universidad mayor de san andrÉs instituto de...

UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS

MAESTRíA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS Y BIOMÉDICAS

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQuíMICAS

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES FÁRMACO BIOQuíMICAS

EVALUACiÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMALÁRICA DE DERIVADOS

SINTÉTICOS Y NATURALES.

Estandarización de modelos in vitro sobre cultivos de Plasmodium

falciparum

TESIS PARA OPTAR Al TíTULO DE MAGíSTER SCIENTARUM EN CIENCIAS BIOLÓGICAS Y

BIOMÉDICAS

MENCiÓN PARASITOLOGíA

POSTULANTE:

ASESORES:

Doynel David Gutiérrez Yapu

Alberto Giménez Ph.D.

Eric Deharo Ph.D.

2005

David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IlFB - UMSA

DEDICATORIA

Dedicado a la memoria de la familia que nos dejo, pero que

siempre estará con nosotros, a mi hermano José Luis,

a mi prima Lourdes y a mi tía Maruja (Q.E.P.D.)

"Querida Familia, alqún día Dios hará caso a nuestras

plegarias y todos estaremos juntos como

antes, con la familia reunida"

DAVID

David Gutiérrez Yapu ÁIea de Quimioterapia Experimental - IIF8 - UMSA

AGRADECIMIENTOS

Al proyecto CYTED, programa X y Proyecto Antiparasitario X.S por la capacitación

del personal deII.I.F.B. y contactos iberoaméricanos.

Al proyecto Flora Regional O.E.A., por el apoyo financiero que brindó para la

adquisición de equipos y reactivos.

Al 1. R. D. (lnstitut de Recherche pour le Développement), por el apoyo brindado en

cuanto a la formación, que se me otorgó en este nivel.

Al Instituto de Investigaciones Científicas Avanzadas y Servicios de Alta Tecnología

(/ND/CASAT) dependiente de la Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e

Innovación (SENACYT), en la República de Panamá, por la capacitación que se

proporcionó en esa.

A la fundación "Alexander Von Hurnboldt-Shtiffun" , por la donación de equipos.

Al Doctor Eduardo Ortega, por toda la colaboración brindada en dependencias de

INDICASAT-SENACYT, República de Panamá.

AL Lic. José María Gonzáles, por todo el apoyo y colaboración desinteresada que se

me brindó en la capacitación llevada a cabo en la Repúblíca de Panamá

Al Dr. Alberto Giménez, por perrnitirme ser parte del 1.1. F.B. Y guiarme en el trabajo

desarrollado.

Al Dr. Eric Deharo, por la colaboración y guía en el trabajo desarrollado.

David Gutiérrez Yapu !vea de Quimioterapia Experimental - "FB - UM~~

A Patricia Oporto, que fue la persona que inculcó en mi, el interés por esta área y me

guío en los primeros pasos que di en esta rama de la Parasitología.

Al personal perteneciente al Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas (lIFB),

de forma especial a Grace Ruiz, Fernando Vargas, Lucia Acebey, Crispin Paredes,

Magali Paz, que siempre me brindaron su desinteresada colaboración.

A mis compañeros de Tesis, Marco Antonio Paco y Efrain Salamanca, que además

de ser compañeros de trabajo son grandes amigos y sin los cuales no hubiera podido

concluir el presente.

A Isabel, Andrés, Dina, Ruth, Evelyn, Lidia, David, Rubén, Bertha y toda mi demás

familia, por haber aguantado este tiempo más de estudio.

A todos los amigos y compañeros de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y

Bioquímicas, por la colaboración y apoyo que me brindaron de una u otra forma.

Fecha:

MAESTRíA EN L7ENCIAS BIOLÓGICAS y BIOMÉDICASMención: Parasitología

La Paz, 23 de Septiembredel 2004

Inltitución: Realizó la Tésis en el Institutode Investigaciones Fármaco Bioquímicas- JIFB

Tít~lo del tema: EVALUACION DE LA ACTIVIDADANTIMALÁRICA DE DERIVADOSSINTÉTICOS y NATURALES· Estandarización de modelos in vitro sobre

cultivos de Plasmodsumfalciparum.

Postulante: Doynel David Gutiérrez Yapu

Tutor: Dr. Alberto Giménez, Ph.O.

Dr. Eric Deharo, Ph, O.

Revisor: Dra. Luz 1. Romero. MD.Institución: Coordinadora Técnica-Centro de Estudios Biomédicos -Instituto de Investiga

ciones Científicas Avanzadas y Servicios de Al!.1 Tecnologia (lNDICASAT)

Calificaciónsobre el 100% en base a: Porcentaje Calificación

l. Presentaciónde resultados y proyección de1trabajo 30% 25'~/()

2. Revisión Bibliográfica 25% 22%

3. Protocolo de investigación 2{)~ó 20%

4. Claridad del documento presentado 15% 15%

5. Cumplimiento de Hipótesis y/o Objeti..'os 10% 9%

91%Nota: Lacalificación mínima de aprobación es 61%,

Firma Revisor

Fecha: 13 de mayo de 2005

A,·, Saavedra N"2224.30 piso • Tel. Fu'C (591-2) 2240347- casilla de correo 3239

La Paz-Bolivia

MAESTRlA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS Y BIOMÉDICASMención: Parasitología

..

Fecha: La Paz, 23 de Septiembre del 2004

Institución: Realizó la Tésis en el Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas - lIFB

Título e1el tema: EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIMALÁRICA DE DERJVADOSSINTÉTICOS y NATURALES - Estandarización de modelos in vitro sobrecultivos de Plasmodium falciparum.

Postulante: Doynel David Gutiérrez Yapu

Tutor: Dr. Alberto Giménez, Ph.D.Dr. Eric Deharo, Ph.D.

Rcvísor:: Dr. Roberto Pinzón, Ph.D.Institución: Facultad de Ciencias, Dpto. de Farmacia Universidad Nacional de Colombia.

Fecha:

.~ ..~ - ..

;J' r= ..Calificación sobre el 100% en base a: Porcentaje Calificación

.... . .~. ..

l. Presentaciónde resultados y proyección del trabajo 30% 3D2. Revisión Bibliográfica 25%

2S"3. Protocolo de investigación 20%

2-D-

4. Claridad del documento presentado 15%.Á,f

y.Cumplimiento de Hipótesis y/o Objetivos 10%

/4:P;. '. (

Nora: Lacalificación mínima de aprobación es 61%. ¡/PAVFirma Revisor

. '.. '

~.. ":~ :....,;. ~: oo.

Av, Sanvcdra N" 2224 - JO piso - Tel. Fnx (591-2) 2221)021 cnsüln de correo J2JI)

LIII'IIJ.·llnllvln

.'L~:':.:~.I.':J..J ENCTENCIAS BIOr..ÓG/t',.,,,, y Bl0MÉDrC4SMenci6n: ParBSitología

Institución; R.etli~'" Tésis en el fnstihM de invcstigacioT1t:i Farmaco Bioquunic~ - IlFB

Tlhll" d~1 r.mn: i'''", .:'.".CIOX DE L\ ftLílVIDAP ANTIMAf..\RIC.\ DE DERIV.'I.DOS SrN~·TleOS y NATU~¡\l.ES - E:sw.ndat'znctor. de nocicl,," itl vi/ro ~obre culti\n:l d;Flas.""-odiWM !óicipan./tt

P01tnhntt: Doyne! Devid Guti~rret Y<1p1.l

·r.tor:Co-Tutor:

Dr. AIIk"o UimC0c2 Ph.D.

Dr. Erk D~aro I'h.D.

lbvi.1lOr: Miche! Sauvsfn ?b.D. -lROl.!ltlrudón. Investigador AStVillr\o - lJnivcr~ite Paul Sabntier - Toulousc, Francia.

C¡Jifi",ción 30blC al ! :10":'. ~n )a~e a. -~orcentn.Jc Calificación

-l. Prestn.lllCior, de resUltAdo5 y proveccion del trabajo 30% ..., .,e t'

2. Rev\~i,," Bibllognttlca ~:S% ¡ .'¡-

3. Proiocoto de investigación --::0% ,(7

~/ <--4. Caridad de documento I're'S~ntado !5% )f

r' '

5. Curnplirmcntc de Hipóre~is '1.'0 Objetivos 10°/" ---(

/ ')}ÚIL./:

t\v~iill <;ll~.eC~J ,,- ::1 4 ;01-1 '-" /5,'1 .2',l2W.147 ':AP!l1\ d~ correo 3D'!

l... T'n·llollV1~

David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA

El presente trabajo se realizó en el Área de Quimioterapia Experimental

del Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas,

perteneciente a la Facultad de Ciencias

Farmacéuticas y Bioquímicas

Universidad Mayor de San Andrés

La Paz - Bolivia

David Gutiénez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA

íNDICE GENERAL

índice General. .

índice de Figuras................... iv

índice de Cuadros........................................................................................................ v

índice de Tablas............................................. . v

índice de Anexos.............................. vi

RESUMEN 1

SUMMARY 2

1. INTRODUCCiÓN 3

2. ANTECEDENTES 6

2.1 CONCEPTO E HISTORIA............................................................................ 7

2.2 SITUACiÓN MUNDIAL DE LA MALARIA................................................... 8

2.3 SITUACiÓN DE LA MALARIA EN BOLIVIA................................................ 10

2.4 LOS PARÁSITOS CAUSANTES DE LA MALARIA.................................... 17

2.5 CLASIFICACiÓN TAXONÓMiCA................................................................. 18

2.6 CICLO BIOLÓGICO DE Plasmodium............................... 19

2.6.1 VECTOR, Anopheles........................................................ 19

2.6.2 CICLO VITAL DEL Plasmodium................................................... 21

2.6.3 DESARROLLO DEL PARÁSITO EN EL VECTOR..................... 22

2.6.4 DESARROLLO DEL PARÁSITO EN EL HOMBRE.................... 23

2.6.5 CARACTERíSTICAS DE Plasmodium falciparum...................... 25

2.7 PATOGENIA Y FISIOPATOLOGíA.............................................................. 26

2.8 DROGAS ANTIMALÁRICAS........................... 28

2.9 ENSAYOS BIOLÓGICOS in vitro DE ACTIVIDAD ANTIPALÚDICA......... 31

2.9.1 ENSAYO SOBRE PARÁSITO ENTERO...................................... 31

2.9.2 MÉTODOS EMPLEADOS PARA DETERMINAR LA

INHIBICIÓN DE LA MADURACiÓN DE ESQUIZONTES........... 32

2.9.2.1 MICROMÉTODO ViSUAL.............................................. 32

2.9.2.2 MICROMÉTODO RADIOISOTÓPICO............................ 34

2.9.2.3 MÉTODO BIOQuíMICO (Prueba in vitro de la Lactato

Oeshidrogenasa parasitaria)........................................... 34

2.9.2.4 MÉTODO FLUOROMÉTRICO........................................ 36

David Gutiérrez Yapu

3. JUSTIFiCACiÓN................. 38

4. OBJETIVOS............. 42

4.1 OBJETIVO GENERAL........................ 43

4.2 OBJETIVOS ESPECíFiCOS........................................................................ 43

5. MATERIAL Y MÉTODOS.................................................................. 44

5.1 DISEÑO METODOLÓGiCO........................................................................ 45

5.2 CULTIVO DE ESTADíos INTRAERITROCITARIOS DE P. tetciperum.. 46

5.2.1 OBTENCiÓN DE GLÓBULOS ROJOS....................................... 46

5.2.2 OBTENCIÓN DE SUERO O PLASMA...................... 46

5.2.3 PREPARACIÓN DEL MEDIO RPMI-1640 SiGMA.................... 47

5.2.4 DESCONGELACiÓN DE LOS AISLADOS DE P. tetciperum.c. 47

5.2.5 CONGELACiÓN DE LAS CEPAS DE P. falcipaf1.lm................... 48

5.2.6 ADAPTACiÓN A CULTIVO in vitro............................................... 48

5.2.7 DETERMINACiÓN DE LA PARASITEMIA.................................. 51

5.3 SINCRONIZACiÓN DE CULTIVOS in vitro de P. falcipaf1.lm..................... 51

5.4 EVALUACiÓN DE LA SENSIBILIDAD in vitro DE P. tetciperum A LAS

DROGAS: MICROMÉTODO ViSUAL...................................... 51

5.4.1 PREPARACiÓN DE LA DROGA DE REFERENCIA Y

EXTRACTOS.................................................................................. 51

5.4.2 PREPARACiÓN DE LA PLACA................................................... 52

5.4.3 MÉTODO ViSUAL............ 53

5.4.3.1 PREPARACiÓN DE REACTIVOS QUíMiCOS............. 53

5.4.3.2 MÉTODO......................................................................... 53

5.4.3.3 INTERPRETACiÓN......................................................... 54

5.4.4 EVALUACiÓN DE LA SENSIBILIDAD in vitro DE P. tetciperum

A LAS DROGAS: MÉTODO BIOQuíMICO (PRUEBA in vitro DE

LA LACTATO DESHIDROGENASA PARASiTARIA).................... 55

5.4.4.1 PREPARACiÓN DE LOS REACTiVOS.......................... 55

5.4.4.2 MÉTODO 55

5.4.5 EVALUACiÓN DE LA SENSIBILIDAD in vitro DE P. tetciperum

A LAS DROGAS: MÉTODO FLUOROMÉTRICO.......................... 57

5.4.5.1 PREPARACiÓN DE LA DROGA DE REFERENCIA Y

EXTRACTOS 57

5.4.5.2 PREPARACiÓN DE LA PLACA..................................... 57

11

David Gutiérrez Yapu Ares de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA

5.4.5.3 PREPARACiÓN DE REACTIVOS QUíMiCOS.............. 57

5.4.5.4 MÉTODO 57

6. RESULTADOS Y DISCUSiONES 59

6.1 EVALUACiÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMALÁRICA DE PRODUCTOS

SINTÉTICOS Y NATURALES POR EL MÉTODO VISUAL......................... 60

6.1.1 SALAMANCA - PRODUCTOS SINTÉTiCOS........... 60

6.1.2 CHILE - PRODUCTOS NATURALES............................... 62

6.1.3 GUATEMALA - PRODUCTOS NATURALES 63

6.1.4 COLOMBIA - PRODUCTOS NATURALES..................... 64

6.1.5 ARGENTINA - PRODUCTOS NATURALES................................. 65

6.1.6 MÉXICO - PRODUCTOS NATURALES 66

6.1.7 PERÚ - PRODUCTOS NATURALES............................................ 66

6.1.8 BOLIVIA - PRODUCTOS NATURALES 67

6.2 EVALUACiÓN DE LA SENSIBILIDAD in vitro DE P. falciparum A LAS

DROGAS: ESTANDARIZACiÓN DE PARÁMETROS DEL MÉTODO

BIOQuíMICO (PRUEBA in vitro DE LA LACTATO DESHIDROGENASA

PARASiTARIA) 69

6.3 EVALUACiÓN DE LA SENSIBILIDAD IN VITRO DE P. falciparum A

LAS DROGAS: ESTANDARIZACIÓN DE LOS PARÁMETROS DEL

MÉTODO FLUOROMÉTRICO...................................................................... 72

7. CONCLUSiONES 75

8. RECOMENDACiONES 80

9. BIBLIOGRAFíA 82

1O.ANEXOS 95

111

David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental - IIF8 - UMSA

íNDICE DE FIGURAS

Figura 1. La Malaria a nivel Mundial, 2003.......................... 10

Figura 2. La Malaria en Bolivia, 2000........................................... 12

Figura 3. índice Parasitario Anual de Malaria en Bolivia............................................. 13

Figura 4. Ciclo evolutivo del mosquito Anopheles........................................................ 19

Figura 5. Mosquito Anopheles (Hembra)...................................................................... 20

Figura 6. Esquema del ciclo biológico de Plasmodium......................................... ...... 22

Figura 7. Evolución del Plasmodium falciparum dentro del eritrocito........................ 25

Figura 8. Reloj biológico de Plasmodium falciparum........ 26

Figura 9. Estructura de la Quinina........... 29

Figura 10. Estructura del Qinghaosu 29

Figura 11. Estructura de la Cloroquina... 30

Figura 12. Esquema de la transformación de lactato en piruvato........ 35

Figura 13. Estructura Molecular del NBT (Nitro Blue Tetrazolium).............................. 35

Figura 14. Estructura Molecular del HOECHST 33258................................................ 37

Figura 15. Cultivo de cepas de P. falciparum in vitro............................... 49

Figura 16. Cambio de Medio de Cultivo........................................................................ 50

Figura 17. Disposición y distribución de los productos evaluados, el control y la

droga de referencia................... 52

Figura 18. Proceso de tinción (Giemsa)............ 54

Figura 19. Proceso de lectura de absorbancias en el lector ELlSA............................. 56

Figura 20. Estructuras de Productos activos procedentes de Chile............................. 63

IV


íNDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Incidencia Parasitaria Anual de Malaria en Bolivia, (1990-2000)............... 13

Cuadro 2. Evolución de la Malaria en Bolivia (1990-2000)................................ 14

Cuadro 3. Distribución de la Población. Área Malárica, Bolivia - 2001........... 16

íNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Notificación de la Malaria por especie parasitaria e indicadores. Sedes y

Distritos, Bolívia-2001.................................. 15

Tabla 2. Enfermedades ocasionadas por especies diferentes de Plasmodium.......... 18

Tabla 3. Clasificación Taxonómica del Plasmodium...................................................... 18

Tabla 4. Evaluación de la actividad in vitro de Derivados Sintéticos realizados en la

Universidad de Salamanca, sobre cepas de P/asmodium falciparum F32... 61

Tabla 5. Evaluación de la actividad in vitro de Diterpenoides aislados de especies

de Azorella compacta, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32............ 62

Tabla 6. Evaluación de la actividad in viiro de extractos de plantas procedentes de

Guatemala, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32 ., 63

Tabla 7. Evaluación de la actividad in vitro de extractos de plantas procedentes de

Colombia, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32................................. 64


México, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32.... 66


Perú, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32......................................... 67

Tabla 10.Evaluaci6n de la actividad in vitro de extractos de plantas procedentes de

Bolivia, sobre cepas de Plasmodium tetciperum F32...................................... 68

Tabla t t.Valores de ICso presentados por los productos en estudio por fos métodos

Visual y Bioquímico 71

Tabla 12.Valores de ICso presentados por los productos en estudio por los métodos

Visual, Bioquímico y Fluorométrico 74

v

David Gutiérrez Vapu

íNDICE DE ANEXOS

ANEXO 1: GRÁFiCOS 96

Gráfico 1: Ultraestructura del Merozoito.... 96

Gráfico 2: Ultraestructura del estadio anillo........................ 96

Gráfico 3: Ultraestructura del Trofozoito............................. 97

Gráfico 4: Ultraestructura de! Esquizonte......................... 97

Gráfico 5: Gráfico del Plasmodium falciparum, estadio de esquizonte....... 98

Gráfico 6: Gráfico del Plasmodium falciparum, estadio de anillo...... 98

ANEXO 2: MATERIAL Y REACTiVOS.................................................................... 99

A) MATERIAL REQUERIDO PARA CULTIVO DE ESTADIOS

INTRAERITROCITARIOS DE P. falciparum................................................ 99

B) MATERIAL REQUERIDO PARA LA SINCRONIZACJÓN DE CULTIVOS

in vitro DE P. falcíparum..................................................... ........ 101

C) MATERIAL REQUERIDO PARA LA EVALUACiÓN DE LA SENSIBILIDAD

in vitro DE P. falciparum A LAS DROGAS: MICROMÉTODO VISUAL........ 101

D) MATERIAL REQUERIDO PARA LA EVALUACiÓN DE LA SENSIBILIDAD

in vitro DE P. falciparum A LAS DROGAS: MÉTODO BIOQUíMICO

(PRUEBA in vitro DE LA LACTATO DESHIDROGENASA PARASITARIA).. 102

E) MATERIAL REQUERIDO PARA LA EVALUACIÓN DE LA SENSIBILIDAD

in vitro DE P. falciparum A LAS DROGAS: MÉTODO FLUOROMÉTRICO.. 102

ANEXO 3: DESCRIPCiÓN DE LOS PRODUCTOS EVALUADOS 104

Cuadro 1: Derivados sintéticos correspondientes al Departamento de Química

Farmacéutica, Facultad de Farmacia de la Universidad de

Salamanca, Salamanca - España 104

Cuadro 2: Productos correspondientes al Laboratorio de Productos Naturales.

Universidad de Antofagasta, Antofagasta - Chile.................... 106

Cuadro 3: Productos naturales procedentes de Guatemala............ 108

Cuadro 4: Productos naturales procedentes de Colombia.................. 109

Cuadro 5: Productos naturales procedentes de Argentina........................ 111

Cuadro 6: Productos naturales procedentes de México...................... 112

Cuadro 7: Productos naturales procedentes de Perú............ ... ...... 113

VI

David Gutiérrez Yapu /vea de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA

Cuadro 8: Fracciones purificadas de Solanum argentinum procedentes de

Bolivia oo oo. oo oo oo oo ., oo oo " .. 115

ANEXO 4: RESULTADOS TOTALES DE LOS PRODUCTOS EVALUADOS

SOBRE CEPAS DE Plasmodium falciparum F32.................................... 116

Cuadro 9: Evaluación de la actividad in vitro de Derivados Sintéticos

realizados en la Universidad de Salamanca, sobre cepas de

Plasmodium falciparum F32oo oo oo 116

Cuadro 1O:Evaluación de la actividad in vitro de Diterpenoides aislados de

especies de Azorelfa compacta, sobre cepas de Plasmodium

falciparum F32 oo oo' oo " oo oo. 118

Cuadro 11:Evaluación de la actividad in vitro de plantas procedentes de

Guatemala, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32... ......... 119


Colombia, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32 .. o...... ..... 120


Argentina, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32oo. o., ........ 123


México, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32 oo... 124


Perú, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32 ,. 126

Cuadro 16:Evaluación de la actividad in vitro de fracciones de Solanum

argentinum procedentes de Bolivia, sobre cepas de Plasmodium

falciparum F32 oo. oo oo oo oo oo oo oo.. 128

Cuadro 17:Comparación de los Porcentajes de Inhibición de la maduración

de esquizontes, obtenidos por los métodos visual y bioquímico.... 130

Cuadro 18:Comparación de los Porcentajes de Inhibición de la maduración

de esquizontes, obtenidos por los métodos visual, bioquímico y

f1uorométrico oo.oo oo oo .. oooo .. oooo.oo oo 131

VIl

David GutiérrezYapu

RESUMEN

Area de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA

El presente trabajo forma parte del Proyecto "Flora Regional - OEA, Proyecto X.5 - CYTED,

Búsqueda, Obtención y Evaluación de Nuevos Agentes Antiparasitarios", teniendo dos metas

fundamentales, la evaluación de la actividad antimalárica de productos sintéticos y naturales,

y la estandarización de dos métodos alternativos mediante los cuales se llega a medir esta

actividad.

Se llegaron a evaluar 50 productos sintéticos y 276 productos naturales, con lo que se

alcanzó un total de 326 productos, provenientes del estudio de plantas, así como de

modificaciones químicas realizadas a estructuras conocidas.

De todas estas evaluaciones se pudo obtener 56 productos activos, de los cuales 20 son

sintéticos y 36 naturales, además de 270 productos inactivos, 40 sintéticos y 240 naturales,

mediante el método óptico.

Con el fin de contar con métodos alternativos más rápidos y menos tediosos que el óptico, se

trabajó en la estandarización de dos métodos alternativos que involucran el cultivo de cepas

de Plasmodium falciparum. Estos métodos son: el Bioquímico que se basa en la reacción de

la Lactato deshidrogenasa parasitaria (pLDH) y el método Fluorométrico que se basa en la

incorporación del colorante en el DNA parasitario para su posterior cuantificación.

En esta parte del trabajo, se procedieron a evaluar 10 diferentes productos mediante los

métodos Visual y Bioquímico y 5 productos empleando los tres métodos Visual, Bioquímico y

Fluorométrico, apreciándose que los valores de actividad encontrados, no difieren en estos

tres métodos, dado que los valores obtenidos en inhibición y concentración inhibitoria del

50% (ICso), estos no presentan una diferencia significativa y lo más importante, no influyen

en la interpretación de su actividad por lo que estos datos son aceptados.

La estandarización de estos métodos, proporcionará grandes beneficios en el trabajo que

venimos desarrollando, ya que el tiempo que tarda cualquiera de los dos métodos

estandarizados, es muy inferior al método visual, eso es de suma importancia cuando existe

gran cantidad de productos a evaluar.


SUMMARY


The present work is part of the Project "Regional Flora - OEA, Project X.5 - CYTED, Search,

Obtaining and Evaluation of New Antiparasitics Agents", having two fundamental objetives,

the evaluation of the antimalarial activity of the synthetic and natural products, and the

standardization of two alternative methods by means of which you ends up measuring this

activity.

We ended up evaluating 50 synthetic products and 276 natural products, with that a total of

326 products was reached, coming from the study of plants, as well as of chemical

modifications carried out to known structures.

Of all these evaluations one could obtain 56 active products, of which 20 are synthetic and 36

natural, besides 270 inactive poducts, 30 synthetic and 240 natural, by rneans of the optíc

method.

With the purpose of having quícker and less more tedious alternative methods that the optic

one, one worked in the standardization of two alternative methods that they involve the

cultivation of stumps of Plasmodium fafciparum. These methods are: the Biochemical one

that is based on the reaction of the parasitic Lactate dehydrogenase (pLDH). and the

f1uorometric meted that is based on the incorporation of the dye in the parasitic DNA for their

later quantification.

In this part of the work, we have proceded to evaluate 10 different products by Visual and

Biochemical methods and 5 products using three methods, Visual, Biochemical and

Fluorometric, being appreciated that the opposing activity values, don't differ in these three

methods, since the values obtained in inhibition and inhibitory concentration of 50% (lCso),

these they don't present a significant difference. and the most important thing they don't

influence in the interpretation of their activity, for what these data are accepted.

The standardization of these methods, will provide big benefits since in the work that we

come developing, the time that takes anyone of the two standardized methods, it is ver¡

inferior to the visual meted, that is of supreme importance, when they exist great quantity of

products to evaluate.

2


,

1. INTRODUCCION

3

David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IIFB • UMSA

La enfermedad de la malaria, está íntimamente relacionada con la historia de la humanidad.

Hasta nuestros días, esta enfermedad permanece con una prevalencia considerable en el

mundo, obstaculizando el desarrollo económico de comunidades y países considerados

zonas endémicas. De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (O.M.S.), casi la

mitad de la población del mundo vive en áreas donde los individuos tienen el riesgo de

adquirir la enfermedad.

La malaria también conocida como paludismo es una enfermedad transmitida por mosquitos

hembras del género Anopheles y causada por diminutos parásitos protozoos del género

Plasmo dium, los cuales infectan al humano y al insecto alternativamente (Knell 1991).

En el mundo esta enfermedad provoca la muerte de cerca a tres millones de personas y

entre 300 a 500 millones de casos clínicos se registran cada año. Esto se debe a que la

mayoría de la población está distribuida en zonas altamente endémicas que corresponden a

zonas subtropicales y tropicales con una incidencia elevada en: África, Sud y Sudoeste de

Asía, Sud y Centro América, donde el ríesgo de infección es permanente (Kondrachine el al.

1997).

Plasmodium falciparum causante de la Malaria Terciana Malígna, se encuentra entre las

cuatro especies que provocan la malaria humana, la más peligrosa y mortal. La gravedad de

esta enfermedad y su erradicación se ha complicado más con el desarrollo de resistencia del

parásito frente a las drogas antipalúdicas de elección. Otro problema con el que han tenido

que tropezar las organizaciones de salud pública mundial en la erradicación de la malaria, es

el desarrollo de la resistencia del mosquito vector frente a los insecticidas utilizados para su

eliminación y prevención en la transmisión (OMS 1994).

La situación actual de la Malaria es motivo de constante preocupación al ser una de las

principales Endemias Parasitarias que tenemos en nuestro territorio; la población boliviana

estimada en riesgo de contaminación de enfermedades transmitidas por vectores está en

constante incremento al aumentar la población y actividad económica de subsistencia en las

zonas endémicas del país, siendo algunos datos de interés que aproximadamente 3 000 000

de personas están expuestas, el 75 % del territorio tiene posibilidades de albergar al

mosquito causante de la enfermedad.

4

David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA

Además contribuye a las complicaciones de los embarazos que terminan en abortos y/o peso

bajo al nacer de los neonatos, además provoca anemia en mujeres y niños, aumentando su

vulnerabilidad a otra enfermedades, todos estos aspectos afectan de gran manera en la

situación social boliviana. (Mollinedo y col, 2000)

Debido al desarrollo de resistencia del parásito a los diferentes antipalúdicos, se han sufrido

consecutivos fracasos en el tratamiento de la malaria en zonas endémicas, específicamente

en los casos de malaria causada por P. falciparum, también está la reaparición de esta

enfermedad en áreas donde ya se la había erradicado. Por estas razones, se ha venido

trabajando continuamente en la búsqueda de drogas con actividad sobre P. falciparum; ya

sean moléculas sintéticas o moléculas obtenidas a partir de extractos vegetales siendo este

último caso, donde la etnobotánica se constituye en una herramienta muy útil para dirigir

estudios de actividad antimalárica, con base en la medicina tradicional.

Para conocer la actividad antipalúdica de los extractos que se obtienen de las diferentes

especies es necesario recurrir a las pruebas in vitro sobre cultivo continuo de P. falciparum ,

bajo condiciones estrictamente controladas.

En este trabajo presentamos tres métodos para la determinación de la actividad antimalárica

de productos naturales o sintéticos, el método visual que es el que habitualmente se emplea

en este tipo de trabajos, y dos métodos relativamente nuevos en nuestro medio, el método

bioquímico (Lactato deshidrogenasa) y el método fluorométrico, que fueron adaptados a las

condicionesestablecidas en el laboratorio.

En este trabajo se evaluó la actividad antimalárica de compuestos por el método visual,

por el método bioquímico y por el método fluorométrico. La parte experimental de este

trabajo fue desarrollada en el Laboratorio de Quimioterapia Experimental del Instituto de

Investigaciones Fármaco Bioquímicas de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y

Bioquímicas de la Universidad Mayor de San Andrés en la Ciudad de La Paz con el apoyo

del Institut de Recherche pour le Développement (IRD) y el proyecto "Flora Regional como

fuente de Fármacos antiparasitarios, antifúngicos y anticancerígenos", financiado por la

Organización de Estados Americanos (O.E.A.)

5


2. ANTECEDENTES

6


2.1 CONCEPTO E HISTORIA

El término malaria deriva de la expresión italiana "mala aria", que quiere decir "mal aire"

asociado con las zonas pantanosas donde crecen los mosquitos que difunden la

enfermedad, la malaria se conoce desde hace miles de años y las primeras menciones

registradas datan de antes del 1500 a. de C., en China y Egipto. La enfermedad fue, hace

tiempo, frecuente incluso en zonas frías como el Norte de Europa, donde afectaba regiones

de Inglaterra y Escandinavia. Fue erradicada de Italia al final de la Segunda Guerra Mundial

y en los años sesenta todavía se produjeron algunos casos en la cuenca mediterránea. En

los años cincuenta, se produjeron casos de malaria incluso en Canadá y Alaska.

El primer hito real en el conocimiento de la malaria fue en 1880, por el cirujano militar francés

Alphonse Laveran quíen logró determinar que esta enfermedad era causada por un

microorganismo unicelular. Poco después, Ronald Ross, siguiendo una sugerencia de otro

médico escocés, demostró que los mosquitos transmitian la enfermedad mientras se

alimentaban de sangre. Este descubrimiento fue la clave para el control de la infección y

condujo a fa desecación de fos pantanos donde crecían los mosquitos, el uso de mosquiteros

por la noche para evitar la picada cuando los mosquitos son más activos y finalmente, al

desarrollo de insecticidas eficaces. La quinina, obtenida de fa corteza de Cinchona, fue

llevada a Europa desde Sudamérica por misioneros jesuitas, a comienzos del siglo XVII, la

quinina todavía se usa extensamente. (P.Oporto, 2002)

La propiedad curativa de esta planta, despertó un gran interés en varios investigadores como

los franceses Pelletier y Caventou en 1820, quienes fueron los que aislaron el principio activo

la QUININA. Debido a este gran éxito, durante la Segunda Guerra Mundial y en nuestros

días, la búsqueda de nuevos componentes con propiedades antipalúdicas similares,

derivados de plantas, es de gran importancia para la Organización Mundial de la Salud.

(Boteroy col. 1998)

Hace aproximadamente 40 años, la mayoría de médicos confiaban en la erradicación de la

malaria y en que esta enfermedad ya no constituia un problema sanitario grave, ya que

estaba perfectamente controlada en zonas en las que, antaño había sido muy común donde

además, se disponía de medicamentos efectivos. No obstante, en los últimos años, se ha

producido un fuerte aumento en el número de casos de malaria, pues los parásitos

7

David Gutiéfrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- JlFB - UMSA

causantes de la malaria y los mosquitos vuelven rápidamente a colonizar las zonas de donde

anteriormente habían sido erradicados mediante quimioterapia, uso de insecticidas y otras

medidas. Actualmente se realizan abundantes esfuerzos para encontrar una cura eficaz.

2.2 SITUACIÓN MUNDIAL DE LA MALARIA

Algunos expertos estiman un aumento del 20% anual del índice de enfermedades y muertes

relacionadas con la malaria, no existe ninguna otra enfermedad occidental tan resistente.

Cada año, en todo el mundo, la malaria destruye, por lo menos, el equivalente a 35 millones

de vidas humanas productivas y sanas, por muertes prematuras y discapacidades, siendo los

niños mucho más vulnerables a la malaria.

Actualmente, 90 países en el mundo son considerados palúdicos, con casi la mitad de ellos

localizados en la región del sub.-Sahara en África, el 90% de los casos y muertes mundiales

se producen en ésta región. Epidemias palúdicas son comunes en Burundi, Rwanda y la

República Democrática del Congo (antes Zaire) (Trigg and Kondrachine 1997).

La malaria es rara en el Norte de África, donde se encuentran las especies P. vivax y P.

ma/ariae y una menor proporción de P. ovale. En el este, en Madagascar, una verdadera

epidemia hizo estragos entre 1987-1988, lo mismo que en Etiopía (Trigg and Kondrachine

1997). La endemia reapareció en La Reunión y en la Isla Maurice (Gentilini et al, 1995).

En Asia, el paludismo castiga intensamente las regiones de: Asia Menor, Península Indiana,

China, Tailandia y Vietnam, donde predominan P. falciparum y P. vivax (Gentilini et al, 1995).

En 1998, la malaria invadió áreas que anteriormente se encontraban bajo control, podemos

citar Azerbaiján, Tayikistán, Irak y Turquía, Rajas tan y Bangla Desh (Trigg and Kondrachine

1997).

Gracias al Programa Global de Erradicación de la Malaria ejecutado por la OMS entre 1955 y

1969, la transmisión de la malaria ocasionada por P. falciparum fue detenida y erradicada en

Norte América, Europa Meridional, la antigua Unión Soviética y algunos territorios de Asia y

Sud América. Sin embargo, son muy frecuentes los casos de importación de ésta

enfermedad por la migración, ó a través de los viajes aéreos (WHO, 1998).

8

David Gutiérrez Yapu AJeade Quimioterapia Experimental- IIF8 - UMSA

Esta enfermedad existe en Sud América, donde está en progresión, particularmente en

Brasil, ya que dos tercios de los casos de malaria que ocurren en América se dan en la

cuenca Amazónica, también se presentan casos de paludismo en las Guayanas y en Haití,

estando ausente en las Antiilas Francesas (Gentílini et al. 1995).

Algunas islas de Oceanía son afectadas por la malaria: Nueva-Guinea, Islas Salomón,

Vanuatu. Tahití, Nueva-Caledonia, y las Islas Lealtad están totalmente libres y han

desaparecido íos focos palúdicos del noreste de Australia. En Francia el paludismo de

importación va en pleno aumento, debido a desplazamientos frecuentes hacia países

tropicales y negligencia en la profilaxis, siendo otra causa el transporte de mosquitos

infectados en los aviones (Gentilini et al, 1995).

En 1999, la población de la Región de las Américas ascendía a 818 millones de habitantes,

de los cuales 299 millones (36,5%) vivían en zonas de condiciones ecológicas propicias para

la transmisión de la malaria. De los 35 países y territorios que son miembros de la

OPS/OMS, 21 informan tener zonas con transmisión activa de malaria. Todos ellos

(Argentina, Belice, Bolivia, Brasil, Colombia, Costa Rica, Ecuador, El Salvador, Guayana

Francesa, Guatemala, Guyana, Haití, Honduras, México, Nicaragua, Panamá, Paraguay,

Perú, República Dominicana, Surinam y Venezuela) han reorientando sus programas de

control de acuerdo con los lineamientos de la Estrategia Mundial para el Control de la Malaria

(EMCM) adoptada en Arnsterdarn en 1992 (OMS, 2002).

En resumen podriamos afirmar que el panorama mundial del paludismo muestra que

aproximadamente el 90 % de los casos con malaria se encuentra en la región Sub-Sahara

del África, pero en la región Norte de África es poco frecuente, en Europa esta casi

erradicado, se presenta en casos de migración, algunas Islas en Oceanía presentan esta

enfermedad. (Fig. 1 )

9

David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental-IIFB - UMSA

Figura 1: La Malaria a nivel Mundial, 2003

Malaria Endemic Countries, 2003

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• No Malaria

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Fuente: http://www.med.sc.edu:85/parasitology/ malariamap-2003.gif

2.3 SITUACIÓN DE LA MALARIA EN BOLIVIA

La historia de la lucha de la erradicación de la malaria en nuestro país se inicia en 1920, con

la creación del Servicio de "Lucha antipalúdica", realizando la primera prueba de

saneamiento antipalúdico durante un período de tres años en el valle de Mizque

(Cochabamba). Este programa consistía en un tratamiento antipalúdico en base a quinina y

la erradicación del vector con insecticidas. En 1932 con el inicio de la Guerra del Chaco se

paralizaron todas las actividades dirigidas a la lucha contra la malaria, y debido a esto

además de la gran movilización de contingente militar hacia la región del Chaco y viceversa

se produjo la diseminación de ésta enfermedad en el país.

Entre 1947 Y 1951 se dio prioridad a la lucha antimosquito con la utilización de OOT, siendo

en 1957 el año en la que se aprobó el decreto supremo para la Erradicación de la Malaria. A

partir de este año el gobierno destina un presupuesto exclusivo para la lucha contra la

malaria, de tal manera que en 1958 se crea el Servicio Nacional de Erradicación de la

Malaria (SNEM). A pesar de esto, los recursos no son del todo suficientes, y año tras año los

casos de infecciones por P. falciparum y P. vivax se incrementan en nuestro territorio

(Méndez 1982).

10

DavidGutiérrezYapu Area de Quimioterama ExpedmelltaJ -¡IFB - UMSA

En la fase de erradicación en 1956 se determina y delimita el área geográfica de transmisión,

ubicación, así como una programación logística para la lucha contra la malaria siendo en

1959 cuando se pone en marcha la fase de ataque con la cooperación de USAID y UNICEF

y en 1963 de forma sorprendente el área de transmisión, se redujo de 821.346 a 201.806

krrr'.

Hasta 1965se mantuvo la fase de ataque por rociamiento con DDT en los departamentos de

La Paz, Cochabamba, Chuquisaca, Santa Cruz y Tarija. Sin embargo, a medida que fue

disminuyendo la cooperación exterior, pese a la disminución de los rociamientos, la situación

epidemiológica se mantuvo sín deterioro desde 1966 hasta 1969.

A partir de 1977 se experimentó un extraordinario incremento de casos, con un pico máximo

en 1978. En 1979 se amplió la cobertura de rociamientos gracias al Programa PL-480,

adminístrándose quimioterapia temporal supresiva, especialmente en ros focos de mayor

incidencia rnalárica, sin embargo el número de casos fue ascendiendo año tras año (Méndez

1982).

En Bolivia, aproximadamente 3/4 partes del territorio (75% de la superficie total)

corresponden a zonas tropicales y subtropicales que son afectadas por el paludismo (Figura

2). Beni es el departamento más afectado por las características climatológicas que

presenta, ya que más del 90% de los casos se registran en las localidades de Riberalta,

Guayaramerín y Magdalena que son las zonas endémicas declaradas (Ávila, 1993).

11

David Gutiérrez Yapu Área de Quimiot¡>Japia Experimental - IIFB - UMSA

Figura 2: La malaria en olivia, 2 00

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Fuente: www.paho.org/spanish/ad/dpc/cd/bahia-bol.pdf

Es necesario mencionar que la malaria es uno de los mayores problemas de salud pública

para Bolivia, donde aproximadamente el 75% del territorio nacional se considera área

endémica y por tanto vulnerable y receptiva a la transmisión de malaria. Según datos del año

2000, la población en riesgo se estima en 3.569.495 habitantes, considerando como

indicador para los niveles de riesgo el índice de Incidencia Parasitaria Anual (IPA). (Fig. 3 Y

Cuadro 1)

12

David Gutiérrez Vapu

Figura 3: índice Parasitario Anual de a en 8 Iivia, ZOOO

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13

lavid Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA

.a enfermedad afecta mayormente a hombres (58%) y a la población económicamente

ictiva (51,9%), principalmente a aquellos que se dedican a las actividades económicas de

:arácter agrícola que muchas veces implican migración desde las zonas altiplánicas. Le

,igue en importancia la población en edad escolar con el 26,5%. Mas allá de su efecto letal,

as consecuencias económicas de la malaria son inmediatamente tangibles en términos de

educción de la fuerza productiva, sea en el caso extremo de muerte o a/ considerar las

iérdidas por la discapacidad laboral producida por la enfermedad.

:n un estudio reciente sobre la pérdida de producción económica de Bolivia como

onsecuencia directa de la enfermedad y mortalidad de la población económicamente activa

or malaria, se estimó que este costo equivale a un 3%0 del PIB. Si bien este cálculo se

estringe a las pérdidas directas de la producción, el costo social puede alcanzar cifras más

I/tas.

:n nuestro país la malaria es una de las enfermedades que merece atención, ya que a

ina/es de 1998 la situación epidemiológica presentó una hiperendemia, la más crítica de

:>do el historial malárico en los últimos 40 años. (Cuadro 2).

Cuadro 2: Evolución de la malaria en Bolivia (1990-2000)

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AJl;¡OS

.'VE"TE.: DeS - PROGRAl\L\.~ACIONAL l>E MALARIA

Fuente: www.paho.org/spanish/ad/dpc/cd/bahia-bol.pdf

14

David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental - IIFB - UMSA

En 1998 se produjo este aumento alarmante debido principalmente a los cambios

climatológicos provocados por el fenómeno de El Niño, ya que éste provocó excesivas

lluvias, con lo que se registraron más de 6.000 casos de malaria causada por P. falciparum

que en 1997.

Por el contrario, en 1999 el total de los casos de malaria disminuyeron a menos de 8.000

casos en relación a 1998 que registró más de 11000 casos de malaria terciana maligna

(Cuadro 2). Si bien estos datos indican la reducción del número de casos en este año, no

significa que la enfermedad haya sido erradicada (PNEM., 2000).

Hasta el año 2001 (Tabla 1), los casos de malaria en el territorio han ido en descenso, y el

departamento de Oruro se mantiene libre de esta enfermedad (PNEM 2002) (Cuadro 3).

Tabla 1.- Notificación de ia !Vlaiaría por especie parasitaria e indicadores. Sedes y

Distritos, BOLIVIA-2001

-

I Población óleal

Especie parasitaria

Sedes y Distritos Casos I P. vivax , P. telciperum IMixla iiI malárica positivos I

251Riberalta (a) 75,158 3,351 3,043 283

Guayaramerin (a) 46,414 2,057 1,897 [ 159 / 1

Magdalena (a) 17,492 429 362 66 1

Resto-Beni 82,373 1,200 224 720 I 41Cochabamba 397,511 1,780 1,780 - -Chuquisaca 195,912 1,821 1,821 - -La paz 289,608 311 I 307

1 41 -1Panda 58,142 1,536 1,294 241 1

Santa Cruz 1,757,411 2,506 2,484 18[ 41Tarija 181,795 1,649 1,648 1 -

Potosí (b) 37,989 101 101 - -TOTALES 3,139,805 15,765 14,957 1 776 1 32,

~I ! !

(a) Distritos de Salud(b) En su mayoría la notificación es de casos clínicosFuente: Programa Nacional de lv/aiada, 20ü2.

i5

David Gutiérrez Yapu ÁreA de Quimiotempia Experim ental - I/FB - UMSA

Cuadro 3.- istribución de la oblación - Área Malárica. BOLIVIA - 2001

o Ríberalta (a.)

• G.1ayanmerin (a)

O M:agdalem. (a)

O Resto-Beni

• Cochabamba

O Clniquisaca

11I La paz

O Pando

• Santa Cruz

Ii Tarija

O Potosí (b)

Fuente: Programa Nacional de Malaria, 2002

Son muchos los factores que han intervenido para que esta enteuneuad aumente

dram áticamente en lo que se refiere a riesgo e incidencia . Entre las principales causas se

pueden citar el insuficiente apoyo ñnanciero dei Gobierno Centrai, insumos iaboraiotiaies y

de medicamentos insuficientes, coberturas de control limitadas y discontinuas, y en algunos

departamentos, exceptuando Seni y Panda, ia faiia de apoyo de palie de las prefecturas y

municipios (Mollinedo, Comunicación directa 1999).

Todo lo anterior dificulta la continuidad en la erradicación y controi dei mosquiio vector, el

mantenimiento de programas de profilaxis y tratamiento en las zonas endémicas de alta

incidencia. Otro factor que se observa es el inadecuado tratamiento, esto siqniñca un

tratamiento inconcluso, ó dosis inadecuada (automedicación), corriendo el riesgo de que el

parásito desarrolle resistencia a los antipalúdicos administrados. Finalmente, la deficiente

situación económica, la precaria construcción de las viví n as, la inadecuada utilización o

inexistencia de mosquiteros, el constante cambio de hábitat en busca de fuentes de trabajo y

la migración permanente de colonos a zonas endémicas son otros factores que aumentan los

problemas en la erradicación de esta enfermedad.

En 1999 se controló el avance y la dispersión de la malaria, se disminuyó en un 38% el

número de casos en relación a 1998 (Mollinedo 1988). Para manejar la complejicac de la

lucha contra la malaria, el Ministerio de Salud y Previsión Social (MSPS) ha elaborado el

16


Programa Nacional de Fortalecimiento y Consolidación de las actividades de Prevención,

Vigilancia y Control de la Malaria en Bolivia, 2001-2005 (PNM) que desarrollará actividades

integradas y sistemáticas en las zonas endémicas del pais, sobre la base de una estructura

centralizada en aspectos de normalización y coordinación de procedimientos e insumos, y

desconcentrará la gestión de recursos humanos para permitir la ejecución de acciones a

nivel departamental y distrital.

El PNM tiene un costo del orden de US $ 12,7 millones, de los cuales ya se cuenta con

financiamientos asegurados del Canadá, UNICEF, USAID y la OPS. Restan financiar US $ 6

millones que el país solicita al BID.

2.4 LOS PARÁSITOS CAUSANTES DE LA MALARIA

La malaria está causada por el Plasmodium, un microorganismo o protozoo unicelular.

Existen cuatro formas diferentes de malaria en el hombre causadas también por cuatro

especies distintas de Plasmodium: P. falciparum, P. vivex, P. ovale y P. malariae. Estas

especies de Plasmodium son exclusivamente parásitos del hombre, excepto en el caso de P.

malariae que puede infectar a otros primates. Por consiguiente, a diferencia de algunas otras

enfermedades tropicales, no existe un reservorio animal de la infección, excepto el mosquito

que difunde la enfermedad.

El P. falciparum es el parásito causante de malaria más importante por diversos motivos,

pudiendo ser los más importantes los siguientes:

• Es altamente infectante .

• Es la forma más agresiva y provoca una gran morbilidad.

• Es el único tipo de malaria con una tasa importante de mortalidad.

• Está ampliamente distribuido en las regiones tropicales y subtropicales .

• Es la causa más frecuente de malaria endémica, especialmente en África

(provoca un 80 % de los casos de malaria)

• Existen cepas quimioresistentes

Los otros dos tipos, P. ovale y P. meietiee, raramente causan problemas sanitarios graves.

La enfermedad causada por cada tipo de parásito se conoce con distintos nombres:

17

David Gutiérrez Yapu !vea de Quimioterapia Experi[T1ental- IIFB - UMSA

íabla 2: Enfermedades ocasionadas por especies diferentes

de Plasmodium.

TIPO DE Plasmodium ENFERMEDADP. falciparum Malaria causada por P. falciparum, fiebre terciana maligna

P. ovale Malaria causada por P. ovale, fiebre terciana por P. ovale

P. vivax Malaria causada por P. vivex, fiebre terciana benignaI

P. ma/ariae Fiebre cuartana, fiebre cuartana benigna I

Fuente: Deharo et al. 2000

2.5 CLASIFICACiÓN TAXONÓMICA.

fabla 3: Cíasificación taxonómica del Plasmodium

I_=~_,",.""".- =-- •. _~.--:c-:-. ".-__ "" -_"..::.:"_ -_.,..~_-.~------------~------_~ ---I~-

Reino AnimaliaSubreino ProtozoaPhylum Sporozoa (apicomplexa)Clase SporozoaeSubclase CoccidiaSuperorden EuccocidiaeOrden HaemosporidaSuborden AconoidinaFamilia HaemosporidaeGénero PlasmodiumEspecies (en el humano) falcíparum........................................................ malariae......................................................... ovale......................................................... vivax

Fuente: Deharo et al. 2000

18

David Guliérrez Yapu

2.6 CICLO BIOLÓGICO DE Plasmo ium

2.6.1 VECTOR, Anopheles.

El mosquito Anopheles es el vector de la malaria y no su causa, existen 380 especies de

Anopheles, pero sólo 60 de ellas son capaces de diseminar la malaria, de estos, dos infestan

a Bolivia A. darlingui y A. pseudopunctipennis. Los parásitos causantes de la malaria se

transmiten de una persona a otra únicamente mediante la succión de sangre que se produce

por pica~ura de los mosquitos hembras que son las que necesitan de sangre. Los machos no

transmiten la enfermedad ya que sólo se alimentan de la savia de las plantas. El ciclo

evolutivo del mosquito se muestra a continuación .

Figura 4: Ciclo evo lutivo del mosquito Anoptietes

1. Larva 2. Pupa

3. Adulto

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4. Huevo

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www.arbovirus. qui

El mosquito hembra del género Anopl1eles (Huésped definitivo) se constituye en el vector de

transmisión del paludismo y en este se lleva a cabo el ciclo sexual del parásito luego pasa

hacia los mamíferos donde se desarrolla la fase asexual. El desarrollo desde el huevo a

nuevos adultos Anopheles toma de 7 a 21 días, dependiendo de la temperatura ambiente.

19

lavid Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental - IIFB - UMSA

Jn Anopheles hembra necesita alimentarse con sangre que contiene los elementos nutritivos

iecesaríos para que sus huevos maduren.

>on más de 380 especies de mosquitos anofelinos las que existen, pero solo 60

lproximadamente actúan como huéspedes definitivos del parásito del paludismo en el

nundo (Botero y Restrepo 1998).

.as especies que predominan en América Latina son principalmente:

Anopheles albimanus

Anopheles aquaralis

Anopheles darfingi

Anopheles nuñezioveri

Anopheles pseudopunctipennis

Anopheles punctimacula

Anopheles vestitipennis

Figura 5: Mosquito Anopheles (Hembra)

Anopheles Mosquito(AdUllremall2'}

Fuente: http://www.enchantedlearning.com/mgifs/Mosquito bw.GIF

20


2.6.2 CICLO VITAL DEL Plasmodium.

Área de Quimioterapia Experimental - IIFB - UMSA

El parásito causante de la maJaria tiene un ciclo vital que se reparte entre un huésped

vertebrado (el hombre u otro mamífero) y un insecto vector. Debe vivir en ambos para

completar el ciclo, que se muestra en la Figura 6 y que se detalla a continuación:

A Multiplicación esquizogónica exo-eritrocitaria.

1 Mosquito Anophe/es hembra. que ya ha succionado sangre infectado de un mamífero (o

persona), inoculando esporozoitos a otro mamífero (o persona) no infectado. 2 Los

esporozoitos inoculados infectan las células del hígado. 3 Estos se encuentran madurando a

esquizontes. 4 Los merozoitos son liberados al torrente sanguíneo.

(El P. vivex y el P. ovale poseen un estadío latente en el hígado llamados hypnozoitos

pueden emerger a intervalos de semanas, meses o hasta años y provocar recaídas de

malaria).

8 Multiplicación esquizogónica intra-eritrocitaria.

5 Los merozoitos infectan glóbulos rojos. 6 El estadio anillo de trofozoito madura a

esquízonte , con la posterior liberación de los merozoitos. 7 Algunos parásitos se diferencian

sexualmente en gametocitos. (Los cambios de estadios en el torrente sanguíneo, son los

responsables de las manifestaciones clínicas características de esta enfermedad).

7 Los gametocítos, macho (microgametocito) y femenino (macrogametocito), son ingeridos

por el mosquito Anopheles mientras succiona sangre (pues necesita hemogiobina para que

maduren sus huevos)

e Los parásitos multiplicados en ros mosquitos corresponden al ciclo esporogónico.

8 Cuando los gametocitos llegan al estomago del mosquito, los microgametocitos maduran

formando un gran numero de microgametos, que son elementos flagelados, estos nadan en

busca de macrogametos (macrogametocitos maduros) esto origina el cigoto. 9 Cuando el

cigoto se alarga, y se mueve se llama ookineto. 10 El ookineto atraviesa la pared estomacal

del mosquito, y se redondea adhiriéndose a la cara extema de esta pared, convirtiéndose en

ooquiste. 11 Los ooquistes sobresalen en la parte extema del estomago del mosquito,

conduciendo a la producción asexuada de numerosos esporozoitos. 12 Al liberarse estos

21

David Gutiérrez YBpU Area de Quimioterapia Experimental - i1FB - UMSA

esporozoitos se dispersan en el cuerpo del mosquito, se anidan en las glándulas salivales

con 100 hasta 70000 esporozo itos, estos son inyectados con la saliva del insecto en el

momento de la picadura.

Figura 6.- Esquem del ciclo biológico de Plasmodium

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Fuente: http://www.dpd.cdc.g v/pdx/HTMLlMalaria.htm

2.6.3 DESARROLLO DEL PARÁS ITO EN EL VECTOR

Cuando fa hembra del mosquito Anopheles pica a una persona infectada con Plasmodium ,

toma parásitos que son inyectados dentro de la sangre de una persona sana cuando esta es

picada por dicho mosquito (Knell 1991; Markell et al. 1994).

22

David Gutiérrez Yapu ÁIea de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA

La fertilización y exflagelación, en la fase sexual o esporogónica del Plasmodium tienen lugar

en el estómago del mosquito. Los gametocitos escapan de los glóbulos rojos y llegan a ser

gametos libres. La unión de un gameto masculino y femenino da lugar a la fertilización, así

se origina el cigoto. Este desarrolla hasta el ooquineto invasivo, el cual perfora el interior de

la pared del estómago y llega a ser un ooquiste. Los ooquistes crecen, se dividen y revientan

produciendo miles de esporozoitos invasivos. Una vez libres migran a través del cuerpo del

mosquito e invaden sus glándulas salivares. El desarrollo de Plasmodium en el mosquito

toma como mínimo 8 días y máximo 35 días (KneIl1991; Markell et aI.1994).

2.6.4 DESARROLLO DEL PARÁSITO EN EL HOMBRE

. Este ciclo es también conocido como esquizogónico o asexual (Botero y Restrepo, 1998). Se

conocen algunas variantes como la esquizogonia hepática, donde los esporozoitos

ínoculados en el torrente sanguíneo pasan rápidamente al interior del higado, entonces se

multiplican en las células hepáticas en los próximos 7 a 10 días, sin causar síntomas. La

esqulzoqonía hepática, la primera fase asexual, ocurre en las células de Kupffer de la vía

hepática. Los esporozoitos llegan a ser trofozoítos. Ellos se dividen hasta producir miles de

merozoítos invasivos (10-30.000 oocistos) (Markell et al. 1994).

En las cuatro especies tiene lugar una multiplicación asexual en el interior de las células

hepáticas, pero en P. vivax y P. ovale, una parte de los esporozoitos infectantes pasa a una

fase de reposo antes de comenzar la multiplicación asexual, mientras que el resto empieza a

multiplicarse de inmediato. La fase de reposo del parásito se denomina hipnozoíto. Tras el

periodo de algunas semanas hasta dos años, la reactivación del hipnozoíto inicia la división

sexual.

A la reactivación de los hipnozoitos se atribuyen las recaídas características de P. vivax y P.

ovale. En P. falciparom y P. ma/ariae no se encuentran hípnozoítos. No se producen

recaidas en el caso de P. falciparom. En el caso de P. ma/ariae, fas recaídas pueden

sobrevenir durante por lo menos 3 años, algunas veces hasta 20 años y más. Este fenómeno

sería debído a las formas eritrocitarias latentes y se expresa cuando las defensas

inmunológicas del huésped bajan. (Figura 6)

23

David Gutiérrez Yapu kea de Quimioterapia Experimental - "FB - UMSA

También se conoce la esquizogonia eritrocítica que también es conocida como fase asexual,

donde el parásito revienta de las células hepáticas para invadir los eritrocitos y multipiicarse

de nuevo. Los merozoítos invaden los glóbulos rojos y llegan a ser trofozoitos eritrocíticos

que crecen y se dividen entre 8-16 nuevos merozoítos. Cuando maduran, ios glóbulos rojos

revientan y los merozoítos son liberados y el ciclo comienza de nuevo, cada 2 o 3 días.

El merozoíto es la forma de vida más corta del ciclo de vida de Plasmodium y está

especializado para reconocer y atacar a molécuias especificas en la membrana de un

eritrocito e invade por sí mismo la membrana del eritrocito. Entre 20 a 30 segundos el

merozoito está dentro del eritrocito después del primer contacto y conexión. El anillo de

fusión se alarga y se mueve hacia atrás sobre el merozoíto, empujando ei cuerpo del

parásito dentro del glóbulo rojo.

La cubierta más externa de la superficie del merozoíto es mudada en este proceso. El

merozoíto ahora desarrolla rápidamente hasta trofozoíto eritrocítico y se alimenta por

ingestión de la hemoglobina y citoplasma de [a célula huésped a través del área

especializada de la membrana (citosomas). Los merozoítos están desprovistos de la vacuola

parasitófora hasta la ruptura de la célula huésped y liberación de elfos para invadir nuevos

glóbulos rojos (Knell 1991; Markell et a1.1994) (Figura 7).

24

Área de Oulrnioteraoia Experimental- IIFB - UMSA

Figura 7: Evolución del Plasmodium dentro del eritrocíto

[ Merozoite ]

[ Ring stage]

Whole developmental cycleof erythrocytic phase SchiIOnt ]

( Trophoroite1

Clri¡:ioI.lfirm' m .....1yu...a!r.B"""'.. ' . • pDm!/iD,..P..... ¡" .. \Ylody\h ..... l~lI) LB.fu.»., J1J.¡¡"~~.U.l<;"'¡', l. l'.rilo.o. u.l GB.lliI::l»n Át.a.fl]g-ttt,\¡4Gda.", 'lA UlmstI'll:1IDIo ofPW:m.ol.iJml~~N.~~(,.l r1ll.~u .pp .H7·.B. Co~(10I)O~ w;i:tt..~l:i)J~.fum..Ulnu.r kj¡,U:;1II

Fuente: http://www. sites.hujLa : Ima\aria/maps/wh \ecyclepath.h

2.6.5 CA ACTE íSTICA D las modium falciparum

Es la especie más tem ible, mortal y la más ampliamente distribuida en 1 regiones trop ica!es

y subtropicales. Así , el desarrollo de su ciclo en el mosquito necesita una temperatura

superior a los 18 "C , a esto se debe la ausencia de este hematozoario en las montañas

tropicales y en regiones templadas. Su ciclo exoeritrocitario es el periódo más corto, dura

solamente 7 a 15 dias en promedio y no presenta reviviscencia esquizogónica; la longevidad

del parásito no pasa habitualmnte de 2 meses , mas puede lleqar a los 6 meses o un año.

P. falciparum parasíta todos los hematíes, por esto 10 de 100 gló bulos rojos pueden ser

parasitados. La esquizogonia eritrocitaria dura habitualmente 48 horas y se efectúa

exclusivamente en los cap ilares vi cerales, especialmente encefálicos (Figura 8). En el frotis

de sangre e observa la presen cia uniforme de trofozoitos anulares (esquizontes y rosáceas

2S


se encuentran en capilares profundos), el poliparasitismo de un glóbulo rojo es frecuente . El

nombre de esta especie se debe a sus gametocitos en forma de cigarro o banana (Botero y

Restrepo, 1998; Gentilini et al, 1995)

Figura 8. e oj biológico de Plasmodium falciparum

Fuente: Deharo et al, 2000

2.7 PATOGE lA y FISJOPATOLOGíA

Estadioanillo

. '.... ,'

La hemó!isis de los glóbulos rojos parasitados y no parasitados, la liberación de los

metabolitas del parásito, la respuesta inmunológica del huésped al antígeno y la formación

del pigmento palúdico se traducen en [os primeros efectos patológicos de fa infección

palúdica.

Además, en P. falciparum la esquizogonia tiene lugar en los capilares de los órganos

internos, esto porque en [a superficie del eritrocito parasitado se forman unas protuberancias

electrodensas cuando e! parásito comienza a dividirse. La isquemia provocada por la

obstrucción de los vasos lleva a síntomas que varían según el órgano fectado, otro factor

26

David GutiérrezYapu hea de Quimioterapia Experimental- IIFB- UMSA

que favorece la obstrucción vascular es la menor deformidad de los glóbulos rojos

parasitados (Markel/ et a', 1994).

Las diferentes especies de Plasmodium se diferencian por su tendencia a infectar distintos

glóbulos rojos. Los merozoitos de P. vivex y P. ovale invaden soro reticulocitos, en cambio

los merozotos de P. malaria e se limitan a células viejas, casi al final de su vida. De esta

manera, estas infecciones tienen un límite natural, P. falciparum es capáz de invadir por

igual, glóbulos rojos de todas las edades, es por esto que las infecciones con este parásito

llevan rápidamente a la anemia. Sin embargo, junto a la destrucción masiva de los glóbulos

rojos se presentan otras alteraciones en muchos casos irreversibles (Markell et al, 1994).

El acceso simple se caracteriza por la fiebre que es provocada por el estallido de los

esquizontes que liberan el pigmento malárico en el torrente sanguíneo. La anemia resulta

tanto del estallido de los esquizontes como de la fagocitosis de los eritrocitos sanos. La

esplenomegalia y la hepatomegalia frecuentes después de cierto tiempo de evolución

demuestran la hiperactividad y la congestión de estos órganos (Markell et al, 1994).

Las particularidades sintomáticas del acceso pernicioso palúdico se deben a la multiplicación

rápida, particularmente de P. tetciperum o en ros capilares viscerales que provocan una

anoxia de los tejidos, predominantemente a nivel del encéfalo, riñones, hígado y pulmones

por anemia hemolítica, disturbios de la microcirculación y fenómenos dtotóxicos. La

gravedad de la hemólisis en el acceso pernicioso es la consecuencia de la parasitemia

elevada.

Las alteraciones de los capilares viscerales son de intensidad variable, los hematíes

parasitados por los esquizontes desarrollan en su superficie protuberancias que los adhieren

al endotelio de los capilares, los eritrocitos sanos se aglutinan a los parasitados formando asi

las rosetas. Estos dos fenómenos provocan la obstrucción de la luz vascular y la retardación

de la circulación, los microtrombos capilares se forman por los eritrocitos aglutinados que se

lisan y liberan una sustancia fosfolipídica que a veces lleva a un proceso de coagulación

lntravasculardifuso.

Se confirma el aumento de la concentración plasmática de TNF que más importante y

durable que el acceso pernicioso es grave, esta citocina de los monocitos cumple un rol

27

David Gutiérrez Yapu !vea de Quimioterapia Experimental - IIFB - UMSA

importante en la fiebre, en diversos desórdenes metabólicos, en reacciones inflamatorias y

en el sufrimiento cerebral por la producción de radicales libres oxidantes que esta induce. La

liberación de substancias vasoactivas agravan los disturbios de la microcirculación, llevando

a una vasodilatación de los capilares y los infiltrados hemorrágicos perivasculares. Los

fenómenos de anoxia citotóxlca serían provocados por la toxina hipotética del parásito

"sustancia plasmática de Maegraith".

Finalmente la hipoglicemia, la acidosis sanguínea y los desórdenes hidroeléctricos aumentan

la hiponatremia (GentiJini et al, 1995). Todas estas alteraciones pueden agravarse y llegar a

una anemia severa, ictericia, desequilibrio electrolítico, falla renal, hipertermia, colapso

respiratorio, alteraciones de la coagulación o sangrado, vómito incoercible, infección

asociada, edema pulmonar, hipog/icemia y hemoglobinuria (Botero y Restrepo, 1998), hasta

malaria cerebral, un coma o finalmente la muerte (Markell et al, 1994).

2.8 DROGAS ANTIMALÁRICAS

Los únicos antipalúdicos naturales son la Quinina (Figura 9), y el Qinghaosu (Figura 10),

actualmente existen más de 1600 derivados de los que tan solo 5 están usándose en la

práctica curativa. Naturales o de sintésis, estos fueron divididos en los años 60 en dos

grupos: según su rapidez de acción y su capacidad de inducir una resistencia por parte del

hematozoario, el grupo I comprende la quinina y las 4-aminoquinoleínas, antipalúdicos de

acción rápida y para los cuales la resistencia es lenta y difícil de aparecer y el grupo "

comprende los antifólicos (sulfonas y sulfonamidas) y los antifolínicos (diguanidas y

diaminopirimidinas), antipalúdicos de acción lenta y por lo cual la resistencia aparece

rápidamente (Gentilini et al, 1995)

28

David Gutiérrez Yaou Afea de Quimioterapia Exp~rimental- IIF8 - UMSA

Figura 9: Estructura de la Quinina

H

quinina

Fuente: www.sbq.org.br/PN-HET/causo4.htm

En 1973 se aisló de un arbusto de China (Artemisia annua L.) el Oinghaosu que es un

sesquiterpeno lactona peróxido, que es un nuevo esquizonticida del que existen muchos

derivados hidrosolubles y liposolubles, por lo tanto administrables por las vías intravenosa e

intramuscular. La actividad del Oinghaosu es rápida, en especial sobre las cepas de P.

falciparom cloroquino-resistentes (Gentilini et al, 1995).

Figura 10: Estructura del Qinghaosu

Fuente:http://www.lctjussieu.fr/manua/s/programes/Gaussian98/cancer.htm

La c1oroquina es un fármaco que pertenece al grupo de ras 4-aminoquino!einas (Figura 11),

este fármaco sintético es activo contra las formas asexuales eritrocíticas de la mayoría de

cepas de Plasmodium ma/ariae, ovale, vivax y fafciparom. Se utiliza para tratar la malaria

29

David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IlFB - UMSA

pero también se ha usado ocasionalmente en artritis reumatoidea y lupus discoide por sus

efectos antiínflamatorios, pero a dosis mucho más altas.

Figura 11. Estructura de la Cloroquina

•

e18H26el r·,)~; Cloroquina

Fuente: www.med.javeriana.edu.colfisiologia/fw/c802.htm

La Cloroquina fue desarrollada como un fármaco antimalárico durante la segunda guerra

mundial, aunque al finalizar esta se descubrió que el fármaco existía en Alemania desde

1934, esta aún en dosis masivas, no produce un efecto significativo sobre los estadios

tisulares exoeritrocíticos de los plasmodios; por lo tanto, este fármaco no es un agente

profiláctico y no previene el establecimiento de la infección. Sin embargo, es muy efectiva

contra las formas eritrocíticas asexuadas del P. vivex y de las cepas sensibles del P.

falciparum y gametocitos del P. vivex.

La resistencia a la cloroquína se ha desarrollado principalmente en cepas de P. tetciperum.

por lo que es importante determinar esta resistencia en el área geográfica donde se vaya a

administrar el tratamiento.

El número de nuevas drogas con que cuenta el arsena! de antipalúdicos es limitado y la

amenaza de la resistencia del parásito a las drogas se incrementa. Desafortunadamente, no

existe una vacuna con un impacto operacional de magnitud, además los instrumentos de

diagnóstico proporcionados deben ser mejorados. Ahí está la necesidad de toma de

conciencia de los gobiernos y sectores privados de cada nación de la importancia de los

recursos esenciales para asegurar que estos requerimientos sean disponibles (Trigg y

Kondrachine, 1998).

30

David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental - lIFB - UMSA

2.9 ENSAYOS BIOLÓGICOS in vitro DE ACTIVIDAD ANTIPALÚDICA

2.9.1 ENSAYO SOBRE PARÁSITO ENTERO

El cultivo continuo in vitro de P. falciparum fue puesto a punto en 1976 por William Trager y

James Jensen y consiste en el mantenimiento in vitro a 37°C en microaerofilia, de glóbulos

rojos humanos infectados con cepas o aislados de P. falciparum suspendidos en el medio de

cultivo celular RPMI suplementado con suero humano. Esta técnica no solo ha permitido el

estudio de drogas antimaláricas, sino también las interacciones parásito-célula huésped

(Trager y Jensen, 1978). Gracias a este método se han abierto nuevas puertas para el

estudio de la biologia, bioquímica, quimioterapia e inmunología de P. falciparum (Chulay,

1983).

El método de determinación de la sensibilidad in viiro de P. falciparum fue introducido por

Rieckmann en 1968 que inicialmente en su macrométodo utilizaba sangre infectada de la

que después de 24 horas de incubación en presencia de diferentes concentraciones del

medicamento se extendían frotis a partir de los diferentes tubos de sangre.

En el micrométodo se empleaban las placas de 96 pozos conteniendo sangre infectada y la

solución del medicamento a diferentes concentraciones, posteriormente se realizaba un frotis

teñido con Giemsa pasadas las 24 horas de incubación, para de esta manera estimar la

inhibición de la maduración de esquizontes (Deloron, 1981)

Las investigaciones sobre paludismo humano adelantaron con los estudios de técnicas de

cultivo continuo in vitro de Trager y Jensen. Las primeras fases erítroclticas obtenidas de

esta forma fueron de P. fafciparum (OMS, 1987).

Gracias a las técnicas de cultivo se pueden estudiar en todo el mundo los parásitos del

paludismo de mayor importancia clínica. Estas técnicas son la base de muchos adelantos en

la biología, bioquímica, parasitología, inmunología y quimioterapia del paludismo (OMS,

1987):

El cultivo de estadios intraeritrocitarios de P. falciparum se basa en dos aspectos

fundamentales, el uso de un medio de cultivo específico el RPMI (Roswell Park Memorial

31


Institut) y el incremento de dióxido de carbono entre 3 a 5 %, además de la reducción de la

concentración de oxígeno. En este tipo de cultivos se debe tener precaución en fa

preparación del medio con agua de mala calidad, el medio suplementado con suero

proveniente de donadores tratados con antibióticos o antimaláricos, la temperatura variable,

un pH no optimo, la frecuencia inadecuada en el cambio de medio de cultivo y los procesos

de congelación y/o descongelación de las cepas inadecuados.

Posteriormente, Trager describió un micrométodo a partir de un cultivo continuo de parásitos,

en el que el medio de cultivo era reemplazado por otro fresco después de 24 horas,

realizándose la lectura de los frotis a las 48 horas.

2.9.2 MÉTODOS EMPLEADOS PARA DETERMINAR LA INHIBICIÓN DE LA

MADURACIÓN DE ESQUIZONTES

El método empleado mayormente para determinar la inhibición de la maduración de

esquizontes, como ya se mencionó anteriormente es la lectura de frotis realizados de los

cultivos, con este método se necesitaban contar 2000 glóbulos rojos como mínimo en una

prueba, siendo el total un número muy grande debido a la gran cantidad de compuestos en

estudio, el método resulta muy lento, por lo que se comenzó a desarrollar nuevos métodos

que permitan obtener resultados similares, confiables y lo más importante mucho más

rápidos que los empleados.

De esta manera se desarrollaron diversos métodos como el Micrométodo Radioisotópico, el

Método Bioquímico y el Método Fluorométrico (Deharo y col. 2000).

2.9.2.1 MICROMÉTODO VISUAL

Las pruebas in vitro permiten en principio, una medida objetiva de la sensibilidad de una

cepa de P. falciparum con respecto a los esquizonticidas sanguíneos de acción directa.

Esta técnica, introducida por Rieckmann en 1968 ha sufrido numerosas modificaciones

adaptadas para el cultivo continuo in vitre de P. falciparum que fue descrito y puesto a punto

por Trager y Jensen (Deloron, 1981). Los tests in vitre miden la concentración de la droga


que inhibe la reproducción asexual de P. falciparum en los glóbulos rojos de pacientes

infectados.

Algunas ventajas de las técnicas in vitro son la obtención de información confiable con

cantidades pequeñas de material (orden de miligramos y microgramos), el nivel de

inmunidad, dificil de evaluar en sujetos residentes en zonas de transmisión, la mayor

precisión de la medición que generalmente no es accesible con sistemas de test in vivo, y la

evaluación de un mayor número de compuestos en un experimento, comparado con el

método in vivo.

El aumento de las restricciones que involucra el uso de animales, han provocado que la

mayor parte de los ensayos usados hoy en día sean cultivos in vitro de parásitos; todas estas

características generalmente hacen de estos métodos más eficaces y menos costosos que

los métodos in vivo.

Sin embargo, estos métodos in vitro tienen limitaciones en cuanto a la incapacidad de

determinar la actividad potencial de drogas antimaláricas que requieren activación

metabólica como el proguaniJ. En el caso de esta y otras drogas como el cicloguanil, la

pironaridina, se prepara un medio de cultivo con baja concentración de ácido fólico y ácido p

aminobenzoico, ya que la acción de estas drogas es justamente sobre la ruta metabólica de

esos dos ácidos metabólicos (OMS, 1987).

Otras limitaciones podrían ser la poca validez en la medición de ciertos parámetros de

actividad con determinados modos de acción, la incapacidad para distinguir selectivamente

la seguridad y toxicidad de compuestos con respecto a la tolerancia de! huésped y los

problemas de ciertas propiedades fisicoquímicas como la solubilidad acuosa y adherencia al

vidrio o plástico.

El principio básico de este método se basa en la coloración de frotis sanguíneos utilizando

Giemsa, que es un colorante neutro compuesto por eosinato (colorante ácido) y violeta de

metileno o azul de metileno (colorante básico); el colorante neutro que precipita es insoluble

en agua pero soluble en alcohol metílico, el colorante se activa al contacto con al agua que

provoca la precipitación del colorante neutro.

33

David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IIF8 - UMSA

Los protozoarios disocian el colorante de tal manera que los núcleos se tiñen de rojo y el

citoplasma se tiñe de azul (Deharo y col, 2000). El método aplicado en este estudio

corresponde al semimicrométodo de De/oron.

2.9.2.2 MICROMÉTODO RADIOISOTÓPICO

Plasmodium es incapaz de sintetizar ex novo las bases purinas (hipoxantina, adenina y

guanina), pero sí [as pirimidinas (uracilo, timína y citosina). Por lo tanto, extrae las purinas

exógenas para la síntesis de sus nucleótidos púricos. La hipoxantina es la base utilizada

principalmente por el parásito para la síntesis de sus nucleótidosadenosina y guanosina.

Si se introduce en el medio de cultivo hipoxantina marcada, los parásitos la incorporarán en

sus ácidos nucleicos. Con un contador beta se puede detectar el nivel de radioactividad, que

es proporcionar a [a parasitemia. La incorporación de la hipoxantina es mayor en los

. trofozoitos y esquizontes que en los estadios anillos. El ruido de fondo de [os glóbulos rojos

sanos es débil puesto que no sintetizan ADN ni ARN (Desjardins et al, 1979)

2.9.2.3 MÉTODO BIOQuíMICO (Prueba in vitro de la Lactato

Deshidrogenasa parasitaria)

Los estudios de las vías metabólicas del Plasmodium han conducido a la identificación de

enzimas estructuralmente diferentes de las del huésped, la Lactato Deshidrogenasa (LDH)

del parásito ha sido identificada como diferente de la LDH humana tanto a nivel bioquímico

como a nivel inmunológico. Los Plasmodium necesitan de la presencia de /a LDH para

asegurar el metabolismo de los carbohidratos (25-30 veces mayor que en los glóbulos rojos

sanos), considerando que requieren un alto nivel de producción energética para una rápida

multiplicación durante el desarrollo intraeritrocitario.

La LDH parasitaria (pLDH) puede ser detectada en el estadio anillo como en el estadio

trofozoito. La pLDH y la del eritrocito, utilizan la nicotinamida-adenina dinucleótido (NAO)

para la transformación de lactato en piruvato; pero solo la pLDH tiene la capacidad de utilizar

la coenzima 3-acetilpiridina adenina dinucleótido (APAD). La lactato deshidrogenasa es la

última enzima de [a vía glicolítica que regenera el NAO necesario para la producción de ATP,

el incremento de la lactato deshidrogenasa está en relación directa con la densidad

34


parasitaria; por lo tanto, la enzima puede ser utilizada como un marcador de P. tetciperum

(Figura 12).

Figura 12: Esquema de la transformación de lactato en piruvato

'" t-.cwed~'Ilrog=í••

Fuente: Rawn et al, 1989

En presencia de la coenzima APAD, la detección de la LDH es específica de la enzima

parasitaria y su medición permite la evaluación de la intensidad parasitaria n el cultivo; la

evaluación de la actividad de la LDH se basa en la reacción bioquímica que conduce a la

formación del piruvato a partir de la L-Iactato en presencia de la LDH parasitaria y de la

coenzima APAD; esta reacción lleva a la formación de APAD reducida que en su momento

reduce el NBT (Nitro Blue Tetrazolium) (Figura 13), formando un derivado formazán azul,

detectable a 650 nM (Makler et al, 1993).

Figura 13: Estructura Molecular del NBT (Nitro Blue Tetrazolium)

Fuente: http://www.sh.lsuhsc.edu/intragrad/cell_mol_phys/210/alexander_PDF/NBT.PDF

35


La tipificación enzimática de la LDH de los diferentes plasmodiales, reveló diferencias entre

P. tetciperum (3 bandas), P. gallinaceum (1 banda), P. berghei (2 bandas), P. cynomolgi (4

bandas) y P. knowlesi (5 bandas). Los Plasmodios necesitan la presencia de la LDH para

asegurar el metabolismo de los carbohidratos (25-50 veces mayor que en los glóbulos rojos

sanos), considerando que requieren un alto nivel de producción energética para una rápida

multiplicación durante el desarrollo intraeritrocitario.

La acidosis láctica complica frecuentemente las infecciones severas constituyéndose en

señal predictiva de mortalidad.

Este método es tan útil como el método visual y el radioisotópico, pero tiene la desventaja de

que la parasitemia inicial tiene que ser superior a 0,5 %, obteniéndose buenos resultados si

se inicia con una parasitemia del 1 Ó 2 % y un hematocrito de 1,5 % y es necesario

mencionar que un hematocrito de! 5 % conduce a un ruido de fondo demasiado elevado, esto

por la actividad de la LDH humana (Makler et al, 1993)

2.9.2.4 MÉTODO FLUOROMÉTRICO

El método se basa en la determinación de la fluorescencia del f1uorocromo Hoechst 33258

(Figura 14), insertado en el ADN de Plasmodium tetciperum, los ensayos biológicos son

realizados en placas de 24 alveólos, en las cuales el parásito es confrontado con las drogas

a diferentes concentraciones, el número de parásitos es directamente proporcional a la

cantidad de ADN de los mismos, por lo tanto la concentración inhibitoria del 50 % puede ser

determinada a través de la cuantificación de ADN presenteal terminar el ensayo biológico.

Se aisla el ADN y se agrega el fluorocromo de la familia de los bis-benzimidazoles, Hoechst

33258, que tiene la capacidad de fijarse sobre los ácidos nucleícos al nivel de la adenina y

de (a timidina. La sensibilidad llega hasta niveles de ng/ml con un afinidad 100 veces más

alta para ADN que para ARN, posteriormente se mide la fluorescencia y se calcula el leso

(Smeijesters et al, 1996)

36


Figura 14: Estructura Molecular del HOECHST 33258

Fuente: http://omlc.ogi.edu/spectralPhotochernCAD/htmUhoechst-33258(DMF).htmI

37

David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental - IlFB - UMSA

JT

3. JUSTIFICACION

38


Sabiendo que la malaria es una enfermedad que se transmite a través de las picaduras del

mosquito Anopheles y que en los últimos años ocasionaron alrededor de 500 millones de

casos todo el mundo, esta enfermedad mantiene en peligro a la humanidad hace miles de

años, hoy el problema básico en la lucha de la erradicación de la malaria es la inexistencia

de una vacuna que sea capaz de permitir la erradicación completa de esta enfermedad

además de la resistencia que el parásito desarrolla constantemente frente a las drogas

antipalúdicas, rápidamente propagada en muchas áreas tropicales y se debe

fundamentalmente a la gran adaptabilidad de Plasmodium y al uso inadecuado de

antipalúdicos.

Por otro lado, a través de la historia de la búsqueda de drogas eficaces para el tratamiento y

erradicación de las enfermedades infecciosas se han desarrollado una serie de técnicas y

métodos que permiten un mejor estudio del mecanismo biológico, bioquímico y molecular de

los agentes causales de las enfermedades, los vectores que las transmiten en algunos

casos, y el mecanismo de acción de las drogas eficaces y de aquellas moléculas con algún

efecto letal sobre los microorganismos patológicos.

En el caso de la malaria, el desarrollo de resistencia tanto en los microorganismos patógenos

(Plasmodium) a los antipalúdicos como de los agentes transmisores (vectores) a los

insecticidas ha opacado constantemente los descubrimientos de nuevas moléculas.

El arsenal terapéutico a disposición de los clínicos para luchar contra el paludismo, no

solamente está limitado en términos de accesibilidad económica, sino también en términos

de eficacia debido a: la emergencia de resistencia a los terapéuticos, los fenómenos de

migración de poblaciones no inmunes hacia el interior de zonas endémicas y el fuerte

crecimiento de poblaciones en riesgo y estructuras y políticas de salud pública carentes de

medios económicos, es por esta razón que es urgente encontrar nuevas alternativas

terapéuticas en la lucha contra la malaria.

Como ya se mencionó anteriormente, una alternativa interesante para el hallazgo de nuevos

fármacos es estudiar la actividad antiparasitaria de nuevos compuestos ya sean naturales o

sintéticos mediante ensayos biológicos in vitro e in vivo.

39


La búsqueda de nuevos antimaláricos, requiere la utilización de estos modelos de estudio,

tanto in vitro como in vivo para evaluar la eficacia de las drogas sobre el desarrollo

parasitario, en el caso de Plasmodium, los modelos in vitre requieren en la actualidad

diversas técnicas para la cuantificación de la parasitemia, desde el mantenimiento del cultivo

del parásito hasta la determinación de la actividad antipalúdica de productos o drogas

potencialmente activas.

Para poder realizar estos estudios, se tiene el método de determinación de la sensibilidad in

vitre de P. talciparum que fue introducido por Rieckmann en 1968, que inicialmente en su

macrométodo utilizaba sangre infectada de la que después de 24 horas de incubación en

presencia de diferentes concentradones del medicamento se extendían frotis a partir de los

diferentes tubos de sangre.

Posteriormente se aplicó el micrométodo donde se empleaban las placas de 96 pozos

conteniendo sangre infectada y la solución del medicamento a diferentes concentraciones,

teniendo como prueba final un frotis teñido con Giemsa pasadas las 24 horas de incubación,

para de esta manera estimar la inhibición de la maduración de esquizontes (Deloron, 1981)

Posteriormente, Trager describió un micrométodo a partir de un cultivo contínuo de parásitos,

en el que el medio de cultivo era reemplazado por otro fresco después de 24 horas,

realizándose la lectura de los frotis a las 48 horas, siendo esta lectura el método

mayormente empleado para determinar la inhibición de la maduración de esquizontes, pero

actualmente debido a la gran cantidad de compuestos en estudio, este procedimiento resulta

ser muy lento, especialmente ante los grandes requerimientos de resultados confiables y

rapidos ; por esta razon se comenzó a desarrollar nuevos métodos que permitan obtener

resultados similares, confiables y lo más importante mucho más rápidos que los empleados.

De esta manera se comenzó a desarrollar diversas técnicas en diferentes países, como son

el Método Radioisotópico, el Método Bioquímico y el Método Fluorométrico, que

proporcionen estos requerimientos, con los cuáles podamos responder a la exigencia que

nos demanda la gran cantidad de extractos vegetales y derivados sintéticos que se

encuentran en estudio, estas tecnicas serían de gran ayuda en el trabajo que se desarrolla

en el Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas donde se realiza este trabajo con

diferentesorganizaciones a nivel mundial, en un trabajo de cooperación.

40

David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental- lIFB - UMSA

Por estas razones es que nosotros intentamos desarrollar los métodos que nos convendrían

por contar con los equipos necesarios, y por ser los que no trajeran mayores inconvenientes

en cuanto a eliminación de los deshechos, siendo los Métodos Bioquímico y Fluorométrico

los elegidos.

41

David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental- "FB - UMSA

4. OBJETIVOS

42


4.1 OBJETIVO GENERAL

AJea de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA

• Evaluar la actividad in vitro de productos sintéticos y naturales sobre la cepa de

P/asmodium tetclperum F32 sensible a la Cloroquina.

4.2 OBJETIVOS ESPECíFICOS

• Identificar la actividad antimalárica in vitro sobre P/asmodíum telciperum de

productos sintéticos y naturales por el método visual.

• Estandarizar el método Bioquímico (Reacción de [a Lactato deshidrogenasa), para

la detección de la actividad de compuestos sintéticos o naturales contra

P/asmodíum fa/cíparom.

• Estandarizar el método Fluorométrico, para la detección de la actividad de

compuestos sintéticos o naturales contra P/asmodium telcipetum.

• Obtener valores de ICso de especies naturales conocidas como activas, para

realizar una comparación con los resultados obtenidos en el estudio.

• Comparar los resultados obtenidos por el método visual clásico con aquellos

obtenidos con los métodos desarrollados.

43

lavid GutiérrezYapu Áreade Quimioterapia Experimental-IIFB - UMSA

5. MATERIAL Y,

METOOOS

44

DavidGutiérrez Yapu

5.1 DISEÑO METODOLÓGICO

Area de Quimioterapia Experimental - IfFB- UMSA

II

IrIL ,

I

I

I

r

I

I

I

I

Ir----------------I

rI

1

~ ----o 1__

: IT.

45

David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental - IIFB - UMSA

5.2 CULTIVO DE ESTADíos INTRAERITROCITARIOS DE P. falciparum

5.2.1 OBTENCIÓN DE GLÓBULOS ROJOS

El método de cultivo continuo in vitre fue desarrollado en 1976 por Trager y Jensen (Trager

and Jensen, 1978). De acuerdo a este método, la sangre para el cultivo fue colectada

estérilmente en un tubo conteniendo 1,5 mI de ACD para 10 mi de sangre total, mezclando la

sangre con el anticoagulante con movimientos suaves de inversión. Los donadores no

debieron haber recibido tratamiento alguno en los dias previos a la toma de sangre, siendo la

sangre empleada para este experimento del grupo 0, factor Rh +.

Después de centrifugar 10 minutos a 780 g a una temperatura superior a 20°C, se colectó el

plasma en otro tubo, eliminando la capa intermedia que contiene los elementos nucleados de

la sangre para dejar así solo los eritrocitos, síendo el siguiente paso el lavado por

centrifugación durante 5 minutos a 466 g dos veces con RPMI, resuspendiendo los eritrocitos

en volumen igual al plasma eliminado, descartando cada vez el sobrenadante.

Luego de eliminado el sobrenadante, estos eritrocitos fueron empleados en los cultivos

durante un tiempo no mayor a una semana y conservados a 4°C.

5.2.2 OBTENCIÓN DE SUERO O PLASMA

El plasma fue obtenido de acuerdo a mecanismos anteriormente señalados, aprovechando el

procedimiento de recolección de glóbulos rojos. Para la obtención de suero se dejó retraer el

coágulo de sangre colectada sin anticoagulante (por lo menos durante una hora), luego se

centrífugo durante 15 minutos a 1250 o 1750 g, el suero fue decantado y centrifugado

nuevamente para eliminar totalmente los glóbulos rojos aún presentes, luego se procedió a

esterilizar con filtros descarta bIes tipo Millipore de 0,22 prn.

Finalmente se procedió a decomplementar (inactivar el complemento) el suero por 45

minutos a 56°C, el suero fue alicuotado en tubos estériles de 50 mi y congelado a -70°C. El

suero utilizado debía ser compatible con el grupo sanguíneo de los eritrocitos, (Grupo O,

factor Rh+).

46

David Gutiérrez Yapu AJea de Quimioterapia Experimental - IIFB - UMSA

5.2.3 PREPARACIÓN DEL MEDIO RPMI-1640 SIGMA

Este medio fue empleado tanto para lavar los glóbulos rojos como para el cultivo in vitro,

añadiéndole suero o plasma como suplemento, este fue preparado disolviendo el contenido

del frasco de RPMI-1640 SIGMA (15,89 g) en 900 mi de agua bidestilada desionizada con 60

mg de gentamicina y 2,1 g de bicarbonato de sodio, completando a un volumen final de 1

litro. Posteriormente, se ajustó el pH a 7,4 con ayuda de ácido clorhídrico o hidróxido de

sodio según el caso y se distribuyó en frascos de 250m/ con su correspondiente

identificación, este medio de cultivo fue esterilizado por filtración con membranas Millipore de

0,22 IJm y fue conservado a 4°C (no mas de cuatro semanas).

5.2.4 DESCONGELACIÓN DE LOS AISLADOS DE P. falciparum

Los eritrocitos son sensibles al choque osmótico y mas todavía aquellos infectados por P.

tetciperum, por lo tanto la criopreservación debe seguir rigurosamente los pasos de

enfriamiento con agentes crioprotectores para impedir el fenómeno de lisis. Al bajar fa

temperatura en el interior las células, se forman cristales de hielo que las pueden dañar,

puesto que el volumen del hielo es superior que del agua liquida, además la cristalización

provoca una deshidratación responsable de cambios en la concentración de sales y

metabolitos, el agua así eliminada del medio interno crea un desequilibrio osmótico que

puede impedir la recuperación de la célula.

Existen varios tipos de crioprotectores tales como el sorbitol, el glicerol, la dextrosa, el

dimetilsulfóxido (DMSQ) que tienen la capacidad de bajar el punto de congelación del agua,

de permeabilizar las membranas y reducir el grado de contracción de las células durante el

proceso de congelación, evitando así el choque osmótico, estos crioprotectores penetran

rápidamente en el interior de la célula a congelar, protegiendo a la célula del fenómeno de

cristalización y así provocan una dismínución del fenómeno que aumenta las fuerzas iónicas.

La eliminación de estas moléculas durante la descongelación es una etapa clave que se

debe realizarpor grados progresivos para evitar la lisis.

Los criotubos que contenían los GRI por las cepas fueron sacadas del congelador, para ser

descongeladas inmediatamente en baño maría a 3rC durante 1 minuto, en esta etapa

fundamental, el contenido del criotubo ya descongelado (aproximadamente 0,5 mi) fue

47


llevado a un tubo estéril de 15 mi añadiéndose 0,1 mi de una solución estéril de cloruro de

sodio a/12%, una gota por segundo, agitando con suavidad y con mucho cuidado.

Luego de 5 minutos se añadieron 5 mi de una solución estéril de cloruro de sodio al 1,6%,

una gota por segundo y agitando siempre con suavidad, esta suspensión fue centrifugada a

500 g durante 10 minutos, eliminándose luego el sobrenadante sin dejar sedimento seco, a

este sedimento se añadieron 5 mI de una solución estéril de cloruro de sodio al 0,9% con

dextrosa al 0,2% (una gota por segundo), agitando siempre con suavidad.

Finalmente después de centrifugar a 500 g, durante 10 min, (eliminando el sobrenadante

pero sin dejar sedimento seco los glóbulos rojos fueron puestos en suspensión de RPMI

suplementado con suero al 20% para el inicio del cultivo.

5.2.5 CONGELACiÓN DE LAS CEPAS DE P. fa/ciparum

Para congelar primero se verificó si la parasitemia era superior o igual al 4 % en el estadio

anillo. Si era así entonces se eliminaba la fase superior de la caja Petri, lavando esta con 4

mi de RPMI, el sedimento (que contiene glóbulos rojos infectados), fue centrifugado durante

10 minutos a 500g y se eliminó el sobrenadante.

Previamente se atemperó la solución de congelamiento a 37 "C, (esta solución contiene 28

mi de glicerol. 3.024 g de sorbitol. 0.65 de cloruro de sodio. 72 mI de agua destilada estéríl),

para terminar se añadió la solución de congelamiento, gota a gota agitando con suavidad, en

una relación de 4 volúmenes de la solución de congelamiento estéril a 1 volumen del

sedimento que se obtuvo (Glóbulos rojos con una parasiternia del 4 %).

Este fue distribuido en criotubos de 0.5 mi para luego ser conservados a -20 oC por 24 horas

y luego trasladados a-52 ó -70 "C. (se tuvo el cuidado de que los criotubos estén

correctamente identificados y fechados).

5.2.6 ADAPTACiÓN A CULTIVO in vitro

Luego de descongelar los parásitos, el sedimento fue colocado en cajas Petrí tipo Fa/con

1016 de 60 mm de diámetro y 15 mm de profundidad, cada caja recibió 5 mi de suspensión

48

David Guliérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimenlal- IIFB - UMS6

de eritrocitos, con un hematocrito de 5 % Y una par sitemia inicial de 0,5-1 %, esto significa

en volumenes:

0,25 mI de eritrocitos parasitados y no paras ltados

4,5 mi de RPM!

0,5 mi de suero o plasma

Se colocó la caja Petri con ef cultivo en el interior de un "Cancle Jarr" y este a la vez fue

colocado permanentemente en una c~:;,,;fz. a 37 (le, (El Can'::;.:; ":0;"( es un íccipit;i¡l¡;; de vidrio

con una tapa de cierre nermético que tiene una ¡¡m/c de paso, con una vela encendida en su

interior, esta permite la sal ida de oxigeno y la saturación con di6:x.¡cJcj de carbono en el

interior, cerrando la nave de paso cuando se apague la vela) (Figura 15),

Figura 15: Cultivo de cepas de P. telciusrum in viiro

El cambio de medio de cult ivo por otro fresco se lo realizó diariamente; este paso es

fundamental debido a que la producción de ácido láct ico por el parás ito es importante y como

resultado disminuye el pH del medio de cultivo, Para realizar el control de la parasitemia

(cada 48 horas al inicio cuando los cultivos tienen pocos parásitos, y cada 24 horas cuando

se observa buen desarrotlo), se sacaron f s cajas de cult ivo de la incubadora

cuidadosamente, para no resuspender los eritrocitos que se encontraban asentados en una

delgada capa,

49

David Guliérrez Yapu Área de Quimioleraoia Experjmenlal- IIFB - UMSA

Para eliminar el medio de cultivo se inclinó ngeramente la caja y con ayuda de una pipeta

Pasteur se aspiró una pequeña parte de sedimento globular, después se procedió a teñir con

el colorante Giemsa al 10%, Esto permite tener un control de la parasitemia, así como el

desarrollo del parásito en el cultivo ya sea con la mariología adecuada, duración normal de

cada estadía intraeritrocitario, aspecto de los eritrocitos, contaminación por bacterias u

hongos.

Finalmente se añadió un volumen igual de medio RPMI al que se eliminó , suplementado con

10% de suero o plasma inactivado, si la parasitemia era mayor al 2% se la disminuía

añadiendo glóbulos rojos no parasitados de /8 siguiente manera:

IPnrrpnbip nA I11' -- "-:'~-J'~ -- _ 'V _ 'v• 'v _ ' v

1Il'parasitemta'1 Cantidad de 3/4 2/3 % OGR :lI plirnin:llr 1

1I 1II .. ~ ~ ........~.

75% 66% I 50% 0% ¡1IVolumen. enporcentaje I

• Se añadieron glóburos rojos frescos conservando el hematocrito al 2%

Figura 16. Cambio de Medio de Cultivo

50


5.2.7 DETERMINACiÓN DE LA PARASITEMIA

Para determinar el porcentaje de parasitemia se realizó la lectura de un frotis del sedimento

teñido con Giemsa y se empleaba la siguiente fórmula:

Número de glóbulos rojos parasitadosPorcentaje de parasitemia =------------------------ x 100I Número de glóbulos rojos totales

5.3 SINCRONIZACiÓN DE CULTIVOS in vitro DE P. falciparum

Plasmodium requiere para su multiplicación el aporte externo de sustratos y catabolitas,

necesarios para el metabolismo del parásito que se produce en el interior de la célula

huésped, por lo que el parásito debe permeabilizar la membrana eritrocitaria para

incrementar el tráfico celular.

La gran permeabilidad de Jos eritrocitos infectados por P. tetciperum a las hexosas es una

característica que se aprovecha en cultivo in vitro para lisar de manera selectiva los glóbulos

rojos infectados con parásitos maduros y concentrar formas jóvenes de P. tetcioerum,

realizando un tratamiento del cultivo con sorbitol (Oeharo y col).

El cultivo de P. tekiperum (con mayor porcentaje del estadio anillo), se centrifugó a SOO g

durante 5 minutos, para posteriormente eliminarse el sobrenadante y añadiéndose nueve

partes de sorbitol al 5% a una parte de sedimento, luego se incubó durante 10 minutos a

37°C y centrifugado nuevamente a sao 9 por 5 minutos. El sedimento es colocado en cultivo,

para ser utilizado 6 horas después.

5.4 EVALUACiÓN DE LA SENSIBILIDAD in vitro DE P. falciparum A LAS

DROGAS: MICROMÉTODO VISUAL

5.4.1 PREPARACION DE LA DROGA DE REFERENCIA Y EXTRACTOS

Se empleo Oifosfato de Cloroquina (CQ) (Sigma, PM=51S), como droga de referencia a partir

de una solución madre a partir de la cual se realizaron diluciones seriadas en

51

David Gutiérrez Yapu Area de Ouimiotempia Experimental- IIFB - UMSA

concentraciones de 10 a 1000 nM, que fueron distribuidas por duplicado en la microplaca de

titulación en orden creciente.

Además se prepararon soluciones madre de los extractos naturales o sintéticos, disolviendo

el extracto en DMSO a una concentración de 10 mg/ml, a partir de esta solución se

realizaron diluciones seriadas de 0,1 - 1 - 10 f.Jg/ml, distribuidas de menor a mayor

concentración y también por duplicado.

5.4.2 PREPARACIÓN DE LA PLACA

Primeramente se colocaron 200 ¡JI de agua destilada estéril en todos los bordes superior e

inferior a la placa de 96 pozos, para evitar el "efecto borde". En cada pozo se colocaron 100

¡JI de una suspensión de glóbulos rojos con un hematocrito del 2 % (para esto se utiliza RPMI

con suero o plasma al 20 %), además de una parasitemia del 1 % (los parásitos deben estar

en estadio anillo en su mayoría, no se toman en cuenta los otros estadios), luego se

añadieron las concentraciones seriales de las drogas (dando un volumen final de 200 ¡JI),

esta placa se incubó a 37 "C por el lapso de 48 horas, al cabo de este tiempo se evaluó la

actividad de los extractos por el método visual (Figura 17).

Figura 17: Disposic ión y distribución de los productos evaluados,

el control y I droga de referencia

1 2 31 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B l o~~ ];~_..;,:¡ b10 b1Q d1Q d i Q If10 If1Q . h1 h1 li1 Ih I

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H I I I I--.J I I I I I I (! ! ! ! ! ! ! ! !

a-j: productos (subíndices concentración IJg/ml)

cq: cloroquina (concentración nM)

T: test igo (RPMI + DMSO)

52


5.4.3 MÉTODO VISUAL


5.4.3.1 PREPARACIÓN DE REACTIVOS QUíMICOS

El colorante Giemsa se preparó disolviendo 0,76 g de polvo Giemsa en 50 mi de glicerina,

sometiendo este sistema a 60 OC para su completa disolución, luego se completó a 100 mi

con Metanol, disolviendo este con ayuda del agitador magnético por 6 horas, cubierto o

protegido de la luz solar, finalmente se incubó en oscuridad por 5 días, filtrándose

posteriormente.

El Tampón fosfato PBS, se preparó disolviendo 0,2 g de KH2P04y 0,5 g de Na2HP04 (2H20),

en 980 mI de agua destilada, ajustándose luego el pH a 7,4 con Hel 0,1 N o NaOH 0,1 N,

para finalmente enrasarlo a 1000 rnl.

5.4.3.2 MÉTODO

Luego que la placa de 96 alveólos fue incubada, se eliminó completamente la fase superior

del cultivo, se hizo un frotis del sedimento de cada alveólo, fijando primeramente con metanol

y realizando la tinción por 15 minutos con la solución de Giemsa (al 20 % con PBS),

posteriormente este se lavo con agua. Dejando secar a medio ambiente (Figura 18).

53


Figura 18: roceso de tinción (Giemsa)

Por último se observó en el microscopio, con lente de inmersión X 100, contando tanto

glóbulos rojos no infectados (GRL) como infectados (GRI), para así tener el % de inhibición,

el cual se calculó mediante la siguiente fórmula:

(G RL - G 1)% Inh = ------------------- x 100

GRL

El cálculo para hallar la Concentración Inhibitoria del 50% en la maduración de los

esquizontes (lCso), se hizo por el método gráfico mediante el programa Cricket Graph 1,3.

5.4.3.3 INTERPRETACiÓN

Los resultados del ICso (Concentración de la droga o extracto que inhibe el 50% de

maduración de esquizontes jce interpreta de la siguiente manera:

54


Inactivo >

Activo <

Patrón (Cloroquina) =

Área de Quimioterapia Experimental- "Fe -UMSA

10 ¡Jg/ml

10 ¡Jg/ml

0,02 ¡Jg/ml (34 nM)

5.4.4 EVALUACiÓN DE LA SENSIBILIDAD in vitro DE P. falciparum A LAS

DROGAS: MÉTODO BIOQuíMiCO (PRüEah in vitro DE LA LACTATO

DESHIDROGENASA PARASITARIA)

La preparación de la droga de referencia, preparación de los extractos y la placa son

similares a los del método visual.

5.4.4.1 PREPARACiÓN DE LOS REACTIVOS

En cuanto a la preparación de la solución de APAD (coenzima) y L-lactato (substrato), se

mezclaron 13,8 ¡JI de Tritón X 100 con 5 mi de agua destilada desionizada a 50 "C hasta su

disolución, añadiéndose luego 220 mg de L-Iactato y 60,5 mg de tampón TRIS, mezclando

hasta su disolución y luego enfriar. Posteriormente se añadieron 40,7 mg de APAD y se

agregó agua hasta un volumen de 11 mi, verificándose el pH de 9,2.

El colorante se preparó disolviendo 32 mg de NBT y 1,6 mg de PES en 20 mi de agua

bidestifada desionizada.

5.4.4.2 MÉTODO

Luego que la placa de 96 alveólos fue incubada, siguiendo los mismos parámetros que los

descritos en el método visual, se homogenizaron los contenidos de los pozos y se pasaron

20 ¡JI de estos homogenizados a otra placa limpia (no estéril), para llevarla a congelación.

Llegado el momento de la prueba, se descongeló las fases anteriormente señaladas y se

colocaron 100 ¡..JI de la solución de APAD previamente preparada, a cada pozo para incubar a

temperatura ambiente por 30 minutos.

55

David Guliérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental - IIFB - UMSA

Pasado el tiempo de incubación, se añadieron 25 ¡.JI de la solución NBT/PES en cada alveólo

y se incubó nuevamente por un lapso de 35 minutos a temperatura ambiente, protegiendo

con papel aluminio de la luz, finalmente se añadieron 25 ¡..ti de una solución de ácido acético

al 25% para parar la reacción enzimática y leer a una densidad óptica de 630 nm,

determinándose luego el porcentaje de inhibición (Figura 19).

Figura 19: Proceso de lectura de absorvancias en el lector ELl5A

La fórmula empleada para calcular el porcentaje de inhibición fue la siguiente:

(DO T - DO M)% Inh =----------.--.-------..-x 100

DOT

El cálculo para hallar la Concentración Inhibitoria del 50% en la maduración de los

esquízontes (ICso), se realizó por el método gráfico mediante el programa Crícket Graph 1.3.

La interpretación fue la misma que la señalada anteriormente .

56

David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimentar - "FB • UMSA

5.4.5 EVALUACIÓN DE LA SENSIBILIDAD in vitro DE P. fa/ciparum A LAS

DROGAS: MÉTODO FLUOROMÉTRICO

5.4.5.1 PREPARACIÓN DE LA DROGA DE REFERENCIA Y EXTRACTOS

La preparación de la droga de referencia y la preparación de los extractos son similares a los

del método visual.

5.4.5.2 PREPARACiÓN DE LA PLACA

En cada pozo de una placa de 24 alveólos, se colocaron 600 ¡JI de una suspensión de

glóbulos rojos con un hematocrito del 2% (para esto se utiliza RPMI con suero o plasma al

20%), y una parasitemia del 1 % (los parásitos deben estar en estadio anillo en su mayoría,

no se toman en cuenta los otros estadios), luego se añadió un volumen similar de las

concentraciones seriales de las drogas, esta placa se incubó a 37 "C por el lapso de 48

horas en Candle Jarr.

5.4.5.3 PREPARACiÓN DE REACTIVOS QUíMICOS

Para la preparación de la saponina al 0,08%, se disolvieron 0,2 g de esta en 250 mi de PBS

con un pH 7,4, el guanidinium HCI 6 M, se preparó disolviendo 57,32 9 de guanidinium HCI

en 100 mI de una solución de acetato de sodio 0,1 M del Tampón TNE.

El reactivo fluorométrico, fue el que mayores cuidados tuvo en cuanto a su preparación,

debido a los peligros que posee el reactivo en sí, el manejo fue con todas las medidas de

seguridad posibles, en este proceso se disolvió Hoechst 33258 en agua bidestilada, para

alcanzar una concentración de 1 mg/ml, para luego mezclar 33 ~I de esta solución madre de

Hoechst 33258 con 100 mI del Tampón TNE.

5.4.5.4 MÉTODO

Luego que la placa de 24 alveólos fue incubada, se pipetearon 0,42 mI de cada pozo de la

placa a un Tubo Eppendorf de 2 mI, agregándose luego la misma cantidad de saponina al

57

David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental- IIFB - Uf\1~6

0,08% para mezclar ambos. Luego se centrifugó durante 3 minutos a 15 800 g,

inmediatamente después de que la lisis de los glóbulos rojos se haya completado,

posteriormente se eliminó el sobrenadante y se trabajó con el sedimento disolviéndolo

nuevamente en 50 ¡.JI de Guanidinium HCI 6 M en acetato de sodio pH 5,5, cuidando de que

el volumen sea el mismo en todos los tubos.

Luego se añadieron 2 mI del reactivo fluorométrico y 50 ¡.JI de una solución de

cloroformo/alcohol isoamílico (24:1), para mezclar todo y centrifugar a 15 800 g por el tiempo

de un minuto. Luego se transfirió este volumen a una cubeta efel fluorómetro y se midió la

fluorescencia del Hoechst 33258, posteriormente se procedió a calcular los porcentajes de

inhibición y los ICso correspondientes de la misma manera que en los anteriores métodos.

58

DavidGutiérrez Yapu Area de QuimioterapiaExperimental- IIFB - UMSA

6. RESULTADOS Y

DISCUSIONES

59

David Gutiéfrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA

6.1 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMALÁRICA DE PRODUCTOS

SINTÉTICOS Y NATURALES POR EL MÉTODO VISUAL

Se realizaron las pruebas de evaluación de la sensibilidad in vitre de 326 productos,

sintéticos y naturales, sobre el Plasmodium falciparum, procedentes de Salamanca (50

productos), Chife (10 productos), Guatemala (30 productos), Colombia (70 productos),

Argentina (6 productos), México (68 productos), Perú (40 productos) y Bollvia (52 productos);

haciendo totales parciales de 50 productos sintéticos y 276 productos naturales.

De todas estas pruebas se pudo seleccionar 56 productos activos, siguiendo los siguientes

criterios de valoración en cuanto a ICso :

Activo

Inactivo

<

>

10 ~tg/ml

10 ).lg/ml

ICso de Difosfato de Cloroquina: 0,02 )lg/ml (34 nM)

6.1.1 SALAMANCA - PRODUCTOS SINTÉTICOS

Estos productos corresponden al Departamento de Química Farmacéutica de la Facultad de

Farmacia, dependiente de la Universidad de Salamanca, corresponden a modificaciones

quimicas de estructuras preestablecidas. Luego de realizadas las pruebas de sensibilIdad

sobre las cepas correspondientes, se pudieron obtener los valores de ICso correspondientes

a los 50 productos, los cuáles se encuentran en el Cuadro 9 del Anexo 4 y la Tabla 4, la que

nos presenta los productos activos solamente.

60

David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental - /lFB - UMSA

Tabla 4. Evaluación de la actividad in vitro de Derivados Sintéticos realizados en la

Universidad de Salamanca, sobre cepas de Ptesmodium faiciparum F32

N° código

1

leso I Actividad Iuglml I I

1 F-10S1 I 3,9 ACTIVO2 F-1071 I 5 ACTIVO3 F-l0Bl ! '" -, ACTiVO.:>,f

4 F-l091 3,1 ACTIVO5 1-1070 1,9 I ACTIVO6 1-1090 0,18 ACTIVO7 1-21020 0,05 ACTIVO8 1-21060 0,49 ACTIVO9 1-21070 0,07 ACTIVO10 1-21080 S ACTIVO11 1-21090 0,02 ACTIVO12 E-lOSO 4,8 ACTIVO13 F-210S1 3,3 I ACTIVO14 F-21091 10 ACTIVO15 F-1S0S1 10 ACTIVO16 \-21110 0,59 ACTIVO17 1-1020 0,03 ACTIVO18 1-1020i 0,3 ACTIVO19 1-1100 0,03 ACTIVO20 1-1080 0,3 ACTIVO

De acuerdo a lo observado, podemos apreciar que existen 20 compuestos activos y 30 que

resultaron inactivos (Ver Cuadro 9 del Anexo 4), entre estos 20 que resultaron ser activos

podemos apreciar que 4 (1-21020, 1-21070, 1-21090 e 1-1020), poseen unos valores muy

similares a los de la sustancia patrón como es la Cloroquina, por lo que pueden ser

considerados de gran importancia e interés, así mismo los demás que también presentan

actividad son compuestos que pueden ser tomados en cuenta para estudios posteriores.

Todos estos corresponden a modificaciones en cuanto a la estructura molecular tal como se

presenta en los Anexos correspondientes.

61


6.1.2 CHILE· PRODUCTOS NATURALES

Área de Quimioterapia Experimental - IlFB - UMSA

Los productos corresponden al Laboratorio de Productos Naturales, dependiente de la

Universidad de Antofagasta, Antofagasta-Chile, estos productos corresponden a

diterpenoides aislados de especies de Azorella compacta.

Se determinó la ICso de 10 productos naturales, mediante los ensayos de sensibilidad,

apreciándose los resultados de los productos activos en la Tabla 5, y los resultados totales

en el Cuadro 10 del Anexo 4.

Tabla 5. Evaluación de la activldad in viiro de Dtterpenoides alslados de especies de

Azorella compacta, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32

N° I Código I IC50 ActividadI ug/rnl

1 Y-6 5 ACTIVO2 Mc-E 0,4 ACTIVO

De acuerdo a los resultados presentados, se aprecia la actividad de dos productos, Y-6 YMc

E (Figura 20), los cuales corresponden a estructuras mostradas en los Anexos . De ambos,

el producto Mc-E es el que presenta mucha mayor actividad y se convierte en el más

atractivo para estudios posteriores.

62

DavidGutiérrez Yapu /vea de Quimioterapia Exnerimental>- HFB - UMSA

Figura 20. Estructuras de Productos activos procedentes de Chile

C20HJ,40 z

M= 306

Y-6

CZZH320 S

M =392

Mc-E

6.1.3 GUATEMALA - PRODUCTOS NATURALES

Estos productos son extractos de plantas recolectadas de la flora guatemalteca, debido a

que se les atribuye cierta actividad antifúngica y antiparasitaria, fueron preparados en función

a órganos seleccionados (Cuadro 3 del Anexo 3), a estos productos también se fes hizo las

pruebas de sensibilidad con las cepas correspondientes otorgándonos los resultados

presentados de los productos activos en la Tabla 6, y los resultados generales en el Cuadro

11 del Anexo 4.

Tabla 6. Evaluación de la actividad in viiro de extractos de plantas procedentes de

Guatemala, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32

N° I Código Especie ICso Actividadug/ml

1 GUA-0311 iPiper ama/ago 9,4 ACTIVO2 GUA-0312 Senecio salignus 2,9 ACTIVO

63


De acuerdo a los resultados presentados, podemos apreciar que dos especies de plantas

recolectadas en Guatemala tienen carácter activo, el Piper amalago con un leso de 9,4

I-lg/ml y el Senecio salignus, con un IC50 menor al anterior, cuyo valor es de 2,9 I-lg/ml. Estas

dos especies, resultan ser tomadas en cuenta para estudios posteriores como ser el

fraccionamiento adecuado y encontrar los principios activos responsables de esta acción.

Si bien los valores no son similares a la Cloroquina, estos puedes ser comparados con otras

sustancias patrón, que resultan ser extractos crudos de especies con actividad sobre el

Plasmodium fa/ciparum, estos son la Cinchona officinalis y la Cinchona pubescens cuyos

valores de ICso son 4,2 y 1 I-lg/ml respectivamente. Con estos nuevos parámetros podemos

afirmar que la actividad es aceptable para la continuación de los nuevos estudios.

6.1.4 COLOMBIA - PRODUCTOS NATURALES

Estos productos corresponden a extractos etanólicos de plantas, de acuerdo a órganos

seleccionados que se detallan en los anexos, así como también de fracciones de algunas

plantas colombianas, que fueron evaluadas de acuerdo a características anteriormente

señaladas, probando la sensibilidad de Plasmodium fa/ciparum frente a estas. Los resultados

de los productos activos se presentan en la Tabla 7, y los resultados generales en el Cuadro

12 del Anexo 4.


Colombia, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32

N° Código Especie ICso ActividadJJg/ml

1 C6 Piper barbatum L. 6,9 ACTIVO2 D6 Piper umbellatum L. 10,2 ACTIVO3 E 12 Annona muricata 10,1 ACTIVO4 18 Chromolaena leivensis 5,4 ACTIVO5 J6 Calea peruviana 19 ACTIVO6 L3 Miconia buxitoiie 15 ACTIVO7 N3 Miconia so 7,3 ACTIVO8 CO-221 fr01 Piper barbatum H.B.K. 2,1 ACnVO9 CO-243 fr01 Bocconia integrifolia

Humb & Bonpl 9 ACTIVO

64

David Gutíérrez Yapu Área de Quimioterapia Experiment,l- IIFB - UMSA

Estos extractos presentaron una mayor cantidad de productos activos en un tamizaje inicial,

pero lamentablemente se pudo apreciar que esta actividad presentada inicialmente poco a

poco fue desapareciendo, por esta razón es que se obtuvo un número menor de productos

activos, los cuales corresponden a las especies Piper barbatum L., Piper umbellatum L.,

Annona muricata, Chromo/aena leivensis, Ca/ea peruviana, Miconia buxifo/ia, Miconia sp,

Piperbarbatum H.B.K y Bocconia integrifo/ia Humb & Bonpl (Frutos).

Debido a esta característica, se tomaron en cuenta a dos especies Ca/ea peruviana y

Miconia buxifo/ia, como activos aun cuando presentaron valores de ICso por encima del

límite, de 19 y 15 Ilg/ml respectivamente, esto con la intención de verificar que una vez

realizadas las purificaciones y aislamientos correspondientes estas actividades aumenten.

De estas especies, Ca/ea peruviana y Miconia buxifo/ia son las que presentaron una

disminución leve en cuanto a su actividad, por lo que se los consideró como moderadamente

activos, pero podrían tener componentes activos dentro de sus componentes, sobre los

cuáles se podría trabajar.

Las demás especies presentan valores de ICso relativamente altos en comparación a los

productos naturales que nos sirven de comparación como son las especies de Cinchona,

pero son incluidas por estar en el límite aceptable de actividad.

6.1.5 ARGENTINA· PRODUCTOS NATURALES

Estos productos pertenecen a la Universidad de Rosario - Argentina y corresponden a

extractos con diferentes solventes y distintos órganos de las plantas como se aprecian en los

anexos, los cuales también fueron evaluados para determinar la sensibilidad del P/asmodium

fa/ciparum hacia estos.

El número de productos activos, que se pudo apreciar fue de cero, ya que ninguno presentó

un porcentaje de inhibición de la maduración de esquizontes considerable (Cuadro 13 del

Anexo 4), por lo tanto no fue necesario realizar los cálculos de ICso.

65


6.1:6 MÉXICO - PRODUCTOS NATURALES


Estos productos también corresponden a extractos de especies vegetales colectadas en

México, los cuáles también fueron evaluados de manera similar a los anteriores, con los

siguientes resultados de los productos activos (Tabla 8), Jos resultados totales se muestran

en el Cuadro 14 del Anexo 4.

Tabla 8. Evaluación de la actividaó in viiro de extractos de plantas procedentes de

México, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32

N° Código IC 50 Actividadproducto J.Ig/ml

1 MX-14 3,1 ACTIVO2 MX-26 2,2 ACTIVO3 MX-27 0,2 ACT1VO4 MX-28 0,13 ACTIVO5 MX-71 5,8 ACTIVO

Estos productos, también poseen los resultados tanto positivos como negativos, de los

cuáles podemos mencionar que todos los productos positivos presentan valores muy

cercanos y más aun algunos presentan valores menores a los de los controles como son las

especies de Cinchona, por lo que un posterior estudio de estas será de gran importancia en

un futuro no muy lejano. Estos estudios se basarán sobre todo en el fraccionamiento de esta

especies vegetales para encontrar el o los principios activos responsables de esta tan

importante actividad.

6.1.7 PERÚ - PRODUCTOS NATURALES

Los mencionados productos procedentes del Perú, forman parte de una colecta de especies

vegetales en la amazonia peruana, trabajo realizado por la Universidad Nacional de la

Amazonía Peruana, mediante la facultad de Farmacia Química y Bioquímica, realizándose la

preparación de los extractos en diferentes solventes y de acuerdo a los órganos de estas

plantas tal como se puede apreciar en las tablas correspondientes a los anexos.

66

David GutiérTez Yapu Area de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA

Todas estas también fueron evaluadas de manera similar a las anteriores con los resultados

de los productos activos presentados en la Tabla 9 y los resultados generales en el Cuadro

15 del Anexo 4.

Tabla 9. Evaluación de la Actividad in viiro de extractos de plantas procedentes de

Perú, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32

N° Órgano Especie le 50 ActividadIJg/ml

1 Hojas Crescienta cujete 3,4 ACTIVO2 Madera 1 ZI IAspidosperma rigidum 4 ACTIVO3 Corteza 1 ZI IAspidosperma rigidum 9 ACTIVO4 Hojas IBixa oreJ/ana 3,9 ACTIVO5 Raíz 3 ZNI IAspidosperma rigidum 10,1 ACTIVO6 Flores Psychotria poeppigiana 5,4 ACTIVO7 Hojas Remijia peruviana (CHC/3) 1,4 ACTIVO8 Hojas Remijia peruviene (EtOH) 0,08 ACTIVO9 Hojas Remijia peruviene (Hex) 0,18 ACTIVO

En el análisis de los resultados presentados por estos extractos podemos apreciar la

existencia de 9 productos con valores de ICso considerables en relación a los patrones

conocidos de la Cínchona, estos valores son muy próximos a los de los productos patrón, por

lo que un estudio con mayor profundidad de estos vendría a ser de gran ayuda en un futuro.

El estudio ahora se basará en un fraccionamiento de estas especies, tratando de encontrar el

principio activo de estas.

6.1.8 BOLIVIA - PRODUCTOS NATURALES

Estos productos pertenecen a un estudio ya establecido sobre la actividad antimalárica de

extractos de plantas procedentes de las etnias Guaraníes, de donde se preparó el extracto

etanólico de una de las plantas con mayor actividad como es el So/anum argentinum, y luego

de heber evaluado a este en experiencias anteriores, proporcionándonos un ICsa de 0,42

llg/ml, se procedió a su fraccionamiento y un subfraccionamiento por métodos de

Cromatografía Líquida al vacio y Cromatografía en Columna respectivamente, con sistemas

de efusión diferentes los cuales estan detallados en el Cuadro 8 del Anexo 3, de donde se

67

David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental - IIFB- UMSA

obtuvieron un total de 52 fracciones y subfracclones que fueron evaluadas de la misma forma

que los anteriormente señalados.

Los resultados de los productos activos se presentan en la Tabla 10 Y los resultados

generales en el Cuadro 16 del Anexo 4.

Tabla 10. Evaluación de la Actividad in vitro de fracciones de So/anum argentinum

procedentes de Bolivia, sobre cepas de Ptesmoüium faíciparum F32

N° Código IC 50 ActividadProducto IJgfml

1 F3 4,5 ACTIVO2 F4 1,3 ACTIVO3 F5 2,1 ACTIVO4 F3-7 2,1 ACTIVO5 F4-10 3,3 ACTIVO6 F4-12 2,1 ACTIVO7 F5-17 3,2 ACTIVO8 F5-18 5,8 ACTIVO9 S.argentinum 0,42 ACTIVO

De acuerdo a resultados expresados en [a tabla, en un primer fraccionamiento se obtuvieron

5 fracciones activas de 9 (F-3, F-4, F-S, F-8 y F~9), las cuales poseían valores de ICso

aceptables para continuar el estudio, lamentablemente no se pudo fraccionar más las dos

últimas por ser muy polares, ya que fueron eluidas con acetato de etilo, en cuanto a las tres

primeras al ser fraccionadas nuevamente, pudimos obtener un total de 42 subfracciones.

De estas 5 tuvieron una actividad considerable en relación a nuestros productos patrón, de

los cuales se escogió la fracción F3-7 por ser la más activa con una actividad mayor a la que

tenía cuando aún no la habíamos fraccionado, además que las otras fracciones van

perdiendo su actividad a medida que vamos fraccionando estas; se escogió esta fracción

para elucidar su estructura.

68

David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental- I/FB - UMSA

6.2 EVALUACIÓN DE LA SENSIBILIDAD in vitro DE P. falciparum A LAS

DROGAS: ESTANDARIZACiÓN DE PARÁMETROS DEL MÉTODO

BIOQUíMICO (PRUEBA in vitro DE LA LACTATO DESHIOROGENASA

PARASITARIA)

Se viene dando hace algunos años atrás un estudio sobre la Lactato deshidrogenasa del

Plasmodium (pLDH) como un método de detección y cuantificación del crecimiento del

parásito en cultivos in vitre, empleando diferentes técnicas (Makler M.T.et al. 1998).

Todo comenzó cuando se pudo determinar que la actividad de la Lactato deshidrogenasa

parasitaria (pLDH) es distinguible de la LDH del huésped usando 3-acetil piridina adenina

dinucleótido (APAD), análogo de la nicotinamida adenina dinucleótido (NAO). (Makler M.T.et

al, 1993), también se estableció este método para diagnóstico de malaria empleando

anticuerpos monoclonales (Piper R. et al. 1999)

En cuanto a su aplicación en los cultivos in vitre, la LDH parasitaria puede ser detectada en

el estadio anillo como en el trofozoito. La pLDH y la LDH de los glóbulos rojos, emplean NAO

para la transformación de lactato en piruvato, pero solo la pLDH tiene la capacidad de utilizar

el APAD, el incremento de la LDH está en relación directa con la densidad parasitaria,por lo

tanto la detección de esta enzima puede ser utilizada como marcador de P. falciparum.

En presencia de la coenzima APAD, la detección de la LDH es específica de la enzima

parasitaria y su medición permite la evaluación de la intensidad parasitaria en el cultivo, la

evaluación de la actividad de la LDH se basa en la reacción bioquímica que conduce a la

formación de piruvato a partir de la L-Jactato en presencia de la LDH parasitaria y de la

coenzima APAD. Esta reacción lleva a la formación de APAD reducida que en su momento

reduce NBT (Nitro Blue Tetrazolium) formando un derivado formazán azul, detectable a 650

nm. (Deharo y col. 2000)

Esta técnica fue desarrollada en algunos sitios de investigación, como un medio alternativo al

convencional como es el de la lectura de frotis, con buenos resultados, ya que una

comparación con otros métodos específicos como son el anteriormente mencionado y el

método radioisotópico, estos se encuentran en relación directa.

69

David GutiérrezYapu Área de Quimioterapia Experimental - I/FB - UMSA

En el presente trabajo, se desarrollaron los parámetros necesarios para poder adoptar esta

técnica, y así poder alivianar el trabajo que demanda la lectura de frotis, esto lo realizamos

siguiendo los pasos descritos a continuación:

• Preparación de los reactivos necesarios

• Realización de la prueba con Patrones posfívos (Cloroquina) y patrones negativos

(RPMI)

• Realización de la prueba con solución Patrón a diferentes concentraciones y

patrones negativos

• Realización de la prueba con extractos sintéticos y naturales seleccionados por la

disponibilidad de muestra y por su actividad (positivos y negativos).

• Cálculo de los porcentajes de inhibición y valores de leSO, si correspondiera.

En una primera fase al trabajar solo con patrones, se verificó la existencia o no de diferencias

en cuanto a las lecturas de absorbancias, lo que nos permitió tener clara la idea de la

diferencia numérica que existía entre estos dos puntos extremos.

Luego se procedió a realizar la prueba de sensibilidad aplicando el método bioquímico,

tomando en cuenta a extractos con ambos tipos de actividades tanto positivo como negativo,

estos productos son procedentes de la región boliviana, peruana, mexicana, productos

tomados como patrón como son las especies de Cinchona y la Cloroquina.

Posteriormente se procedió a calcular los porcentajes de inhibición de maduración de

esquizontes mediante fórmulas matemáticas, haciendo una comparación posterior con el

método visual que resultó ser nuestro control. (Cuadro 17 del Anexo 4)

De acuerdo a la tabla presentada y realizando una comparación con los resultados obtenidos

con ambas pruebas, apreciamos una relación directa entre los productos activos e inactivos,

con ligeras diferencias en cuanto a valores numéricos, siendo las diferencias más

significativas las que presentan las fracciones BMI 43 V2 que presenta unos porcentajes de

inhibición de 11,6% Y 44% en los métodos visual y bioqulmlco respectivamente, si bien estas

diferencias parecen ser muy altas, se mantienen en el rango de activos e inactivos,

asumiendo que el límite inferior para ser considerados activos es de 50%.

70

David Gutiérrez Yapu AJea de Quimioterapia Experimental - IlFB - UMSA

Los criterios de valoración en cuanto a ICso ,fueron los mismos que empleamos en el

Método Visual:

Activo < 10 Jl9/ml

Inactivo > 10 Jl9/ml

Posteriormente se realizaron los cálculos para hallar los valores de ICso correspondientes,

también por duplicado realizando la comparación de ambos métodos apreciándose los

resultados de la Tabla 11.

Tabla 11. Valores de IC 50 presentados por los productos en estudio por los métodos

Visual y Bioquímico

N° Extracto IC 50 (ug/ml) IC so (ug/ml)

Método Visual Método LDH

1 IBMIIF17 3,6 3,8

2 iBMlfF16 >10 >10

3 iBMIIF15 > 10 >10

4 BMI43V2 >10 >105 Remijia peruviene 4 4

6 Mx 11 3 I 1,8

7 Mx 71 > 10 > 108 Cinchona officínalis 4,2 4,9

9 Cinchonapubescens 1 4,5

10 boroquina 36 nM ! 39 nM

Con ayuda de esta comparación, podemos afirmar que los valores están en relación directa

por ambos métodos, ya que las diferencias numéricas no son altas, y menos aún, no se

contraponen en el sentido de resultar activo con un método e inactivo con otro.

Por estas razones podemos afirmar que el método alternativo bioquímico proporciona

resultados de similar manera a el método convencional que es el Visual.

71


6.3 EVALUACIÓN DE LA SENSIBILIDAD in vitro DE P. falciparum A LAS

DROGAS: ESTANDARIZACiÓN DE LOS PARÁMETROS DEL MÉTODO

FLUOROMÉTRICO

El procedimiento no requiere reactivos o equipos sofisticados, y puede ser completado en un

lapso de tiempo muy corto. siendo de gran ayuda en pruebas con un gran número de

muestras a ensayar. El ensayo es altamente sensible, según los estudios que se realizaron

con Cloroquina, y la evaluación de la intensidad de fluorescencia en diferentes estadios

parasitarios. (Smeijsters et al, 1996)

Los métodos de cuantificación de DNA están normalmente basados en medidas

espectrofotométricas, siendo uno de los colorantes más empleados el Bisbenzimide H33258

(Hoechst), esto debido a que las medidas por métodos f1uorométricos, tienen mucha más

sensibilidad . Además de este colorante, también existen otros como el Pico Green el cual

fue empleado como reactivo específico en [a cuantificación de DNA en muestras de tierra

(Sandaa et al, 1997).

A nivel de la determinación de la susceptibilidad de drogas sobre Plasmodium faIciparum ,

los trabajos comenzaron con éxito al realizar análisis de la intensidad parasitaria en

diferentes estadios, por medio de cultivos sincronizados, y verificando la actividad de la

Cloroquina, en estos ensayos los resultados son altamente específicos, todo esto con el

reactivo Hoechst 33258 cuya sensibilidad es del orden de los nanogramos.

Es necesario mencionar que este fundamento ya fue aplicado con éxito en Panamá,

empleando el Pico Green como colorante, cuyo fundamento es similar al del Hoechst 33258,

este método fue usado para determinar la inhibición del crecimiento parasitario y los valores

de concentración inhibitoria del 50% que fueron reportados frente a diversos agentes

antímaláricos. (Corbett et al, 2004)

Este método basado en la determinación de la fluorescencia del f1uorocromo Hoechst 33258

- ADN de Plasmodium falciparum, se realizó en placas de 24 alvéolos en Jos cuales el

parásito fue confrontado con extractos y drogas patrón a diferentes concentraciones, al ser

el número de parásitos. evidenciado por conteo visual, directamente proporcional a la

72

iavid Gutiérrez Yapu kea de Quimioteraoia Experimenta! - IIFB - UMS~

.antldad de DNA de los mismos, la concentración inhibitoria del 50% puede ser determinada

I través de la cuantificación de ADN presente al terminar el ensayo biológico. (Deharo et al ,

!OOO)

:specíficamente en este ensayo se siguieron parámetros establecidos en experiencias

mteriores y se adaptaron estos de acuerdo a el material existente en el laboratorio,

ealizándose las pruebas respectivas, de manera similar a la prueba bioquímica, tomando en

:uenta compuestos naturales, activos e inactivos, y compuestos patrón con valores

sstablecdos previamente.

)e la misma forma primeramente se establecieron valores como son los porcentajes de

nhibición a diferentes concentraciones, y realizando una comparación con el método

xmvencional como es el visual y el método desarrollado recientemente, el Bioquímico

nediante la LDH, estableciéndose los resultados en el Cuadro 18 del Anexo 4.

:;on los resultados apreciados, podemos determinar que los valores al igual que en el

anterior método, tienen gran relación que tiene que ser considerada muy importante ya que

nantiene el vínculo de la actividad, es decir los tres métodos reportan resultados

::onsiderados como activos e inactivos simultáneamente.

.os criterios de valoración en cuanto a ICSO ,fueron los mismos que empleamos en el

Vlétodo Visual:

Activo < 10 Jlg/ml

Inactivo > 10 ).lg/ml

t.os valores no llegan a ser exactos pero se guarda una cercanía en estos, lo que nos

oroporciona cierta exactitud en los tres métodos, y especialmente en el Fluorométrico que

venimos desarrollando. Con todos estos parámetros. se procedió a realizar los cálculos

::orrespondientes para determinar los valores de ICSO que se detallan a continuación en la

Tabla 12.

73

David Gutiérrez Yapu !vea de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA

Tabla 12. Valores de leso presentados por los productos en estudio por los métodos

Visual, Bioquímico y Fluorométrico

N° Extracto IC 50 (ug/ml) IC 50 (ug/ml) IC 50 (ug/ml)

Método Visual Método LDH Mét.FluorométricoI

>10 > 10 >101 ¡Mx 712 !SMIIFI6 >10 >10 > 103 Cmchonapubescens 1 4,5 5,84 Cinchona officinalis 4,2 4,9 7,15 !Cloroquina 36 nM 39 nM 15 nM

Estos valores nos demuestran la confiabilidad que posee el método desarrollado, el

Fluorométrico, ya que los valores están catalogados en el rango de actividad establecido

anteriormente, ya que realizando una comparación entre los tres no se puede negar que los

valores representan actividad.

Además, el método f1uorométrico proporcionó valores que diferencian los activos y los

inactivos por lo tanto se convierte en un método confiable.

74

David Gutiérrez Yapu ÁreadeQuimioterapia Experimental - IIFB - UMSA

7. CONCLUSIONES

75


En el presente trabajo se llevaron a cabo dos aspectos fundamentales, el ensayo de

quimiosensibilidad en productos sintéticos y naturales, e! desarrollo de dos nuevas técnicas

de evaluación de la sensibilidad del Plasmodium falciparum como son el Método Bioquímico

(mediante la reacción de la Lactato deshidrogenasa) y el Método Fluorométrico.

En cuanto al primer aspecto, se evaluaron un total de 326 productos evaluados, de los

cuales 60 eran sintéticos y 266 naturales procedentes de diferentes lugares, de todos estos

34 productos naturales resultaron ser activos contra 232 que resultaron ser inactivos, lo que

proporcionalmente nos da a lugar un 12,78% de extractos activos.

Estos extractos serán sometidos a nuevos procesos ya sea de' purificación o

fraccionamiento, para obtener el o los componentes que proporcionan a estos su actividad,

esto va en relación a todo trabajo realizado con especies vegetales como nuevas alternativas

contra la malaria.

En cuanto a los productos sintéticos, 22 resultaron contar actividad contra Plasmodium

falciparum, lo que representa un 36,66% del total de productos sintéticos, la diferencia de la

relación porcentual en cuanto a los productos naturales, se debe a que estos productos

sintéticos son en su mayoría derivados de compuestos reportados como activos

anteriormente, por lo que existe mayor posibilidad de encontrar actividad en estos que en los

otros.

Los productos sintéticos, serán sometidos a nuevas pruebas, como ser la toxicidad para

poder determinar nuevos aspectos muy importantes en cuanto al estudio de estos productos.

Las fracciones serán nuevamente evaluadas para determinar además si la actividad se

mantiene o no, todo este proceso se llevará a cabo en los lugares de procedencia y serán

evaluadas en el Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, La Paz - Bolivia.

Como parte del segundo aspecto que era el desarrollo de nuevas técnicas in vitro para

determinar la sensibilidad de Plasmodium telcipetum a diferentes productos, tenemos el

Método Bioquímico que se basa en la reacción de la Lactato deshidrogenasa parasitaria, el

cual fue llevado a cabo con éxito ya que se pudo verificar la aplicabilidad de este método

76


debido a que los resultados presentados, se encuentran en el mismo rango que los

obtenidos con el método control como es el visual.

En este desarrollo se emplearon diversos productos con actividad predeterminada y

productos que no tenían reportes sobre si eran activos o no; se procedió a evaluar estos con

ambos métodos tratando de encontrar valores similares, los resultados fueron aceptables,

pues en productos con actividad desconocida como eran los productos BMIIF17, BMIIF16 Y

. BMIIF15, se pudo apreciar que el primero poseía actividad contra Plasmodíum falcíparum

con un ICso de 3,6 y 3,8 Jlg/ml por los métodos visual y bioquímico respectivamente, los otros

dos resultaron ser inactivos, con valores obtenidos con ambos métodos.

También se hicieron los ensayos sobre Jos productos que ya habían sido reportados como

activos anteriormente y de la misma manera los resultados que estos productos presentaron,

fueron activos para la Remijía peruvíana, el producto Mx 11 y las dos especies de Cínchona,

e inactivo para el producto Mx 71.

Los resultados numéricos, tambíén se encuentran en el rango considerado como activos, por

lo tanto los resultados obtenidos por el Método Bioquímico mediante la reacción de la Lactato

deshidrogensa parasitaria, son considerablemente aceptables, para la determinación de la

actividad de productos contra Plasmodium fa/cíparum.

Esto puede ser comprobado mediante los resultados presentados en cuanto a porcentaje de

inhibición, donde se aprecian que valores considerados como negativos y positivos

presentan estos en ambos métodos, con ligeras variaciones en el valor numérico.

Las diferencias de los valores de ICso calculados no son considerables y por lo tanto se

encuentran en el rango de actividad correspondiente, esto nos proporciona muchas ventajas

sobre el anterior método empleado en relación al tiempo empleado para realizar las pruebas,

ya que con este método no necesitamos más de 90 minutos para poder determinar valores

que visualmente nos tomarían días, siendo además su rendimiento casi del 100%.

77


En cuanto al segundo método que fue desarrollado en este trabajo, el Método Fluorométrico,

que se basa en la determinación de la fluorescencia del fluorocromo Hoechst 33258 - ADN

de Plasmodium falciparum se tomaron en cuenta todos los parámetros con el mayor cuidado

posible, pues el trabajo con DNA así lo demanda.

También se tuvo el cuidado de realizar las pruebas con productos con actividad positiva

como negativa, verificada anteriormente, además que se hizo la prueba con los productos

por triplicado, tomando como métodos control, el Visual y el Bioquímico desarrollado

anteriormente.

Una vez que se realizaron las pruebas correspondientes, se calcularon los valores de los

porcentajes de inhibición y estos se encontraban con valores diferentes pero dentro de los

rangos establecidos como activos e inactivos, por lo tanto estos resultados son confiables.

Nuevamente se demostró que aquellos productos inactivos como son el producto Mx 71 y el

BMIIF16, nuevamente presentaron esta falta de actividad luego de hacerse el ensayo con el

método Fluorométrico, y de manera similar, los productos con actividad demostrada,

volvieron a presentar estos resultados con el nuevo métododesarrollado.

Una vez que se calcularon los valores de leso se aprecia una diferencia más notable que en

el método bioquímico, pero aun se mantiene en los rangos aceptables de actividad, por lo

que podemos afirmar que el método desarrollado es considerablemente aceptable.

Este método también presenta una gran ventaja sobre el convencional que es el visual, ya

que puede ser realizado en 30 minutos, a diferencia del anterior que demanda un lapso de

tiempo mucho mayor, presentando además una gran efectividad en cuanto a resultados.

Ambos métodos, el Bioquímico y el Fluorométríco, presentaron resultados que comparados

con el convencional, el visual, son completamente aceptables y confiables para continuar el

trabajo que se viene realizando, aplicando estos métodos el tiempo que se necesitaría para

obtener resultados confiables sería disminuido de gran manera, contando además que los

equipos empleados no son altamente sofisticados y los reactivos no son difíciles de

co~seguir.

78


Este problema del tiempo surge a raíz de la gran demanda de resultados debido a la gran

cantidad de productos en estudio, con la aplicación de estos dos nuevos métodos, se tendría

la posibilidad de cubrir toda esta demanda y continuar con el trabajo establecido, teniendo

como pilar fundamental el de contar con tres diferentes métodos que validarían nuestro

trabajo.

79


8. RECOMENDACIONES

80


Es necesario mencionar que el tamaño de muestra empleado para este trabajo, no es

significativo, por lo que necesitamos continuar con el mismo, tomando en cuenta un mayor

número de estas, verificando siempre sus actividades por los tres métodos, teniendo en

cuenta siempre que los resultados obtenidos fueron alentadores

También es necesario realizar un trabajo sobre la influencia del color del producto a evaluar,

sobre la actividad que presenta, para determinar si este es un factor negativo en las lecturas

calorimétricas que se hacen.

Una última recomendación es la de realizar un seguimiento biodirigido, a través de un

fraccionamiento cromatográfico de especies seleccionadas, mediante una comparación de

los tres métodos empleados.

81

DavidGutiérrez Yapu Áreade Quimioterapia Experimental- IIF6 - UMSA

,.

9. BIBLIOGRAFIA

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125. Wu, Y.; Chen, H.; Yiang, K.; Li, Y.; Shan, F.; Wang, D. y Wang, Y. Interaction of

biomolecules with qinghaosu (artemisinin) and its derivatives in the presence of

ferrous lon-an exploration of antimalarial mechanism. Chemistry Pure Applicate.

1999.71 (6): 1139-1142

126. Ziegler, H.; Staerk, D.; Christensen, J.; Hviid, L.; Haqerstrand, H. y Jaroszewski, J. In

vitro Plasmodium falciparum Drug Scnsitivity Assay: Inhibition of Parasite

Growth by Incorporation of Stomatocytogenic Amphiphiles into the Erythrocyte

Membrane. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2002. Vol 46 N° 5. 1441-1446

94

David Guliérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA

10. ANEXOS

95


ANEXO 1:

Área de Quimioterapia I=xperimenl(}l - IIFB - UMc A

GRÁFICOS

Gráfico 1: Ultraestructura de Merozoito

Mi1Dchondnon

PI!lStid Mlcrtrtul\.Jles

== RibosomesMERozorre - Ttyee--dlmenslonal <Tg<r1l2abon 01a PJasmoaium tec o etum

merozoue, witll tne peMicle partly 0.1away lOsna.. me In!pmal srucnze.~~"_Vt... · """" ·""' I """-"~O' t.ty"""'IO·)LA "''U, '. ZSo ''-.U. IIlo~ ''Itdo '''' ''' OJl ''' ''l''""" I ~-"'G.-. " _.~ü.lf'c-_.-..1~"'''' p) . tl"I I I.C.~("' ) _"""' ~ L t...U ..... " ,_

Fuente: htt :llsit s.luji.ac.ilImalaria/maps/merozoi

Gráfico 2: Ultraestructura del estadio anillo

R0U9h EA GOIgi comotex(?)

h.html

Cylo>lorno

Plasmamemb<ane

Nud<>us

EXocy\lC vestcíes

Mltoct1lJoorlon

Free rlbo s.'lmeS¡'. ....-.:..to.. lf)' i.;col·"

RJNG STAGE - Three -<lirnenslona l rrganiZanon r:J a PJasmocJ;um fa lcíparumearly nrg sla ge. a cW- lIke rorrn In IhIS example Tne nos t reo 01000 cen(RBC)and pzrasüopnorous vacuoie rnemorane (PVM) are not sho;m. ER encoptasrmr reticulum

~l1ro-""_1yt.."'1! ~"J ...... 1 .,.p__.. t/ r·¿v \.Co-... I I( I. ) L !r.~ r. !L lLJh6l, tKD uoIC Jf ....,"b IO' ... . I~ . .. tlbon._.t~ll;,..__ ,...u'Lin-.l. hto... .J). j l 'J.I ) ).C.~u."\ ~..:-D .a

Fuente: http:// ites.huji.ac.il/maJaria/maps/ringstagepath.html

96

David Guliérrez Yapu Area de QL.imioterapia Experimental - "FB - UMSA

Gr ' fico 3: Ultraestructura d / Trofozoito

rree fOOsomes

TROPHOZOITE - MIll-trophOro r.e staqe 01Ptsstrootum 18.'c'P8run , charac", r!?plj ti)' ns Irregu"', IlJtllne.me íncresse In prolelr>-synmeslZlng appa-alUs, lncreaseo reeding tIlIDugh rnu nrue I)lOstomes, !T'lWttl alOle pigmeO!vacooie , and smxnras assoctateo Wltt1 e"POf101parasi!e frolelns (Golgl ooov, eJ<Ocytlcvesicles). ER - ercopiasmtc rettceturn

~""" "'_\,Io_II. a.-nt • ...-~ . .. ' _ ••o,r...... \4... 1l(1. 1 L..~ .. ~ f . e. lZ-~~' IW O !:. ..~ll ,.

1ofm.c..~. e;,.,. ... o-..._,..(Y~~,.,.•.r-..l~"" " '" fJ In~ )). t '~("""" l ..-.••~n _

Fuente: http://sites.h ji.ac.i Ima/aria/maps/trophozoi ath.htm/

Gráfico 4: Itraestruct a E qui nte

GOIgico"'"lo. nhoplry

SCHIZONT - OrganlZatlon al a P/asmodium lil f(;.'f'arum schlzonl l owards tre em al mal steqe ·~ :;-ra sRJ-~d RBCsmxture. lncludn g Maur",,"s oe ns (de' '9131"0 nere as lm g aro snot elens) aro serace knons 15oeoicted In meapex al eacn merozore tl l lj me aplcal organelles a-e deve' p .ano mnochonala ('7een) ano plast(ls(yellow)are m;grabng mto me buls ER - !'<ldOplasrmc rencuairn.

~~"-y _a~"''''~' '''. P-.''. lY f~ ....-. t(l'l La.a-n' '''.''-'' l...I.. .. _ ..IKIlr''''u.lGJI_'''I ''\O( m..-....o-. tr-. ..._ ••~~ü ....._~ra..¡",.. Pr_ I r'7-4I ).e.~(,.. ~ ..............lIo-.n. .. . ,"•• •

Fuente: http://sites.huji.ac .il/ma/aria/ma

97

David Gutiérrez y apu .Isss.-=,-d "~_ q'iimioterania Experimental - IIFa - MSA

Gráfico 5: Gráñco del tesmo dium tetcip tu , e tadio d esquizonte

Gráfico 6: Gráfico del PI smotiium telciperu m, estadía de anillo

'. :" ~'"

."

'- - ' . 'l' .

98


ANEXO 2: MATERIAL Y REACTIVOS

A) MATERIAL REQUERIDO PARA CULTIVO DE ESTADías INTRAERITROCITARIOS

DE P. falciparum

Material Biológico

• Cepa F32 de Plasmodium falciparum sensible a la c1oroquina (aislada en Tanzania)

• Glóbulos rojos humanos infectados (GRi) con P. falciparom

• Glóbulos rojos humanos no infectados (grupo sanguíneo compatible)

• Suero o plasma humano (compatible con el grupo sanguíneo de los glóbulos rojos

utilizados)

• Medio de cultivo RPMI 1640 (GIBCO 079-03018 A o SIGMA R-4130, con HEPES 25

nM, L-glutamina 300 mglJ y glucosa 2 g)

Material de plástico y de vidrio

• Cajas Petri de diámetro 100 mm, 60 mm y 35 mm

• Criotubos de 2 mI

• Filtros Millipore de 0,22 prn

• Frascos de cultivo de 25 cm2 de cuello inclinado

• Guantes de látex

• Jeringas estériles de 10 mi

• Matraces Erlenmeyer de 1000 mi

• Micropipetas de 200-1000 !JI



• Micropipetas multicanal 50-200 !JI

• Microplacas de cultivo de 96 alveólos de fondo plano estériles

• Pipetas Pasteur

• Pipetas volumétricas estériles de 1, 2, 5 Y10 mi

• Portaobjetos

• Puntas amarillas de 5-200 !JI

• Tubos de centrífuga de 15 mi

99


• Tubos de centrifuga de 50 mi

• Tubos Eppendorf de 1,5 mi

Reactivos químicos

• Agua bidestilada desionizada

• Antibióticos (Gentamicina, Cloranfenicol)

• Anticoagulante ACD (Citrato Dextrosa) (Sigma C-3821)

• Bicarbonato de sodio anhidro p.a. (NaHC03)

• Cloruro de sodio p.a. (NaCI)

• Colorante Giemsa (Merck 0-61 9203)

• Dextrosa (O-glucosa) p.a. (Sigma 0-6152)

• Glicerina bidestilada

• Metanol p.a. (CH30H)

• Fosfato diácido de potasio (KH2P04)

• Fosfato ácido de sodio (Na2HP04)

• Sorbitol p.a.

Equipos

• Autoclave (Al! American Modelo H79-ICE)

• Baño Maria (Grant Instruments CB2 SaZ)

• Campana de flujo laminar (Securiplus PSM Modelo 514 24)

• Candle Jarr (Desecador con llave, permite bajar la tensión de oxígeno hasta 17%)

• Centrifugadora (Jovan CR 3i)

• Estufa básica para cultivo (Forma Scientific Modelo 3192)

• Microscopio (Wild Leitz GMBH Tipo: 020-503-030)

• Potenciómetro (Sigma 237, 940-9)

• Agitador Magnético (Barnstead/Lab-Line 1999)

• Congelador (Revco Scientific Modelo 3192)

• . Pipeta Automática (Drummond Scientific Co.Broomell, PA 19008)

• Refrigerador (DLG GR-2525VF)

• Vortex (Scientific Industries, INC Modelo G-560E)

100


B) MATERIAL REQUERIDO PARA LA SINCRONIZACiÓN DE CULTIVOS in vitro DE

P. falciparum

Reactivos y material biológico

• Cultivo de Plasmodium falciparum

• Solución de O-sorbitol al 5 %

• Material utilizado en adaptación y mantenimiento de cultivos de P. falciparum

C) MATERIAL REQUERIDO PARA LA EVALUACiÓN DE LA SENSIBILIDAD in vitro

DE P. falciparum A LAS DROGAS: MICROMÉTODO VISUAL

Material y reactivos

• Tubos de hemólisis de vidrio de 5 mi (Fisher A 14 720 121)

• Tubos Eppendorf de plástico

• Microplacas de titulación de 96 alveólos de fondo plano estériles (Tipo Nunción)

• Oimetil sulfóxido (OMSO) (Sigma 0-5879)

Equipo

• Micropipetas multicanal 50-200 ¡JI

• Micropipetas de 10-200 ¡JI, 50-200 ¡JI Y200-1000¡J1

• Ultrasonicador

101


D) MATERIAL REQUERIDO PARA LA EVALUACiÓN DE LA SENSIBILIDAD in vitro

DE P. falciparum A LAS DROGAS: MÉTODO BIOQuíMICO (PRUEBA in vitro DE

LA LACTATO DESHIDROGENASA PARASITARIA)


• Utilizar el mismo material indicado en los anteriores puntos para el mantenimiento de

cultivos in vitro y la prueba de la sensibilidad

• APAD (3-acetilpiridina adenina dinucleótido)

• L-lactato

• NBT (Nitro Blue Tetrazolium)

• PES (Phenazine Ethosulfate)

• Tampón TRIS (Tris hydroxymethyl aminomethane)

Equipo

• Micropipetas multicanal 50-2001-11

• Micropjpetas de 10-200 ¡JI, 50-200 1-11 Y 200-10001-11

• Espectrofotómetro (Awareness Technology Inc. Stat Fax - 2100)

E) MATERIAL REQUERIDO PARA LA EVALUACiÓN DE LA SENSIBILIDAD in vitro

DE P. falciparum A LAS DROGAS: MÉTODO FLUOROMÉTRICO


• Utilizar el mismo material indicado en los anteriores puntos para el mantenimiento de

cultivos in vitro y la prueba de la sensibilidad

• Placas estériles de 24 pozos

• Tubos Eppendorf de 2 mi

• Acetato de sodio

• ADN de timo de bovino (para calibrar el f1uorómetro)

• .Alcohol isoamílico

102

DavidGu'tiérrez Yapu

• Cloroformo

• Cloruro de sodio p.a.

• EDTA Na2-2H20

• Guanidinium HCI

• Ácido Clorhídrico

• Hoechst 33258

• Hidróxido de sodio

• Saponina

• Tris HCI

Equipo

• Micropipetas de 10-200 !JI, 50-200 !JI Y 200-1 OOO!JI

• Fluorómetro tipo Hoefer DyNA Quant 200 (Amersham Biotech Pharmacia, espectros

de emisión de 365 nm y detección de 460 nM)

• Cubetas de cuarzo para el lector de fluorescencia

103

David Gutiérrez Yªpu Área de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA

ANEXO 3: DESCRIPCiÓN DE LOS PRODUCTOS EVALUADOS

Cuadro 1: Derivados Sintéticos correspondientes al Departamento de Química

Farmacéutica, Facultad de Farmacia de la Universidad de Salamanca, Salamanca

España

N° Código Fórmula Pesomolecular molecular

1 8-1010 C'6H'202 236,0

2 8-1020 C17H,40 3 266,0

3 8-1060 C'6H1,02C1 270,5

4 8-1080 C,6H1Q02CI2 304,9

5 8-1090 C'6H1002Cb 304,9

6 8-6060 C1sHaN04CI 301,5

7 8-6070 C15HaN04CI 301,5

8 8-6080 C'sH7N04CI2 335,9

9 8-6090 C1sH7N04Cb 335,9

10 8-21010 C1sHa02Cb 290,9

11 8-21020 C16H1003Cb 320,9

12 8-21070 C1sH702CI3 325,4

13 8-21080 C1sH602CI4 359,8

14 8-21090 C1sH602CI4 359,8

15 F-1011 C16H16N20 252,0

16 F-1060 C16H13N2OCI 284,5

17 F-1061 C17H,sN2OCI 298,5

18 F-1070 C16H13N20CI 284,5

19 F-1071 C17H15N2OC\ 298,5

20 F-10S0 C16H12N20Cb 318,9

21 F-1081 C17H14N20C12 332,9

22 F-1090 C16H12N20CI2 318,9

23 F-1091 C17H14N20C12 332,9

24 F-1101 C1aH1aN2S0 310,0

25 F-21011 C16H12N20CI2 318,9

26 F-21020 C16H12N202CI2 334,9

27 F-21070 C1sHgN20CI3 339,4

28 F-21080 C1sHsN20CI4 373,8

29 1-1060 C1aH17N20CI 312,5

30 1-1070 C'8H17N2OCI 312,5

104


Continuación del Cuadro 1

Areade Quimioterapia Experimental - IlFB - UMSA

N° Código Fórmula Pesomolecular molecular

31 1-1090 C18H16N20CI2 346,9

32 1-21020 C18H16N202CI2 362,9

33 1-21060 C17H13N20C13 367,4

34 1-21070 C17H13N2OCh 367,4

35 1-21081 C17H12N20C14 401,8

36 1-21090 C17H12N20C14 401,8

37 E-1060 C21H22N02CI 355,5

38 8-1070 C16H1102CI 270,5

39 8-21060 C15H702CI3 325,4

40 F-21061 C16H11CI3N20 353,6

41 F-21071 C16H11ChN20 353,6

42 F-21091 C16H10CI4N20 388,1

43 F-21081 C16H10CI4N20 388,1

44 F-16061 C21H22CIN303 399,9

45 1-21110 C21H16CI2N30 383,3

46 1-1020 C19H20N202 308,4

47 1-1020; C19H20N202 308,4

48 1-1110 C22H20N2O 328,4

49 1-1100 C19H20N20S 324,4

50 1-1080 C18H16CI2N20 347,2

105


Cuadro 2: Productos correspondientes al Laboratorio de Productos Naturales.

Universidad de Antofagasta, Antofagasta-Chile

1

2

3

4

5

CODIGO

Y-1

Mc-F

Al. c-1

Y-4

Mc-E

FORMULA ESTRUCTURAL FORMULA

MOLECULAR

PESO

MOLECULAR

320 g/mol

360 g/mol

336 g/mol

330 g/mol

392 g/ mol

106


Continuación del Cuadro 2:


CODIGO

6 . Ac-Y-17

7 Y-6

8 Az-m9

FORMULA ESTRUCTURAL FORMULA

MOLECULAR

PESO

MOLECULAR

330 glmol

306 glmol

348 glmol

9

10

Az-m6

LA-7

290 glmol

348 gl mol

107

DavidGutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental - IIFB- UMSA

Cuadro 3: Productos naturales procedentes de Guatemala

Órgano

N° Código Familia Especie empleado- . --~,.=====

1 G-01 Euphorbiaceae Acalypha guatemalensis Hojas2 G-02 Fabaceae Cassia alata Hojas

3 G-03 Fabaceae Cassia qrendis Hojas4 G-04 Fabaceae Cassia grandis Corteza

5 G-05 ~steraceae Chaptalia nutans Hierba

6 G-06 Verbenaceae Comutia pyramidata Hojas7 G-07 Verbenaceae Comutia pyramidata Tallo

8 G-08 Clusiaceae Hypericum uliqinosum Hojas

9 G-09 lVerbenaceae LiPQié! chiapasensis Hojas10 G-10 lVerbenaceae Liooie areveolens Hojas

11 G-11 Biqnonaceae Parmenteria aculeata Hojas12 G-12 Myrtaceae Pimenta dioice Hojas13 G-13 Sapotacea Pouteria viride Tallo14 G-14 Fabaceae Quercus crispifolia Tallo15 G-15 Lamiaceae Salvia lavanduloides Hierba16 G-16 Smilacaceae Smilax oomioensls Rizoma17 G-17 Sterculiaceae Sterculia apeta/a Corteza

18 G-18 Sterculiaceae Sterculia eoetete Hojas19 G-19 Biqnonaceae Tabebulia rosea Hojas20 G-20 Theaceae Temstroemia teoezeoote Hojas21 G-21 Theaceae Temstroemia tepezapote Flores22 G-22 Asteraceae Tithonia diversifolia Hojas23 G-23 ~steraceae Tithonia diversifolia Tallo24 G-24 Valerianaceae Valeriana prionophylla Raíz25 G-25 Asteraceae Vemonia deppeana Hojas26 GUA-0310 Polymnia maculata Holas27 GUA-0311 Piper amalago Hojas28 GUA-0312 Senecio selkmus Hojas29 GUA-0313 Plumeria rubra Hojas

30 GUA-0314 Monnina xalepensis Hojas-Tallo

108

David GuliérrezYapu

Cuadro 4: Productos naturales procedentes de Colombia

Órgano Tipo de

N° Código Especie empleado muestra

1 A3 Pioer ho/tonni e.D.e. Hojas Partición 3

2 A6 Piper ho/tonni e.D.e. Hojas Partición 6

3 A8 Pioer ho/tonni e.D.e. Hojas Partición 8

4 A 12 Piper ho/tonni e.D.e. Hojas Partición 12

5 B3 Ca/ea prunifo/ia Planta entera Partición 3

6 B6 Ca/ea prunifo/ia Planta entera Partición 6

7 B8 Ca/ea prunifolía Planta entera Partición 8

8 B 12 Ca/ea prunifolia Planta entera Partición 12

9 e3 Piper barbatum L. Hojas Partición 3


11 e8 Pioer barbatum L. Hojas Partición 8


13 03 Pioer umbe!!atum L. Planta entera Partición 3

14 06 Piper umbe!!atum L. Planta entera Partición 6

15 08 Piper umbe!!atum L. Planta entera Partición 8

16 012 Piper umbe//atum L. Planta entera Partición 12

17 E3 Annona muricata Planta entera Partición 3

18 E6 IAnnona muricata Planta entera Partición 6

19 E8 IAnnona muricata Planta entera Partición 820 E 12 Annona muricata Planta entera Partición 12

21 F3 Coffea arabica Planta entera Partición 3

22 F6 Coffea arabica Planta entera Partición 6

23 F8 Coffea arabica Planta entera Partición 824 F12 Coffea arabica Planta entera Partición 12

25 G3 Cardiospermum qrandiflorum Planta entera Partición 3

26 G6 Cardiospermum grandiflorum Planta entera Partición 627 G8 Cardiospermum grandiflorum Planta entera Partición 8

28 G 12 Cardiospermum grandiflorum Planta entera Partición 1229 H3 Tabebuia rosea Planta entera Partición 3

30 H6 Tabebuia rosea Planta entera Partición 6

31 H8 Tabebuia rosea Planta entera Partición 832 H12 Tabebuia rosea Planta entera Partición 1233 13 Chromo/aena /eivensis Planta entera Partición 3

34 16 Chromo/aena /eivensis Planta entera Partición 635 18 Chromo/aena /eivensis Planta entera Partición 8

36 112 Chromo/aena /eivensis Planta entera Partición 12

109

David Gutiérrez Yaou


Área de Quimioterapia Experimental- IIFB - UMSA

Órgano Tipo de

N° Código Especie empleado muestra

37 J3 Ca/ea peruviana Planta entera Partición 3

38 J6 Ca/ea peruviana Planta entera Partición 639 J 8 Ca/ea peruviana Planta entera Partición 8

40 J 12 Ca/ea peruviana Planta entera Partición 1241 K3 Ha/enia asc/epiadeae Planta entera Partición 342 K6 Ha/enia asclepiadeae Planta entera Partición 643 K8 Halenia asclepiadeae Planta entera Partición 8

44 K12 Ha/enia asc!epiadeae Planta entera Partición 1245 L3 Miconia buxifo/ia Planta entera Partición 346 L6 Miconia buxifolia Planta entera Partición 647 L8 Miconia buxifo/ia Planta entera Partición 848 L12 Miconia buxifolia Planta entera Partición 1249 M3 Miconia sp Planta entera Partición 350 M6 Miconia sp Planta entera Partición 6

. 51 M8 Miconia so Planta entera Partición 852 M 12 Miconia sp Planta entera Partición 1253 N3 Miconia sp Planta entera Partición 354 N6 Miconia sp Planta entera Partición 655 N8 Miconia sp Planta entera Partición 856 N 12 Miconia sp Planta entera Partición 1257 03 Lafoensia acuminata Planta entera Partición 358 06 Lafoensia acuminata Planta entera Partición 659 08 Lafoensia acuminata Planta entera Partición 860 012 Lafoensia acuminata Planta entera Partición 1261 CO-221 fr01 Piper barbatum H.B.K. Frutos Crudo62 CO-243 h01 Bocconia integrifolia Hojas Crudo

Humb & H.Rob63 CO-243 fr01 Bocconia integrifolia Frutos Crudo

Humb &H.Rob64 CO-244 h01 Piper barbatum H.B.K. Hojas Crudo65 CO-245 f101 Critonia morifolia Flores Crudo66 CO-245 fr01 Critonia morifo/ia Frutos Crudo

110

pavid Gutiérrez Yapu



Órgano Tipo de

N° Código Ef'Eecie empleado muestra

67 CO-247 h01 Cinchona pubescens Vahl Hojas Crudo68 CO-248 h01 Paullinia densiflora J.E.Smith Hojas Crudo39 CO-249 h01 Sida rhombifolía L. Hojas Crudo

40 CO-250 fi01 Lanata camara L. Flores Crudo

Cuadro 5: Productos naturales procedentes de Argentina

Tipo de

N° Código Especie extracto

1 Pd(Pas)Ac Paríetaria debilísAcuoso

2 Et(Pas)Hex Epbetire tweedíana Hexánico3 As(Pas )OCIM Argemone subfusíformis Diclorometá nico4 Mp(pas)OCIM Míkania periplocifolia Diclorometá nico5 Et(pas)OCIM Ephedra tweedíana Alcohólico6 Pd(Pas)Hex Parietaria debilís Hexánico

111

DavidGutiérrez Yapu Áreade Quimioterapia Experimental - IIFB- UMSA

Cuadro 6: Productos naturales procedentes de México

N° Código

1 MX-11

2 MX-12

3 MX-13

4 MX-14

5 MX-15

6 MX-16

7 MX-17

8 MX-18

9 MX-19

10 MX-20

11 MX-21

12 MX-22

13 MX-23

14 MX-24

15 MX-25

16 MX-26

17 MX-27

18 MX-28

19 MX-29

20 MX-30

21 MX-31

22 MX-32

23 MX-33

24 MX-34

25 MX-35

26 MX-36

27 MX-37

28 MX-38

29 MX-39

30 MX-40

31 MX-41

32 MX-42

33 MX-43

34 MX-44

N° Código

35 MX-45

36 MX-46

37 MX-47

38 MX-48

39 MX-49

40 MX-50

41 MX-51

42 MX-52

43 MX-53

44 MX-54

45 MX-55

46 MX-56

47 MX-57

48 MX-58

49 MX-59

50 MX-50

51 MX-61

52 MX-62

53 MX-63

54 MX-64

55 MX-65

56 MX-66

57 MX-67

58 MX-68

59 MX-69

60 MX-70

61 MX-71

62 MX-72

63 MX-73

64 MX-74

65 MX-75

66 MX-76

67 MX-77

68 MX-78

112

David GuliérrezYapu Áreade QuimioterapiaExperimental - I1F8 - UMSA

Cuadro 7: Productos naturales procedentes de Perú

N° Especie Órgano Tipo de

empleado extracto

1 Maytenus macrocarpa Corteza Acuoso2 Crescienta cuiete Hojas Hexánico3 Crescienta cuiete Hojas Clorofórmico4 !Aspidosperma rigidum Madera 1 ZI Hidroalcohólico5 Pouteria caimito Hojas Clorofórmico

6 IAspidosperma tiqidum Corteza 1 ZI Hidroalcohólico7 Wing coci Planta entera Hidroalcohólico

-

8 !Annona Hojas Acuoso9 Coly cophylum spuamm Corteza Hidroalcohólico10 Crescienta cujete Hojas Hidroalcohólico11 Spondias mombin L. Corteza Acuoso12 Aspidosperma riaidum Raíz 1 ZNI Hidroalcohóllco13 Bixa orellana Hojas Acuoso14 !Aspidosperma exce/sium Madera 1 ZI Hidroalcohólico15 !Aspidosperma rigidum Madera 2 ZI Hidroalcohólico16 !Aspidosperma rigidum Raíz 2 ZNI Hidroalcohólico17 !Aspidosperma rigidum Madera 2 ZNI Hídroalcohólico18 !Aspidosperrna exce/sium Hojas 1 ZI Hidroalcohólico19 Aspidosperrna rigidum Madera 3 ZNI HidroalcohólJco20 !Aspidosperrna rigidum Raíz 3 ZNI Hidroalcohólico21 Dolicarpus dentatus Hojas Hidroalcohólico22 Psvcbotrie poeppigiana Hojas Hidroalcohólico23 Lsndetberaie magnífo/ia Hojas Hidroalcohólico24 Martine/la obovata Hojas Hidroalcohólico25 Remijia ulei Holas Hidroalcohólico26 Remijia u/ei Holas Clorofórmico27 Martinel/a obovata Hojas 1 Clorofórmico28 Landerberqía magnifolia Hojas Clorofórmico29 Psvcbotrie poeppigiana Hojas 1 Clorofórmico30 Psychotria poeppigiana Hojas 2 Clorofórmico31 Dolicerpus dontatus Hojas Clorofórmico32 Remiiie ulei Hojas Clorofórmico33 Martinella obovata Hojas 2 Clorofórmico34 Landerberqia maqnifolia Hojas Hexánico

113

David Gutién"ez Yapu



N° Especie Órgano Tipo deextracto

35 Psychotria ooeooiaiene Flores Hexánico

36 Psvchotria poeppígíana Holas Hexánico

37 Dolícarpus dontatus Hojas Hexánico38 Remliie peruvíana Hojas Clorofórmico39 Remiiie peruviana Hojas Hidroalcohólico

40 Remíjia peruvíana Hojas Hexánico

114

David Gutiérrez Yaou Área de QuimioterapiaExperimental- IIFB - UMSA

Cuadro 8: Fracciones purificadas de So/anum argentinum procedentes de Bolivia

~ I Código Solvente deproducto elusión

1 F1 OCM2 F2 OCM:MeOH3 F3 OCM:MeOH4 F4 OCM:MeOH5 F5 OCM:MeOH

6 F6 OCM:MeOH7 F7 OCM:MeOH8 F8 Acetato de etilo9 F9 Acetato de etilo10 F3-1 EP:OCM11 F3-2 EP:OCM12 F3-3 EP:OCM13 F3-4 EP:OCM14 F3-5 EP:OCM1S F3-6 EP:OCM16 F3-7 EP:OCM17 F3-8 EP:OCM18 F3-9 OCM19 F3-10 OCM20 F4-1 EP:OCM21 F4-2 EP:OCM22 F4-3 EP:OCM23 F4-4 EP:OCM24 F4-S EP:DCM25 F4-6 EP:DCM26 F4-7 EP:OCM27 F4-8 EP:OCM28 F4-9 EP:OCM29 F4-10 EP:OCM

30 F4-11 EP:OCM31 F4-12 EP:OCM32 F4-13 EP:OCM33 F4-14 EP:OCM34 F5-1 EP:OCM

N° Código Solvente deproducto elusión

-..

35 FS-2 EP:OCM36 FS-3 EP:OCM37 FS-4 EP:OCM38 F5-S EP:OCM39 F5-6 EP:OCM

40 F5-7 EP:OCM41 F5-8 EP:OCM42 F5-9 EP:OCM43 FS-10 EP:OCM44 FS-11 EP:OCM45 FS-12 OCM46 F5-13 EP:OCM47 FS-14 EP:OCM48 F5-15 EP:OCM49 F5-16 EP:OCMSO FS-17 EP:DCM51 FS-18 OCM52 S.arqentinum Crudo

115

DavidGutiérrez Yapu Area de Quimioterapia Experimental - IIFB - UMSA

, ANEXO 4: RESULTADOS TOTALES DE LOS PRODUCTOS EVALUADOS SOBRE

CEPAS DE Plasmodium falciparum F32

Cuadro 9: Evaluación de la actividad in vitro de Derivados Sintéticos realizados en la

Universidad de Salamanca, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32

N° Código IC 50 Actividad

I!g/ml

1 8-1010 > 10 Inactivo

2 8-1020 > 10 Inactivo

3 8-1060 > 10 Inactivo

4 8-10S0 > 10 Inactivo

5 8-1090 > 10 Inactivo

6 8-6060 > 10 Inactivo

7 8-6070 > 10 Inactivo

S 8-60S0 > 10 Inactivo

9 8-6090 > 10 Inactivo

10 8-21010 > 10 Inactivo

11 8-21020 > 10 Inactivo

12 8-21070 > 10 Inactivo

13 8-21080 > 10 Inactivo

14 8-21090 >10 Inactivo

15 F-1011 > 10 Inactivo

16 F-1060 > 10 Inactivo17 F-1061 3,9 ACTIVO

18 F-1070 > 10 Inactivo19 F-1071 5 ACTIVO

20 F-1080 > 10 lmctivo21 F-10S1 3,7 ACTIVO

22 F-1090 > 10 Inactivo23 F-1091 3,1 ACTIVO

24 F-1101 > 10 Inactivo

25 F-21011 > 10 Inactivo

26 F-21020 > 10 Inactivo

27 F-21070 > 10 Inactivo

28 F-21OSO > 10 Inactivo

29 1-1060 >10 Inactivo

30 \-1070 1,9 ACTIVO

116



Area de Quimioterapia Experimen\al-IIFB - UMSA


IJg/ml-

31 1-1090 0,18 ACTIVO

32 1-21020 0,05 ACTIVO

33 1-210S0 0,49 ACTIVO

34 1-21070 0,07 ACTIVO

35 1-21080 6 ACTIVO

36 1-21090 0,02 ACTIVO

37 E-10S0 4,8 ACTIVO

38 8-1070 >10 Inactivo

39 8-21060 >10 Inactivo40 F-21 061 3.3 ACTIVO

41 F-21071 > 10 Inactivo42 F-21091 10 ACTIVO

43 F-21081 > 10 Inactivo44 F-1S0S1 10 ACTIVO45 1-21110 0.59 ACTIVO46 1-1020 0.03 ACTIVO47 1-1020i 0.3 ACTIVO

48 1-1110 > 10 Inactivo

49 1-1100 0.03 ACTIVO

117


Cuadro 10: Evaluación de la actividad in vitro de Diterpenoides aislados de especies

de Azorella compacta, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32

N° Código IC 50 Actividad~gfml

1 y -1 >10 Inactivo

2 Mc-F >10 Inactivo

3 Az C-1 > 10 Inactivo

4 Y-4 > 10 Inactivo

5 Mc-E 0,4 ACTIVO

S Ac Y -17 >10 Inactivo

7 Y-S 5 ACTIVO

8 Az- m9 > 10 Inactivo

9 Az-mS >10 Inactivo

10 LA-7 >10 Inactivo

118

David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimenlal-IIFB - UMSA

I

Cuadro 11: Evaluación de la actividad in vitro de extractos de plantas procedentes de

Guatemala, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32

N° Código Especie IC 50 ActividadI..IQ/ml

1 G-01 ~calypha guatemalensis >10 Inactivo

2 G-02 Cassia alata >10 Inactivo

3 G-03 Cassia qrandis (Hojas) >10 Inactivo

4 G-04 Cassia grandis (Corteza) >10 Inactivo

5 G-05 Chaptalia nutans >10 Inactivo

6 G-06 Comutia pyramidata (Hojas) >10 Inactivo

7 G-07 Comutia pyramidata (Tallos) > 10 Inactivo

8 G-08 Hypericum uliginosum > 10 Inactivo

9 G-09 Lippia chiapasensis > 10 Inactivo

10 G-10 Liooie qraveolens >10 Inactivo

11 G-11 Parmenteria aculeata >10 Inactivo

12 G-12 Pimenta dioica > 10 Inactivo

13 G-13 Pouteria viride > 10 Inactivo

14 G-14 Quercus crispifolia >10 Inactivo

15 G-15 Salvia lavanduloides > 10 Inactivo

16 G-16 Smilax domioensis > 10 Inactivo17 G-17 Sterculia eoetete (Corteza) >10 Inactivo

18 G-18 Sterculia apetala (Hojas) > 10 Inactivo19 G-19 Tabebulia rosea > 10 Inactivo

20 G-20 Temstroemia te ezapote (Hojas) >10 Inactivo21 G-21 Temstroemia tepezapote (Flores) >10 Inactivo

22 G-22 Tithonia diversifolia (Holes) > 10 Inactivo23 G-23 Tithonia diversifolia (Tallo) > 10 Inactivo

24 G-24 Valeriana prionophylla >10 Inactivo

25 G-25 Vemonia deppeana >10 Inactivo

26 GUA-0310 Polvmnie maculata > 10 Inactivo

27 GUA-0311 Piper amalaqo 9,4 ACTIVO

28 GUA-0312 Senecío salignus 2,9 ACTIVO

29 GUA-0313 Plumeria rubra > 10 Inactivo30 GUA-0314 Monnina xalepensis >10 Inactivo

llQ

David Gutiérrez Yapu Área de Quimioterapia Experimental-IIFB - UMSA


Colombia, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32

N° Código Especie IC 50 Actividad

~9./ml

1 A3 Piper holtonni e.D.e. > 10 Inactivo

2 A6 Piper holtonni e.D.e. >10 Inactivo

3 A8 Pipe,- holtonni e.D.e. >10 Inactivo

4 A 12 Piper holtonni e.D.e. >10 Inactivo

5 83 Calea prunifolia >10 Inactivo

6 B6 Calea prunifolia >10 Inactivo

7 B8 CaJea prunifolia >10 Inactivo

8 812 CaJea prunifolia >10 lnactivo

9 C3 Piper barbatum L. >10 Inactivo

10 e6 Piper barbatum L. 6,9 ACTIVO

11 e8 Piper barbatum L. >10 Inactivo

12 e 12 Piper barbatum L. >10 Inactivo

13 D3 Piper umbellatum L. >10 Inactivo

14 06 Pioer umbellatum L. 10,2 ACTIVO



17 E3 'Anoone muricata >10 Inactivo

18 E6 Annona muricata >10 Inactivo

19 E8 IAnnona muricata >10 Inactivo

20 E 12 IAnnona muricata 10,1 ACTIVO21 F3 Coffea arabica >10 Inactivo

22 F6 Coffea arabica >10 Inactivo23 F8 Coffea arabica >10 Inactivo

24 F12 Coffea arabica > 10 Inactivo

25 G3 Ceniiosoermum qrandiflorum >10 Inactivo

26 G6 Cardiospermum grandiflorum >10 Inactivo

27 G8 Cardiospermum grandiflorum >10 Inactivo

28 G 12 Cardiospermum grandifforum >10 Inactivo

29 H3 Tabebuia rosea >10 Inactivo

30 H6 Tabebuia rosea >10 Inactivo31 H8 Tabebuia rosea >10 Inactivo32 H 12 Tabebuia rosea >10 Inactivo

33 13 Chromolaena leivensis >10 Inactivo


35 18 Chromolaena leivensis 5,4 ACTIVO1


120



Área de QuimioterapiaExperimental-IIFB - UMSA

N° Código Especie IC 50 Actividad

IJglmJ

37 J3 Calea oeruviene >10 Inactivo

38 J6 Ca/ea peroviana 19 ACTIVO

39 J8 Ca/ea peruviene >10 Inactivo

40 J 12 Ca/ea peroviana >10 Inactivo

41 K3 Ha/enia asclepiadeae > 10 Inactivo42 K6 Halenia asclepiadeae >10 Inactivo

43 K8 Ha/enia asc/epiadeae >10 Inactivo

44 K 12 Ha/enia asclepiadeae > 10 Inactivo45 L3 Miconia buxifolia 15 ACTIVO46 L6 Miconia buxifolia >10 Inactivo47 L8 Miconia buxifolia >10 Inactivo

48 L12 Miconia buxifolia >10 Inactivo

49 M3 Miconia sp > 10 Inactivo50 M6 Miconia sp >10 Inactivo51 M8 Miconia st: >10 Inactivo

52 M 12 Miconia sp >10 Inactivo53 N3 Miconia sp 7,3 ACTIVO54 N6 Miconia sp >10 Inactivo55 N8 Miconia sp >10 Inactivo56 N 12 Miconia sp >10 Inactivo57 03 Lafoensia acuminata >10 Inactivo58 06 Lafoensia acuminata >10 Inactivo59 08 Lafoensia ccumineie >10 Inactivo60 012 Lafoensia acuminata >10 Inactivo61 CO-221 fr01 Piper barbatum H.S.K. 2,1 ACTIVO62 CO-243 h01 Bocconia integrifolia >10 Inactivo

Humb & H.Rob63 CO-243 fr01 Bocconia integrifolia 9 ACTIVO

Humb & H.Rob64 CO-244 h01 Piper barbatum H.S.K. >10 Inactivo65 CO-245 fl01 Critonia morifolia >10 Inactivo66 CO-245 fr01 Ca/ea peruviana >10 Inactivo

121



Áreade Quimioterapia Experimental- IIFB- UMSA

N° Código Especie le 50 ActividadIJg/ml

67 CO-247 h01 Cinchan a pubescens Vahl > 10 Inactivo68 CO-248 h01 Paullinia densiflom J.E.Smith >10 Inactivo--39 CO-249 h01 Sida rhombifo!ia L. >10 Inactivo

40 CO-250 fl01 Lanata camara L. >10 Inactivo

122



Argentina, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32

N° Código Especie IC 50 ActividadIJg/ml

1 Pd(Pas)Ac Parietaria debilis (Ae) >10 Inactivo

2 Et(Pas)Hcx Ephedra tweediana (Hex) > 10 Inactivo

3 As(Pas)OCIM Argemone subfusiformis >10 Inactivo

4 Mp(pas)OCIM Mikania periplocifolia > 10 Inactivo

5 Et(Pas)OCIM Ephedra tweediana (EtOH) > 10 Inactivo

6 Pd(Pas)Hex Perieierio debilis (Hex) > 10 Inactivo

123



México, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32

N° Código IC 50 ActividadJ.lg/ml

1 MX-11 >10 Inactivo



4 MX-14 3,1 ACTIVO

5 MX-15 > 10 Inactivo


·7 MX-17 >10 Inactivo









16 MX-26 2,2 ACTIVO17 MX-27 0,2 ACTIVO

18 MX-28 0,13 ACTIVO19 MX-29 >10 Inactivo

20 MX-30 >10 Inactivo21 MX-31 >10 Inactivo

22 MX-32 >10 Inactivo23 MX-33 > 10 Inactivo



26 MX-36 >10 Inactivo27 MX-37 >10 Inactivo


29 MX-39 >10 Inactivo30 MX-40 >10 Inactivo31 MX-41 > 10 Inactivo32 MX-42 >10 Inactivo33 MX-43 >10 Inactivo34 MX-44 >10 Inactivo

124




N° Código IC SO Actividad

IJg/ml





39 MX-49 > 10 Inactivo40 MX-50 > 10 Inactivo

41 MX-51 > 10 Inactivo42 MX-52 > 10 Inactivo

43 MX-53 > 10 Inactivo44 MX-54 > 10 Inactivo45 MX-55 > 10 Inactivo46 MX-56 > 10 Inactivo47 MX-57 > 10 Inactivo


49 MX-59 > 10 Inactivo50 MX-60 > 10 Inactivo51 MX-61 > 10 Inactivo

52 MX-62 > 10 Inactivo53 MX-63 > 10 Inactivo54 MX-64 > 10 Inactivo55 MX-65 > 10 Inactivo56 MX-66 > 10 Inactivo57 MX-67 > 10 Inactivo58 MX-68 > 10 Inactivo59 MX-69 > 10 Inactivo60 MX-70 > 10 Inactivo61 MX-71 5,8 ACTIVO62 MX-72 > 10 Inactivo63 MX-73 >10 Inactivo64 MX-74 > 10 Inactivo65 MX-75 > 10 Inactivo66 MX-76 > 10 Inactivo67 MX-77 > 10 Inactivo68 MX-78 > 10 Inactivo

125

David Gutiérrez Yaou Área de Quimioterapia Experimental - IIFB - UMSA


Perú, sobre cepas de Plasmodium falciparum F32

N° Especie Órgano IC 50 Actividadempleado J..Ig/ml

1 Mavtenus macrocarpa Corteza >10 Inactivo

2 Crescienta culeie Holas 3,4 ACTIVO

3 Crescienta cuiete (CHCI3) Hojas >10 Inactivo

4 Aspidosperrna tiqkium Madera 1 ZI 4 ACTIVO

5 Pouteria caimito Hojas >10 Inactivo

6 I,Aspidosperrna tiokium Corteza 1 ZI 9 ACTIVO

7 Wing coci Planta entera >10 Inactivo

8 Annona Hojas > 10 Inactivo

9 Coly cophylum souemm Corteza >10 Inactivo

10 Crescienta cujete (EtOH) Hojas > 10 Inactivo

11 Spondies mombin L. Corteza > 10 Inactivo

12 [Aspidosperma riqidum Raíz 1 ZNI >10 Inactivo

13 Bixa orel/ana Hojas 3,9 ACTIVO

14 Asokiospetme excelsium Madera 1 ZI >10 Inactivo

15 [Aspidosperrna rioioum Madera 2 ZI >10 Inactivo

16 Aspidosperrna rigidum Raíz 2 ZNI >10 Inactivo17 Aspidosperma tiokiutn Madera 2 ZNI >10 Inactivo

18 Aspidosperrna excelsium Holas 1 ZI >10 Inactivo19 Aspidosperrna riaidum Madera 3 ZNI >10 Inactivo

20 Aspidosperrna rigidum Raíz 3 ZNI 10,1 ACTIVODo/icarpus denta tus (EtOH)

r21 Hojas >10 Inactivo

22 Psychotria ooeooiaiene (EtOH) Hojas >10 Inactivo23 Landerbemia magnifo/ia (EtOH) Hojas >10 Inactivo

24 Martine//a obovata (EtOH) Hojas >10 Inactivo

25 Remijia u/ei (EtOH) Hojas > 10 Inactivo

26 Remijia u/ei (CHC/3) Hojas > 10 Inactivo

27 Martinella obovata (CHC/3) Hojas 1 >10 Inactivo

28 Landerbergia magnifolia (CHC/3) Hojas > 10 Inactivo

29 Psvchottie ooepoiaieno (CHC/3) Hojas 1 > 10 Inactivo.-30 Psvcnotrie poeppigiana (CHC/3) Hojas 2 >10 Inactivo31 Dolicerpus dontatus (CHC/3) Hojas >10 Inactivo32 Remiiie u/ei (CHC/3) Hojas >10 Inactivo33 Martina//a obovata CHC/3) Hojas 2 >10 Inactivo34 Lenderberqie magnifolia (Hex) Hojas >10 Inactivo

126




N° Especie Órgano IC 50 ActividadIJg/ml

35 Psychotria poeppigianaFlores 5,4 ACTIVO

36 Psvchottie poeppigian~ (Hex) Hojas > 10 Inactivo

37 Dolicertius dontatus (Hex) Hojas > 10 Inactivo38 Remiiie oeruviene (CHC/3) Hojas 1,4 ACTIVO

39 Remijia peroviana (EtOH) Hojas 0,08 ACTIVO

40 Remijia petuviens (Hex) Hojas 0,18 ACTIVO

127

David Gutíérrez Yapu

Cuadro 16: Evaluación de la actividad in vitro de fracciones de So/anum argentinum

procedentes de Bolivia, sobre cepas de P/asmodium fa/ciparum F32


IJQ/ml

1 F1 > 10 Inactivo

2 F2 > 10 Inactivo

3 F3 4,5 ACTIVO

4 F4 1,3 ACTIVO

5 F5 2,1 ACTIVO

6 F6 > 10 Inactivo

7 F7 > 10 Inactivo

8 F8 > 10 Inactivo

9 F9 > 10 Inactivo

10 F3-1 > 10 Inactivo



13 F3-4 Muestra insuficiente



16 F3-7 > 10 Inactivo17 F3-S Muestra insuficiente

18 F3-9 Muestra insuficiente19 F3-10 Muestra insuficiente








29 F4-10 3,3 ACTIVO30 F4-11 >10 Inactivo31 F4-12 2,1 ACTIVO32 F4-13 Muestra insuficiente33 F4-14 > 10 Inactivo34 F5-1 > 10 Inactivo

128





~g/ml





39 F5-6 Muestra insuficiente40 F5-7 > 10 Inactivo

41 F5-8 > 10 Inactivo42 F5-9 > 10 Inactivo

43 F5-10 Muestra insuficiente44 F5-11 >10 Inactivo45 F5-12 > 10 Inactivo46 F5-13 > 10 Inactivo47 F5-14 >10 Inactivo

48 F5-15 >10 Inactivo

49 F5-16 > 10 Inactivo50 F5-17 3,2 ACTIVO51 F5-18 5,8 ACTIVO52 S.erqeniinum 0,42 ACTIVO

129

David Gutiérrez Yapu Area de Quimioterapia ~xperimental- IIFB - UMSA

Cuadro 17: Comparación de los Porcentajes de Inhibición de la maduración de

esquizontes, obtenidos por los métodos visual y bioquímico

N° Extracto Concentración % Inhibición % Inhibiciónpg/ml Método visual Método LDH

1 BMII F17 0,1 O O2 BIVIII F17 1 O O3 BMII F17 10 81 904 BIVIII F16 0,1 O O5 BMII F16 1 O O6 BMII F16 10 O 127 BMII F15 0,1 O O8 BMII F15 1 O O9 BMII F15 10 O O10 BMI43 V2 0,1 O O11 BMI43 V2 1 O O12 BMI43 V2 10 11,6 4413 Remiiie peruviana 0,1 O O14 Remijia peruviana 1 O O15 Remijia peruviana 10 83 8316 Mx11 0,1 O O17 Mx 11 1 43 O18 Mx 11 10 83 9819 Mx 71 0,1 O O20 Mx 71 1 O O21 Mx 71 10 O O22 Cinchona officinalis 0,001 O O23 Cinchona officinalis 0,01 O O24 Cinchona officinalis 0,1 O O25 Cinchona officinalis 1 O 15,9926 Cinchona officinalis 10 79 67,227 Cinchona pubescens 0,01 O O28 Cinchona pubescens 0,1 O O29 Cinchona pubescens 1 51 O30 Cinchona pubescens 10 76 72,931 Cloroquina 10 nM 6 532 Cloroquina 100 nM 87 8033 Cloroquina 1000 nM 99 100

nn

David Gutiérrez Vapu Área de Quimioterapia Experimental- IIF8 - UMSA

Cuadro 18: Comparación de los Porcentajes de Inhibición de la maduración de

esquizontes, obtenidos por los métodos visual, bioquimico y f1uorométrico

N° Extracto Concentración % Inhibición % Inhibición % Inhibición

1l9!ml Método visual Método LDH Mét.Flurométrico

1 Mx71 0,1 O O O2 Mx 71 1 O O O3 Mx71 10 O O O4 BMII F16 0,1 O O O5 BMII F16 1 O O O6 BMII F16 10 O 12 O7 Cinchona pubescens 0,01 O O O8 Cinchona pubescens 0,1 O O 0,59 Cinchona pubescens 1 51 O 16,2410 Cinchona pubescens 10 76 72,9 62,9411 Cinchona officinalis 0,001 O O O12 Cinchona officinalis 0,01 O O O13 Cinchona officinalis 0,1 O O 5,0214 Cinchona officinalis 1 O 15,99 12,0115 Cinchona officinalis 10 79 67,2 59,6816 Cloroquina 0,01 nM O O 2717 Cloroquina 0,1 nM O O 3618 Cloroquina 1 nM O O 4419 Cloroquina 10 nM 6 5 4820 Cloroquina 100 nM 87 80 . 7021 Cloroquina 1000 nM 99 100 86

131

universidad mayor de san andrÉs instituto de...

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