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Universidad Nacional
Autónoma de México
Curso Genética y Biología Molecular (1630)
Licenciatura
Químico Farmacéutico Biológico
Facultad de Química
Dra. Herminia Loza Tavera Profesora Titular de Carrera
Departamento de Bioquímica
Lab 105, Edif E
5622-5280
Objetivos del tema El alumno... Conoci-
miento
Compren-
sión
Aplica-
ción
IV. GENÉTICA
BACTERIANA
Comprenderá los mecanismos de la genética de virus,
bacterias y elementos genéticos móviles. Revisará los
mecanismos por los que se producen las mutaciones en las
bacterias y sus virus, conocerá su utilidad para el mapeo
génico en procariontes a partir de los mecanismos de
transferencia horizontal de material genético y comprenderá
la importancia de los elementos genéticos móviles en la
evolución de los genomas.
1. Tipos de
mutaciones en
bacterias
1.1. Conocerá la nomenclatura para referirse a los fenotipos y genotipos
de bacterias mutantes. X
1.2. Entenderá los métodos para la generación y selección de bacterias
mutantes. X
2. Bacteriófagos y
virus eucariontes
2.1. Describirá la composición química de los virus. X
2.2. Analizará los ciclos lítico y lisogénico de los bacteriófagos. X
2.3. Conocerá las características y ciclos de infección de algunos virus
de eucariontes mediante los ejemplos del virus VIH y el de influenza. X
3. Plásmidos 3.1. Definirá la estructura, propiedades y funciones del plásmido F
bacteriano. X
4. Mecanismos de
transferencia
horizontal del
material genético
4.1. Conocerá los procesos de transformación, transducción y
conjugación. X
4.2. Comparará los mecanismos de transferencia de información
genética en bacterias. X
4.3. Aplicará los procesos de transferencia horizontal de material
genético en la elaboración de mapas genéticos de virus y bacterias
basados en la recombinación sitio específico.
X
5. Elementos
genéticos móviles
5.1. Conocerá la estructura y función de las secuencias de inserción y
transposones.
X
5.2. Discutirá la función de los elementos genéticos móviles en la
producción de cambios en los genomas.
X
TERCER EXAMEN: Temas III y IV.
GENÉTICA BACTERIANA
¿Qué es un mutante?
Un organismo que desciende de un miembro normal
(silvestre) pero que es diferente
¿Qué es una mutación?
Un cambio heredable en la secuencia de nucleótidos
en el DNA
Una mutación no necesariamente es deletérea
En algunos casos puede ser ventajosa
En otros casos puede no producir ningún cambio observable
1. TIPOS DE MUTACIONES EN BACTERIAS
Un cambio que sea letal no puede ser
considerado una mutación pues ésta debe
ser heredable
Para la genética y la biología molecular, las mutantes
son útiles para estudiar cómo se regulan los genes, qué
codifican o cuál es la función de su producto génico.
Las mutaciones son preadaptativas, es
decir no se generan en respuesta a la
presencia del agente selectivo….
Lederberg y Lederberg, 1952
…se generan
espontáneamente y
el agente selectivo
solo las selecciona.
Tipos de mutaciones • Cambios en una sola base
– Transición: cambia pur x pur o pyr x pyr
– Transversión: cambia pur x pyr
• Frameshift mutations (cambia la fase de
lectura del mensaje)
– Deleción de una sola base
– Inserción de una sola base
• Una secuencia de pares de bases
– Deleción
– Inserción
• Una larga región de DNA
– Duplicación
– Inversión
Frameshift (cambio del marco de lectura)
Al insertarse
o perderse un
nucleótido
ocurre un
cambio en el
marco de
lectura del
mensaje
¿Cómo se genera una mutante?
De manera natural, por errores en la replicación Por exposición a agentes mutagénicos como:
•Agentes físicos: luz UV, rayos X, rayos gamma •Agentes químicos: anaranjado de acridina, otros...
¿Y en el lab....?
Existen métodos que permiten generar mutaciones que
luego se pueden mapear para saber cuál gen fue el que
se alteró. Uno de estos métodos es la mutagénesis por
transposición.
PROTOTROFÍA/AUXOTROFÍA
Las cepas silvestres son protótrofas (crecen en medio mínimo). Las cepas auxótrofas son mutantes incapaces de sintetizar algún metabolito esencial, por lo que éste debe ser añadido al medio (bio-, arg-, met-, ad-)
UTILIZACIÓN DE DIVERSAS FUENTES DE ENERGÍA
Capacidad de las bacterias para utilizar determinados sustratos como fuentes de energía, generalmente carbohidratos: galactosa (gal-/gal+); lactosa (lac-/lac+)
RESISTENCIA/SUSCEPTIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS
Capacidad de crecer en presencia de inhibidores, como antibióticos (estreptomicina, ampicilina, kanamicina, etc.
strR/strS; ampR/ampS
Otras características como morfología de las colonias y pruebas bioquímicas también se emplean.
Tipos de mutantes bacterianas
Medio mínimo: medio sintético básico para el crecimiento bacteriano sin nutrientes adicionales
Suspensión celular bacteriana
Suspensión plaqueada en caja con agar
Incubación 1 – 2 días
Caja Petri con agar
Células individuales invisibles a simple vista
Colonias visibles procedentes de una célula individual (mismo genotipo y fenotipo)
Cultivos de bacterias
Aislamiento de mutantes
a partir de colonias
individuales
¿Qué ventajas presenta para uso
de laboratorio?
Escherichia coli
Descubridor: Theodore Escherich
Una de las bacterias más estudiadas
2. BACTERIÓFAGOS Y
VIRUS EUCARIONTES
Generalidades de los virus
Virus de la influenza (200 nm)
• Tamaño 24 – 300 nm
• DNA o RNA, de cadena simple o doble
• Cubierta de proteínas con o sin lípidos
• Forma icosaédrica, de varilla, o cabeza y cola
Algunas estructuras de los bacteriófagos (fagos): virus bacterianos
Icosahédricos sin cola (X174) Icosahédricos con cola ()
Filamentosos (M13)
Están formados por un ácido nucleico (DNA/RNA) y una cápside de proteína
El genoma de los fagos RNA simple cadena (MS2, Qß) RNA doble cadena (phi 6) DNA simple cadena (phi X174, fd, M13) DNA doble cadena (T3, T7, lambda , T5, Mu, T2, T4) Estos ácidos nucleicos pueden contener bases inusuales que son sintetizadas por proteínas del fago. En los fagos T-pares, el genoma no contiene citosina sino 5'- hidroximetilcitosina, mientras que en otros tipos de fago algunas de las bases están parcialmente sustituidas.
Bacteriófago
Cabeza
Cuello y collar
Vaina
Centro
Placa Basal
Fibras
Fago libre
Fago infectando
Componentes del Fago
Ciclo lítico
1. Adsorción del fago a receptores en la superficie de la bacteria (proteínas transportadoras de maltosa o de Fe2+)
2. Inyección del material genético viral
3. Transcripción del DNA del bacteriófago y producción de proteínas virales
4. Replicación del material genético viral
5. Empaquetamiento del DNA dentro de la envoltura proteica y ensamblaje de la envoltura
6. Lisis y liberación de las partículas virales
Ciclo Lítico Ciclo de replicación del bacteriófago
Halos o placas de lisis de los fagos
Son generados sobre un manto de bacterias, área opaca en el gel
Además del
ciclo lítico el
fago puede
presentar un
ciclo
lisogénico
1. Una molécula de DNA del fago es inyectada a la bacteria.
2. Transcripción de genes necesarios para la integración.
3. El DNA del fago se inserta en el cromosoma bacteriano. (Integración)
4. La bacteria replica su DNA (y el del fago) y se divide normalmente.
5. El fago insertado se denomina profago y a la bacteria lisógeno.
6. La bacteria es ahora inmune a la infección de otros fagos.
Ciclo Lisogénico (Fagos temperados)
Características de los ciclos de vida del fago
Integración del DNA del
fago al cromosoma
bacteriano
El cromosoma del bacteriófago lambda () en estado libre es circular. El sitio de integración es una región del cromosoma que se alinea en un sitio del cromosoma bacteriano (entre los genes gal y bio). Sitios de attachment: attP en el fago y attB en la bacteria.
Ocurre un entrecruzamiento recíproco entre el fago circular y el cromosoma bacteriano resultando en la integración. Esta integración es mediada por los genes del bacteriófago y no por el sistema de recombinación de la bacteria.
Al DNA del fago integrado al cromosoma se le llama profago.
Una bacteria
lisogénica es la
que porta un
profago
(genoma del
fago integrado al
genoma de la
bacteria)
El DNA del
bacteriofago
es lineal con
extremos
cohesivos, lo
cual permite
que pueda
circularizarse
Integración
de al
cromosoma
bacteriano
Virus de la
influenza A
Virus de RNA
Los retrovirus se integran al DNA Esto es posible por la
actividad e una
transcriptasa reversa, la
cual sintetiza DNA a partir
de RNA
El genoma del
retrovirus es RNA y
dentro de la
cápside viene la
transcriptasa
reversa
HIV
Moléculas de DNA circulares extracromosomales que tienen su propio origen de replicación y se encuentran en la mayoría de las bacterias y en algunas células de eucariontes.
3. PLÁSMIDOS
Usan la misma maquinaria de replicación del DNA cromosomal y contienen un origen de replicación.
Se clasifican en:
• de bajo número de copias (1-10 copias por célula)
• de alto número de copias (10-100 copias por célula)
Los plásmidos autoregulan su número de copias a través de un represor (proteína o RNA) que impide que se repliquen muchas copias del plásmido.
Estos represores también pueden actuar sobre otros plásmidos relacionados, excluyéndolos así de la célula.
Características de los plásmidos
Los plásmidos codifican diversas funciones que le permiten, a la bacteria que los contiene, sobrevivir
en distintos habitats Funciones de resistencia
• Antibióticos (aminoglicósidos, cloramfenicol, -lactamas)
• Metales pesados (Hg, Ni, Co, Pb, Cd, Bi)
• Aniones tóxicos (arsenato, arsenito, boratos, cromatos)
Funciones metabólicas
• Producción de bacteriocinas
• Metabolismo de carbohidratos
• Metabolismo de compuestos carbonados
Factores que intervienen en la interacción con el hospedero
• Enterotoxina y hemolisinas (Escherichia coli)
• - endotoxina (Bacillus thuringiensis)
• Neurotoxina (Clostridium tetani)
• Infección y nodulación de leguminosas (Bradirhizobium sp.)
Transferencia
parcial del genoma
por consumo de
DNA
Transferencia parcial del
genoma durante la
conjugación
Transferencia de
plásmidos durante la
conjugación
Transferencia parcial como parte
del genoma viral
Transformación
Conjugación Conjugación
Transducción
Plásmidos
Genoma
4. MECANISMOS DE TRANSFERENCIA
HORIZONTAL DEL MATERIAL GENÉTICO EN
BACTERIAS
La transformación es la transferencia de genes resultante del consumo de DNA exógeno de un donador.
Si el DNA exógeno es un fragmento sin origen de replicación, debe ser incorporado al DNA cromosomal por recombinación para que se mantenga dentro de la bacteria.
Una de las dos cadenas es hidrolizada y el DNA de cadena sencilla que queda es protegido por proteínas de unión a DNA de cadena sencilla (SSBP) y está disponible para recombinarse con el DNA cromosomal.
Si el DNA exógeno contiene un origen de replicación, por ejemplo un plásmido, puede mantenerse independiente del genoma de la bacteria
TRANSFORMACIÓN
Tamaño y estado del DNA
• Sensible a nucleasas
Competencia de la célula receptora
(Bacillus, Haemophilus, Neisseria, Streptococcus)
• Factor de competencia
• Competencia inducida
Factores que afectan la transformación
No todas las bacterias se transforman de manera natural
Transformación de fragmentos de DNA que
deben integrarse al genoma de la bacteria
receptora para permanecer
En el laboratorio, se puede inducir que algunas
bacterias que no se transforman de manera natural
puedan ser competentes
Se emplean plásmidos como
vectores para introducir los genes
deseados. En este caso el DNA
introducido no requiere insertarse en
el genoma de la bacteria receptora
pues el plásmido contiene un origen
de replicación.
E. coli no se transforma de manera natural. En el
laboratorio debe hacerse “competente” para aceptar
material genético exógeno
Observación:
cuando dos
cultivos con
marcadores
auxotróficos
distintos (cepa
A y cepa B) se
mezclan pueden
surgir colonias
prototróficas
CONJUGACIÓN
Estudiada por Lederberg
y Tatum, 1947
Experimento de Lederberg y Tatum
Se requiere contacto físico entre las bacterias para que ocurra este intercambio
Medio mínimo
Conjugación en Escherichia coli
Pili
F+
F+ (Factor de fertilidad)
F -
Plásmido F
*Plásmido F codifica alrededor de 100 genes
William Hayes, 1953
Conjugación es el proceso de apareamiento de bacterias mediante el cual se transfiere información genética. Involucra el contacto físico entre bacterias (F+ y F-).
• La Conjugation es el análogo más cercano en bacterias al sexo en eucariontes.
• La habilidad para conjugar es conferida por el plásmido F. Las células bacterianas que contienen el plásmido F son llamadas “F+”. Las bacterias que no tienen el plásmido F son llamadas “F-”.
• Las células F+ tienen fibras especiales llamadas “pili sexuales”. Cuando células F+ encuentran a células F-, los pilli sexuales las acercan y una copia del plásmido F es transferida de F+ a F-. Ahora ambas células son F+.
• ¿Por qué no todas las células de E. coli son F+, ya que es posible que F se distribuya tan fácilmente? Porque el plásmido F puede ser espontáneamente perdido.
CONJUGACIÓN
Participan dos tipos de células:
• donadoras/machos que tienen el plásmido F (plásmido sexual/ factor de Fertilidad) (F+)
• receptoras/hembras que no lo tienen el plásmido F (F-)
Plásmido F
•contiene unos 100 genes
•algunos codifican proteínas involucradas en la replicación del DNA
•otros codifican proteínas tubulares que forman el pilus
CONJUGACIÓN
Mecanismo de conjugación
La célula F+ inicia la conjugación al sintetizar y extender el pilus que se adhiere a la superficie de la célula F-
El pilus se retrae y acerca a las dos células.
Una de las cadenas del DNA F es cortada por una endonucleasa y se separa de la otra cadena. Se transfiere esa cadena a la otra célula, a través del poro de conjugación, mientras que se comienza a replicar el DNA de la cadena que se quedó en la célula F+
La cadena de DNA recién transferida también se replica. Las dos células contienen un plásmido F íntegro, por lo que ambas son F+
La replicación del plásmido requiere de un “puente de cruzamiento”
entre la célula donadora y la célula receptora.
Antes de que el puente de cruzamiento pueda formarse se requiere
que:
• la célula donadora reconozca a la célula receptora
• la célula donadora tome contacto con la célula receptora
Las funciones conjugativas del plásmido F están especificadas por
un cluster de la menos 25 genes de transferencia (genes tra). Ellos
determinan:
• expresión del pili F
• síntesis y transferencia del DNA durante el cruzamiento
• determina la incapacidad de F+ de funcionar como célula
receptora.
Características del
mecanismo de conjugación
Si bien la conjugación explica el paso de material genético
de una bacteria donadora a otra receptora, no explica el
haber encontrado bacterias prototrófas en el experimento
de Lederberg y Tatum (1947).
El plásmido F es capaz de integrarse al cromosoma bacteriano.
La célula Hfr mantiene su
capacidad de conjugación,
por lo que se puede aparear
con una célula F-
Episoma. Fragmento de DNA que puede existir como plásmido y que se puede integrar al cromosoma.
Cuando el plásmido F se integra al cromosoma de la bacteria, la
célula ya no es F+ sino es Hfr (high frequency of recombination).
Bacterias con alta frecuencia de
recombinación (Hfr)
Al conjugarse una Hfr se lleva a cabo la transferencia de material genético, empezando por el DNA cromosomal. Generalemente, no se transfiere el cromosoma completo pues las células se separan, por lo que, la secuencia del plásmido F no se transfiere.
Como se transfirió un fragmento del DNA cromosomal, y si hay homología con el cromosoma de la célula receptora, ocurre recombinación con alta frecuencia (Hfr)
Una característica importante del apareamiento Hfr / F- es que la transferencia del cromosoma Hfr ocurre a una tasa constante a partir de un punto fijo determinado por el sitio donde está insertado el episoma F.
F integrado
Generación de una cepa Hfr
Integración del plásmido F al cromosoma
O
O
Tanto el cromosoma bacteriano como el episoma F son circulares
Regiones
homólogas
donde el
apareamiento
entre bases
puede ocurrir
Dirección de la
transferencia
Después de 2 h
algunos exconjugantes
se convierten en Hfr
F d c b a O
En la conjugación de Hfr se transfiere
parte del genoma de la bacteria
La bacteria donadora contribuye con una fracción de
material genético a la bacteria receptora
El fragmento de DNA donado es llamado exogenota y
el genoma receptor el endogenota
Una bacteria que contiene ambos DNAs, el
exogenota y el endogenota es un merocigoto
a+ b+
a b
Exogenota
Endogenota
Para que ocurra la integración estable del
exogenote debe haber un doble
entrecruzamiento con el endogenote
No viable
Recombinación
sencilla
a+
a–
a+
+
a– No viable
Viable
Merocigoto
Recombinantes
recíprocos
Recombinación doble
Corolario
1. El cromosoma de E. coli es circular.
2. El plásmido F es circular.
3. La orientación en la que se integra F al
cromosoma determina la dirección de la
transferencia.
4. Un extremo de F integrado es el Origen donde
comienza la transferencia y el otro extremo es el
término que generalmente NO se transfiere a
menos que antes se haya transferido TODO el
cromosoma Hfr.
Resumen de la conjugación bacteriana
Una característica importante del apareamiento Hfr / F- es que la transferencia del cromosoma Hfr ocurre a una tasa constante a partir de un punto fijo determinado por el sitio donde está insertado el episoma F.
Esta propiedad permite controlar la cantidad de información genética transferida y mapear la posición de los genes transferidos con respecto a la secuencia F de
acuerdo al tiempo de conjugación.
Mapeo de genes en E. coli por
conjugación
• El tiempo que se requiere para que los genes entren en la célula receptora está asociado con el ordenamiento en el cromosoma bacteriano.
• El cromosoma Hfr es transferido linealmente a la célula F - receptora.
• Si se interrumpe la conjugación a distintos tiempos ocurrirán transferencias parciales de los genes.
• El orden de los genes a lo largo del cromosoma se puede deducir al determinar los genes transferidos durante apareamientos cortos y comparados con apareamientos largos.
Cepa Donadora Hfr: thr+; leu+; azis; tons; lac+; gal+; strs
Cepa receptora (F-): thr-; leu-; azir; tonr; lac-; gal-; strr
1. Poner en contacto a las dos cepas.
2. Interrumpir la conjugación a distintos tiempos, por agitación fuerte.
3. Sembrar en medio con streptomicina (elimina a la cepa donadora).
4. Evaluar el fenotipo de las bacterias conjugantes sembrando en cajas con distintos medios.
Experimento de conjugación a tiempos controlados
Tiempo de conjugación
(min)
% de colonias que sobreviven con los genotipos indicados
thr+leu+ azis tons lac+ gal+
Resultados del experimento
Observando el orden en que los genes son
transferidos en una conjugación podemos
saber el orden que tienen en el cromosoma
Punto de inicio
Las unidades son minutos. Se refiere al tiempo que tardan los genes en entrar a una bacteria F- receptora durante el experimento de conjugación.
Mapa genético del cromosoma de Escherichia coli
realizado por conjugación
En células Hfr, ocurre con baja frecuencia que, F se escinde del cromosoma y forma un plásmido circular nuevamente. En algunos casos, F acarrea consigo genes adyacentes del cromosoma bacteriano que ahora se encuentran formando parte del plásmido F. Entonces, a éste se le llama plásmido F’.
CONJUGACIÓN F’
A los factores F que tienen genes
bacterianos se les llama episomas F’
Éstos se originan por una
excición errónea del
plásmido F.
Cuando un episoma F’ se
transfiere a una bacteria
receptora, ésta se convierte
en un diploide parcial
Con esta transferencia se pueden crear células diploides parciales
Los plásmidos F’ también pueden ser transferidos por conjugación
CONJUGACIÓN F’
TRANSDUCCIÓN Transferencia de material genético entre bacterias a través
de un bacteriófago
Transducción
Transferencia de material genético bacteriano por los virus de bacteria (fagos)
phe– trp– tyr– met– his–
WT
Requiere de contacto entre el fago y la bacteria para que el fago pueda
infectar
Inducción del ciclo lítico
La escición del DNA del fago acarrea DNA cromosomal
Replicación del fago
Lisis celular y
liberación del fago
El fago infecta a la
célula receptora Integración del DNA del fago al cromosoma
La célula receptora
adquiere nuevos
genes
Cromosoma bacteriano
Profago
Transducción
Transducción generalizada: es el mecanismo por el cual
potencialmente cualquier gene bacteriano de la donadora puede ser
transferido a la célula receptora.
Transducción especializada: La transducción especializada es la
transducción en la cual solo ciertos genes del donador pueden ser
transferidos al receptor.
Transducción generalizada
Fagos llevando
genes de la célula
donadora
Los fagos que median la transducción generalizada, normalmente cortan el DNA
de la célula huésped en pequeñas piezas y empacan ambos DNAs al interior de la
partícula fágica mediante un mecanismo llamado “head full” o llenado de las
cabezas del fago. Ocasionalmente una de las piezas del DNA de la bacteria
huésped resulta empacada al azar dentro de una cubierta de fago. Por lo tanto
cualquier gene de la bacteria donadora puede ser potencialmente transferido, pero
solamente se transferirá tanto DNA como pueda caber en una sola cápside. Cuando
la célula receptora se infecta con un fago que contiene DNA de una donadora, el
DNA de la donadora puede entrar a la receptora. Ya dentro de la célula receptora
puede ocurrir el evento de la recombinación generalizada, en el cual se substituye
el DNA de la célula donadora por el de la receptora.
Transducción especializada Diferentes fagos pueden transferir diferentes genes pero un fago individual
solamente puede transferir unos pocos genes. La transducción especializada está
mediada por fagos lisogénicos o fagos temperados y los genes que se llegan a
transferir dependerán del lugar donde el profago queda insertado en el
cromosoma.
Mapeo de genes empleando transducción
Células donadoras: arg+; met+, strs
Infección con el fago P1.
Ciclo lisogénico. Integración.
Ocasionalmente un fago
contendrá un segmento del
cromosoma bacteriano.
Mezclar los fagos con la
bacteria receptora: arg-; met-;
strr
Plaquear en medio mínimo
con arginina y estreptomicia
pero sin metionina
Estas colonias
deben ser met+
Para determinar si
también son arg+
estriar en placas sin
ambos aminoácidos
Transferencia horizontal de genes entre distintas
especies e incluso géneros de bacterias
Mecanismos de resistencia a antibióticos y su transmisión
1. Impermeabilidad y eflujo. Gram+ (peptidoglicano); Gram-
(capa de Lipopolisacáridos). Proteínas de eflujo. Los genes responsables pueden estar en plásmido o en cromosoma.
2. Modificación e inactivación del antibiótico. -lactamasa,
enzimas modificadoras de aminoglicósidos, cloramfenicol acetil transferasa.
3. Modificación del blanco. Dominios de transpeptidasa con
menor afinidad por las -lactamas.
4. Vías alternativas de síntesis. Síntesis de tetrahidrofolato
insensible a sulfonamidas.
La transferencia horizonzontal de material genético en bacterias ha dispersado los
distintos genes que confieren resisitencia a antibióticos, generando un grave problema de
multi-resistencia a antibióticos
1. Cuatro cepas Hfr de E. coli procedentes de la misma cepa F+ transfieren los siguientes marcadores en el orden: Cepa 1: M Z X W C Cepa 2: L A N C W Cepa 3: A L B R U Cepa 4: Z M U R B ¿Cuál es el orden de estos marcadores en la cepa F+ original?
5. ELEMENTOS GENÉTICOS MÓVILES (TRANSPOSONES)
• La transposición es otro tipo de recombinación de DNA en el cual un elemento transponible o transposón se mueve de una molécula de DNA a otra (recombinación ilegítima).
• Su existencia fue propuesta por Barbara Mc Clintock en maíz, sin embargo, no se demostró su existencia sino hasta mucho tiempo más tarde en bacterias.
• Su presencia se ha documentado también en otras especies, desde bacterias hasta humanos.
Descubrimiento de los transposones eucariontes
Barbara Mc Clintock, 1951
Elementos de control
Premio Nobel, 1983
Tipos de transposones Secuencia de Inserción o Elemento de
Inserción (IS): contiene una secuencia
central con el gen de la transposasa y en
los extremos una secuencia repetida en
orden inverso no nesariamente idéntica,
aunque muy parecida. Cuando un
transposón simple se integra en un
determinado punto del DNA aparece una
repetición directa de la secuencia diana (5-
12 pb).
Transposón Compuesto (Tn): contiene
un elemento de inserción (IS) en cada
extremo, en orden directo o inverso y
una región central que además suele
contener información de otro tipo. Por
ejemplo, los Factores de transferencia
de resistencia (RTF) poseen
información para resistencia a
antibióticos (cloranfenicol, kanamicina,
tetraciclina, etc.).
http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Mutacion/mutacion.htm
Elemento Longitud
Repetición
terminal
invertida
Repetición directa
de la diana Selección de la diana
IS1 786 pb 23 pb 9 pb Regional
IS2 1327 pb 41 pb 5 pb Zona caliente
IS4 1428 pb 18 pb 11-12 pb AAAX20 .........XTTT
IS5 1195 pb 16 pb 4 pb Zona caliente
Características de algunos elementos IS
Características de algunos Transposones compuestos (Tn)
Elemento Longitud Marcador genético
(resistencia)
MÓDULOS TERMINALES
IS Orientación Relación entre ambos
Tn 10 9300 pb Tetraciclina IS 10 Invertida Divergencia 2.5%
Tn 5 5700 pb Kanamicina IS 5 Invertida Difieren en 1 pb
Tn 903 3100 pb Kanamicina IS 903 Invertida Idénticos
Tn 9 2500 pb Cloranfenicol IS 9 Directa Idénticos (?)
http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Mutacion/mutacion.htm
Tanto los elementos IS como los transposones (Tn) tienen que estar
integrados en una molécula de DNA, que contenga un origen de
replicación, ya sea en el cromosoma principal bacteriano o en un
plásmido, nunca se encuentran libres.
Algunos elementos
pueden encontrarse
en varias copias
Cromosoma de
E. coli
http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Mutacion/mutacion.htm
Transposones en procariontes
Secuencias de inserción (IS)
Frecuencia global de transposición: 10-3 – 10-4
Frecuencia individual de transposición: 10-5 – 10-7
Reversión de la transposición: 10-6 – 10-10
Transposones El tamaño de los transposones varía entre 103 a 104 pb dependiendo del tipo de transposón.
La secuencia íntegra del transposón se puede insertar en un sitio particular del cromosoma.
La transposición involucra recombinación entre secuencias no relacionadas (recombinación ilegítima) que son los extremos flanqueantes del transposón y el sitio del cromosoma donde se insertó.
Formas de transposición
Replicativa
Conservativa
Transposasa. Enzima que corta al DNA blanco en sitios al azar y
une los extremos del transposón.
Secuencias repetidas invertidas. Funcionan como el sitio de reconocimiento de la transposasa. Como las secuencias son invertidas, son idénticas.
Marcador de selección. La inserción del transposón confiere una ventaja ecológica a la célula, que puede ser la resistencia a algún antibiótico. KanS KanR
Tn5: 5,800 pb y regiones flanqueantes de 1,530 pb. Genes de resistencia a Kan, Bleo, Strp.
Tn7: 14,000 pb y regiones flanqueantes (secuencias repetidas invertidas de 30 pb). Resistencia a Strp, Spec.
Tn10: 9,300 pb y regiones flanqueantes de 1,300 pb. Genes de resistencia a Tet.
Mecanismo de transposición
(recombinación ilegítima)
Repetidos directos (5-9 pb)
Transposición conservativa
Unión de la transposasa a la región flanqueante
Formación del asa (complejo sináptico). Los extremos del transposón se acercan.
Corte del DNA y escición del transposón
Unión del transposón al DNA blanco
La transposasa cataliza la inserción del transposón al DNA blanco.
Transposición replicativa Transposasa Resolvasa
Transposones de eucariontes
Retrotransposones Transposones de DNA
Los transposones pueden causar reordenamientos y cambios en los genomas
Transposones
Transferencia de DNA
Evolución de genomas
Virus
Duplicación de DNA
1. Para introducir inserciones de Tn5 al azar en el cromosoma de E. coli, se usa un vector de fago lambda: Pam int-::Tn5
2. Cuando este fago infecta células KanS, el DNA del fago no se puede replicar ni integrar, así que la única manera de que E. coli se vuelva KanR es que el transposón Tn5 se inserte en algún sitio del cromosoma. Esto va a ocurrir en aprox. 1 de cada 100,000 células infectadas.
3. Si se infectan 2 x 109 células, se obtendrán aprox. 2 x 104 colonias KanR. Cada una tendrá una inserción de Tn5 en un sitio distinto del cromosoma. Si en el genoma de E. coli hay unos 5,000 genes, es probable que se tenga una colección con inserción de Tn5 en casi todos los genes.
Uso de transposones para generar mutantes en bacterias
(mutagénesis por transposición)