparados con los valores de los parámetros de

aceptación reportados en la USP. Como se puede observar los resultados obtenidos

cumplen con los criterios de aceptación propuestos en la USP.

VI.4. Linealidad del Sistema y Linealidad del Método

Este estudio se realizó con el objetivo de encontrar el grado de linealidad que existe a lo

largo de un buen rango de aplicación, para comprobar la linealidad del sistema se realizó

una curva de calibración normal en un intervalo de concentración entre 80 – 120 μg/mL

para acetaminofen y de 9.2 – 13.8 μg/mL para Tramadol, los datos se muestran en la tabla

No. 8.

El valor del coeficiente de determinación (r2) obtenido fue: 0.9997 para acetaminofen y de

0.9990 para Tramadol, una linealidad ideal indica un valor de coeficiente de determinación

igual a 100 % (r2 = 1),

Tabla N. 8. Datos de las curvas de calibración normal para acetaminofen y tramadol


Concentración

μg/mL Área

Concentración

μg/mL Área

80 1535.82 9.2 37.04 90 1735.86 10.3 41.44 100 1915.56 11.5 47.26 110 2119.28 12.6 52.34 120 2307.00 13.8 57.24 r 2 0.9997 r 2 0.9990

Como el valor de r2 obtenido experimentalmente es cercano a la unidad se puede decir que

existe una excelente linealidad, es decir existe una fuerte correlación entre las áreas

obtenidas como función de la concentración inyectada. A continuación se muestran los

gráficos obtenidos.



47

Linealidad del Sistema(Acetaminofen)

1400

1600

1800

2000

2200

2400

75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125

µg/mL

Áre

as

Linealidad del Sistema(Tramadol)

30

35

40

45

50

55

60

9 9,5 10 10,5 11 11,5 12 12,5 13 13,5 14

µg/mL

Áre

as

Gráfico No. 3. Linealidad del Sistema para Acetaminofen

Gráfico No. 4. Linealidad del Sistema para Tramadol



48

A demás de evaluar la linealidad del Sistema a través de la curva de calibración normal se

evaluó la linealidad del Método por medio de una curva de adición patrón dentro del mismo

rango de concentraciones de (80-120 μg/mL para acetaminofen y de 9.2 a 13.8 μg/mL para

tramadol), los datos se muestran en la tabla No 9.

Tabla N. 9. Datos de las curvas de adición patrón para acetaminofen y tramadol


Concentración

μg/mL Área

Concentración

μg/mL Área

80 1736.3 9.2 39.1 90 1933.1 10.3 45.4 100 2140.0 11.5 51.8 110 2353.0 12.6 57.6 120 2580.0 13.8 64.0 r 2 0.9993 r 2 0.9997

El valor del coeficiente de determinación (r2) obtenido fue: 0.9993 para acetaminofen y de

0.9997 para tramadol, como los valores de coeficientes de determinación obtenidos están

cercanos a la unidad (r2 = 1) es decir casi 100 %, entonces podemos afirmar que existe una

fuerte correlación entre la variable dependiente (Áreas) y la variable independiente

(Concentración) es decir el método tiene una excelente linealidad en el rango de aplicación

seleccionado tanto para acetaminofen como para tramadol. Las gráficas se muestran a

continuación



49

Linealidad del Método(Acetaminofen)

150017001900210023002500

75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125

µg/mL

Área

Linealidad del Método(Tramadol)

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

9 9,5 10 10,5 11 11,5 12 12,5 13 13,5 14

µg/mL

Área

Gráfico No. 5. Linealidad del Método para Acetaminofen

Gráfico No. 6. Linealidad del Método para Tramadol



50

VI.5. Precisión del Sistema y Precisión del Método

La precisión del sistema se llevo a cabo realizando cinco inyecciones de tres estándares a

tres niveles de concentraciones diferentes, 80, 100 y 120 para acetaminofen y de 9.2, 11.5 y

13.8 para tramadol, seguidamente se calculó el factor de respuesta (FR =

Área/Concentración) para cada estándar, posteriormente se calculó el promedio y la

desviación estándar correspondiente a cada estándar, para finalmente calcular el %RSD por

medio del cual se evalúa la precisión del sistema. Los resultados se muestran a

continuación en las siguientes tablas.

Tabla No. 10. Resultados del estudio de precisión del Sistema para Acetaminofen

Concentración (μg/mL) Réplicas 80 100 120 1 1483.3 1872.7 2245.6 2 1485.9 1874.3 2247.5 3 1486.8 1874.3 2247.6 4 1489.4 1876.1 2251.2 5 1489.2 1873.9 2248.5

18.5 18.7 18.7 18.6 18.7 18.7 18.6 18.7 18.7 18.6 18.8 18.8

FR

18.6 18.7 18.7 Promedio 18.6 18.7 18.7 Desv. Est. 0.03 0.012 0.017 %RSD 0.17 0.04 0.09

Tabla No. 11. Resultados del estudio de precisión del Sistema para Tramadol

Concentración (μg/mL) Réplicas 9.2 11.5 13.8 1 37.4 46.5 59.1 2 36.8 46.1 59.0 3 37.2 46.0 59.0 4 37.2 46.0 58.8 5 36.6 45.8 59.0

4.1 4.0 4.3 4.0 4.0 4.3 4.0 4.0 4.3 4.0 4.0 4.3

FR




51

De igual manera se realizó el estudio de la precisión del método con la única diferencia que

a cada uno de los tres estándares inyectados se les agregó una cantidad igual de la muestra

previamente tratada. Los resultados obtenidos se pueden observar en las siguientes tablas.

Tabla No. 12. Resultados del estudio de precisión del Método para Acetaminofen

Concentración (μg/mL) Réplicas 80 100 120 1 1735.7 2155.5 2580.7 2 1736.2 2154.6 2581.9 3 1735.8 2155.7 2584.2 4 1737.5 2156.1 2587.1 5 1735.6 2156.5 2586.5

21.7 21.6 21.5 21.7 21.5 21.5 21.7 21.6 21.5 21.7 21.6 21.6

FR


Tabla No. 13. Resultados del estudio de precisión del Método para Tramadol

Concentración (μg/mL) Réplicas 9.2 11.5 13.8 1 39.1 51.8 64.4 2 39.1 51.6 64.6 3 39.2 51.9 64.6 4 39.3 51.5 64.8 5 39.2 51.6 64.7

4.3 4.5 4.7 4.3 4.5 4.7 4.3 4.5 4.7 4.3 4.5 4.7

FR


Como se puede observar se obtuvieron valores de %RSD menores al 1% lo cual indica una

excelente precisión. De acuerdo a los resultados obtenidos podemos afirmar que tanto el

Sistema como el Método tanto para acetaminofen como para tramadol presentan excelente

precisión.



52

VI.6. Exactitud del Método

Para llevar a cabo el estudio de la exactitud del método se realizaron lecturas de cinco

estándares (cinco niveles de concentración) de concentraciones perfectamente conocidas

tanto de acetaminofen como de tramadol, realizándose cinco réplicas para cada una de

ellas, posteriormente se determinó el porcentaje de recuperación para evaluar la exactitud

del método. Al mismo tiempo se realizó el test de COCHRAN para evaluar si las varianzas

del %R de los cinco niveles de concentración son homogéneas es decir para evaluar la

precisión del %R. A continuación se muestran los resultados obtenidos.

Tabla No. 14. Resultados de la exactitud del método para Acetaminofen

Concentración Teórica (μg/mL) 80 90 100 110 120

Réplicas Concentración Recuperada (μg/mL) 1 80.23 93.73 104.28 113.82 124.27 2 80.63 93.74 104.63 113.64 124.11 3 80.63 93.54 104.12 114.06 123.9 4 80.32 93.55 104.51 113.97 123.91 5 80.7 93.95 104.46 113.52 124.22

Promedio 80.50 93.70 104.40 113.80 124.08 Desv. Estd 0.21 0.17 0.20 0.22 0.17

%R 100.63 104.11 104.40 103.46 103.40 Desv Est %R 0.26 0.19 0.20 0.20 0.14

IC %R 100.63 ± 0.26 104.11 ± 0.19 104.40 ± 0.20 103.46 ± 0.20 103.40 ± 0.14 Varianza %R 0.070 0.035 0.040 0.042 0.020

Suma de Var %R 0.207 Var máxima 0.070

Gcal 0.34

Gtab (α = 0.05, K =5, n = 5) 0.68

Como Gcal < Gtab (α = 0.05, K =5, n =

5), entonces No hay diferencias significativas entre las varianzas

del %R de los 5 niveles de concentración

Como se puede observar los resultados de %R obtenidos en los cinco niveles de

concentración tienen igual precisión, entonces el valor de %R a reportar será el promedio, a

continuación se puede observar el %R total o promedio con su desviación estándar los

cuales son usados para encontrar el intervalo de confianza del %R ( SX ± ) y la precisión

como expresada como %RSD.



53

Tabla No. 15. Porcentaje de Recuperación (%R) con su intervalo de confianza y precisión

para Acetaminofen

%R total (promedio) Desviación estándar total IC del %Rtotal %RSD

103.20 1.50 103.20 ± 1.50 1.45

Como se puede observar el valor del %R se encuentra dentro del criterio de aceptación de

la USP el cual propone que éste debe estar dentro del rango de 90 a 110 %. Por lo tanto

podemos afirmar que el método presenta buena exactitud para la determinación de

acetaminofen.

Tabla No. 16. Resultados de la exactitud del método para Tramadol

Concentración Teórica (μg/mL) 9.2 10.3 11.5 12.6 13.8

Réplicas Concentración Recuperada (μg/mL) 1 9.31 10.86 12.09 13.53 14.72 2 9.47 10.89 12.21 12.46 14.70 3 9.47 10.84 12.03 13.55 14.69 4 9.33 10.88 12.17 13.53 14.65 5 9.34 10.94 12.18 13.49 14.69

Promedio 9.38 10.88 1214 13.51 14.69 Desv. Estd 0.08 0.04 0.07 0.04 0.03

%R 100.20 105.65 105.53 107.24 106.45 Desv Est %R 0.86 0.37 0.64 0.29 0.18

IC %R 100.20 ± 0.86 105.65 ± 0.37 105.53 ± 0.64 107.24 ± 0.29 106.45 ± 0.45 Varianza %R 0.742 0.134 0.414 0.083 0.034

Suma de Var %R 1.407 Var máxima 0.742

Gcal 0.53

Gtab (α = 0.05, K =5, n = 5) 0.68

Como Gcal < Gtab (α = 0.05, K =5, n =

5), entonces No hay diferencias significativas entre las varianzas

del %R de los 5 niveles de concentración

Como se puede observar los resultados de %R obtenidos en los cinco niveles de

concentración tienen igual precisión, entonces el valor de %R a reportar será el promedio, a

continuación se puede observar el %R total o promedio con su desviación estándar los

cuales son usados para encontrar el intervalo de confianza del %R ( SX ± ) y la precisión

como expresada como %RSD.



54

Exactitud del MétodoAcetaminofen

75,0085,0095,00

105,00115,00125,00135,00

75 85 95 105 115 125

µg/mL(Teórica)

µg/m

L(E

xper

imen

tal)

Tabla No. 17. Porcentaje de Recuperación (%R) con su intervalo de confianza y precisión

para Tramadol

%R total (promedio) Desviación estándar total IC del %Rtotal %RSD

105.37 2.01 105.37 ± 2.01 1.90

Como se puede observar el valor del %R se encuentra dentro del criterio de aceptación de

la USP el cual propone que éste debe estar dentro del rango de 90 a 110 %. Por lo tanto

podemos afirmar que el método presenta buena exactitud para la determinación de

tramadol.

A continuación se muestran los gráficos elaborados de concentraciones teóricas Vs

concentraciones experimentales tanto para acetaminofen como para tramadol.

Gráfico No. 7. Gráfico de valuación de la exactitud del Método para Acetaminofen



55

Exactitud del MétodoTramadol

8,00

10,00

12,00

14,00

8,5 9,5 10,5 11,5 12,5 13,5 14,5

µg/mL(Teórica)

µg/m

L(Ex

peri

men

tal)

Gráfico No. 8. Gráfico de valuación de la exactitud del Método para Tramadol

Como se puede observar en los gráficos No. 7 y No. 8, para acetaminofen y tramadol

representan una línea recta con coeficientes de determinación de 0.996 y 0.997

respectivamente, por lo que podemos afirmar que no existen diferencias significativas entre

los valores de concentración teóricos y experimentales es decir el método presenta una muy

buena exactitud tanto para la determinación de acetaminofen como de tramadol.



56

VI.7. Efecto de Matriz y Exactitud del Método

El efecto de matriz es uno de los principales problemas que se presenta a la hora de realizar

una medición analítica ya que los componentes que están presentes en la muestra podrían

aumentar o disminuir la señal analítica y obtener resultados erróneos de las lecturas. Para

evaluar el efecto de matriz en el resultado del análisis de acetaminofen y tramadol en las

muestras de tabletas de Ingeril Compuesto se elaboraron dos curvas, una de calibración

normal (Estándares puros) y otra de adición patrón, para observar dicho efecto se graficaron

ambas curvas en un mismo plano de coordenadas, a continuación se muestran los datos de

las curvas.

Tabla No. 18. Datos de las curvas de calibración normal para acetaminofen y tramadol


Concentración

μg/mL Área

Concentración

μg/mL Área

80 1486.92 9.2 37.04 90 1671.96 10.3 41.44 100 1874.26 11.5 46.08 110 2051.04 12.6 52.34 120 2248.08 13.8 57.24 b1 19.014 b1 4.459

Sb1 0.194 Sb1 0.169

Tabla No. 19. Datos de las curvas de adición patrón para acetaminofen y tramadol


Concentración

μg/mL Área

Concentración

μg/mL Área

80 1736.30 9.2 39.05 90 1933.10 10.3 46.28 100 2055.48 11.5 51.78 110 2375.25 12.6 57.58 120 2505.20 13.80 60.60 b1 19.799 b1 4.723

Sb1 1.615 Sb1 0.391



57

Acetaminofen

1000,00

1500,00

2000,00

2500,00

3000,00

70,00 90,00 110,00 130,00

µg/mL

Áre

as CAP

CCN

Tramadol

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00

35,00 45,00 55,00 65,00

µg/mL

Áre

as CAP

CCN

Con los datos mostrados en las tablas No. 18 y No. 19 se elaboraron los gráficos para la

evaluación del efecto de matriz, para ello se graficaron en un mismo plano tanto la curva de

calibración normal como la curva de adición patrón.

Gráfico No. 9. Gráfico de valuación del efecto de matriz para Acetaminofen

Gráfico No. 10. Gráfico de valuación del efecto de matriz para Tramadol

Como se puede observar en los gráficos de evaluación del efecto de matriz se obtuvieron

rectas paralelas entre si para acetaminofen y tramadol respectivamente (no se cruzan en

ningún punto) por lo que podemos afirmar que no existe efecto de matriz (ni depresor ni

intensificador de la señal) en la determinación de acetaminofen y tramadol en tabletas de

Ingeril Compuesto.



58

Con los datos que se muestran en las tablas No. 18 y No. 19, se calculó también en % de

Recuperación (%R) utilizando la siguiente ecuación:

100%)(1

)(1 xbb

RCCN

CAP=

Donde:

%R = es el porcentaje de recuperación

b1(CAP) = es la pendiente de la curva de adición patrón

b1(CCN) = es la pendiente de la curva de calibración normal

Sustituyendo los datos de las tablas 18 y 19 en la ecuación 1 se obtienen los siguientes

resultados:

Tabla No. 20. Resultados de %R calculado a partir de la curva de calibración normal y de

la curva de adición patrón para acetaminofen y tramadol

Acetaminofen Tramadol %R 104.13 105.91

Como se puede observar el valor del %R obtenido de esta forma coincide con los resultados

encontrados en el acápite VI.5 mostrados en las tablas No 15 y No 17, los cuales están

dentro de los límites de aceptación 90 a 110% por lo que de esta forma se confirma que el

método para determinar acetaminofen y tramadol en tabletas de Ingeril Compuesto presenta

muy buena exactitud.

Ec. (6)



59

VI.8. Límite de Detección y Límite de Cuantificación

Una de las ventajas de utilizar métodos instrumentales de análisis es que son capaces de

detectar y determinar cantidades de analito mucho más pequeñas que los métodos clásicos.

Uno de los principales problemas que se presentan cuando se trabaja a bajos niveles de

concentración se da a la hora de informar sobre la presencia o ausencia de un analito

determinado por esta razón es muy importante llevar a cabo la determinación tanto del

límite de detección como del límite de cuantificación, esto se realizó utilizando la

desviación estándar del intercepto y la pendiente de la curva de calibración normal

elaborada con estándares de acetaminofen y tramadol, las concentraciones utilizadas en la

curva de calibración normal se encuentra cercana a la señal del blanco. los datos se pueden

observar en la siguiente tabla.

Tabla No. 21. Datos de las curvas de calibración normal para acetaminofen y tramadol

utilizadas para calcular el LD y el LC


Concentración

μg/mL Área

Concentración

μg/mL Área

0.50 10.53 0.06 0.50 1.00 21.40 0.12 0.43 1.48 32.67 0.17 1.10 3.00 66.93 0.35 2.03 5.00 68.20 0.58 1.80 7.00 152.60 0.81 3.93 9.00 219.70 1.03 5.43 b1 22.97 b1 4.83 Sb0 12.57 Sb1 0.33



60

Para el cálculo del límite de detección y el límite de cuantificación se usaron las siguientes

ecuaciones:

Donde Sb0 es la Desviación estándar del intercepto de la curva de calibración normal y b1 es

la pendiente de la curva de calibración normal.

Los resultados obtenidos se muestran a continuación, como se puede observar los valores

encontrados son muy pequeños.

Tabla No. 22. Resultados del LD y LC para acetaminofen y tramadol


Límite de Detección (L.D.) 1.80 μg/mL 0.22 μg/mL

Límite de Cuantificación (L.C.) 4.47 μg/mL 0.68 μg/mL

1

029.3bxSbLD =

1

010bxSbLC =

Ec. (1)

Ec. (2)



61

1 2 3 4 580 1561,9 1560,4 1556,5 1566,8 1564,590 1701,2 1709,8 1702,6 1702,2 1704100 1899,8 1903,3 1899,6 1893 1898,3110 2069,7 2067,4 2078,5 2070,6 2080,2120 2276,3 2269,9 2269,2 2281,2 2272,8bo 104,48 125,56 99,98 105,56 111,16b1 17,973 17,766 18,013 17,972 17,928

Acetaminofén

μg/mLDías

1 2 3 4 59,2 41,8 41,8 42,1 42,3 42,510,3 46,9 47,3 47,3 47,1 47,311,5 52,5 52,5 52,3 51,7 52,212,6 57,2 57 56,9 57 57,113,8 63,3 62,7 63 63,4 62,4bo -0,8804052 0,85167826 1,00193529 0,28070759 2,78881161b1 4,6359238 4,47807681 4,4702147 4,53129725 4,31282129

μg/mLDías

Tramadol

VI.9. Repetibilidad de la curva de calibración normal Para observar la repetibilidad en las curvas de calibración normal se realizó un gráfico de

control donde se presentan los límites de tolerancia de los parámetros de regresión

(intercepto y pendiente) de dichas curvas las cuales se elaboraron por cinco días

consecutivos, construyendo los límites de control de la elipse con los parámetros de la

curva del primer día. Estos datos se muestran en las siguientes tablas.

Tabla No. 23. Parámetros de regresión de las curvas de calibración normal para

acetaminofén, realizadas por cinco días consecutivos. Tabla No. 24. Parámetros de regresión de las curvas de calibración normal para tramadol,

realizadas por cinco días consecutivos.



62

Si tomamos en cuenta que los parámetros b0 y b1 están correlacionados, el modelo de

correlación es una elipse. Los gráficos No. 11 y 12 se muestran las formas de los gráficos

de control. Los valores de b0 y b1 de las diferentes curvas de calibración deben caer dentro

de la elipse. Los valores experimentales (b0 y b1) obtenidos durante cinco días consecutivos

están dentro de la elipse, por lo que se puede afirmar que la linealidad es repetible o la

curva de calibración normal tiene una buena repetibilidad.

Gráfico No. 11. Gráfico de control de calidad de la curva de calibración normal de

Acetaminofén realizada durante 5 días consecutivos

Gráfico No. 12. Gráfico de control de calidad de la curva de calibración normal de

Tramadol realizada durante 5 días consecutivos

Gráfico b1 Vs b0(Acetaminofén)

-100-50

050

100150200250300

16 16,5 17 17,5 18 18,5 19 19,5 20

b1

b0

Gráfico b1 Vs b0(Tramadol)

-2

-1

0

1

2

3

4

4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,7

b1

b0



63

VI.10. Aplicación del método y estimación de la incertidumbre asociada a la cuantificación de acetaminofén y tramadol en tabletas de Ingeril Compuesto

VI.10.1. Modelo matemático

A continuación se muestra el modelo matemático empleado para la cuantificación de los

principios activos (acetaminofén y tramadol) en tabletas de Ingeril compuesto, el

flujograma del proceso de cuantificación puede ser observado en los anexos.

Donde: Ax: es el área del principio activo obtenida experimentalmente.

b0: es el intercepto de la curva de calibración normal (CCN).

b1: es la pendiente de la curva de calibración normal (CCN).

V2: es el volumen de la alícuota tomada (10 mL).

V3: es el volumen de dilución final (100 mL).

W0: es el peso de la muestra a ser analizada.

W1: es el peso promedio de las tabletas de Ingeril compuesto

VI.10.2. Identificación de las fuentes de incertidumbre

Figura No.7. Identificación de las fuentes de incertidumbres asociadas a la determinación de los principios activos en la muestra de ingeril compuesto

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ −=

1002

13

1

0

xxWVxWVx

bbAC x

x Ec. (7)



64

VI.10.3. Cuantificación de los componentes de incertidumbre.

Incertidumbre debida a la lectura del área de la muestra (acetaminofén)

Incertidumbre debida a la lectura del área de la muestra (tramadol)

Incertidumbre del intercepto de la curva de calibración normal para acetaminofén

Incertidumbre de la pendiente de la curva de calibración normal para acetaminofén

Incertidumbre del intercepto de la curva de calibración normal para tramadol

Incertidumbre de la pendiente de la curva de calibración normal para tramadol

06.0506.0

511.0

222)(

2)(

min=⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=

n

U

n

UU métodoPsistemaP

A ofénaceta

27.0525.0

554.0

22)(

2)( =⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=

n

U

n

UU métodoPsistemaP

Atramadol

75.8561.190

0===

nSbUb

09.0519.01

1===

nSbU b

59.0533.10

0===

nSb

U b

05.0511.01

1===

nSbU b

Ec. (9)

Ec. (8)

Ec. (11)

Ec. (10)

Ec. (12)

Ec. (13)



65

Incertidumbre debida a la alícuota de 10 mL

01.032

101.2*3*10302.0

32**

3

4222

2

2=⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛=⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛ Δ

+⎟⎠⎞

⎜⎝⎛=

−xtVUU TV

α

Incertidumbre debida a la dilución de 100 mL

05.032

101.2*3*100308.0

32**

3

4223

2

3=⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛=⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛ Δ

+⎟⎠⎞

⎜⎝⎛=

−xtVUU TV

α

Incertidumbre debida a la pesada de la muestra (200 mg)

001.032

0001.02001.0

322

2222

0=⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛+⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛=⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛+⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛=

UresUcalUW

Incertidumbre debida a la pesada de la tableta de Ingeril compuesto (650 mg)

001.032

0001.02001.0

322

2222

0=⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛=⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛=

UresUcalUW

VI.10.4. Cálculo de los coeficientes de sensibilidad (Generalizado para acetaminofén y tramadol)

Coeficiente de sensibilidad par el área

Coeficiente de sensibilidad par el intercepto de la curva de calibración normal

( )( )10**

*

021

13

WVbWV

AC

Cx

xAX

=⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

=

( )( )10**

*

021

13

00 WVb

WVbC

C xb −=⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

=

Ec. (14)

Ec. (15)

Ec. (16)

Ec. (17)

Ec. (18)

Ec. (19)



66

Coeficiente de sensibilidad par la pendiente de la curva de calibración normal

Coeficiente de sensibilidad par la alícuota de 10 mL

Coeficiente de sensibilidad par la dilución a 100 mL

Coeficiente de sensibilidad par el peso de la muestra (200 mg)

Coeficiente de sensibilidad para el peso promedio de las tabletas (650 mg)

( )( )( )10**

*

022

1

130

11 WVb

WVbAbCC xx

b−

−=⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

=

( )( )( )10** 021

10

33 WVb

WbAVCC xx

V−

=⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

=

( )( )( )10**

*

02

21

130

22 WVb

WVbAVC

C xxV

−−=⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

=

( )( )( )10** 021

30

11 WVb

VbAWC

C xxW

−=⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

=

( )( )( )10**

*2

021

130

00 WVb

WVbAWCC xx

W−

−=⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

=

Ec. (20)

Ec. (21)

Ec. (22)

Ec. (23)

Ec. (24)



67

Ec. (25)

Ec. (26)

VI.10.5. Estimación de la incertidumbre combinada asociada al proceso de determinación de acetaminofén en ingeril compuesto

Aplicando la ley de propagación de la incertidumbre al modelo matemático (Ec. 7) se

obtiene la siguiente expresión la cual se aplica para el cálculo de la incertidumbre

combinada (La deducción completa de esta ecuación puede ser observada en los anexos).

La contribución de cada fuente de incertidumbre se obtiene finalmente multiplicando la

incertidumbre estándar con su coeficiente se sensibilidad, la incertidumbre combinada es la

suma cuadrática de las contribuciones individuales.

Sustituyendo los valores de los coeficientes de sensibilidad y los valores de las

incertidumbres de cada uno de los parámetros que contribuyen con la incertidumbre en la

ecuación 25, se obtiene el siguiente resultado.

05.2)( =XCUc

VI.10.6. Estimación de la incertidumbre expandida asociada al proceso de determinación de acetaminofén en ingeril compuesto

Tomando un factor de cobertura de 2, para un nivel de confianza del 95.45 %. La

incertidumbre expandida asociada a la cuantificación de acetaminofén en tableta de ingeril

compuesto estará dada por:

11.42 )()( ==XX CC xUcUe

( )22222222

,22222222

)( 1100332210101011002 WWWWVVVVbbbbbbbbbbAAC UCUCUCUCrUUCCUCUCUCUc

XXX+++++++=



68

Tabla No. 25. Resultado obtenido para la cuantificación de acetaminofén en tabletas de Ingeril compuesto

Tipo de muestra Analito Concentración Incertidumbre K = 2

Unidades

Ingeril compuesto (tableta) Acetaminofén 316.36 4.11 mg acetaminofén /

650 mg tableta

VI.10.7. Cuantificación y estimación de la incertidumbre expandida asociada al proceso de determinación de tramadol en ingeril compuesto

De igual manera que para el caso de la acetaminofén se introducen los valores

correspondientes a las áreas obtenidas correspondientes a la muestra y los valores de

intercepto y pendientes de la curva de calibración normal en el modelo matemático en el

cual se toman en cuenta los efectos de dilución y la relación de tramadol por tableta, para

cuantificar los mg de tramadol contenidos por tableta.

Al mismo tiempo se estimó la incertidumbre asociada a la cuantificación realizando los

mismos pasos descritos para el caso de la acetaminofén.

Los resultados se describen a continuación:

Tabla No. 26. Resultado obtenido para la cuantificación de Tramadol en tabletas de Ingeril compuesto

Tipo de muestra Analito Concentración Incertidumbre

K = 2 Unidades

Ingeril compuesto (tableta) Tramadol 37.76 1.28 mg tramadol / 650

mg tableta A continuación se muestran los resultados de una serie de determinaciones de acetaminofén y tramadol en tabletas de ingeril compuesto.



69

1 316,4 ± 4,1 37,8 ± 1,32 317,7 ± 3,2 38,0 ± 1,23 318,0 ± 3,1 38,0 ± 1,44 317,6 ± 4,2 37,9 ± 1,55 315,6 ± 2,2 37,4 ± 1,16 319,1 ± 2,5 38,7 ± 1,67 319,0 ± 2,7 38,7 ± 1,28 321,5 ± 3,8 39,0 ± 1,69 318,9 ± 3,9 38,6 ± 1,910 320,9 ± 4,3 39,0 ± 1,511 317,5 ± 2,4 38,6 ± 1,812 317,1 ± 2,6 38,4 ± 1,113 316,5 ± 4,2 38,5 ± 1,414 317,0 ± 2,4 38,4 ± 1,215 316,8 ± 3,3 38,2 ± 1,016 323,9 ± 3,6 39,1 ± 1,317 323,9 ± 3,8 39,2 ± 1,518 324,2 ± 3,5 39,2 ± 1,819 324,0 ± 4,3 39,2 ± 1,420 324,5 ± 2,8 39,4 ± 1,221 318,8 ± 2,9 37,2 ± 1,722 316,4 ± 2,6 36,5 ± 1,123 316,8 ± 2,7 36,3 ± 1,624 317,0 ± 4,2 36,2 ± 1,225 317,1 ± 3,9 35,9 ± 1,026 315,4 ± 4,0 36,5 ± 1,527 316,1 ± 4,2 36,8 ± 1,3

mg Acetetaminofén / 650 mg Tableta

mg Tramadol / 650 mg Tableta

No. Muestras

Tabla No. 27. Resultado obtenido para la cuantificación de Acetaminofén y Tramadol en tabletas de Ingeril compuesto



70

VII. CONCLUSIONES

Se demostró que el método es selectivo para la determinación de acetaminofen y tramadol

en tabletas de ingeril compuesto, no se observó ninguna interferencia de ningún tipo.

Se comprobó que el placebo no ejerce ningún efecto en la curva de calibración normal por

lo que ésta podrá ser elaborada tomando en cuenta o no el placebo.

Se logró comprobar la idoneidad del sistema obteniéndose parámetros aceptables es decir

que cumplen con los criterios de aceptación establecidos en la USP

Existe buena linealidad en un buen rango de aplicación, desde 80 μg/mL a 120 μg/mL para

acetaminofen y de 9.2 μg/mL a 13.8 μg/mL para tramadol obteniéndose valores de r2 ≥

0.999, tanto para el sistema como para el método.

El sistema y el método presentaron muy buena precisión para la determinación de

acetaminofen y tramadol en tabletas de Ingeril Compuesto, obteniéndose valores de %RSD

menores del 1%.

El método analítico presentó muy buena exactitud, este se evaluó de dos maneras una

mediante inyecciones de cinco niveles de concentración perfectamente conocidas para

luego compararlas con las concentración obtenida experimentalmente para luego calcular el

% de Recuperación, obteniéndose valores de %R de 103.20 ± 1.50 y %R 105.37 ± 2.01

para acetaminofen y tramadol respectivamente, y la otra manera fue calculando el %R por

medio de las pendientes de las curvas de calibración normal y adición patrón, obteniéndose

valores de %R de 104.13 y 105.915 % para acetaminofen y tramadol respectivamente.

Se demostró que no existe efecto de matriz en la cuantificación de acetaminofen y tramadol

por HPLC en tabletas de Ingeril Compuesto.



71

Se lograron determinar el Límite de Detección obteniéndose valores de 1.80 μg/mL y 0.22

μg/mL para acetaminofen y tramadol respectivamente y el Límite de Cuantificación 4.47

μg/mL y 0.68 μg/mL para acetaminofen y tramadol respectivamente.

Las curvas de calibración normal presentaron una muy buena precisión, lo cual se demostró

a través de los gráficos de control para el intercepto y la pendiente, observándose que todos

los puntos están dentro de la zona de aceptación del gráfico (Elipse).

Se realizó la cuantificación de acetaminofén y tramadol, obteniéndose buenos resultados

tomando en cuenta que los pesos de las tabletas son muy variables (el peso debe estar entre

90 % – 110 %).

Se estimó la incertidumbre asociada a la cuantificación de acetaminofén y tramadol en

tabletas de ingeril compuesto, obteniéndose resultados aceptables para el % de error: 1 %

para acetaminofén y 3 % para tramadol.



72

VIII RECOMENDACIONES

• Evaluar la exactitud del método utilizando un material de referencia certificado.

• Realizar el estudio de robustez de este método.

• Realizar el estudio de posibles interferencias debidas a los productos de degradación

de la muestra y del placebo.

• Realizar el estudio de la estabilidad de la muestra

• Realizar análisis de un mayor número de muestras



73

IX BIBLIOGRAFÍA

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76

CONCENTRACION Acetaminofen

CONCENTRACION Tramadol Area/Acetaminofen Area/Tramadol

80 9,2 1483,3 32,780 9,2 1485,9 32,680 9,2 1486,8 32,380 9,2 1489,4 32,580 9,2 1489,2 32,490 10,3 1669,9 39,490 10,3 1669,7 39,490 10,3 1672,2 39,490 10,3 1674,1 39,490 10,3 1673,9 39,4100 11,5 1872,7 42,2100 11,5 1874,3 41,9100 11,5 1874,3 42,7100 11,5 1876,1 41,8100 11,5 1873,9 42,5110 12,6 2049,1 48,1110 12,6 2048,8 48110 12,6 2052 47,9110 12,6 2052,5 48110 12,6 2052,8 48120 13,8 2245,6 54,5120 13,8 2247,5 54,2120 13,8 2247,6 54,3120 13,8 2251,2 54,2120 13,8 2248,5 54,3

X. ANEXOS

X.1. Datos completes de la curva de calibración normal sin placebo



77

80 9,2 1490,6 37,480 9,2 1490,8 36,880 9,2 1496,7 37,280 9,2 1494,2 37,280 9,2 1491,6 36,690 10,3 1724,1 41,690 10,3 1727,2 41,690 10,3 1724 41,690 10,3 1725 41,290 10,3 1726,3 41,2100 11,5 1949,7 46,5100 11,5 1946,9 46,1100 11,5 1950,5 46100 11,5 1949,7 46100 11,5 1947,6 45,8110 12,6 2087,4 52,8110 12,6 2084,9 52,5110 12,6 2082,9 52,3110 12,6 2085 52,2110 12,6 2084,3 51,9120 13,8 2281 59,2120 13,8 2286 57,6120 13,8 2284,5 56,9120 13,8 2285,2 56,4120 13,8 2284,7 56,1

CONCENTRACION Acetaminofen

CONCENTRACION Tramadol Area/Acetaminofen Area/Tramadol

X.2. Datos de la curva de calibración normal cargada con placebo



78

X.2. Flujograma del procedimiento analítico



79

X.3. Deducción de la ecuación para estimar la incertidumbre asociada a la determinación de acetaminofén y tramadol en tabletas de ingeril compuesto.

Modelo Matemático:

Aplicación de la Ley de Propagación de la Incertidumbre al Modelo Matemático se obtiene:

11

00

33

22

11

00

dWWC

dWWC

dVVC

dVVC

dbbC

dbbC

dAAC

dC xxxxxxx

x

xx ⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

=

∑∑∑∑∑∑∑∑ ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

= 11

00

33

22

11

00

dWWC

dWWC

dVVC

dVVC

dbbC

dbbC

dAAC

dC xxxxxxx

x

xx

( )2

11

00

33

22

11

00

2⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

= ∑∑∑∑∑∑∑∑ dWWC

dWWC

dVVC

dVVC

dbbC

dbbC

dAAC

dC xxxxxxx

x

xx

( ) ( ) ( ) ( )

( ) ( )∑∑

∑∑∑∑∑∑

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

=

21

2

1

20

2

0

23

2

3

22

2

2

2

11

00

22

2

dWWC

dWWC

dVVC

dVVC

dbbC

dbbC

dAAC

dC

xx

xxxxx

x

xx

( ) ( ) ( ) ( ) ( )

( ) ( ) ( ) ( )∑∑∑∑

∑∑∑∑∑∑

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

=

21

2

1

20

2

0

23

2

3

22

2

2

101010

21

2

1

20

2

0

22

2 ,2

dWWC

dWWC

dVVC

dVVC

bbrdbdbbC

bC

dbbC

dbbC

dAAC

dC

xxxx

xxxxx

x

xx

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ −=

101

0

1

2

3

1

0

WW

VV

bbA

C xx



80

Correlación entre el intercepto y la pendiente.

Calculo de los coeficientes de Sensibilidad

Derivando parcialmente cada uno de los términos del modelo matemático se obtienen los coeficientes de sensibilidad, los cuales se muestran a continuación:

( )[ ] ( ) ( ) ( ) ( )

( ) ( ) ( ) ( )N

dWWC

dWWC

dVVC

dVVC

Nbbrdbdb

bC

bC

dbbC

dbbC

dAAC

dCN

xxxx

xxxxx

x

xx

1

1,21

21

2

1

20

2

0

23

2

3

22

2

2

101010

21

2

1

20

2

0

22

2

⎥⎥⎦

⎤

⎢⎢⎣

⎡⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+

⎥⎥⎦

⎤

⎢⎢⎣

⎡+⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

=

∑∑∑∑

∑∑∑∑∑∑

( ) ( )nXn

Xr

i

ibb ∑

∑−=2, 10

( )

22

1

22

0

22

3

22

2,

22

10

22

1

22

0

22

2

10

321010102

Wx

Wx

Vx

Vx

bbbbxx

bx

bx

Ax

xC

UWC

UWC

UVC

UVC

rUUbC

bC

UbC

UbC

UAC

UXX

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

=

( )( )10**

*

021

13

WVbWV

AC

Cx

xAX

=⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

=

( )( )10**

*

021

13

00 WVb

WVbC

C xb −=⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

=

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ −=

101

0

1

2

3

1

0

WW

VV

bbA

C xx



81

( )( )

0

*

1

130

=

−=

dbdU

WVbAU x ( )

( )10**

10**

021

021

WVdbdU

WVbU

=

=

( )( )( )10**

*

022

1

130

11 WVb

WVbAbCC xx

b−

−=⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

=

( )[ ] ( ) ( )( )[ ] ( )( )( )[ ]

( )( )[ ] ( )( )[ ]

( )( )[ ]( )10**

*10**

10****

10**10****0*10**

022

1302

021

02130

1

2021

02130021

1

1

1

1

WVbWVbA

WVbWVWVbA

bC

C

WVbWVWVbAWVb

bC

C

xxxb

xxb

−−=

−−=⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

=

−−=⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

=

( )[ ] ( )( )[ ] ( )( )[ ] ( )[ ]( )[ ]2021

021130130021

1 10**10******10**

1 WVbWVbdWVbAWVbAdWVb

bC

C xxxb

−−−=⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

=

( )( )( )10** 021

10

33 WVb

WbAVCC xx

V−

=⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

=

( )( )( )10**

*

02

21

130

22 WVb

WVbAVC

C xxV

−−=⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

=

( )( )( )10** 021

30

11 WVb

VbAWC

C xxW

−=⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

=

( )( )( )10**

*2

021

130

00 WVb

WVbAWCC xx

W−

−=⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

=

( )22222222

,222222222

1100332210101011002 WWWWVVVVbbbbbbbbbbAAC UCUCUCUCrUUCCUCUCUCU

XXX+++++++=

( )22222222

,22222222

1100332210101011002 WWWWVVVVbbbbbbbbbbAAC UCUCUCUCrUUCCUCUCUCU

XXX+++++++=

XX CC UUe 2= Incertidumbre expandida

Incertidumbre Combinada

universidad nacional autÓnoma de...

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