UNIVERSIDAD DE COLIMAFACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y,ZOOTECNIA

MAESTRÍA EN BIOQUÍMlCA Y CINETICA RUMINAL

EFECTO DEL AZUFRE SOBRE LA DIGESTIBILIDAD IN VITRO DECELULOSA POR HONGOS RUMINALES DE CAPRINOS

RAMÓN GOVEA CASARE2

TESIS

presentada como requisito para obtener el grado de

MAESTRO EN CIENCIAS

1998

ii

AGRADECIMIENTOS

A la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Colima

por haberme dado la oportunidad de formarme como maestro en ciencias.

Con especial atención agradezco el gran apoyo económico que me brindó la

empresa del Consorcio Minero “Peña Colorada” en el desarrollo de mi formación.

Reconozco con apreciación extensiva el gran interés del cuerpo de asesores que

me condujeron con sus opiniones técnicas, tan importantes al desarrollo de mi trabajo y

la guía para la preparación de mi documento: ,

Dr. Miguel Arenas V.

Dr. Luis Felipe Bojalil Jaber

Dr. Fausto Sánchez y García Figueroa

Dr. Daniel Contreras Lara

Dr. Héctor González Cerezo,

Dr. Antonio Flores Díaz.

Dr. Judith Licea de Arenas.

Dr. Francisco Radillo Juárez

Además, a la Ingeniera Teresa Castillo Velasco, MC. Leonardo Gutiérrez

ChávezMC. Martha Vergara, MC. Joel López Pérez. BQ. Juan Manuel Miramontes,

Dra. Rocío Flores Bello, Dr. Sergio Aguilar Espinoza, MC. Ruben Ballardo y MC. J.

Trinidad Ramírez Carrillo por el apoyo fructífero en la revisión de mi trabajo.

i i i

Dedico a MIS PADRES J. Jesús Govea Terriquez y Ma. Soledad Casarez M. Quienes

me ofrecieron su apoyo incondicional en el proceso de formación para la obtención de

este grado.

A mi ESPOSA Alida Montejano Peregrino por su invaluable apoyo moral para la

realización de mi trabajo.

A mis HERMANOS Roberto, Pedro, Ana y Belén. A quienes admiro porque me

han brindado confianza y motivación en mi superación profesional.

A mis SUEGROS por tener el apoyo incondicional que me han mostradosiempre.

RESUMEN

Las paredes celulares de los forrajes en el Trópico Seco se caracterizan porposeer altos contenidos de celulosa hemicelulosa, lignina y pectina; compuestos que alser ingeridos por los rumiantes dificultan su digestibilidad. Los hongos anaerobiospresentes en el rumen, participan en la degradación de las paredes celulares, y el azufreinfluye en la proliferación de estos microorganismos. El conocer respuestas metabólicasde estos hongos en presencia de azufre puede permitir su manejo. Se evaluó in vitro lacapacidad de los hongos ruminales caprinos para digerir la celulosa pura (Sigmacell tipo10 1) en presencia de diferentes fuentes y concentraciones de azufre. y se determinaronlas concentraciones de glucosa y fluctuaciones del pH. Para reproducir las zoosporas delos hongos en cultivo axénico, se tomó una muestra de contenido ruminal de caprinos yse depositó en un medio de cultivo por 72 horas. Se inocularon en un medio de cultivocon celulosa pura como fuente de carbono. Se determinó la digestibilidad de los hongosutilizando diferentes fuentes y niveles de azufre. Las fuentes de azufre fueron: Sulfuro deSodio (Na2S), Metionina (C5 H11NO2S y ambos compuestos al 50% en proporción alazufre de su fórmula (considerando su peso molecular), y en los niveles de 0, 0.15, 0.25y 0.35%. La digestibilidad de celulosa se evaluó a los 2, 4, 6 y 8 días de incubación,donde se encontró una relación positiva en la digestibilidad con la concentración deSulfuro de Sodio y los períodos de incubación, con un coeficiente de coorelación der=0.94, r=0.96, r=0.94 y r=0.97, respectivamente. Destacó la concentración del Sulfurode Sodio en el nivel 0.15% a las 48, 96, 144 y 192 horas con digestibilidad de 35.26.40.82, 39.95 y 34.35% respectivamente; superando al testigo con valores de 28.86,29.44, 25.93 y 22.90%. La combinación de Metionina y Sulfuro de Sodio incrementó ladigestibilidad de la celulosa en el nivel 0.15% solo en las horas 144 y 192 (42.07 y42.45%). La concentración de glucosa se incrementó en la combinación de las dosfuentes, con valores 2.45 hasta 4.16 µmol/ml y con valores superiores en lasconcentraciones del 0.35%; en tanto que el testigo mostró valores que fluctuaron de 0.99a 2.78 µmol/ml, la metionina de 1.28 a 3.99 y sulfuro de sodio de 0.83 a 4.16 µmol/ml.El pH del medio de cultivo con Sulfuro de Sodio con el nivel de 0.25% para todos lostiempos, mostró variación desde 7.60 a 8.64, en tanto que los valores de los medios conMetionina y la combinación de ambos fueron más ácidos (7.20 a 7.61 y de 7.30 a 7.43).Mediante la adición de tientes de azufre, los hongos ruminales caprinos modifican ladigestibilidad i n vitro de la celulosa, concentración de glucosa y el pH.

Palabras Claves: Rumen, hongo anaerobio, digestibilidad, Sulfuro de Sodio,Metionina, Celulosa, Caprinos.

IX-DICE Pagina

AGRADECIMIENTOS. . .................. ..................... .................................. i i

RESUMEN ................................ ................................. ............... i v

INDICE . . . . . . . . .................... ............................... ................. \.

LISTA DE C’U>,U>ROS ................... .................................................. \:ii

LISTA DE FIGURAS.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . \?Il

1. INTRODCC‘CIÓY ........................ .................................. ..................... 1

-2. INFLUEKCI.4 DEL AZUFRE Es 14 DEGRADACIÓN DE L<\S

PAREDES CELULARES DE FORI?(.UES POR HONGOS DEL RGMEN.... 4

2 .1 El trópico seco y la producciitn mimal.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

2 1 I Caracterización de los forajes en el trópico seco ......... 5

2 3 Condiciones ambientales en el ri::~n. .......... .......... 6

2 3 1 Fisiología digestiva en el T;lmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

2 2 2 Absorción de nutrientes a Través del rumen . . . . . . . ................. 9

2.3.3 Participación microbiana <n la digestión de las paredes celulares en

el rumen ....................... ................... ........ ..................9

2 3.4 Asociación de microorgar,ismos y alimento en el rumen ................... 1 0

? ? 5 Importancia de la adaptación a al dieta alimenticiah.d. ......................... 1 3

2 3.6 hqanipulación en la digestion del alimento ....................................... 13

2.3 Estructura de la pared celular de las plantas y su degradación por hongos

del turnen.. . . . . . . . . . . . _. _. . . . _. _._. ._... *,

2 3.1 Aspectos generales de los hongos del rumen .__. ___._.__. .__. 2 0

2.3.1.1 Taxonomía ..__.. .._......__....__._...., .._.._...__,._......_.... 2 1

2.3.1.2 Ciclo de vida ..,_.__.___,................._...._.,....____...._......_.... 21

2.3.1.3 F i s i o l o g í a y m e t a b o l i s m o . _. _. _. _. _. .._. 2 4

2.2.1.4 Características de los géneros de hongos más importantes.... 2 4

2 3.2 Colonización fungal de los tejidos de las plantas .._................__..._.__, 2 7

2 .;.3 Matabolismo de energía 1. caract&ísticas de fermentación _._. ,_ ____._. 2 8*-

2 3 4 Degradación de la pared celular por los hongos anaerobios del

1-1~ men .<.,...,___...............2 9

2.3.4.1 Degradación dc: celulosa., _. _. __, ._ ____.. _. _. _.

2.3.4.2 Degradazion dc lignina. .__.._..

2.4 Importancia del azufre 5-n la nutrición de rumiantes

3 4.1 Metabolismo y rquerimientos de azufre por microorganismos del

mmen.. _.

2.4.3 Síntesis de vitaminas. ._.__. ._____.._._... .._.

2.-l 3 Efecto del azufre sobre las poblaciones de hongos del wmcn. ..__..

3. MATERIALES Y MÉTODOS ..,_.........__,_.....

3 . 1 kluëstra... .._.._......,.. .,_.., ._.,,__..._,.. .¿. 67

3.2 Restricciones _...._.__.... ., ..,, _.____ 6 2

3.3 Localización del área de estudio _. ___. .._. . 6 3

3.4 Técnica de muestreo.. _. _. _. _. _. 6 3

3 .5 Procedimiento. _. 6 3

3 . 6 Descripcion d e l o s a n i m a l e s .._............ ._. 65

3.7 Mediciones.. ._ .___. ._ __ _. _. . . 6 6

3.8 Variables. _, . ._. ._. 6 7

3.9 Análisis estadístico _._. ,_, ..__. . ..___....... .._. 6 8

4. RESCLTADOS _..,.______.._.. .__,. ..__......_....... <. 70

4.1 Digestibilidad de celulosa ____. __ __. _. _.. . . .._._.

4.2 Concentración de glucosa........................................ ................ 7 6

4.3 Determinación de pH.. ................................................. ................. 8 0

5. DISCLWóN ....................................................................................... 8 4

5.1 Digestibilidad de celulosa..................... ,_. ........................ .................. 8 6

5.2 Concentración de glucosa. ............................................ .................. 8 9

5.3 Determinación de pH................................................... ................... 9 0

ANEXO.................................................................................. ................... 9 8

A). kletodo para la determinación de azíxares reductores propuesto por Jue

y Lipke ( 1985)....................................................................... .................. 98

B). Medio de cultivo para los hongos del rumen descrito por- Joblin 1198 1) 9 8C). Procedimiento para la determinación de proteína del formje utilizado

para la dieta de los caprinos:. ................................................................ 9 9

Cuadro 1. Val:jr nutritivo de la dieta utilizada en la alinicntación de los animales 60donadores de inoculo. . .._ ._. __.... .__. .._..

Cuadro 2. Porcentaje de digestibilidad de celulosa pura por hongos del Fumen,con diferentes fuentes. 3 niveles ]I’ 1 tiempos de incubación.. _. 71

Cuadro 3. Concentración de glucosa en el sobrenadante de los medios de cultivopara 10s hongos del turnen, con diferentes fuentes de azufre, 3 :i,rel,es 77v 1 tiempos de incubación itr r+/r’o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Cuadro 4. Vaiores de pH del sobrenadante del medio de cultivo axénico de loshongos del rumen, con diferentes fuentes de azufre. 3 niveicj y 4t i e m p o s d e i n c u b a c i ó n . . _. ___. ., _. __. _. 8 I

. . .Vlll

LISTA DE FIbUK.4S

Figura 1. Di egrama que representa el tracio digestivo como un sistema para

COI;‘. er-bidn de la planta de forraic ti productos finales hasta productos

nurricios que puedan ser utilizado;; por el animal 1

.Figura 2. Cicin 32 \ida de los hongos del ruxn .._.._...., ?<

Figura 3 Inflciencia dei sustrato en el rumw sobre la actividad de la enzima p-g l u c o s i d a s a . . 34. . < . . . . . . . .

Figura 4. E\.oli::ón dc la digestibilidad al 0.15’!~, U: Lwdre.. ,,, 72

Figura 5. ET-olu~!;ln de la digestibilidad af .) _.’ 3-6 d‘ n7ufrc .._.. . . . < . . . 77

Figura 6. E\~olu:lon-de la digestibilidad al O.?i” o dc mifre. _. __. _. .._. 72

Figura 7. Evolu:~on de la glucosa al 0. l-i”,o dc ULI~JL’ _. _. __ _. __. _.. _. _. 78

Figura 8. E\olu~ton de la glucosa al 0.25%, de azufro ..___....._._.__........ .._._. 78

Figura 9. E~~oluaon de la glucosa al 0.35% de wuirc. .._._.._______..___.____...... <.. 75

Figura 10. E\.oluaón del pH al 0. i.í% de amfrc... _.., 8 2

Figura 11. E\.olwión del pH al 0.25% de azufre. _. ._._._. .______..... . ..__. _. ._.._ __ 82

Figura 12. Evoluckn del pH al 0.35?4 de amfrc. ..<............................... 82

INTRODUCCION

Entre los mamíferos con mayor distribución en la Tierra, se encuentran

los rumiantes; los cuales debido a la habilidad única de este grupo para digerir

un amplio rango de vegetación, están adaptados a los ambientes del Ártico,zonas templadas y tropicales. Su microflora presente en el rumen hace posible

la obtención de energía de una amplia variedad de alimentos fibrosos

(McAllister et al., 1994).

.

Para que un forraje sea útil como alimento, debe ser resistente al ataque

de patógenos y parásitos microbianos mientras crece en el campo, y ser

susceptible a la penetración, colonización y digestión por microorganismos

dentro del rumen (Cheng ef al., 1991). Las cutículas aceitosas o serosas, así

como los compuestos protectores (taninos condensados y ácidos fenólicos),

son necesarios para que los vegetales se defiendan y sobrevivan del ataque

microbiano en sus ambientes naturales (Forsberg y Cheng, 1992), pero éstos

impiden la digestión del material vegetal dentro del rumen principalmente a

través de la acción mecánico-enzimática de protozoarios, bacterias y hongos

(Jung y Allen, 1995; Sijtsma y Tan, 1996). Esta microflora es capaz de

degradar compuestos de las paredes celulares de plantas como celulosa y

hemicelulosa (Susmel y Stefanon, 1993).

Los hongos que habitan en el rumen son anaerobios estrictos y se

encuentran también en el tracto gastrointestinal de otros herbívoros (Phillips y

Gordon, 1995). Además, son capáces de degradar eficazmente a la celulosa y

otros polisacáridos estructurales como hemicelulosa, lignina y pectina, que son

base para la generación de energía utilizable por los hongos y bacterias. Asi

mismo forman la base para el metabolismo del herbívoro (Morgavi et al.,

1994).

2

La mayoría de las cepas de hongos del rumen, se han aislado de

rumiantes que viven en clima templado, generalmente alimentados con

pasturas suculentas o altamente digestibles de pajas y concentrados. La

producción de rumiantes en el trópico seco se caracteriza por ser de pastoreo

extensivo y por utilizar pasturas con alto contenido de paredes celulares y por

lo tanto poco digestibles. En este sentido se tienen pocos estudios

relacionados sobre la participación de los hongos en la digestibilidad de

paredes celulares que consumen los animales (Phillips y Gordon, 1995)

Entre los factores que modifican significativamente la población fungal

en el fumen se encuentra el contenido de azufre en las dietas o forrajes

ejerciendo una mayor degradación sobre las paredes celulares del forraje

(Gordon y Phillips, 1995).

Los hongos limitan su crecimiento en ausencia de los aminoácidos

azufrados como cisteína y metionina, lo que interfiere en la degradación de las

paredes celulares del forraje que consume el rumiante. Es muy posible que

los hongos ruminales puedan sintetizar sus proteínas a partir de fuentes de

azufre (Onoda et al., 1996), sin embargo, los requerimientos específicos de

este elemento no han sido suficientemente esclarecidos, por ello se pretende

evaluar la digestibilidad de celulosa in vitre, variando las fuentes y

concentraciones de azufre, y los periodos d e incubación. Así como

determinar la cantidad de glucosa generada en la fermentación de celulosa y

determinar los niveles de pH [H’] para cada uno de los tratamientos.

LITERATURA CITADA

Cheng, K.J., McAllister, T.A., Kudo, H., Forsberg and Costerton, J.W. 1991.Microbial strategy in feed digestion. In: Recent Advances on theNutrition of Herbivores (Y.W. Mo, H.K. Wong, N. Abdullah and Z.A.Tajuddin eds), pp 181-I 87. Vinlin Press, Kuala Lampur, Malaysia.

Forsberg, C.W. and Cheng, K.J. 1992. Molecular strategies to optimize forageand cereal digestión by ruminants, In: Biotechnology and Nutrition (D.Bilis and S.B. Kung eds.), pp. 109-147. Butterworth-Heinemann,Stoneham, MA.

Gordon, G.L.R and Phillips, M.W. 1995. New approach for the manip;lation ofanaerobic fungi in the rumen. In: Recent Advances in Animal Nutrition inAustralia, (J. B. Rowe and J.V. Nolan eds) 708-7 75

Jung H. G. and Allen M. S. 1995. Characteristics of plant cell walls affectingintake and digestibility of forages by ruminants. J. Anim. ScL- 73: 2774-2790.

McAllister T.A, Bae H. D.; Yanke, L.J.; Cheng: K. J. and Ha, J.K. 1994. A reviewof microbial digetion of feed particles in the rumen. AJAS 7 (3): 303-316.

Morgavi, D. P., Sakurada, M., Mizokami, M., Tomita, Y. and Onodera, R. 1994.Effects of Ruminal protozoa on cellulose degradation and the growth ofan anaerobic ruminal fungus, piromyces sp. strain OTSI, in vitre. Appl.Environ. Microbio/. 60: 3718-3723

Onoda, A.; Kobayashi Y; Hoshino S. 1996. Effects of anino acids on the growthof an anaerobic rumen fungus Neocallimasfix sp N 13. Reprod. Nufr.Dev. 36: 31 l-320

Philips, M. W. and Gordon, G.L.R. 1995. Carbohydrate fermentation by threespecies of polycentric ruminal fungi from cattle and water buffalo intropical Australia. Anaerobe 1: 41-47.

Sijtsma, L., Tan, B. 1996. Degradation of perennial ryegrass leaf and stem cellwalls by the anaerobic fungus Noecallimastix sp. Strain CS3b. Appl. andEnviron./ Microbio/, 62 (4): 1437-I 440.

Susmel P. and Stefanqn B. 1993. Aspects of lignin degradation by rumenmicroorganisms. J. of Biofechnol. 30: 141-I 48.

2. INFLUENCIA DEL AZUFRE EN LA DEGRADACION DE LAS PAREDES

CELULARES DE FORRAJES POR HONGOS DEL RUMEN.

2.1 El trópico seco y la producción animal.

Dentro de los animales, los rumiantes son los más ampliamente

distribuidos sobre la tierra, estos se adaptan a los ambientes tropicales y

templados. Su amplia distribución es debido a su capacidad para digerir una

amplia gama de vegetación (McAllister et al ., 1994; Fichney, 1996)

.

Entre los factores del medio ambiente que tienen reacciones diferentes

en los trópicos sobre los rumiantes se incluye al bajo contenido de nutrientes

en los forrajes que consume el animal, el cual esta asociado a la baja

digestibilidad, También se encuentra la variación en el contenido de nutrientes

de acuerdo su estado de madurez, asi mismo; la gran incidencia de

enfermedades parasitarias en rumiantes en pastoreo, asi como la imposición

que se tiene debido al estres calórico a través de la combinación de

temperatura alta con humedad elevada (Leng, 1988).

Los requerimientos de nutrientes para los rumiantes es complicada porque en LP@

el sistema digestivo fermentativo, lo cual se alteran los nutrientes en el 5iPbb

alimento a productos finales de la digestión microbiana en el rumen (Leng,\

1985).

Para la aplicación de principios nutricionales para la alimentación de

rumiantes. Se deben considerar ciertas imposibilidades por el medio ambiente

La primera es la baja cantidad de proteína en las plantas, la segunda que el ($@‘/

forraje es deficiente en nutrientes esenciales que son necesarios para Q/

eficientar la fermentación en el rumen (Leng, 1988).

5

2.1.1 Caracterización de los forrajes en el trópico seco.

Los forrajes tropicales son difíciles de cosechar por los múltlipes cambios

que se originan en relación a su calidad. El valor nutritivo de los forrajes es

bajo por la selección genética que se han dotado; formándose estructuras

protectoras en gran predación. La digestibilidad baja de una planta madura

bajo este ambiente es muy característico por su crecimiento y maduración

(Van Soest, 1982).

El producto de la fotosíntesis de estos forrajes se compqne de 4

carbonos (C,), mientras que los forrajes de clima templado están compuestos

de 3 carbonos (C,). Las plantas C4 son más eficientes en su fotosíntesis,

presentan una cantidad elevada de peso seco y bajo valor nutritivo. Además

tienen la particularidad de adaptarse a condiciones con altas temperaturas y

periodos de sequía prolongados (Van Soest, 1982).

El ambiente tiene influencia significativa sobre el contenido de la pared

celular y la digestibilidad en el forraje. La temperatura es el factor que más

influye, presentándose una lignificación elevada de la pared celular y una

maduración rápida de los tejidos. Este efecto se ha observado más en los

forrajes de clima templado y clima tropical, siendo mayor en forrajes que en

leguminosas y en tallos que en hojas. El desarrollo de los forrajes utilizados

como alimento para el ganado en las zonas tropicales y subtropicales son de

naturaleza fibrosa, tienen bajo contenido de nitrógeno y son menos digestibles

que las especies de las zonas templadas. A mayor cantidad de luz el contenido

de la pared celular se incrementa y la digestibilidad disminuye (Aagnes et al .,.1996).

Las características de la pared celular tiene influencía sobre la calidad

nutritiva en la baja digestibilidad y la dificultad para disminuír el tamaño de

partícula (Wilson, 1993)..

2.2 Condiciones ambientales del turnen.

El fumen es una porción del tracto @gestivo altamente especializado

que facilita el almacenamiento y prcesamiento microbiano de una gran

cantidad de forraje. La degradación y utilización del material ingerido por

rumiantes es regulado por la planta, animal y factores microbianos. De esta

manera el rumen aporta un ambiente adecuado para el crecimiento de

numerosos microbios estrictamente anaerobios, los cuales son los

responsables de la degradación del forraje que ingresa a él. El crecimiento de

estos microorganismos depende de las condiciones ambientales qel rumen

(Trinci ef al., 1994, Selinger et al., 1996)

Entre las condiciones ambientales se encuentran la temperatura que se

mantiene entre 38 a 41°C, potencial redox -250 y - 450 mV. reflejándose un

medio fuertemente reducido y la ausencia de oxígeno, mantiene pH entre 5.8

a 6.8. La composición del gas del rumen es variable pero contiene valores

comprendidos entre 65% de CO2 y un 35% de metano (Lin et al., 1985) (Fig.

1).

El rumen se mantiene estable, debido a la presencia de ácidos

orgánicos producidos durante la fermentación de los alimentos y el flujo de la

saliva en la cual existen bicarbonatos y fosfatos (Hobson y Wallace, 1982).

De la fermentación de polímeros de las plantas a compuestos simples

por los microorganismos del rumen resulta la producción de tres ácidos grasos

volátiles, normalmente encontrados en las proporciones de 56-70% de acetato,

17-29% de propionato y 9-19O/6 de butirato (Lìn et al., 1985)(Fig.l)

7

PARTES DEL SISTEMA CONDICIOIIES Y ACTIVIDADES DEL SISTEMA D I G E S T I V OD I G E S T I V O

B O C A

R u m e n -reticulo

Ornas0

AbomasoIn tes t ino de lgado

-wIn tes t ino g rueso

Recto y ano

Ftt. 1, Diagrama

ul Mastkacti ! humedec im ien to de l a l imen to de p lan tasl Sumin ins t r c !X ác ido carbón ico y agua (sa l iva y beb ida ,l fkracii y fermentac ión de gases (amoniaco y COZ

l CONDICICJ’tESpo tenc ia l 6x03 reducc ión = -250 a 450 mVpH 5.6 a 6 6Temperatun 39dCOsmolaridao 433 mOsmol<g’

l Organismz (concentracidn aproximada /g’ d e di-)Bac te r ias IO’O - 10”ProtozoaBcs 10” - 10’Hongos 1 d un idades fwmadoreas de t a l l os

l Productos ce la fermentación (concentracibn aproximroajAce ta to 60mMPropionarc MmfvlBut i ra to 10mMco2 6 5 %CH. 2 7 %

‘.’

Sekcción oe oarticulas pequenas de plantas

y celulas rncobianas para el resto det tracto =>diges t i vo . AQwción de l í qu idos

Digesti6n g&&-ice -Idrólisis ácida de biomasa Carbohtdratwrnicrobtana y algunvs te j i dos de p lan tas Amiînáci

3Ac. grasosVfinas

Ws farmentaciór; -microbiana

Forrnaci4n y elimrración de heces,

contentendo bactews viables y

hongc6 anaerob ios

u

Acetato

Prop ionatoBut i ra to

Usados por fos tejidosdel animal para reacciones

de biosfntasts y c rec imien to

que representa el tacto digestivo como un sistema para conversión de la planta de forra@ a

productos finales a productos nutricios que ouedan ser utiridos por el animal (Lin et al., 1935)

8

La fase gaseosa en el rumen se encuentra variando en su composición

pero contiene COn (65%), CH4 (27%), N (7%), 0 (0.6%), H (0.2%) y H2S

(0.1 Oh) (Trinci et al.,1 994). La presión osmótica puede estar entre 250 a 450

osmoles, una presión osmótica alta es detrímental a la función del rumen,

disminuyendo la absorción de ácidos grasos volátiles (Hoover y Miller, 1991).

2.2.1 Fisiología digestiva del rumen.

La mayor proporción de la dieta para rumiantes es a base de forraje, el

cual es fermentado en el rumen. El material alimenticio es fermentqdo hacia

azúcares, almidones, carbohidratos complejos de paredes celulares y proteína;

estos se convierten dentro de células microbianas y ácidos grasos volátiles,

aminoácidos y vitaminas, lo cual son la fuente principal de nutrientes para el

animal. El contenido de proteína de celulas microbianas es dependiente de

una fuente de nitrógeno adecuada (Leng, 1988; Mackie y White, 1990;

Selinger et al., 1996).

Los rumiantes se alimentan con dietas a base de materiales vegetales

compuestos principalmente de celulosa, hemicelulosa y lignina. Los herbívoros

no pueden sintetizar enzimas que degradan las paredes celulares de las

plantas, esta limitante la han superado por su propia evolución, en función de

la dependencia de los microorganismos que realizan estas funciones; y que

además, desarrollan cambios específicos en la fermentación en el rumen.

Además, pasan continuamente dentro del abomaso y son digeridos en el

intestino donde su producto del metabolismo es la fuente de energía para el

rumiante (Patterson, 1989).

El material ingerido por el rumiante es retenido en el rumen hasta que la

medida de las partículas son reducidas suficientemente por masticación y

acción microbiana permitiendo el tránsito hacia el intestino (Wilson, 1993).

Y

2.2.2 Absorción de nutrientes a través de la pared del rumen.

El estudio de la fisiología del rumen resulta interesante para entender la

nutrición en el rumiante (McAllister et al., 1994; Fichney, 1996). Como

participación en la fermentación del material vegetal, la población microbiana

aporta fuentes de carbono, energía y proteína microbiana al animal rumiante. En

su mecanismo de fermentación elaboran productos generados a partir de éste

como acetato y lactato que pueden ser absorbidos directamente pasando el

epitelio no glandular del rumen y ser utilizados como nutrientes (Teunissen et al.,

1991; Trinci et al.) 1994; Mukhopadhyay y Kurar, 1995). *

Los ácidos grasos volátiles son absorbidos lentamente a través de la pared

del rumen; la proporción de absorción depende de la longitud de la cadena de

estos ácidos, pH, concentración y osmolaridad. Entre un pH de 4.5 y 6.5, el grado

de absorción de los ácidos grasos volátiles es mayor el butirato que el propionato

y mayor que el acetato. Los microorganismos del rumen producen ambos lactato

levógiro y destrógiro en cantidades iguales y son facilmente absorbidos (Hoover y

Miller, 1991).

La glucosa, también puede ser absorbida a través de la pared del rumen,

pero está presente en cantidades insignificantes. El amoniaco es de facil

absorción, dependiente de la concentración y el pH. La absorción es rápida y alta

a un pH de 6.5 y declina a cero a un pH de 4.5. En este caso la absorción de

aminoácidos toman su lugar, pero las concentraciones de estos son muy bajas,

representando menos del 10% del total de nitrógeno absorbido del rumen (Hoover

y Miller, 1991)

2.2.3 Participación microbiana en la digestión de paredes celulares en el

rumen.

Los microorganismos del rumen se adhieren a la pared del rumen y están

presentes en el fluido -deI rumen y más del 75% se asocia a las partículas

parcialmente digeridas. El grado de colonización es dependiente de cada especie

microbiana (McAIIister et al., 1994). Algunas especies celulolíticas se adhieren

íntimamente a la pared celular de la planta (Fibrobacfer succinogenes), otros

desarrollan su papel digestivo en la superficie de la pared celular

(Ruminococcus). Los hongos ruminales producen hifas los cuales, atacan sus

substratos y penetran estructuras resistentes de las plantas ( Bonhomme, 199Oj.

La saliva, es considerada el vehículo adecuado para la transferencia de

microorganismos; es posible la ingestión inadvertida de éstos a par;tir de heces

frescas en animales jóvenes y estas heces contienen esporangias en la pastura

siendo un posible medio para la transferencia entre animales adultos del mismo

grupo (Lowe et al., 1987b; Munn ef al., 1988).

El grado en la cual los microorganismos penetran y digieren componentes

intracelulares ricos en nutrientes esta determinado por la composición química y

mecanismos protectores de la planta (McAllister ef al., 1994; Jung et al., 1995).

Engels y Brice (1985) mencionan que las paredes de células lignificadas de

rastrojos actúan como una barrera para los microorganismos del fumen, sin

embargo el modo de crecimiento rizoidal de los hongos puede vencer y penetrar

esa barrera.

2.2.4 Asociación de microorganismos y alimento en el rumen.

El rumen de animales recién nacidos está libre de microorganismos, las

bacterias predominan dos días después del nacimiento, siguendo los protozoarios

y los hongos, que aparecen después de 8 a 10 días ( Fonty et al., 1987).

La extrema asociación entre bacterias y enzimas que digieren las

partículas de alimento tiene especificidad para cada substratos (Pell y Schofield,

11

1993). Existen componentes naturales de la pared celular que impiden el proceso

de digestión microbiana de asociación y adhesión como son los taninos sílica o

terpenos (Bae et al.: 1993).

De los materiales alimenticios de planta utilizados por rumiantes. el forraje

es uno de los más importantes, éste puede permanecer en el rumen por 2 ó 3

días y posteriormente ser fermentado por los microorganismos albergados en este

lugar (Teunissen et al., 1991).

Los vertebrados son capaces de producir celulasas y hemicwlasas y

muchos herbívoros han evolucionado en asociaciones simbióticas con bacterias,

protozoarios y hongos, los cuales producen estas enzimas que son cagaces de

degradar polímeros de la plantas (Trinci et al., 1994; Mukhupadhyay I/ Kurar,

1995).

Existen interacciones entre estos microorganismos que son esenciales

para mantener el ecosistema del rumen, es por eso que cualquier trabajo donde

se pretenda incrementar la degradación de polímeros de la pared celular como la

celulosa es de mucho interés en la actualidad (Fonty et al., 1995).

Las interacciones entre hongos y bacterias no metanogénicas cel rumen

pueden establecer un mecanismo de competencia, sinergismo o simbiosis. Las

bacterias Selemonas ruminantium, consumen hidrógeno y compuestos similares

como succinato y lactato; además, digieren celulosa en presencia de

Neocallimastix sp y Caecomyces communis (Marvin-Sirkema et al., 1990). Sus

interacciones son poco conocidas y difíciles de determinar. Recientemente se

han encontrado mycoplasmas asociados con un gran número de hongos aislados

en bovinos (Kudo et al,, 1990).

12

La simbiosis entre hongos y bacterias metanogénìcas en el fumen es muy

común. Bauchop y Mountfort (1981) mostraron que los cultivos de Neocahnasfix

frontalis degradaron más extensamente el papel filtro en presencia que en

ausencia de bacterias metanogénicas.

Akin et aL(1983) demostraron que la presencia de hongos en el rumen

contribuyen significativamente en el consumo voluntario y la digestion del

alimento fibroso en ovinos.

Los hongos hacen más accesibles los fragmentos de las plantas a las

bacterias que se encuentran presentes en el rumen y fermentan algunos

monosacáridos como fructosa, glucosa y xylosa (Phillips y Gordon, 1992;

Theodorou et al., 1988 Gordon y Phillips, 1989).

Se ha demostrado que algunos hongos se incrementan con la defaunación

de los animales. -Rómulo et al. (1986, 1989) mostraron un incremento de entre 3 y

4 veces la concentración de zoosporas y esporangias de hongos en la

defaunación de ovinos. Se han reportado evidencias por Orpin (1989) que al

eliminar a los ciliados por defaunación también se incrementa la población fungal.

Los hongos del Turnen tienen acceso a los polisacáridos no disponibles

por bacterias celulolíticas, lo que significa que pueden penetrar las paredes

celulares de la planta por acción mecánica o enzimática o una combinación de

ambas (Kolattukudy, 1985), también se pueden detectar sobre fragmentos de

alimento a las 2 ó 3 horas después de haber sido ingeridos (Bauchop, 1986).

Akin y Rigsby (1987) encontraron que los hongos solos pueden degradar la

misma cantidad de fibra como hongos y bacterias a la vez.

1 3

2.2.5 Importancia de la adaptación a la dieta alimenticia.

En el fumen, la adaptación de los microorganismos se puede dar con

especies individuales o con una población microbiana completa. En verano, los

nutrientes son facilmente disponibles y la población microbiana asociada a la

pared del rumen es variada y compleja. Al contrario, durante el invierno cuando

el forraje es de baja calidad, el número de celulas bacterianas es limitada (Cheng

et al., 1993).

La dieta es el factor más importante que influye en el medio ambiente del

rumen, como el grado de procesamiento de alimento, la presencia de aditivos

alimenticios, la proporción de grano al forraje en la dieta que afecta el número,

proporción y actividad digestiva de los microorganismos ruminales. Los

microorganismos cultivados en el laboratorio sobre substratos artificiales tienen

poca invariabilidad sobre su capacidad digestiva (Cheng ef al 1991 c).

Los microorganismos que digieren componentes de la pared celular son

diferentes a los que digieren almidón, esto se ha experimentado en ganado

alimentado con granos de cereal comparado con alimento a base de forrajes

(McAllister ef al., 1993). La naturaleza estable de adaptación a la población

microbiana asegura que el hospedero animal recibe una continuidad, uniformidad,

suplencia de ácidos grasos volátiles y. proteína microbiana para mantenimiento,

crecimiento y reproducción (McAllister et al., 1994).

2.2.6 Manipulación en la digestión del alimento.

Una de las áreas más importantes de los estudios de la nutrición animal es

la de suplementación de alimentos, estos suplementos pueden disminuir el estrés

calórico, incrementan la conversión de la fibra, desarrollo en el animal, asi como

la producción de leche en rumiantes (Harper et al., 1996).

Los tejidos estructurales de las plantas dan lugar a grandes contenidos de

partículas en el rumen, éstas son resistentes a la reducción del tamaño de

partícula por la masticación y digestión Esta partícula debe ser reducida a 1 mm

antes de su ingreso al fumen y requiere un periodo de tiempo largo de retención

en el rumen para este propósito, teniendose como efecto que el alimento sea

consumido en bajas cantidades, resultando un rendimiento muy bajo en el animal

(Mackie y White, 1990).

Para que resulte un mejoramiento significativo en la prqducción de

rumiantes es esencial un entendimiento del proceso microbiano de penetración,

asociación, formación y adaptación asi como de de la manipulación química o

biológica del alimento a base de forraje de baja calidad como ejemplos primarios

de tratamientos (Mason et al., 1990; Eriksson, 1990).

Los forrajes con alto contenido de paredes celulares no son digeridos en el

intestino, por eso se considera necesario estimular la digestión microbiana en el

rumen. Se están evaluando gran cantidad de moléculas como aditivos

alimenticios en el rumiante, la mayoría de ellos son usados para un a función

específica, pero ellos intervienen a varios niveles para producir una variedad de

efectos sobre el animal (Jouany, 1994)

Es esencial una penetración y digestión microbiana del alimento y para

este fin es necesario el rompimiento de barreras que hacen resistencia utilizando

un procesamiento mecánico para utilizarlo como un medio de manipulación para

incrementar la digestibilidad del alimento en el turnen (Fahey et al., 1993; Wilson,

1994).

El valor nutricional de las plantas depende del estado físico de la planta a

la cosecha sobre madurez y contenido de paredes celulares y características que

son genéticamente caracterizadas (Waghorn, 1990).

Con la finalidad de evaluar la importancia de los hongos dentro del rumen

se han realizado pruebas para su eliminación en tratamientos in vivo alimentando

animales con un rastrojo de trigo, tratado con cloruro de sodio, pero este

mecanismo no ha funcionado (Ford ef al., 1987).

Los hongos del rumen ayudan al flujo del alimer;to dentro tracto digestivo e

incrementan su consumo; sin embargo, no está bién establecido una relación

directa en la degradación fungal de las paredes celulares con relación,al consumo

de alimento a base de forrajes con elevado contenido de paredes celulares y

requiere de más estudios (Akin y Borneman, 1990).

La colonización por hongos en forrajes (como determinación de cuentas

esporangiales sobre hojas blandas) fue substancialmente mayor cuando se

incluyeron antibióticos antibacterianos en el fluído del rumen de ovinos (Akin y

Windham, 1989).

Cuando se agregan grandes cantidades de harina a dietas ricas en granos

ofrecidas a intervalos de tiempo de dos o tres días, las zoosporas estan ausentes

de el rumen; lo que explica los efectos de una fermentación bacteriana de los

carbohidratos solubles evitando asi, la zoosporogenesis de los hongos y su

sobrevivencia en el rumen o bien, se atribuye a la depresión del pH ruminal con

un valor igual a 5.0 o menor (Gordon, 1985).

La disminución de pH del fluido del rumen a 5.5 por la adición de grandes

cantidades de azúcares solubles eliminaron a los hongos por un corto tiempo,

este tratamiento tiene efectos negativos sobre otros componentes del ecosistema

ruminal (Grenet et al., 1989).

16

La máxima estimulación para la produccióin de microorganismos fue dada

por glutamato, seguido por serina y metionina. La hemina es una proteína

necesaria para la formación de hemoproteínas en muchos microorganismos y

también es similar para los hongos del rumen. El papel principal de la hemina en

el metabolismo no se conoce, pero se ha comprobado que la hemina puede

inducir la zoosporogénesis en hongos del rumen (Orpin, 1989). Por el contrario la

falta de triptófano, tirosina y fenilalanina reduce el crecimiento de acuerdo al

medio que contenga una mezcla completa de aminoácidos, lo cual indica que los

hongos tienen dificultades para sintetizar aminoácidos aromáticos ,(Li y Heat,

1993).

Las hemicelulasas se han descrito por gran número de trabajos (Mountfort

y Asher, 1989) produciéndose en mayor cantidad cuando los hongos del rumen

crecen sobre celulosa, celobiosa, glucosa o xylosa (Lowe et aI., 19874).

El contenido de lignocelulosa en la dieta es un factor que determina la

presencia de poblaciones normales de hongos en el rumen. Las dietas a base de

ensilado de sorgo o de maíz reducen el número de hongos en el rumen por el

gran contenido de carbohidratos; asi como tambien los carbohidratos altamente

fermentados en la dieta como el almidón o granos, soportan bajas poblaciones de

hongos (Grenet et a/.,1989; Ho et al., 1991).

Además de la influencia de los nutrientes disponibles para la actividad

hemicelulolítica, las variaciones del pH atribuídas al tipo de alimento disponible

en el rumen pueden tener efectos significativos sobre el crecimiento y la

formación de enzimas que degradan los polisacáridos ( Williams y Orpin, 1987b).

Una cantidad de glucosa elevada es inhibidora de las enzimas

carboximetilcelulasa y P-glucosidasa (Wood ef al., 1988).

2.3. Estructura de la pared celular de las plantas y su degradación por

hongos del rumen.

La digestibilidad de la materia seca de un forraje es la clave que determina

la producción animal, este factor está influido por la proporción de paredes de

paredes celulares, la resistencia del forraje y estructuras fibrosas a la disminución

del tamaño durante la masticación (Wilson y Mertens, 1995, Wilson y hatfield,

1997). Es necesaria la digestión de la pared celular rápida por los microbios del

turnen y una trituración efectiva por la masticación para reducir el, tamaño de

partícula para que pase rápidamente y permita altos consumos de forraje,

(Deschamps et al., 1996).

La digestión ruminal de hemicelulosa, aunque extensa, resulta incompleta

alcanzando una digestión de 10 a 30% de la dieta (Wilson, 1993), algunas de las

causas que limitan su digestión son: a) la naturaleza física y química de la fibra

b) la cinética de digestión ruminal c) la naturaleza y densidad de población de las

especies de microorganismos que digieren la fibra d) la acción enzimática de

microorganismos sobre carbohidratos de la pared celular. Otros factores

principales que limitan la digestión de la pared celular del forraje en el rumen son:

características de los polisacáridos que dependen de las plantas, factores del

hospedero, componentes de la dieta y pH en el rumen (Wilson, 1994).

El contenido de la pared celular de un forraje es nutricionalmente

importante, ya que un alto contenido de estas paredes celulares ofrece una baja

digestibilidad (Stefanon et al., 1998). La dieta elevada en fibra tiene efecto

positivo sobre la población de hongos del rumen (Bauchop, 1989b).

La producción animal está determinada por el consumo y digestibilidad de

materia seca de un forraje. Ambos están influenciados por la proporción de las

paredes celulares y la resistencia y estructuras fibrosas a la disminución y tamaño

de partícula durante la digestión por los microorganismos del rumen (Wilson,

1994).

Las paredes celulares de las plantas aportan la principal fuente de energía

para más de 1.4 X 10’ unidades de ganado rumiante en el mundo (Wilson, 1994).

El contenido de la pared celular de un forraje se considera nutricionalmente

importante ya que un contenido elevado de ésta, disminuye su digestibilidad y

son consumidos en bajas cantidades por rumiantes. Las paredes celulares

representan un rango entre 30 y 60% del peso seco; también se encuentran en

menor cantidad en hojas que en tallos, en plantas leguminosas que en gramíneas

y en plantas jóvenes que en adultas (Minson, 1990; Stefanon ef al., 1996; Lewis

et al., 1996). Este bajo grado de digestión es variable y se inspira a mejorar las

características de la pared celular (Karunanandaa y Varga, 1996).

La digestión de los polisacáridos se dificulta debido a la estructura

molecular, degradación de enlaces, presencia de constituyentes esterificados,

lignificación y grado de enlaces cruzados, solubilidad y medida de partícula, entre

los factores dependientes de las plantas podemos mencionar la madurez, así

como la presencia de sílica y cutícula en la pared celular de la planta ( Stewart,

1986).

En relación a los factores del hospedero se tiene el coeficiente de medida

de partícula; retención de partícula, coeficiente de tránsito, anatomía intestinal, pH

del tracto intestinal y población microbiana y en los componentes de la dieta los

azúcares, almidón, grasas, cantidad del alimento consumido, procesamiento de

alimento y la presencia de manipulantes químicos o antibióticos (Stewart, 1986).

19

La celulosa y hemicelulosa unidos con pectina y parte de ácido

poligalacturónico se consideran componentes estructurales que se encuentran

en mayor cantidad en las paredes celulares de el forraje (Wilson, 1993).

La celulosa es uno de los compuestos orgánicos que se encuentra en

mayor proporción en el mundo y se producen 10” toneladas anuales sobre la

tierra, la mayoría se produce de los residuos de cosechas y terrenos madereros.

La celulosa es ampliamente disponible y además representa una fuente de mucho

valor renovable accesible en todas las naciones desarrolladas o e[l desarrollo

(Halliwell y Halliwel, 1995).

La celulosa es el más abundante de todos los polisacáridos, esta constituye

una fracción insoluble de la fibra ligada a una fracción lineal p-1,4 de varias

moléculas de glucosa. La celulosa es un polímero lineal con ligaduras

glucosídicas p-1,4 D-glucana. Las cadenas de p-1,4 glucana de celulosa se

encuentran agregadas a estructuras llamadas microfibrillas. El grado de

polimerización de la celulosa en la pared secundaria es muy alta con un valor de

14 000 moléculas de glucosa (Carpita y Gibeaut, 1993; Liyama et al ., 1994;

Denman ef a/., 1996).

La hemicelulosa está compuesta de una mezcla de polisacáridos que

incluyen xilanos, glucanos, mananos, galactanos y arabinanos. Los xilanos

constituyen la mayor proporción de Ilas fracciones de hemicelulosa, puede

comprender hasta el 40% del total de los carbohidratos encontrados en las

paredes celulares. Su importancia se debe a su unión tan estrecha con los ácidos

fenólicos (Besle et al., 1994).

20

Los forrajes presentan en su naturaleza física y química, una barrera para

su digestión completa en el rumen. La celulosa comprende de 40 a 50% de la

materia seca y la hemicelulosa de 20 a 30% de las plantas vasculares (Wilson,

1994).

2.3.1 Aspectos generales de los hongos del rumen.

Obispo y Dehority (1992) encontraron que al ofrecer una dieta compuesta

solo de paja o mayor de un 80% de granos de cereal con paja con frecuencia de

alimentación de una comida diaria, se mantuvo una cantidad S normal de

zoosporas en el rumen (1 O3 - 1 O4 /ml).

Los hongos del fumen están presentes en las especies más importantes de

los rumiantes domesticados (ovinos, cabras, bovinos y búfalos), también se

encuentran en otras especies de animales herbívoros, como antílopes, venados,

camélidos, canguros, caballos y elefantes (Fonty y Joblin, 1990, 1991). Además,

se han aislado de todas las porciones del tracto digestivo y la saliva, heces

frescas y secas de rumiantes adultos ( Munn et al .,1988; Trinci et al., 1994).

Los hongos saprófitos del rumen son capaces de crecer en medios

complejos y definidos (Lowe et al., 1985). Provocan un rompimiento substancial a

la planta fragmentándola y separando lignina de hemicelulosa (Akin et al., 1989;

Joblin, 1989; Gordon y Phillips 1989).

La morfología de la esporangia depende del ciclo de vida y condiciones de

crecimiento, esto a sido poco usado taxonómicamente, y ésta puede medir de 21

X 9 ym a 200 X 140 Pm y pueden ser ovales o cilindrìcas ( Orpin, 1975).

2.3.1.1 Taxonomía.

Las correcciones en su clasificación han sido confirmadas por comparaciones

recientes de secuencias genéticas de los hongos (Dore y Stahl, 1991; Bowman et

al., 1992; Li y Heath, 1993).

Su morfología y estructura es guiada para la identificación como la clase

de hongos Chitridiomycetes (Heath ef al., 1983).

Los hongos producen zoosporas y pertenecen a la clase Chitridiomycetes.

Existen muchas similitudes entre las familias y géneros. Los hongos del rumen

son clasificados taxonómicamente por: Barr (1988) y Barr et al. (1989) en:

División: Eumicotina

Subdivisión: Mastigomicotina

Clise: Chytridiomycetes

Orden: Spizellomycetales

Familia: Neocalimasticaceae

Género: Caecomyces (zoospora con uno o dos flagelos)

Neocallimastix (zoospora con 4 ó 20 flagelos)

Piromyces (zoospora con 1 ó 4 flagelos)

Orpinomyces (zoospora multiflagelada)

Anaeromyces (zoospora con un flagelo)

2.3.1.2 Ciclo de vida.

Los hongos del rumen son un grupo de microorganismos que tienen la

habilidad de producir zoosporas móviles wmo parte de su ciclo de vida. Después

de que se libera la esporangia, las zoosporas permanecen viables ahí por cierto

tiempo, formándose una vesícula la cual germina bajo condiciones apropiadas

produciendo uno o dos tubos germinativos, para luego desarrollarse dentro del

tallo vegetativo nuevamente, tienen movimientos amiboideos y permanecen

móviles por periodos que fluctuan entre minutos u horas. El ciclo completo se

realiza en 24 h in vitre. El espacio de tiempo de un ciclo de crecimiento fungal

típico in vivo no ha sido registrado, pero ésto no podría ser más de 15 a 18 h, esto

se basa en el tiempo de retención de partículas de alimento dentro del rumen.

(Lowe et al., 1987 a).

Su forma es esférica u oval y desarrollan esporangias, como micelio; se

reproducen de manera asexual mediante la liberación de zoosporas unicelulares

de partición citoplásmica en cada esporangia (Heath, 1988; Bauchop, 1989a).

Después de la desaparición de sus flagelos, las zoosporas se esparcen con los

cinetosomas, y posteriormente se lleva a cabo la eclosión (Li et al., 1990). Las

zoosporas de los hongos pueden ser poliflageladas o uniflageladas, dependiendo.

del género, en las especies poliflagelados, los flagelos toman una dirección

cerrada como si fuera un solo flagelo e impulsan zoosporas en forma de espiral

(Wubah et al., 1991a). (Fig. 2)

, \

Fig 2. Ciclo de vida de lcp hongos anaerobios (Marvin -Sikkema, 1994)

2.3.1.3 Fisiología y metabolismo.

Sus requerimientos nutricionales son similares a otros hongos saprófitos

considerando las fuentes de carbón y nitrógeno. Sin embargo, en relación a su

hábitat, los hongos desarrollan algún requerimiento especial para su crecimiento y

desarrollo (Lowe et al., 1985).

Los hongos tienen la característica de ser más resistentes a monómeros

fenólicos que las bacterias (Borneman ef al., 1990, Tanaka ef al., 1992)..

En los protozoarios y hongos el piruvato es convertido en acetil-CoA y

COZ por piruvato:ferredoxina oxidoreductasa; y los electrones producidos, son

canalizados a la formación de hidrógeno derivado por un proceso complejo donde

intervienen en acetil COA de la reducción de la ferredoxina por una hidrogenasa,

proceso que además forma acetato, donde toman lugar los hidrogenosomas,

siendo los organelos análogos a la mitocondria en algunos eucariotes

estrictamente anaerobios ( Finlay y Fenchel, 1989).

2.3.1.4 Características de los géneros de hongos más importantes.

El género de los hongos se determina en base a la forma de sus tallos

(monocéntrico y policéntrico), el tipo de rizoides (filamentos o bulbos) y el número

de flagelos por zoospora, las especies se definen en base en la estructura de la

zoospora ( Munn,1994; Nielsen et al.,1 995).

Los hongos monocéntricos presentan una zoospora que produce

solamente una esporangia, con toda la división del núcleo contenida en él.

También se reportan tres géneros de hongos monocéntricos, distinguiéndose de

otros por la producción de zoosporas uniflageladas o multiflageladas, además por

la posición de cada uno de los filamentos y rizoides que están altamente unidos.

Los nombres de estos géneros son: Neocallimastix, Piromyces, Caecomyces y

Sphaef-omonas (Li et al., 1993).

Neocallimastíx : Se han encontrado diferencias en la morfología micelial de los

hongos del rumen, las especies de Neocalimasfíx poseen muchos rizoides con

una longuitud de 35 x 2.5 Pm y se encuentran ampliamente unidos. Las zoosporas

de Neocallimastix frontalis, son de las especies con las dimensiones más largas

de 8 x 20 CLrn y además, son de estructura ovoide, sus organelos constan de un

núcleo, ribosomas e hidrogenosomas. No se observa retículo endoplásmico y

todas las zoosporas son mótiles (Barichievich y Calza, 1990a). Las zoosporas de

Neocallimasfix sp no germinan a menos de 25°C o arriba de 42°C (Lowe et al.,

1987c).

Pyromyces: Aunque se ha encontrado en Piromonas spp que existen rizoides

hasta de 734 Pm y se ha clasificado que tienen un sistema altamente

desarrollado ((Barichievich y Calza: 1990a). Las zoosporas de Piromonas ssp

poseen dimensiones de 7.1 x 14.6 prn su morfología es la misma cultivándola in

vibro o in vivo. Los organelos se encuentran dispersos y su contenido es de

apariencia granular. Presentan hidrogenosomas y todas las zoosporas son

mótiles. Las zoosporas flageladas de Piromonas communis en crecimiento in vitre

e in vivo es de morfología similar. Las zoosporas de Sphaeromonas ssp. son

esféricas con diámetro aproximado de 4 a 8 Pm. Los organelos son globulares

(0.2 - 0.5 Pm) y consisten de gránulos densos y algunas veces unidos con una

membrana. también se encuentran hidrogenosomas en ausencia de mitocondrias

(Barichievich y Calza, 1990a).

Caecomyces: Es característico por poseer especies con zoosporas uniflageladas

que tienen un estado vegetativo. La especie equi, de las heces de equino, es la

que se ha descrito ampliamente. Las colonias de Caecomyces equi crecen sobre

26

celobiosa in vitre, siendo de apariencia granular, tienen un crecimiento lento

comparado a Neocalhmastix spp y Piromyces spp. (Gold et al., 1988)

Sphaeromonas; Las Sphaeromonas no poseen rizoides. (Barichievich y Calza,

1990a). Las zosporas son esféricas a lipsoidales ó amivoidea, con un solo

flagelo. El nucleo es central con sus organelos distribuidos a través del

citoplasma e hidrogenosomas cerca de los cinetosomas, presenta agregados de

ribosoma. Poseen crecimiento vegetativo y desarrollo endógeno (Munn et al.,

1988). ,

Caecomyces: Las zoosporas de Caecoyces equi miden de 5 a 7 Pm con

organelos dispersos de núcleo: retículo endoplasmático e hidrogenosomas

Caecomyces egui también posee rizoides. El número de zoosporas varía de 2 a

78 y el máximo tiempo de maduración corresponde a 90 minutos después de la

alimentación (Orpin, 1977a)

En tanto sean descritas nuevas formas de hongos, el número de especies

se incrementará, específicamente para los géneros Piromyces y Neocallimasfix

(Barr ef al., 1988; Heat et al., 1988).

Se conoce la existencia de hongos policéntrícos en los Estados Unidos de

América, Canadá, Francia y Australia y se caracterizan por contener una extensa

unión de rizoides dentro de su núcleo y desarrollar esporangias a intervalos

largos. Se han encontrado dos nuevos géneros de hongos que son Orpinomyces2

Anaeromyces y Ruminomyces ( Ho et al., 1993, Ho et al., 1994).

Orpínomyces: Poseen rizomicelio policéntrico con un esporangióforo complejo y

uniones intercaladas o termínales. Las zoosporas son multiflageladas. Se

cuentan con especies bovis yjoyonii. Las colonias de Orpinomyces spp. crecen

sobre celobiosa en cultivps in vit/o (Breton et al., 1989)

Anaeromyces: Posee un tallo policéntrico extenso, con fuertes uniones,

rizomicelio polinucleado. Zoosporangia elíptica, 29x120 Pm. Los esporangióforos

miden 31 x 83 Pm. Las zoosporas son esféricas y miden 7.5-8.5 Pm. de diámetro,

con un solo flagelo mayor a 30 Pm (Breton et al., 1990)

Ruminomyces: Este género posee un rizomicelio complejo. Hifas muy unidas,

largas. Esporangióforo erecto, sin uniones. Esporangia elipsoidal a fusiforme.

Zoospora uniflagelada, esférica y variable en su forma. La especie para este

género es R. elegans ( Ho y Bauchop, 1990).

2.3.2 Colonización fungal de los tejidos de las plantas.

El alimento que ingresa al rumen; es rápidamente colonizado por una gran

población de hongos cuya frecuencia es mayor en dietas con tallos fibrosos que

con hojas blandas o suculentas (Bauchop, 1979 a, b, 1981).

Por otro lado Theodorou et al. (1988) sugieren que los hongos, por tener

acceso primario sobre las partículas de las plantas, desarrollan habilidades para

colonizar las partículas de plantas y asi facilitar su degradación.

Además, los tejidos de plantas fibrosas son retenidos en el rumen por un

periodo más largo de tiempo, lo que facilita su colonización extensiva por los

hongos (Bauchop, 1981, 1989a; Grenet et al., 1989).

Las esporangias fungales que se encuentran en el rumen, se adhirién a la

superficie de las hojas y posteriormente sobre los tallos de forrajes (Bauchop,

1979b; Gordon y Ashes, 1984).

La solubilización de la pared pelular de las plantas ha sido comprobada

en la mayoría de los trabajos desarrollados in vitre e in vivo con algúnos de los

2x

géneros de hongos del rumen incluyendo a Neocalimastix patriciarum,

Piromonas communis, Sphaeromonas communis y Caecomices egui, los

cuales tienen funciones específicas durante las reacciones de solubilización

de celulosa en rumiantes : - -., 1: (Elliot et al., 1987; Ho et al., 1988b;

Theodorou et al,, 1988).

2.3.3 Metabolismo de energía y características de fermentación.

Las componentes de las paredes celulares que digieren los hongos son

principalmente celulosa, B-glucanasa y la fermentación de carbohidratos como

glucosa y xylosa (Gordon y Phillips: 1989).

En comparación con los protozoarios y bacterias, los hongos emplean

mezclas de fermentación ácida; sus productos de fermentación son formato,

acetato, lactato, succinato, etanol, bióxido de carbono e hidrógeno;

conviertiendo la glucosa y esta en piruvato, siendo éste el producto

intermediario de la fermentación (Yarlett et al., 1981; Gottschalk, 1986; Yarlett

y Orpìn, 1986; O’Fallon et al., 1991).

Las celulasas extracelulares de orígen microbiano tienen gran

importancia para la conversión de componentes de celulosa y de componentes

lignocelulosos hacia azúcares fermentables. En el sistema celulolítico, la

enzima b-glucosidasa se considera un componente importante, ya que éste

aporta glucosa necesaria para el metabolismo y crecimiento de hongos.

Además, la actividad específica de las celulasas sobre celulosa puede dar

orígen a la producción de glucosa y fermentar a etanol (Calza, 1990; Wood y

Wilson, 1995; Dijkerman et al. 1996).

La fermentación de celulosa por hongos del rumen puede ser

determinada en medios de cultivo por m_ediciones gravimétricas o mediciones

de pérdida de materia seca o por la cuantificación de los productos finales de

la fermentación (Theodorou, 1995).

29

Mountfort y Asher (1985) determinaron que los hongos producen hasta

0.94 pmol de glucosa/minuto a partir de la fermentación de compuestos

celulósicas.

23.4 Degradación de la pared celular por los hongos anaerobios del Turnen.

Los trabajos ín vitre han demostrado que los hongos del rumen tienen la

particularidad de atacar, parcial o completamente tejidos de las plantas ( Gulati et

al., 1989).

.

El papel de los hongos en el papel de la degradación de las paredes

celulares ha sido ampliamente evaluado. Sus rizoides penetran los tejidos de

laplanta mejor que las bacterias y protozoarios. Estos hongos tiene más acceso al

material de la planta que otros microorganismos, ocupan un nicho ecológico en el

tracto digestivo de rumiantes y otros mamíferos herbivoros, participando en la

colonización primaria de las paredes celulares de las plantas (Wubah et al., 1993.

Zhu et al., 1996).

La digestión de las paredes celulares de plantas está influenciada por las

enzimas que degradan los polisacáridos elaboradas por los propios

microorganismos como bacterias, protozoarios y hongos (Fonty et al., 1995).

Los hongos producen enzímas hidrolíticas que actuan sobre disacáridos,

oligosacáridos y polisacáridos (Borneman et al., 1989: Gordon y Phillips, 1989;

Barichievich y Calza, 1990a).

Los hongos del rumen son capáces de solubilizar una elevada proporción

de paredes celulares de la planta, degradando fragmentos de las plantas durante

el pasaje de partículas en el tracto digestivo (Gordon y Ashes, 1984).

Williams y Orpin (1987a,b) reportaron que entre las enzimas de los hongos

del rumen que degradan polisacáridos se incluyen a la carboximetilcelulasa,

celobiosidasa y p-glucosidasa en estado vegetativo o zoospórico.

La contribucion de los hongos en la degradación de las paredes celulares

de plantas en el rumen no es claro; debido a la dificultad de medir la biomasa

fungal y la actividad en una mezcla de la población del ecosistema (Stewart ef

al., 1990). .

La actividad de estas enzimas se ha confirmado por diferentes grupos de

investigadores y solamente una especie del genero de Neocallimastix frontal&, ha

sido investigada en detalle relacionado con la especificidad de las enzimas que

degradan la pared celular de las plantas (Pearce y Bauchop, 1985).( Akin y

Rigsby, 1987; Lowe et al., 19874; Williams y Orpin, 1987 a, b; Gordon y Phillips

1989; Borneman ef al., 1989, 1990; Akin et al., 1990; Barichievich y Calza, 1990b;

Hebraud y Fevre, 1990; Calza, 1991).

Después de un período prolongado de fermentación (>72 h), los hongos

policéntricos y monocéntricos producen enzimas como feruloil y pcoumarol

esterasas desempeñando un papel importante en la neutralización de ácido

ferúlico y coumárico sobre lignocelulosa, considerado como una disolución de las

paredes celulares de la planta (Borneman et al.? 1990, 1991).

Williams y Orpin (1987a) reportan que la secreción de la enzima p-

glucosidasa se incrementa al adicionar ciertas fuentes de carbono. La actividad

carboximetilcelulasa de los hongos se localiza entre un pH de 5 a 7 y una

temperatura entre 4555OC.

La P-glucosidasa de los hongos del fumen tiene un pH óptimo de 5.5 a 6.0 y

una temperatura óptima de 45 a 55°C (Hebraud y Febre, 1988).

La celulasa, generalmente es inhibida por los productos finales de la

fermentación (Wood et al., 1988).

La celulosa y hemicelulosa son los componentes que se encuentran en

mayor proporción en las paredes celulares de las plantas; par2 su hidrólisis

completa a monosacáridos se requiere la presencia de dos enzimas complejas

como celulasas y xylanasas (Chahal, 1991).

La digestión de lignocelulosa se relaciona con la producción de esterasas

fungales que fraccionan la lignina de la hemicelulosa considerándose como los

responsables de la digestión arriba del 70% de lignocelulosa de forrajes (Akin et

al., 1990; Borneman et al., 1990, 1992).

Barichievich y Calza (1990 a, b) han definido las características físicas,

químicas y enzimáticas de las celulasas; caracterizándola como una enzima

compleja con múltiples componentes y peso molecuar de 1 a 2 millones de dalton.

Además, mencionan que el azufre tiene efecto positivo sobre la actividad de

carboximetilcelulasa.

La actividad de la enzima B-glucosidasa de Neocalimastk fronfalis se

incrementa 4 ó 5 veces más en cultivo con celulosa como fuente de carbono

(Calza, 1990).

Se ha mostrado que en mayor presencia de glucosa se detiene la

producción de la enzima celulasa (Mguntfort y Asher, 1983). Estudios a la fecha

indican que las enzimas de hongos qae degradan las paredes celulares de

forrajes son extracelulares; algunas de estas enzimas estan reguladas por la

presencia de azúcares solubles (Mountfort y Asher, 1989).

Se ha demostrado que los hongos pueden producir esterasas y liberan

ácido ferúlico y p-cumárico de la pared celular de la planta (Borneman et al.,

1989). Bajo esta característica, dichas enzimas desempeñan un papel significativo

en la degradación de las paredes celulares de las plantas aftas en compuestos

fenólicos (Hartley y Akin, 1989).

2.3.4.1 Degradación de celulosa.

Orpin y Letcher (1979) fueron los primeros en reportar que los hongos son

celulolíticos. Los hongos monocéntricos y policéntricos degradan y fermentan

celulosa (Borneman et al., 1989; Gordon y Phillips, 1989). Sin embargo, su

capacidad para degradar pectina no es significativa (Phillips, 1989).

La celulosa se considera el biopolímero más abundante en la naturaleza, y

son pocos los hongos que producen celulasas capaces de degradar la celulosa

cristalina; entre ellos se tiene al género Trichoderma spp y los hongos del rumen.

Las celulasas microbianas pueden ser utilizadas para generar glucosa. lo cual

pueden ser fermentadas hasta la producción de etanol. La celulasa de

Neocallimastix fronfalis es la de r&s interes en estudiar por el efecto considerable

sobre la hidrólisis de hidrógeno que se encuentra unido a la celulosa cristalina (

Wood, 1991; Wood y Wilson, 1995; Wood et al, 1995).

Los estudios sobre la formación de enzimas celulolíticas por hongos del

rumen (Mountfort y Asher, 1985) indican que el nivel de actividad p-glucosidasa

está influenciada por la naturaleza de los carbohidratos en el rumen. Estos

autores han dado importancia a mejorarar la digestibilidad del material de plantas

por rumiantes (Fig 3).

Esta enzima es común encontrarla en plantas, hongos y bacterias, su

estudio ha sido de mucho interes porque se involucra en la conversión biológica

de material celulosico (Chen et al., 1994)

Los hongos mejoran significativamente la digestión de rastrojo de trigo

(+28%) con efecto particularmente marcado sobre la celulosa (+50%) y

hemicelulosa (+33%) (Hillaire et al., 1990).

Se ha demostrado que la presencia de celulosa en el rumen induce la

secreción de celulasa pero los componentes que inducen la síntesis y secreción

no han sido determinados (Li, 1991).

La hidrólisis de la celulosa es fundamentalmente enzimática. Las enzimas

necesarias para la digestión de celulosa se asocian a la pared celular fungal y

estas tienen la capacidad de digerir celulosa cristalina y comprende las enzimas

endo-1,4- p- glucanasa, 1-4-p celobiohidrolasa y -p glucosidasas (Wilson y

Wood. 1992).

Se considera de 40°C la temperatura óptima de actividad contra celulosa

cristalina en incubaciones in vibro a 72 horas (Wood et a/., 1988).

31

SISTEMA CELULOLITICO

f3- GLUCOSIDASA

GLUCOSA

HONGO

,/’//í’ ‘1,._’ “\,/_’ _..\

YA ‘\\Metabolismo Crecimiento Degradacion de celobiosa

Fig. 3 Influencia del sustrato en el fumen sobre la actividad de la enzima J3-

glucosidasa (Dijkerman ef al., 1996).

2.3.4.2 Degradación de lignina.

Las plantas que contienen cantidades elevadas de lignina son pobres en

nutrientes y de difícil digestión por los microorganismos del ru-nen; aunque

algunas no son muy lignificadas y de baja digestibilidad debido al contenido de

compuestos fenólicos de bajo peso molecular que se encuentran unidos a estos

tejidos ( Harris y Hartley, 1976; Akin, 1986).

La asociación de lignina con polisacáridos de la pared céular limita la

digestión microbial con protección de 1 a 4 veces su propia #Tasa en los

carbohidratos de la pared célular (Van Soest, 1981).

Los hongos del rumen degradan la lignina que se encuentra contenida en

las paredes de las plantas y la habilidad para utilizar este componente

anaeróbicamente es una contribución importante por los microbios del rumen. Por

ello, muchos de los estudios se han enfocado a evaluar la habilidad de los

hongos para atacar los componentes de lignina de las paredes de las plantas

(Akin et al., 1983).

2.4 Importancia del azufre en la nutrición de rumiantes.

Para que la síntesis de aminoácidos se lleve a cabo dentro del rumen, el

azufre debe estar presente en la dieta. En adición, las vitaminas que contienen

azufre, semejantes a la tiamina y biotina son sintetizadas por los microbios del

rumen; más sin embargo, el sulfato de sodio y metionina han demostrado que

estimulan la síntesis de otras vitaminas como rivoflavina y vitamina BI2 en un

grado mayor que cuando la fuente de azufre fué cisteína o azufre elemental

(Phillips y Gordon, 1991).

En áreas del mundo deficientes en azufre, la fertilización ha sido utilizada

para promover la producción de forraje, y bajo estas condiciones la probabilidad

de una deficiencia de este elemento ocurrida en animales alimentados con

forrajes o granos es menor (Spears et al.: 1976).

La acción de la microflora del rumen altera completamente la dieta de

ambos elementos; la degradación de la dieta de proteína para producir amoniaco

y sulfuro o la síntesis de proteína microbiana de la dieta de urea y sulfato

inorgánico. La retención de nitrógeno y azufre está determinado por las

cantidades de nitrógeno y azufre depositados en los tejidos del cuerpo donde las

dietas suplementadas con más azufre tienen una mayor retención de,nitrógeno y

azufre (Kandylis, 1984).

McLenan et al. (1989) mostraron que mediante la adición de azufre a

suplementos con base en urea para rumiantes, consumiendo forrajes con alto

contenido de paredes celulares, se incrementó la retenck de nitrógeno y la

digestibilidad de los mismos. La razón en el incremento del consumo y

digestibilidad de materia seca y materia orgánica cuando el sulfato de sodio fue

adicionado a la dieta, puede ser explicado por la mejor utilización del nitrógeno

presente; sin embargo, el efecto de la suplementación de azufre solamente se

da si el nivel de nitrógeno es adecuado en la dieta.

Whanger, (1972) establecieron que para promover la máxima retención de

nitrógeno, es necesario una proporción adecuada de nitrógeno-azufre en la dieta.

La metionina es el primer aminoácido azufrado limitante en ganado lechero y su

deficiencia quizá origina cambios en el metabolismo de los lípidos (Bull y

Vandersall, 1972).

En los estudios que se han realizado en relación al efecto del azufre en

forrajes fertilizado y no fertilizados ha demostrado que la fertilización con azufre

incrementa el consumo voluntario y reduce los niveles de amonio en el rumen, lo

cual es indicador de una elevada actividad microbiana en el rumen, además se

37

encuentra un efecto marcado en la contribución de los hongos a la degradación de

celulosa cuando estos tienen una adecuada proporción de azufre (Akin ef al

1983).

El metabolismo del azufre y nitrógeno se encuentran estrechamente

asociados en rumiantes. La acción de la microflora del rumen quizá se altere

completamente la forma de la dieta para ambos de estos elementos (Kandylis,

1984). Se sugiere que para que el metabolismo sea óptimo por parte de la

microbiota y el animal hospedero, la cantidad y formas requerida? de azufre

necesaria en dietas a base de forraje, esto puede ser exitoso y aún no se ha

establecido (Weston et al., 1988).

Rees y Minson (1978) demostraron que el consumo voluntario y la

digestibilidad de materia seca de forraje fertilizado con azufre fue menor en

relación al control cuando las determinaciones se efectuaron con ovinos

suplementados con azufre. Además determinaron que la fertilización con azufre

reduce el tiempo de retención del forraje e incrementa el consumo voluntario y la

digestibilidad comparado con el forraje Digitaria decumbens que no se fertilizó.

Los autores sugieren que la baja actividad microbiana debido a la deficiencia de

azufre podría provocarle una respuesta negativa al animal.

La suplementación de azufre estimula la actividad bacteriana en el rumen.

Aunque algunos de los microorganismos tienen preferencia por ciertas formas de

azufre, debido a la relación simbiótica entre microorganismos del rumen, las

formas de azufre no parecen tener una influencia significativa sobre su actividad

(Whanger, 1972).

Los requerimientos de azufre para rumiantes productores de leche han

recibido un interés limitado y se ha establecido que los requerimientos para

ganado lechero no se eqcuentran establecidos, aunque se ha sugerido 0.20% de

38

azufre en la dieta en base seca, o se han definido los requerimientos para cabras

lecheras (Qi ef al., 1992).

Se ha demostrado que el sulfato inorgánico puede ser substituido por

fuentes de azufre orgánico como la metionina y viceversa. El azufre elemental ha

sido usado como fuente de azufre, pero ha mostrado que no puede ser realmente

disponible como sulfato o fuentes orgánicas, probablemente debido a la baja

solubilidad en el fluído del rumen (Spears et al., 1976).

Momont et al. (1993) no encontraron diferencias significativas en la

digestibilidad aparente de materia seca, fibra detergente neutro y fibra detergente

ácido entre corderos suplementados con sulfato de sodio o metionina. McCracken

et al. (1993) observaron que la suplementación de metionina no incrementa la

desaparición de fibra detergente neutro del forraje a 96 horas comparado con el

tratamiento controlado.

Lodman ef al. (1990) observaron solamente un aumento en la digestión de

materia seca y fibra detergente neutro como resultado de la suplementación de

metionina y urea. Hall et al, (1990) encontraron que ofreciendo metionina a

novillos alimentados con paja de bermuda grass y granos de maíz no se mostró

ningún efecto sobre el consumo y digestión de alimento, solamente tuvo un

incremento en la digestión de fibra detergente neutro.

Huisman et al. (1988) reportaron un incremento en la degradación de

materia seca de forraje con la suplementación de metionina en el líquido ruminal

en forma protegida.

2.4.1 Metabolismo y requerimientos de azufre por los microorganismos del

rumen.

La adición de componentes de azufre en una incubación in. vitre por

microorganismos del fumen han demostrado que estimulan la digestión de

celulosa. La metionina ha tenido una respuesta más alta que cualquier otra fuente

evaluada (Whanger, 1972).

El azufre total y el contenido de otros minerales en los forrajes no siempre

es un indicador confiable de disponibilidad para los microorganismos del rumen

(Spears et al., 1976).

Los microorganismos del rumen pueden reducir formas oxidadas de azufre

y ser incorporadas dentro de compuestos orgánicos; estos pueden producir

sulfuro de hidrógeno de sulfato e incorporar azufre dentro del material celular

(Whanger, 1972).

Los microorganismos del rumen pueden reducir formas oxidadas de azufre

a la forma en la cual la incorporan dentro de los compuestos orgánicos lo que

sígnifica que los rumiantes tienen la habilidad para obtener el azufre de las

fuentes inorgánicas de azufre (Kandylis, 1984).

Kahlon et al. (1975) indicaron que los microorganismos del rumen pueden

utilizar formas inorgánicas como formas orgánicas del azufre a la síntesis de

aminoácidos y cada una las fuentes de azufre difieren grandemente con respecto

a su disponibilidad. Ellos evaluaron las disponibilidades de varias fuentes de

azufre y encontraron que la concentración de azufre de 21.5 ug/ml de inóculo

(0.32% de azufre en la materia seca del substrato) resultó menor que la síntesis

óptima de proteína microbiana en un sistema in vitre donde se utilizó almidón

como substrato, mientras las concentraciones de 86.7 y 130.0 ug/ml (1.3 y 1.95%

en la materia seca del sybstrato) fue inhibitoria. Sin embargo, una concentración

de 43.3 ug/ml en la incubación del medio (0.65% en la materia seca del substrato)

resultó una mayor síntesis de proteína.

Komisarczuk-Bony ef al (1992) evaluaron los requerimientos de azufre para

los microbios del rumen y reportaron que la digestión de celulosa diaria fué de

45.3% suplementando diariamente 12 y 22 mg de azufre como sulfato de sodio en

un fermentador semicontinuo. A la adición de sulfuro de sodio se observó que

disminuye la incorporación de azufre dentro de la proteína bacteriana, más que la

adición de aminoácidos azufrados como metionina o cisteína.

Bull y Vandersall (1973) determinaron que el nivel óptimo de azufre fué de

0.16 a 0.25% como sulfato de sodio o sulfato de calcio y 0.32% como metionina,

en relación a las fuentes de azufre, el sulfato de sodio, sulfato de calcio y

metionina s$ comportaron iguales a las mismas concentraciones en relación a su

habilidad de las bacterias del rumen para promover la digestión de lignocelulosa

in vifro. Los mismos autores mencionan que las formas de azufre no parecen

tener influencia significativa sobre su actividad.

Spears et al. (1976) reportaron que con la suplementación de azufre se

incrementa el rompimiento de lignocelulosa por los microorganismos del rumen,

además observaron un incremento en la retención de nitrógeno y digestión de

fibra detergente neutro cuando el contenido de azufre se aumentó de 0.20 a

0.32% orgánica e inorgánicamente en la dieta.

Se ha encontrado que la digestibilidad in vivo, digestibilidad de materia

seca, materia orgánica, fibra detergente neutro y proteína cruda fué incrementada

por la adicíón de 0.6, 0.11, 0.28, y 0.36% de azufre como sulfato de calcio en la

dieta respectivamente (Qi et al., 1992).

Se ha indicado que el nivel óptimo de azufre en la dieta para una máxima

ganancia diaria en caprinos es aproximadamente 0.22% de materia seca de la

dieta con una relación de N:S de 1 O:? . Por eso, es posible que el nivel óptimo de

azufre en la dieta mejore el desarrollo por un incremento en la síntesis de proteína

bacteriana en el rumen y mejore el balance de aminoácidos, ya que se han

observado diferencias en el metabolismo de nitrógeno y azufre; estas

comparaciones se han realizado cuando la dieta aporta suficiente cantidad de N:S

para encontrar los requerimientos de los microbios del rumen (Qi et al., 1993,

Hegarty et al., 1954).

Numerosos estudios han indicado que la metionina es uno de los

aminoácidos limitantes en el crecimiento microbiano y la fermentación de

substrato en el rumien (Salter et al., 1979).

La población microbiana del rumen en animales alimentados con forrajes

de baja calidad y suplementados con 0.21% de azufre, contenia más del 10% de

bacterias, más dei 22% de protozoarios, y más del 69% de zoosporas fungales. El

incremento proporcional de hongos en el turnen se relacionó con un aumento del

16% en la digestión de la fibra (Millard et al., 1987).

Harrison y McAllan (1980) reportaron un valor medio de la relación 18.51

(N:S) en un rango de 8.6:1 y 30.8:1, para las bacterias del rumen. y un valor

medio de 21.6:1 en un rango entre 14:l y 38:l para protozoarios. De esto, ellos

concluyen que una relación de 2O:l de azufre y nitrógeno disponible debería ser

el adecuado para los requerimientos de los microbios del rumen.

Multani ef al. (1986) determinó la disponibilidad de varias fuentes de azufre

y encontró que una relación de N:S de 1O:l resultó una mayor síntesis de

proteína microbial in vitre cuando el azufre fue suplementado con sales de sulfato

de sodio, potasio, calcio, fierro (III) y amonio, as¡ como a través de metionina. Sin

embargo, el mejor nivel con sulfato de zinc y cisteína fue 40: 1.

Clark y Petersen (1988) observaron un incremento en relación a la

digestibilidad de materia seca i~ situ de forraje de baja calidad en bovinos

suplementados con urea más 15 g de metionina comparado con sulfato de

amonio. Se ha demostrado que la suplementación de aminoácidos en un medio

definido como sales de amonio, hemina, vitaminas y fuentes reducidas de azufre

estimulan considerablemente el crecimiento de los hongos del ru,men, estos

hongos pueden tomar sus aminoácidos e incorporar en ellos sus proteínas sin

que requieran ninguna modificación (Onoda et al., 1996).

Onwuaka y Akinsoyinu (1989) utilizando azufre elemental como fuente de

azufre en una relación de 151 en cabras y ovinos observaron una mejor

retención de nitrógeno y digestibilidad aparente de materia seca contra la relación

N:S 28:1, 7:l y6:l.

2. 4.2 Sintesis de vitaminas.

Las vitaminas que contienen azufre, semejantes a la tiamina y biotina son

sintetizadas por los microbios del rumen; sin embargo, el sulfato de sodio y

metionina han demostrado que estimulan la síntesis de rivoflavina y BI2 por los

microorganismos del rumen aun más que con cisteína o azufre elemental (Kahlon

et al., 1975; Whanger, 1972).

2.4.3 Efecto del azufre sobre las poblaciones de hongos del rumen.

A principios de 1980, el contenido de azufre en la dieta a base de forraje

con alto contenido de paredes celulares, fue reconocido como un factor

significante que gobierna la población fungal en el rumen (Akin et al., 1983; Akin y-THogan, 1983; Gordon, 1,985). En Australia la fertilización de forrajes con azufre

43

(Akin et a/., 1983) y dietas suplementadas con metionina (Gordon et al,, 1983)

mostró un incremento en la población fungal.

Akin et al. (1983); Akin y Hogan (1983) observaron que fertilizando la

pastura con azufre se mostró un efecto positivo sobre la población fungal. Los

hongos del rumen no fueron detectados en ovinos alimentados con paja de

Digitaria penfiii cosechadas de parcelas deficientes en azufre; además, la paja

colectada de la misma parcela después de una fertilización con azufre mantuvo

una población activa de los hongos del rumen, el número de zoospora$ por ml fue

de 4,000 a 6,000 y con suplementación de metionina (4.5 g/dia) la cantidad fue

4,100 por cada mililitro de líquido ruminal.

Orpin y Greenwood (1986) mencionan que una deficiencia de azufre en la

dieta podría limitar el crecimiento de los hongos en el rumen y esto limitaría el

crecimiento de los hongos en el rumen y se limitaría su contribución en la

digestibilidad de las paredes celulares de plantas.

Gulati ef al. (1989) sugirieron que en un incremento de la biomasa de los

hongos del rumen en ovinos resulta un incremento cuantitativo de azufre esencial

y aminoácidos que son absorbidos en el intestino. Esto se refleja en el

crecimiento de lana y tiene importantes aplicaciones para la producción de lana

en ovinos que pastorean en forrajes de baja calidad nutritiva.

En dieta con forraje tropical ( Heteropogon contorfus) que tenía un bajo

contenido de azufre, mostró una ausencia de población fungal en el rumen

(Morrison ef a/., 1990). Pero se reporta un incremento en el número de bacterias,

protozoarios y esporangias de hongos del rumen en ovinos suplementados con

sulfato de sodio, aunque este incremento no fue muy marcado en la cantidad de

esporangias, el contenido de azufre en paja de trigo afectó positivamente en los

hongos en el rumen.

En un sistema de alimentación en donde se ofreció forraje maduro

fertilizado con azufre, se estimuló la población fungal y se incrementó el consumo

de alimento, considerando que este efecto está influenciado por la habilidad de

los hongos para atacar y debilitar las paredes celulares de las plantas en

presencia de azufre (Akin et al., 1983).

El desarrollo de los hongos no solo depende del substrato sobre del cual

ellos degradan, sino también sobre el medio ruminal. Este hecho se explica en

base a los resultados obtenidos por Millard et al. (1987), donde el suministro de

azufre en el alimento no tuvo efecto significativo sobre el número de bacterias

viables, pero si se mostro un incremento en el número de hongos celulolíticos.

Con ei azufre inorgánico como suplemento en dietas de baja calidad, la

mayoría de la materia orgánica y fibra detergente ácido fueron digeridas en el

estómago y en el tracto alimentario, una gran cantidad de amoniaco fue digerido

en los intestinos por unidad de consumo de materia orgánica digestible y la

actividad fung,al en el rumen fue alta. Esto indicó que una inadecuada cantidad

de azufre en una dieta afecta el metabolismo de la microbiota del rumen y afecta

las variables relacionadas con la digestión y el metabolismo (Weston et al.,

1988).

Los hongos del rumen pueden usar sulfuro de sodio y cisteína y

metionina como fuentes de azufre (Li y Heath, 1993).

Gulati et al. (1985) y Weston et al. (1988) Evaluaron fuentes de azufre y

determinaron que suplementado rastrojo de cereal con metionina o sulfato de

sodio se mostró un incremento en el número de hongos del rumen. La fertilización

de la pastura mostró un incremento de 25% de consumo de alimento ad libifum.

En dietas con rastrojo de trigo con baja cantidad de azufre, mostró una

disminución en la población de hongos del rumen (Gordon, 1985).

El azufre puede ser utilizado por Neocalimastix pafríciarum cuando se

suplementa con cisteína, metionina o sulfuro de sodio. Phillips y Gordon (1991)

indicaron por el contrario que el azufre es un nutriente limitante para

Neocallimastix sp. porque varía la concentración de sulfuro solo y con cantidades

iguales de cisteína o metionina teniendo un incremento en su crecimiento de

arriba de 1 - 2 Pm del total de azufre, y el crecimiento sobre *sulfuro en

combinación con cisteína o metionina fué mejor que el crecimiento sobre sulfuro

solo.

Cuando se suplementó sulfato de sodio a los animales, se observó un

incremento en el número de hongos como también el consumo de alimento.

Además! se mostraron ligeros cambios en la población ruminal de bacterias y

protozoarios ciliados debido a la suplementación de la dieta. El Heteropogon sp;

suplementado con sulfato de sodio, manifestó una alta población fungal en el

rumen comparado la misma paja cuando no se suplementó. Los hongos requieren

formas reducidas de azufre como sulfuro de sodio y aminoácidos que contienen

azufre como cisteína y metionina para su crecimiento in vitre ( Marvin-Sirkema et

al., 1990: Phillips y Gordon, 1991)

Las dietas con un contenido inadecuado de azufre pueden tener un efecto

negativo sobre la población fungal en el rumen (Morrison et al., 1990).

Aunque Neocalkmastix pafrkiarum puede usar sulfato de amonio como una

sola fuente de nitrógeno para estimular su crecimiento, los aminoácidos

azufrados también lo estimulan (Li y Heat, 1993).

La ausencia de los aminoácidos azufrados limitan el crecimiento de los

hongos del rumen, interfiriendo en la degradación del sustrato presente en el

rumen.

Los requerimientos y fuentes de azufre para los microorganismos del

rumen no han sido esclarecidos, por lo que se proponeque la presencia de

fuentes de azufre en paredes celulares de forraje que consume el rumiante se

considera un factor significativo que modifica las poblaciones de hongos en el

rumen y este mejora la degrdación de los compuestos lignocelulosos de forraje.

Por ello se pretende evaluar la digestibilidad de celulosa in vitre bajo

diferentes fuentes y concentraciones de azufre, así como la concentración de

glucosa y pH.

LITERATURA CITADA

Aagnes, T. H., Blis A.S. and Mathiesen S.O. 1996. Digestibility and rumenfermentation in Reindeer feed baled timothy silage in summer and winter. J.of Agrie. Sc;. 127(4): 517-523.

Akin, D.E. 1982. Section to slide technique for the study of forage anatomyand digestion. Crep. Sc;. 22: 444-446.

Akin, D. E. 1986. lnteraction of ruminal bacteria and fungi with Southern forages,J. Anim. Sc;. 63:962.

Akin, D.E. and Benner R. 1988. Degradation of polysaccharides a?d lignin byruminal bacteria and fungi. Appl. Environ. Microb. 54: ll 17.

Akin, D.E. and Borneman W.S. 1990, Role of rumen fungi in fiber degradation. J.Dairy Sc;. 73:3023. Review

Akin, D.E. and Hogan J. P. 1983. Sulfur fertilization and rumen microbialdegradation of cell walls in Digitaria pentz;; (stent). Crep. Sc;. 23:851-858.

Akin, D. E. and Rigsby L.L. 1987. Mixed fungal populations and lignocellulosictissue degradation in the bovine rumen. Appl. Env. Microbio/. 53 (9), 1987-1995.

Akin, D.E., Borneman, W.S. and Lyon, C.E. 1990. Degradation de leaf blades andstems by monocentric and policentrìc isolates of ruminal fungi. Animal FeedScience and Technology. 31,20522 1

Akin, D.E.,Gordon G. L. R., and Hogan J.P. 1983. Rumen bacteria1 and fungaldegradation of Oigitatia pentzi grown with or without sulfur. Appl. Environ.Microbio¡. 461738-748.

Akin, D.E; Lyon C. E., Windham W. R., and Rigsby L.L. 1989. Physicaldegradation of lignified stem tissues by ruminal fungí. Appl. Environ.Microbio/, 55:611-616.

Barichievich, E.M. and Calza R.E. 1990a. Supernatant protein and cellulaseactivíties of the anaerobic ruminal fungus Neocallimastíx frontal& EB188.Appl. Environ. MicrobioI. 56:43.

Barichievich, E.M. and Calza R.E. 1990b. Media carbon inductión of extracellularcellulase activities in Neocallimastix frontalis EBI 88. Appl. Environ. Microbio/.56:43-48.

Barr, D. J. S. 1988. How modern systematics relates to the rumen fungi.BioSystems 21: 351-356.

48

Barr, D. J.S., Kudo, H., Jakober, K. D. and Cheng, H. J. 1989. Morphology anddevelopment of rumen fungi: Neocallimastix sp., Piromyces communis andOrpinomyces bovis gen. nov., sp. nov. Can. J. of Botany 67: 28152824.

Bae, H.D., McAllister, T.A., Yanke, L.J., Cheng, K.J. and Muir, A.D. 1993. Effectsof condensed tannins on cellulolytic activity and filter paper digestion byfibrobacter succinogenes S85. Appl. Environ. Microbio/. 59:2132-2138.

Bauchop T, 1989a. Colonization of plant fragments by protozoa and fungi In: TheRole of Protozoa and Funqj 111 Ruminant Diaestion (OECD/UNE InternationalSeminar) (ed. J. V. Nolan, R. A. Leng and D. 1. Demeyer), pp. 83-96.Penambul: Armidale, New South Wales, Australia.

Bauchop, T. 1979a. Rumen anaerobic fungi of cattle and sheep. Appl. andEnviron. microbio/. 38: 148-I 58.

‘

Bauchop, T. 1979b. The rumen anaerobic fungi: colonizers of plant fibre. Ann.Rech. Vef. 10:246-248.

Bauchop, T. 1981. Anaerobic fungi in rumen fiber digestion. Agtic. Environ. 6:339-348.

Bauchop, T. 1986. Rumen anaerobic fungi and the utilization of fibrous feeds.Rev. Rural Sc¡; 6. ll 8-23.

Bauchop, T. 1989b. Biology of anaerobic gut fungi. BioSysfems, 23: 53-64.J

Besle, J.M.! Cornu, A. and Jouany J.P. 1994. Roles of structural phenylpropanoidsin forage cell wall digestion. J. Sci. Food Agrie. 64: 171-l 90.

Bonhomme, A. 1990. Rumen ciliates: their metabolísm and relationships withbacteria and their hosts. Anim. Feed. Sc;. Technol. 30:203-266

Borneman, W.S., Hartley, R.D., Morrison, W.H., Akin, D.E., Ljungdahl, L.G. 1990.Feruloyl and p-cumaroyl esterase from anaerobic fungi in relation to plantcell wall degradation. Appl. Microbio/. biotechnol. 33: 345-351

Borneman, W. S., Ljungdahl, L. G., Hartley, R. D. and Akin, D. E. 1991. Isolationand characterization of p-coumaroyl esterase from the anaerobicNeocallimastix strain MC-2. Appl. and Environ. Microbio/. 57: 2337-2344.

Borneman, W.S., Ljungdahl L. G., Hartley R. D., and Akin D. E. 1992. Purificationand partial characterization of two feruloyl esterases from the anaerobicfungus Neocallimastix strain MC-2. Appl. Environ. Microbio/. 58:3762.

Bowrnan, B. H., Taylor, J. W., Brownlee, A. G., Lee, J., Lu, S. D. & White, T. J.1992. Molecular evolution of the fungi: Relationships of the Basidiomycetres,Ascomycetes, and Chytridiomycetes. Mo/. Biol. Evol. 9: 285-296

19

Breton, A., Bernalier, A., Bonnemoy, F. 1989. Morphology and metaboliccharacterization of a new species of strictty anaerobic rumen fungus:Neocailimastix joyonii. FEMS Microbio/. -58: 309-310

Breton, A., Bernalier, A., Dusser, M. 1990. Anaeromyces mucronatus nov. gen.,nov. sp. A new strictly anaerobic rumen fungus with polycentric thallus.FEMS. Microbiol. Lett. 70 : 177-182

Bull, L.S. and Vandersall J.H. 1973, Sulfur source for in vitre cellulose digestionand in vivo ratio utilization, nitrogen metabolism. and sulfur balance. J. Dairy.- -Sc;. 56: 106.

Calza. R. E. 1991. Nascent synthesis and secretion of cellobiase in Neocallimastixfrontalis EB188. Curr. Microbio/. Lett. 70: 177-182. .

Calza., R. E. 1990. Regulation of protein and cellulase excretion in the ruminalfungus Neocallimastix frontalis EBI 88. Curr. Microbio/, 21: 109-I 15.

Carpita, N.C. and Gibeaut, D.M. 1993. Structural models of primary cell walls inflowering plants: consistency 6f molecular structure with the physicalpropertes of the walls during growth. The Hant Journal3: I-30

Clark, C.K. and Petersen M.K. 1988. Influente of DL-methionine supplementationof growth, ruminal fermentation and dilution rates in heifers, J. Anim. Sci.66:743.

Coleman, G. S. 1985. The cellulasas content of 15 species of ontodinomorphidprotozoa. mixed bacteria and plant debris isolated from the ovine rumen. J.Agrie. Sci. 104:349-360.

Chahal, D.S. 1991. Production of Trichoderma reesei cellulase system with highhydrolytic potential by solid-state fermentation. In: Enzymes in BiomassConversion. by G.F. Leatham and M.E. Himmel.ed. ACS Symp. Ser. No. 480.pp. Il 1-122.

Chen, H., Li, X. and Ljungdahl, L.G. 1994. Isolation and properties of anextracellular p- glucosidasa from the polycentric rumen fungus Orpinomycessp. Strain PC-2. Appl. and Environ. Microbio/. 60 (1): 64-70.

Cheng, K.J., McAIIister, T.A., Kudo, H., Forsberg and Costerton, J.W. 1991.Microbial strategy in feed digestion. In: Recent Advances on the Nutrition ofHerbivores (Y.W. Ho, H.K. Wong, N. Abdullah and Z.A. Tajuddin eds), pp181-I 87. Vinlin Press, Kuala Lampur, Malaysia.

Cheng, K.J., McAIIister, T.A., Mathiesen, S.D., Blix, A.S., Orpin, C.G. andCosterton, J.W. 1993. Seasonal changes in the adherent microflora of therumen in high-arctic Svalbard reindeer. Can. J. Microbíol. 39: 101-l 08.

Denman, S., Xue, G.P. and Patel, B. 1996. Characterization of a Neocallimastixpatriciarum cellulase cDNA (celA) homologous to Trichoderma reeseicellobiohydrolase II. Appl. and Environ. Microbio/. 62(6): 1889-l 896.

Deschamps, F.C., Ramos, L.P. and Fontana, J.D. 1996. Pretreatment ofsugarcane bagasse for enhaced ruminal digestion. Appl. Bíoch. Biotechnol.16: 2-9.

Dijkerman, R. ; Vervuren, M.B.F, Op den camp H. J.M.; Drift Ch. V.D. 1996.Adsorption Characteristics of cellulolytic enzyme from the Anaerobic fungusfiromyces sp. Strain E2 on Microcristaline cellulose. Appl. and Environ.Micro6io/. 62( 1): 20-25.

Dore, J. & Stahl, D. A. 1991. Phylogeny of anaerobic Turnen chytridiomycetesinferred from small subunit ribosomal RNA sequence comparisohs. Can. J.Bot. 69: 1964-I 971.

Elliot, R., Ash A. J., Calderon-Cortes F., Norton B. W., and Bauchop T. 1987. Theinfluente of anaerobic fungi on rumen volatile fatty acid concentrations invivo. J. Agrie. Sc;. 109: 13-I 7.

Engels, F. M. and Brice, R. E. 1985. A barrier covering lignified cell walls of barleystraw that resists access by rumen microorganisms. Curr. Microbio/, 12, 217-224.

Er-iksson, K.L., 1990. Biological delignification for improved utilization. In: Microbialand Plant Opportunities to Improve Lignocellulose Utilization by Ruminants(D.E. Akin, L.G. Ljungdahl, J. R. Wilson and P. J. Han-is eds.), pp. 227-233.Elsevier Science Publishers, New York.

Fahey, G.C., Bourqin, L.D., Titgemer, E.C. and Atwell, D.G. 1993. Postharvesttreatment of fibrous feedstuffs to improve their nutritive value. In: Forage cellWall structure and digestibility (H.G. Jung, D.R. Buxton, D.R. Hatfield and J.Ralph eds.’ pp 515-766. Ameritan Society of Agronomy, Crop ScienceSociety of America, Soil Science Society of America, Madison, WI.

Faichney, G.J. 1996. Rumen physiology: the key to understending the conversionof plants into animal products. Aust. J. agrie. Res 47: 163-174. Revíew

Finlay, B. J; and Fenchel, T. 1989. Hydrogenosomes in some anaerobic protozoaresemble mitochondria. FEMS Microbio/. Lett. 65: 311-314.

Fonty, G. and Joblin K.N. 1990/1991. Rumen anaerobic fungi; theìr role andinteractions with other rumen microorganisms ín relatíon to fibre dígestion, In:Physiological Aspe& of Digestion and Metabolism in Ruminants (Tsuda T,Sazaki Y, Kawasshima R. ed.) Academic press, NY, 655-680.

Fonty, G; Gouet, P; Jouany, J. P; and _Senaud, J. 1987. Establishment of themicroflora and anaerobic fungi of the rumen of lambs. J. Gen. Microbio/. 133:1835-l 843. ‘.

Fonty, G; Williams, A.G; Bonnemoy, F; Withers, S.E; y Gouet, P. 1995. Effect ofanaerobic fungi on glycoside hydrolase and polysaccharide depolymeraseactivities, in sacco straw degradation and volatile fatty acid concentrations inthe rumen of gnotobiotically reared lambs. Reprod Nufr Dev 35: 329-337

Ford C.W., Eliiott R., Maynard P.J. 1987. The effect of chlorite delígnífication ondigestibility of some grass forage and on intake and rumen microbial activityin sheep fed barley straw. J Agrie Sci, Camb 108: 129-I 36.

Gilbert, H. J; Hazlewood, G. P; Laurie, J. 1; Orpin, C. G; and Xue. G. P. 1992.Homologous catalytic domaíns in a fumen fungal xylanasa: evidente forgene duplication and prokaryotic origin. Mo/. Microbio/. 6: 20652072.

Gold, J.J., Heath, LB., Bauchop, T. 1988. Ultrastructural description of a newchytrid genus of caecum anaerobe, Caecomyces equi gen. nov. BioSysfems.125: 31 l-323

Gordon, G.L.R. 1985. The potential for manipulation of rumen fungi. In. R.A. Leng,J:S:F: Barker, DB: Adams, and K:J: Hutchinson (Eds.) Reviews in RuralScience. Univ. New England, Publications Office, Armidale, Australia. 6: 124-128.

Gordon, G. L. R. & Phillips, M. W. 1991. Pectin degradation by some ruminalanaerobic fungi. In: Proceedinos of the Third International Svmoosium on the- - - - -Nutrition @ Herbivores . Zahari, M. W., Tajuddin, Z. A., Abdullah. N. & Wong,H. K. p. 27. Serdang: Malaysian Society for Animal Production.

Gordon, G.L.R. Gulati, S.K, and Ashes, J.R. 1983. Influente of low-sulphur strawon anaerobic fungal numbers in a sheep rumen. Pr-oc. Nufr. Soc. Aust. 8: 188

Gordon, G. L.R. and Ashes J.R. 1984. In vitre digestion of wheat straw by differentrumen anaerobic fungi. Can. J. Anim. Sci 64(suppl.): 156.

Gordon, G.L.R. and Phillips M.W. 1989. Degradation and utilization of celluloseand straw by three different anaerobic fungi from the ovine rumen. Appl.Environ. h4crobiol. 55: 1703.

Gottschalk, G. 1986. Bacteria1 metabolism. 2nd ed. Springer Verlag, New York.

Grenet, E., Breton, A., Barry, P. and Fonty, G. 1989. Rumen anaerobic fungi andplant substrate colonization as affected by diet composition. Anim. Feed Sci.Techo/. 26: 55-70.

Guardiola, C. M, Fahey, G.C., Spears, J.W. and Garrigus U.S. 1980. Effect ofsulphur suplementation on in vítro cellulose digestion and on nutrientutilizatión and nitrogen metabolísm of lambs fed low quality fescue hay. Can.J. Anim. ScL,- 60: 337-344.

Guardiola, C. M, Fahey, G.C., Spears, J.W. and Garrigus U.S. 1983. The effectsof sulphur supplementation on cellulose digestion and on nutrient digestion,

52

nitrogen metabolism and rumen characteristics of lambs fed on good qualityfescue and tropical star grass hays. Anim. Feed Sci. and Technol. 8: 129-138.

Gulati, S. K; Ashes J. R., Gordon J. L. R., and Rogers P.L. 1989. Batch culture ofrumen fungus Neocallimasfix and digestíbility of its amino acids. In: TheRoles of Protozoa and Fun@ jo Ruminant Diclestion. J. V. Nolan, R. A. LeEand D. 1. Demeyer, ed. Penambul Books, Armidale. NSW, Aust. Pag: 281

Gulati, S.K., Ashes J. R., Gordon J. L. R, and Phillips M.W. 1985. Possiblecontribution of rumen fungi to fiber digestion in sheep. Proc. NI.&. Soc.. Ausf,10:96.

Hall, K.L., Goetsch A. L., and Forster L.A., Jr. 1990 Effects of buffer or DL-methionine with different amounts of supplemental corn on feed intake andnutrient digestion by Holstein steers consuming bermudagrass hay. J. Anim.Sc;. 68: 1674.

Halliwell, N. and Halliwel, G. 1995. Biotechnological aspects of lignocellulose andbiomass degradation. Outlook on Agriculfure. 24(4) 219-225

Harper, E.G., Welch, R.P., Contreras, L.D., Chang, J.S Calza, R.E. 1996. Theeffect of Aspergillus oryzae fermentation extraci on the anaerobic fungiNeocallimastix frontalis EB 188, Piromyces c-ommunis DC 193 andOrpinomyces ssp. RW 206: generalized effects and component analysis.Appl. Microbio/. Biotechnol. 45: 8 17-82 1

Harris, P. J. and Hartley, R.D., 1976. Detection of bound ferulic acid in cell walls ofthe Gramineae by ultraviolet fluorescente microscopy. #afufe (London), 259:508-5 10.

Harrison, D.G., and McAllan A.B. 1980. Factors affecting microbial growth yieldsin the reticulo-rumen. In: Diaestive Phvsioloav @ Metabolism a Ruminants.Y. Ruckebush and P. Thivend (editors), MTP press. Lancaster, pp. 205-226.

Hartley, R. D; and Akin D.E. 1989. Effect of forage cell Wall phenolic acids andderivates on rumen microflora. J. Scí. Food Agrie. 49:405.

Heath, I.B., Bauchop T., and Skipp R.A. 1983. Assignment of the rumen anaerobeNeocallimastix frontalis to the Spizellomycetales iChvtrid¡omvcetes) on thebasis of its polyflagellate zoospore ultrastucture. Can. J. Bot. 61:295-307.

Heath, I.B. 1988. Gut fungi. Trends Eco/. Evol. 3: 167.

Hebraud, M; and Fevre M. 1988. Characterization of glycoside and polysacharidehydrolases secreted by the rumen anaerobic fungi NeocaIímastíx fronfalis,Sphaeromonas communis and Piromonas communis. J. Gen. Microbiol~134: 1123-l 129.

Hebraud, M. and Fevre M. 1990. Purification and characterization of a specificglycaside hydrolase from the anaerobic ruminal fungus Neocallimastixffontalis. Appl. Environ. Microbio/, 56:3164.

Hegarty, R-S; Nolan, J.V. and Leng R.A. 1994. The effects of protozoa and ofsupplementation with nitrogen and sulfur on digestion and microbialmetabolism in the rumen of sheep. Aust, J. Agrie. Res.45: 1215-1227

Hillaire M.C, Jouany J.P, Fonty G. 1990. Wheat straw degradation in Rusitec, inthe presente or absence of rumen anaerobic fungi. Proc. Nutr. Soc. 49:127A.

Ho, Y.W., Bauchop. T. Ruminomyces elegans gen. et sp. nov. A polycentricanaerobic rumen fungus from cattle. Mycotaxon. 38:397-405 .

Ho, Y. W. & Bauchop, T. 1991. Morphology of three polycentric rumen fungi anddescription of a procedure for the induction of zoosporogenesis and releasefor the induction of zoosporogenesís and release of zoospores in cultures. J.Gen. Microbio! 137: 213-217.

Ho, Y. W., Abdullah. N, & Jalaludin, S. 1991. Fungal colonization of rice strawand palm press fibre in the rumen of cattle and buffalo. An. Feed Sc;. andTechnol. 34: 3 ll -32 1.

Ho, Y. W., Abdullah. N. ¿i Jalaludin, S. 1994. Orpinomyces intercalafis, a newspecies of polycentric anaerobic rumen fungus from cattle. Mycotaxon 47:283-284.

Ho, Y.W., Barr D. J. S., Abdullah N., Jalaludin S., and Kudo M. 1993.Anaeromyces, an earlier name for Ruminomyces. Mycotaxon. 47:283.

Ho, Y.W., Abdullah N., and Jalaludin S. 1988a. Colonization of guinea grass byanaerobic rumen fungi in svvamp buffalo and cattle. Anim. Feed Sci.Technol. 22: 16 1.

Ho, Y.W., Abdullah N., and Jalaludin S. 1988b. Penetrating structures ofanaerobic rumen fungi in cattle and swamp buffalo. J. Gen. Microbio/,134:177-181.

Hobson, P. N; and Wallace, R. J. 1982. Microbial ecology an,d activities in therumen. Part 1. CRC Crit. Rev. Microbio/. 9: 165-225.

Hoover W.H. and Miller T.K. 1991. Rumen digestive physiology and microbialecology. Dairy Nutrition Management Vol 7 (2)

Huisman, J., Van Weerden E. J., Van Leeuwen P., and Koch F. 1988. Effect ofmethionine compounds on rumen activity of cows. Neth. J. Agr. Sci. 36:l ll.

Hume, I.D., and Bit-d. P.R. 1970. Synthesis of microbial protein in the rumen. IV.The influente of lev@ and form of dietary sulphur. Aust. J. Agr. Res. 21: 315.

Hungate, R. E. 1969. A roll tube method for cultivation of strict anaerobes. In:Norris J. R. Ribbons D. W. , eds. Methods in Microbiology. Vol. 3B. London:Academic Press. 117-l 32.

Joblin, K. N. 1989. Physical disruption of plant fibre by rumen fungi of theSphaeromonas group. In: The Roles of Protozoa and Fun@ b RuminantDiaestion. J. V. Nolan, R. A. Leng, and D. 1. Demeyer. ed. Penambul Books,Armidale, Australia. pp. 259-260.

Jouany, J.P. 1994. Methods of manipulation the microbial metabolim in the rumen.Ann Zootech. 43: 49-62

Jung H. G. and Allen M. S. 1995. Characteristics of plant cell walls affectingintake and digestibility of forages by ruminants. J. Anim. Sc;.- 73: 2774-2790..

Karunanandaa, K., and Varga, G.A. 1996. Colonization of rice straw by white-rotfungi (cyathus stercoreus). Effect on ruminal fermentation pattern, nitrogenmetabolism and fiber utilization during continuous culture. Anim. leed. SciTechnol. 61 (l-4) 1-16.

Kandylis, K. 1984. The role of sulphur in ruminant nutrition. Livestock Prod. Sc;,ll :611. A review

Kolattukudy, P. E. 1985. Enzymatic penetration of the plant cuticle by fungalpathogens Ann. Rev. Phytopath. 23: 223-250

Komisar&uk-Bony, S.: S. Toillon, C. Huc, and M. Carcelen. 1992. Estimation ofthe sulfur requirements of Turnen microbes in a semi-continuous fermentorRusitec. Proc. Aust. Soc. Anim. Prod. 19:300.

Kudo, H., Jakober K. D., Phìllippe, R. C., Cheng, K. J., Barr, D. J. S. & Costerton,J. W. 1990. lsolation and characterisation of cellulolytic anaerobic fungi andassociated mycoplasmas from the rumen of a steer fed a roughage diet.Canadian Journal of Microbiology 36: 513-517.

Leng, R.A. 1985. Muscle metabolism and nutrition in working ruminants. In:Draught Animal Power for Production. ACIAR Proceedings Series No. 10

Leng, R.A. 1988. Ruminant nutrition in the tropics. Livestock production p- 221-228.

Lewis, L.A., Hunt, C.W., Sanchez, W.K., Treacher, R., Pritchard, G.T. and Feng,P. 1996. Effect of direct-fed fibrolytic enzymes on the digestivecharacteristics of a forage based diet fed to beef steers. J. of Anim. Sc¡. 74(12). 3020-3028.

Li, J. & Heath, 1. B. 1992. The phylogenetic relationships of the anaerobícChvtridiomvcetous gut fungi (Neocallimasticaceae) and the Chvtrídiomvcota.1. Cladistic analysis of rRNA seque‘nces. Canadian Journal of Botany 70:1738-l 746. -.

55

Li, J., Heath, 1. B. & Packer, L. 1993. The phylogenetic relationships of theanaerobic Chvtridiomvcetous gut fungi (Neocallimasticaceae) and theChvtridiomvcota. II. Cladistic analysis of structural data and description ofNeocallimasticales ord. nov. Canacfian Journa/ of Botany 71: 393-407.

Li; J; Heath, 1.8; and Cheng, K. J. 1994. The development and zoosporeultrastructure of a polycentric chytridiomycete gut fungus, Orpinomycesjoyoni comb.nov. Can. J. Bof. 69: 580-589.

Li. J. & Heath, 1. B. 1993. Chytridiomycetous gut fungi, oft overlooked contributorsto herbivore digestion. Can. J. Microbio/. 39: 1003-l 013. Review

Lin, K. W; Patterson, J.A. and Ladisch, M.R. 1985. Anaerobic fermentations:Microbes from ruminants. Enzymes and Microbial Technology 7: 98-107.

Lodman, D.W., Petersen M. K., Clark C. K., Wiley J. S., Haustad K. M., andMclnerney M. J. 1990. Substitution of DL-methionine for soybean meai as awinter supplement for gestating cows grazing native range. J. Anim. Sc;,68:4361.

Lowe, S. E; Theodorou, M. K; Trinci, A.P.J; and Hespell, R. 6. 1985. Growt ofanaerobic rumen fungi on defined and semidefined media lacking rumenfluid. J. Gen. Microbio/. 131: 2225-2229.

Lowe, S.E; Griffith, G. G; Milne, A; Theodorou, M. K; and Trinci, A. P. J. 1987a.The life cycle and growth kinetics of an anaerobic rumen fungus. J. gen.Microbio/. 133: 1815-l 827.

Lowe, S.E., Theodorou, M.K. and Trinci, A.P.J. 1987b. Isolation of anaerobic fungifrom saliva and faeces of sheep. J. of Gen. Microbio/. 133: 1829-I 834.

Lowe, S.E., Theodorou, M.K. and Trinci A.P. J. 1987c. Growth and fermentation ofan anaerobic rumen fungus on various carbon .sources and effect oftemperature on development. Appl. and Environ. Microbio/. 53: 1216-1215

Lowe, S.E., Theodorou M. K., and Trinci A.P. J. 19874 Cellulases and xylanase ofan anaerobic rumen fungus grown on wheat s t raw, wheat s t rawhemicellulose, cellulose, and xylan. Appl. Environ. Microbio/. 53: 1216-1223.

Mackie, R.I. and White, 6. A. 1990. Recent advances in rumen ecology andmetabolim: potential impact on nutrient cutput. J. Dairy Sc¡. 73: 2971-2995.

Marvin-Sirkema, F.D; Richardson, A. J; Stewart, C. S; Gottschalk, J. C; and Prins,R. A. 1990. Influente of hydrogen consuming bacteria on cellulosedegradation by anaerobic fungi. Appl. Environ. Microbio/. 56: 3793-3797.

56

Mason, V.C., Cook, J.E., Keene, A.S. and Hartley, R.D. 1990. The use of mixturesof ammonium salts tith lime for upgrading cereal straws. Anim. Feed. Sc;.Technol. 28:169-181.

McAlIister T.A, Bae H.D.; Yanke, L.J.; Cheng, K.J. and Ha, J.K. 1994. A review ofmicrobial digetion of feed particles in the rumen. AJAS 7 (3): 303-316.

McCracken, B.A.! Judkins M. B., Krysl L. J., Holcombe D. W., and Park K.K.1993. Supplemental methionine and time of supplementation effects onruminal ferrnentation, digesta kinetics, and in situ dry matter and neutraldetergent fiber disappearance in cattle. J. Anim. Sci. 71: 1932.

Minson, D. J. 1990. Foraie in Ruminant Nutrition. New York. Academic Press. pp.20-22.

Momont, P.A., Pruitt R. J., and Johnson P.S. 1993. Effect of methionine additionto a urea-grain supplement on intake and digestibility of mature, dormantgrasses and performance of cows grazing winter range. J. Anim. Sci. 71:515.

Morgavi, D. P., Sakurada, M., Mizokami, M., Tomita, Y. and Onodera, R. 1994.Effects of Ruminal protozoa on cellulose degradation and the growth of ananaerobic ruminal fungus, piromyces sp. strain OTSI, in vitre. Appl. Environ.Microbio/. 60: 37 18-3723

Morrison, M., Murray, R. M. & Boniface, A. N. 1990. Nutrient metabolism andrumen microorganisms in sheep fed a poor-quality tropical grass haysupplemented with sulfate. J. Agrie. Sc;. 115: 269-275.

Mounfort, D.O. and Asher, R.A. 1989. Production and regulation of cellulase bythe ruminal anaerobic fungus Neocahmastix frontal&. Appl. and Environ.Mícrobiol. 55: 1016-I 022.

Mounfort, D.O., Asher, R.A. 1985. Production and regulation of cellulase by twostrains of the rumen anaerobic fungus Neocallimasfix frontahs. Appl, andEnviron. Microbio/, 49: 1314-l 322.

Mountfort, D. 0; and Asher R.A. 1983. Role of catabolite regulatory mechanismsin control of carbohydrate utilization by the rumen anaerobic fungusNeocallimastix frontalis. Appl. Environ. Microbio/, 46: 1331.

Mukhopadhyay and Kurar, C. 1995. Role of rumen bacteria, protozoa and fungi onthe digestion of dry matter and cell-wall components of certain feedstuffs.lndian J. of Anim. Sc¡. 65 (1): 117-I 19.

Multan¡, A.S., Makkar G. S, and Ahuja A.K. 1986. In vitre utilization of a sulfursalts by the rumen microorganisms. Indian J. Anim. Sci. 56:461.

Muller, M. 1988. Energy metabolism of protozoa without mitochondria. Ann. Rev.Microbio1 42: 465-488.

57

Munn, E. A. 1994. The ultrastructure of anaerobic fungi. In: j& anaerobic fun@(ed. C. G. Orpin & D. 0. Mountfort). Marcel Dekker: New York. In press.

Munn, E. A., Orpin, C. G. & Greenwood, C. A. 1988. The uitrastructure andpossible relationships of four obligate anaerobic chyfricfiomycete fungi fromthe fumen of sheep. BioSysfems 21: 67-82.

Nielsen, B.B., Zhu, W.Y., Trinci, A.P. J., Theodorou, M.K. 1995 Demostration ofzoosporangia of anaerobic fungi on plant residues recovered from faeces ofcattle. Mycol. Res. 99 (4): 471-474.

Obispo, N. E. & Dehority, B. A. 1992. A most probable number method forenumeration of rumen fungi with studies on factors affecting theirconcentration in the rumen. J. Microbio/. Meth. 16: 259-270.

O’Fallon, J.V., Wright, R. W and Calza, R. E. 1991. Glucose metabolic patways inthe anaerobic rumen fungus Neocallimastix frontak EB 188. J.Biochem-.274: 595599.

Onoda, A.; Kobayashi Y; Hoshino S. 1996. Effects of anino acids on the growth ofan anaerobic rumen fungus Neocallimastix sp N 13. Reprod, Nutr. Dev. 36:31 l-320

Orpin, C.G. 1975. Studies on the rumen flagellate Neocallimastix frontalis. J. Gen,Microbiol. 91:249-262.

Orpin, C.G. 1976. Studies on the rumen flagellate Sphaeromonas communis. J.Gen. Microbio/. 94:270.

Orpin, C. G. 1977a. The ocurrence of chitin in the cell walls of the rumenorganisms Nocallimastix frontal&, Piromonas communis and Sphaeromonascommunis. J. Gen. Microbio/. 99: 215-218.

Orpin, C. G. 1977b. On The induction of zoosporogenesis in the rumenphycomycetes Neocallimastix frontal&, Piromonas communis. J. Gen.Microbio/. 101: 181-I 89.

Orpin, C. G. 1983/1984. The role ciliate protozoa and fungi in the rumen digestionof plant cell walls. Anim. Feed Sc¡. Technol; 10, 121-l 43.

Orpin, C. G. 1989. Ecology of rumen anaerobic fungi in relation to the nutrition ofthe host animal. Page 29 in The Roles of Protozoa and Funai in Ruminant- - - -Diaestion. J. V. Nolan, R. A. Leng, and D. 1. Demeyer, ed. Penambul Books,Armidale, NSW, Aust.

Orpin, C.G., and A.J. Letcher. 1979. Utilization of cellulose, starch, xylan andother hemicelluloses for growth by the rumen Phycomycete Neocallimastixfrontalis. Curr. Microbio/. 3: 121-I 24.

Patterson J. A. 1989.-. Prospects for establisment of genetically enginermicroorganisms in the rumen. Enzíme Microb. Technol, vol ll _

Pearce, P.D., and Bauchop T. 1985. Glycosidases of the rumen anaerobic fungusNeocallimastix fronaths grown on ce l lu los ic subst ra tes. Appl. Environ.Microbio/. 49: 1265-l 269.

Phillips, M. W. & Gordon, G. L. R. 1992. Fungistatic and fungicida1 effects of theionophores monensin and tetronasin on the rumen fungus Neocallimastix sp.Lm?. Lett. Appl. Microbio/. 15: 116-I 19.

Phillips, M. W. and Gordon, G.L.R. 1995. Carbohydrate fermentation by threespecies of polycentric ruminal fungi from cattle and water buffalo in tropicalAustralia. Anaerobe 1: 41-47.

Philips, M.W. 1989. Unusual rumen fungi isolated from northern Australian cattleand water buffalo. In: Nolan, J.V., R.A. Leng and D.I. Demeyer. (eds.). TheRole of Protozoa and Funai 111 Ruminant Diaestion. pp. 247-249. Peambul- -Books, Armidale, AGralia.

. Phillips, M.W. and Gordon G.L. R. 1991. Growth responses to reduced sulphurcompounds of a ruminal fungus, Neocalhmastix sp. LMI. Proc. Third Int.Symp. on Nutr. Herbivores. (Malaysia. p. 26.

Qi, K., Lu C. D. and Owens F.N. 1992. Sulfate supplementation of Alpine goats:effects on milk yield and composition, metabolites, nutrient digestibilities, andacid-base balance. J. Anim. Sci. 70:3541-3550.

Qi, K., Lu C. D. and Owens F. N. 1993. Sulfate supplementation of growing goats:effects on performance, acid-base balance, and nutrient digestibilities. J.Anim. Sc¡. 71: 1579.

Rees, M.C. , Davis P. and Hogan J.P. 1982. The effect of fertilizer andsupplementary sulphur on the digestion of Digitatia pentzi in sheep. Proc.Aust. Soc. Anim. Prod. í4:681

Romulo, B. H., Bird, S. H. & Leng, R. A. 1986. The effects of defaunation ondigestibility and rumen fungi counts in sheep fed high-fibre diets. Proc. Aust.Soc. Anim. Prod. 16:327-330.

Romulo, B. H., Bird, S. H. & Leng, R. A. 1989. Combined effects of defaunationand protein supplementation on intake, digestibility, N retention and fungicounts in sheep fed straw based diet. In The Role of Protozoa and Funcli inRuminant Diaestion (OECD/UNE Intemational Seminar) (ed. J. V. Nolan, R.A. Leng & D. 1. Demeyer), pp. 285-288. Penambul: Armidale, New SouthWales, Australia.

Salter, D.N., Daneshvar K. and Smith R. H. 1979. The origin of nitrogenincorporated into compounds in the rumen bacteria of steers given proteinand urea containing diets. Br. J. Nutr, 41:197.

Selinger, L. B., Forsberg, C. W and Cheng: K. J. 1996. The rumen: A unique sourceof enzymes for enhácing livestock production. Anaerobe 2, 263-284.

Sijtsma, L., Tan, B. 1996. Degradation of perennial ryegrass leaf and stem cellwalls by the anaerobic fungus Noecallimasfix sp. Straìn CS3b. Appl. andEnwiron. Microbio/. 62 (4): 1437-l 440.

Spears, J. W., Ely D. G., Bush L. P. and Buckner R. C. 1976. Sulfursupplementation and in vitre digestion of forage cellulose by rumenmicroorganisms. J. Anim. Sc;. 43:513.

Spears, J.W., Ely, D.G. and Bush, L. P. 1978. Influente of supplemental sulphuron in wifro and in vivo microbial fermentation of Kentuky 31 tall fescue. J.Anim. Sc;. 47: 552.

Spears, J.W., Bush, L.P. and Ely, D.G. 1977. Influente of nitrate andmolybdenum on sulphur utilization by rumen microorganisms. J. Dairy Sci.60: 1889.

‘

SPP. 1991. Síntesis geográfica del Estado de Colima, Col. México. Pag. 22-23.

Stefanon, B., Pell: A.N. and Schofield, P. 1996. Effect of maturity on digestionkinetics of water soluble and water-insoluble fractions of alfalfa and bromehay. J. ofAnim. Sc;. 74 (5). ll 04-I 115.

Stewart, C. S., Akoyo, J. A. and Zadrazil, F. V., 1990. Enhan’ced degradability ofwheat straw following fermentation by Pleurotis ostreatus and thecontribution of rumen fungi and bacteria to straw degradation in vitro. In: M.T. Collaco and M. Coughlan (Editors), Advances in the Biolo~ical Treatment- -g Liclnocellulosic Materials, Elsevier Sciences, Barking, pp. 269-280.

Stewart, C. S. 1986. Rumen function with special referente to fibre digestion. Soc.Appl. Bactetiol. Symp. Ser, 13: 263-286.

Susmel P. and Stefanon B. 1993. Aspects of lignin degradation by rumenmicroorganisms. J. of Biotechnol. 30: 141-l 48.

Tanaka, H; Ushida, K; and Kojima, Y. 1992. Effect of p-coumaric acid on celluloseutilization by rumen fungi with or without methanogen. Anim. Sc;. Technol.63: 917-923.

Teunissen, M.J., Op den Camp, H. J. M., Orpin, C. G., Huis, J. H. J. & Vogels G.D. 1991. Comparison of growth characteristics of anaerobic fungi isolatedfrom ruminant and non -ruminant herbivores during cultívation in a noveldefined medium. Joumal of General Microbiology 137: 1401-l 408.

Theodorou, M.K., Lowe, S.E. and Trinci, A.P.J. 1988. The fermentativecharacteristics of anaerobic rumen fungi. Biosystems 21: 371-376.

Theodorou, M.K., Davies, D.R., Nielsen, B.B., Lawrence, M.I. and Trinci, P.J.1995. Determination of growth of anaerobic fungi on soluble and ce\\u\osicsubstrates using a pressure transdüiir. Microbiology-141: 671-678.

Trinci, A. P. J., Davies, D. R., Gull, K., Lawrence, M. I., Nielsen, B. B., Rickers, A.& Thepdorou, M. K. 1994. Anaerobic fungi in herbivorous animals. Mycol.Res. 98: 129-152. Review.

Van Soest, P. J. 1981. Limiting factors in plant residues of low biodegradability.Agrie. Environ. 6: 135.

Van Soest, P.J. 1982. Environment and forage. In: Nutritional Ecology of theRuminant. Edit. 0 and B Books Corvallis, Oregon p: 58-74

Waghorn, G.C. 1990. Beneficial effects of low concentrations of condensedtannins in forages fed to ruminants. In: Microbial and Plant Opportunities toImprove Lignocellulose Utilization by Ruminants (D.E. Akin, L.G. Ljungdahl,J.R. Wilson and P.J. Harris eds.), pp. 137-147. Elsevier Science, Publishers,New York.

Weston, R.H., Lindsay J. R, Purser D. B., Gordon G. L. R. and Davis P. 1988.Feed intake and digestion responses in sheep to the addition of inorganicsulfur to a herbage diet of low sulfur content. Aust. J. Agrie. Res. 39:1107-1119.

Whanger, P.D. 1972. Sulfur in ruminant nutrition. World Rev. Nutr. Dietect. 15:225A Review

Wilson, C.A., and Wood T.M. 1992. Studies on the cellulase of the rumenanaerobic f u n g u s Neocallimastix fronatlis, with special referente t o t h ecapacity of the enzyme to degrade crystalline cellulose. Enzyme Microb.Technol. 14: 258.

Wilson, J. R. 1993. Organization of forage plant tissues. In Foracle Cell WallStructure and Dinestibility (Eds H. G. Jung, D. R. Buxton, R. D. Hatfield & J.Ralph), pp. l-32. Madison: Ameritan Society of Agronomy.

Wilson, J.R. 1994. Cell wall characteristics in relation to forage digestion byruminants. J. Agrie. Sc;. (Camb.). 122:173- 182.

Wiliiams, A.G., and Orpin C.G. 1987a. Polysaccharide-degrading enzymes formedby three species of anaerobic rumen fungi growt on a range of carbohydratesubstrates. Can. J. Microbio/.- 33: 418-426

Wìlliams, A.G., and Orpin C.G. 1987b. Glycoside hydrolase enzymes present inthe zoospore and vegetative growth stages of the rumen fungi Neocallimastixpatticiarum, Piromonas communis, and an unidentified isolate, grown on arange of carbohydrates. Can. J. Microbio/. 33:427-434.

Windham, W.R. and Akin, D.E. 1984. Rumen fungi and forage fiber degradation.Appl. and Environ. Microbio/. 48: 473-476.

61

Wood, T. M. 1991. Fungal cellulasas. In Biosynthesis and Biodegradation ofCellulose (ed. C. H. Haigler & P. J. Weimer). 499-53. Marcel Dekker: NewYork.3

Wood, T. M., and Wilson C.A. 1995. Studies on capacity of cellulase of theanaerobic rumen fungus Piromonas communis to degrade hydrogen bond-ordered cellulose. Appl. Microbio/ Biotechno/-. 43: 572-578

Wood, T. M., McCrea S. I., Wilson C. A., Bhat K. M. and Gow L. A. 1988.Aerobic and anaerobic fungal cellulases, with special referente to their modeof attack on crystalline cellulose, In Biochemistry -and Genetics of CelluloseDeat-adation. ed. J. P. Aubert, P. Begin and J. Millet, AcademPresq pp.31-52

Wood, T.M., Wilson, C.A., McCrae, S.I. 1995. The cellulase sys’tem of theanaerobic rumen fungus Neocallimasfix frontalis : studies on the properties offractions rich in endo- (1-4)-p-D-glucanase activity. Appl. Microbiol.Biotechnol 44: 177-l 84

Wubah, D.A; Fuller, M.S; and Akin, D. E. 1991. Studies on Caecomycescommunis: morphology and development. Mycologia, 83: 303-310.

Wubah, D.A., Akin, D.E. and Borneman, W.S. Biology, fiber-degradation, andenzymology of anaerobic zoosporic fungi. Ctitical Reviews in Microbiology.19 (2): 99-115

Xue, G. P; Gobius, K. S; and Orpin, C. G. 1992a. A novel polysaccharidehydrolase cDNA (ceID) from Neocallimasfix patriciarum encoding three multi-functional catalytic domains with high endoglucanase, cellobiohydrolase andxylanase activities. J. gen. Microbio/. 138: 2397-2403.

Xue, G. P; Orpin, C. G; Gobius, K. S; Aylward, J. H; and Simpson, G. D. 1992b.Cloning and expression of multiple cellulase cDNAs from the anaerobicrumen fungus Neocallimastix patriciarum in Escherichia col¡. J. Gen.Microbio/. 138: 1413-l 420.

Yarlett, N. & Orpin, C.A. 1986. Hydrogenosomes in the rumen fungusNeocallimastix pattíciarum. Biochem. J. 236: 729-739.

Yarlett, N; Hann, A.C; Lloyd, D., and Williams, A. 1981. Hydrogenosomes in therumen protozoon Dasyfricha rumínanfium. Biochem. J. 200: 365-372.

Zhu, W., Theodorou, M.K., Longland, A. C., Nielsen, B.B., Dijkstra, J. and Trinci, A.P.J.1996. Growth and survival of anaerobic fungi in batch and continuous-flowcultures. Anaembe. 2: 29-37

62

3. MATERIALES Y MÉTODOS

El experimento se realizó con la finalidad de evaluar la particularidad de

degradar celulcsa pura por los hongos del rumen de caprinos alimentados con

sustratos fibrGsOS característicos del tr8pico seco. Se evalu8 su efecto sobre

la digestión de celulosa, asi como la concentración de glucosa como producto

de la fermentación y cambios en el pH al adicionar fuentes de azufre para

promover el crecimiento de estos hongos. .

3.1 Muestra

Para el experimento se utilizaron 2 X IO3 Iml zoosporas de hongos del

rumen, estas Leron obtenidas de un medio de cultivo axénico; las cuales se

cultivaron bajo condiciones específicas para su crecimiento en un medio de

cultivo descrito por Joblin (1981).

3.2. Restricciones

Se adicionaron antibióticos al medio de cultivo para evitar

contaminación bacteriana y se comprobó que el cultivo era axénico mediante

la observación al microscópio óptico.

En este experimento se tuvieron ciertas limitantes en relación con la

obtención de cultivos puros de hongos para llegar hasta su clasificación

taxonómica una vez que se contaba con una cepa local y esto debido a la falta

de equipo y condiciones adecuadas para este fin. Además no se contó con los

recursos necesarios para poder implementar las técnicas ya establecidas,

teniendo que adoptar materiales y reactivos existentes en nuestro laboratorio.

3.3 Localización del área de estudio

El trabajo se realizó en el Laboratorio de Posgrado del Area

Agropecuaria de la Universidad de Colima, el cual se ubica en la carretera

Jiquilpan- Manzanillo Km 260.

A los 18O 55’ latitud norte y !O3O 52’ longitud oeste, con una altura de 33

msnm. Su temperatura promedio anual es de 25OC y la precipitación media

anual de 710 mm (Anuario Estadíwco, 1994).

3.4 Técnica de muestreo

Los hongos se obtuvieron directamente de una fístula de un caprino,

recolectando digesta después de 2 horas de haber aliementado los animales.

La muestra se colocó en una bolsa de polietileno previamente esterilizada y

colocada en el medio de cultivo descrito por Joblin (1981) Después de 72

horas se obtuvieron las zoosporas para ser usadas para el experimento.

3.5 Procedimiento

Para la determinación dl contenido de paredes celulares del rastrojo de

maíz que se adicionó a la dieta para los animales se utilizó el método de

Goering y Van Soest (1970).

El contenido de azufre en la dieta se determinó de acuerdo a la técnica

de Mottershead (197 1)

En la preparación del cultivo axénico los hongos se aislaron y

multiplicaron en el medio propuesto por Joblin (1981), se adicionó celobiosa

(100 mg), almidón (1 OO mg) y glucosa (200 mg) como fuentes de carbono, los

componentes del medio se aforaron a 200 ml de agua destilada,

posteriormente se calentó hasta ebullición, se insertó una cánula conteniendo

COn comercial libre de 02, y el burbujeo se mantuvo hasta equilibrar la

anaerobios& en el medio. Además, se añadieron sulfuro de sodio (0.12%) y

cisteína (0.12 g) como agentes reductores, posteriormente se esterilizó en una

olla de presion a ll 5OC (1.5 libras/ kg de presión) por 15 minutos, Se adicionó

al medio una mezcla de antibióticos para evitar la contaminación bacteriana la

que consistió de 100 mg de cloranfenicol (diluídos en 1 ml de etanol), 2 g de

penicilina- G ( penicilina benzatínica yl procaínica, Cls Hj8 N2 Oq S CI3 H20 NZ

02, peso molecular 570.7, 1000 unidadesimg, Sigma, Pen-P) y 800 mg de

sulfato de estreptomicina (Sigma, S- 6501, peso molecular 1457.4, 765.

unidades de estreptomycina base/ mg, 5.5 mol/mol de agua ) lo anterior se

diluyó en 9 ml de agua destilada (Akin y Benner, 1988).

Los hongos se cultivaron en un medio de cultivo descrito por Joblin

(1981) bajo condiciones anaerobias según metodología como propone

Hungate, (1969) y con ciertas modificaciones por Obispo y Dehority (1992).

Se comprobó que el medio era axénico por observación al microscopio óptico

con un objetivo 10X y una vez que se preparó el medio de cultivo, este se

mantuvo en un matraz de fondo plano de capacidad de un litro. sellado con

tapón de goma No 5, posteriormente se esterilizó a una temperatura de

ll 5OC por un tiempo de 15 minutos. Se agregaron 20 g. de digesta ruminal

contenida en un filtro de polietileno (poro de 50 um), previamente esterilizada

con 1600 poroslcm’, misma que se colocó en 180 ml de la preparación del

medio. Se incubó a una temperatura de 39OC durante 72 h.

Se realizó el conteo de zoosporas con una cámara hemocitométrica de

Newbauer en microscópio óptico con el objetivo de 40 X. como describe

Morgavi et al., 1994. Se adicionaron 9 ml de medio basal en cada uno de los

3 tubos de ensayo (16cm/l.5 mm) utilizados en cada tratamiento, incluyendose

la misma cantidad de tubos no inoculados para considerarlos como control y

en la condición anaerobia. Las zoosporas que se encontraban en el medio de

cultivo donde se llevó a cabo la multiplicación de los hongos, fueron

transferidas a cada uno de los tubos tomando un mililitro que contenía una

cantidad aproximada de 2 X lo3 zoosporas del medio de crecimiento y estos

se colocaron en cada uno de los tubos de ensayo (16cmH.5 mm) para su

posterior evaluación en las incubaciones in vifro.

Después se adicionó a cada uno de los tubos 100 mg de celulosa pura,

tubos sin celulosa y sin fuente de azufre también fueron utilizados para

tomarlos como control. Aunque se comprobó que el medio era axénico se

agregaron 10 ~1 de antibióticos a cada uno de los tubos (16cmU.5 mm) para

evitar la contaminación bacteriana.,

3.6 Descripción de los animales

En el cuadro 1 se describe el valor nutritivo de la dieta utilizada para la

alimentación de los animales. El análisis bromatológico se realizó con la

técnica de macro Kjendhal (Tejada, 1985) para la determinación de proteína.

SE: utilizaron como donadores de inóculo para el experimento 2 caprinos

machos criollos castrados de aproximádamente 4 años de edad, 25 kg de

peso vivo, con fístula y cánula ruminal; con un tiempo de 3 años de fistulados.

La ración diaria para los animales consistió de 700 g de rastrojo de maíz (en

base seca), 200 g de melaza, 15 g de urea y 10 g de una mezcla de

minerales de casa comercial exento de azufre.

Con un consumo diario promedio de 800 g por día. El agua se

suministró a libre acceso.

66

Cuadro 1. Valor nutritivo de la dieta utilizada para la alimentación de los animales donadores

d e inóculo.

Dieta MS PC FDN FDA Hemi L i g Cel Azufre

% % % % % % % (w-N

Rastrojo de maíz 92.32 6.57 70.54 50.20 21.86 ll .53 36.30 9.6

Melaza 5.99 77.9

MS = Mater ia seca FDN = Fibra detergente neutro Llg = L ign ina Gel = Celulosa C = Proteína cruda,

Hemi = Hemwlulosa FDA = Fibra detergente ácido ppm = par tes por m i l l ó n

3.7 Mediciones

El medio de cultivo para el experimento fue el que describe Kudo et a/.

(1990) modificado por Barichievich y Calza (1990a). El sustrato utilizado en el

experimento fue celulosa pura comercial (Sigma chemical Co, No. Cat: S-

6790). El pH del medio se ajustó a 6.8 con ácido fosfórico (dilución 2O:l con

agua destilada, J.T. Baker, M-32736, 85.3% de pureza), posteriormente se

calentó hasta ebullición a flama directa con un mechero bunsen, este se

burbujeo con una canula de bióxido de carbono (COZ) comercial libre de

oxígeno (02 ) para su posterior vaciado a tubos de ensayo (16cm/?.5mm) y

sellados con tapón de goma No. 0.

Para el desarrollo del experimento se utilizaron como fuentes de azufre

al sulfuro de sodio, metionina y una mezcla de ambas fuentes comerciales

(Sigma), en estas dos últimas; dicha mezcla se realizó considerando la

proporción de azufre de cada fuente en cantidades de 50% del peso fórmula

gramo en relación al contenido de azufre;

3.8 Variables

Las variables evaluadas que se midieron fueron: digestibilidad de

celulosa (%) niveles de glucosa (~mollml) y valor de pH.

Se manejaron 4 periodos de incubación (2, 4, 6 y 8 días), al término de

cada periodo el contenido de cada uno de los tubos se filtró usando papel

filtro Whatman No 40. El mismo papel junto con el residuo de celulosa se

deshidrató en un horno (UL, K-5030-01) por un tiempo 12 h a una temperatura

de 80°C, se colocaron en un desecador (K-6514-1 0) por 15 *minutos.

Posteriormente se pesaron en una balanza analítica (Sigma, modelo AS120S,

capacidad 122 g) y por diferencia de peso se estimó la cantidad de celulosa

digerida, además se consideró la fracción fluída que contenia cada uno de los

medios de cultivo para determinar la cantidad de materia seca encontrada en

ellos y así corregir esta determinación como propone Obispo y Dehority

(1992).

Se tomó el sobrenadante de cada uno de los tubos que se encontraba a

una temperatura de 20° C para la determinación del pH mediante un

potenciómetro digital, calibrado con solución buffer de pH 4 y 7 (modelo S-

220, Electrodo 476140,Corning Mexicana, S.A México D.F.).

Se guardaron 2 ml de sobrenadante en camara de refrigeración a 4OC

para posteriormente determinar la concentración de glucosa por el método de

azúcares reductores propuesto (Jue y Lipke, 1985).

ox

3.9 Análisis estadístico

Los datos fueron analizados de acuerdo al procedimiento de SAS. El

modelo incluye los efectos de las fuentes de azufre x niveles de azufre x

interacción entre fuentes y niveles x error.

Se evaluaron 12 tratamientos para cada uno de los tiempos de

incubación.

El diseño utiliza& en el presente experimento fue completamente ai

azar con arreglo factorial. Para el experimento se utilizaron un total de 4

niveles de azufre ( 0, 0.15, 0.25 y 0.35%) de la fracción molecular de la fórmula

para las fuentes de metionina, sulfuro de sodio y la mezcla de sulfuro de sodio

y metionina con 3 repeticiones cada uno, mismos que fueron evaluados en 4

periodos de incubación a los 2, 4, 6 y 8 dias. El grupo testigo se consideró sin

ninguna fuente.

El modelo estadístico utilizado fue Y = M + A + B + AxB + Error

donde:

M = Media de cada uno de los tratamientos

A = Variable de fuentes

B = Variable de niveles

AxB = Interacción de fuentes con niveles

Error = Error experimental

Los resultados obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante

un análisis de varianza. Para la comparación múltiple de medias de los

tratamientos se utilizó la prueba de Tukey (PC O.OS)(Steel y Torrie, 1980)

69

LITERATURA CITADA

Akin, D.E. and Benner R. 1988. Degradation of polysaccharides and lignin byruminal bacteria and fungi. Appl. Environ. Microb. 54: 1117.

Anuario Estadístico del Estado de Colima. 1994. México. Pag. 4-6

Barichievich, E.M. and Calza R.E. 1990a. Supernatant protein and cellulaseactivities of the anaerobic ruminal fungus Neocahmastix frontalis EB188.Appl. Environ. Nlicrobiol. 56:43.

Goering, H.K. and Van Soest P. J. 1970. Forage Fiber Analyses (apparatus,reagents, procedures and some applications). USDA AgricultureHandbook 379. \

Hungate, R. E. 1969. A roll tube method for cultivation of strict anaerobes. In:Norris J. R. Ribbons D. W. , eds. Methods in Microbiology. Vol. 38.London: Academic Press. 117-I 32.

Joblin, K. N. 1981. isolation, enumeration and maintenance of rumen anaerobicfungi in roo1 tubes. Appl. Environ. Microbio/. 42: ll 19-l 122

Jue, C. K. and P. N. Lipke. 1985. Determination of reducing sugars in thenanomole range with tetrazolium blue. J. Biochem. Biophys. Metho&ll: 109.

Kudo, H., Jakober K. D., Phillippe, R. C., Cheng, K. J., Barr, D. J. S. &Costerton, J. W. 1990. Isolatíon and characterisation of cellulolyticanaerobic fungi and associated mycoplasmas from the rumen of a steerfed a roughage diet. Can. J. of Microbio/. 36: 513-517.

Mottershead, B.E. 1971. Estimation of sulphur in biological materials using thetechnicon autoanalyser. Lab. pract. 20: 483

Obispo, N. E. & Dehority, B. A. 1992. A most probable number method forenumeration of rumen fungi with studies on factors affecting theirconcentration in the rumen. J. Microbio/. Meth. í6: 259-270.

Steel, R.G.D. and Torne, J.H. 1980. Principles and procedures of statistics(2nd edn). McGraw Hill International, London, UK.

Tejada, H. 1. 1985. Determinación de proteína cruda por el método de Kjeldahl

“Manual de laboratorio para anátisis de ingredientes utilizados en la

alimentación aniti-ial” Patronato de apoyo a la investigación y

experimentación pecuaria en México, A.C. Pag. 23

70

4. RESULTADOS

Los resultados encontrados para la digestibilidad de celulosa,

concentración de glucosa y cambios en el pH en el medio de cultivo por efecto

de las fuentes de azufre se describen en los cuadros 2, 3 y 4 y en las figuras 4,

5,6,7>8 S lo;11 y 12

4.1 Digestibilidad de celulosa <

LGS resultados de digestibilidad de celulosa por los hongos del rumen

estimulando su crecimiento con fuentes de azufre se muestran en el cuadro

No. 2 y en las figuras 4. 5 y 6

LGS resultados muestran que la digestibilidad de celulosa se ve afectada

por los niveles de azufre en el medio de cultivo, ya que se obtuvieron

diferencias significativas para los 3 niveles de azufre utilizados en los

tratamientos de metionina y sulfuro de sodio a los 2,4,6 y 8 dias de incubación,

en el tratamiento de sulfuro de sodio hubo diferencias significativas entre los 3

niveles de azufre a los 2 y 4 dias de incubación, mientras que a los 6 días no

hubo diferencias significativas entre los niveles 0.15 y 0.25%. ni entre los

niveles de 0.25 y 0.35%, no habiendo diferencia solo entre los niveles de 0.15

y 0.35%.

Como se observa en las figuras 4 y 5, al utilizar la mezcla de metionina

más sulfuro de sodio se obtuvieron los resultados de digestibilidad más

sobresalientes solo para los niveles de 0.15 y 0.25% de azufre, no siendo así

el efecto para el nivel 0.35% de azufre. Los resultados más bajos se

registraron al utilizar la metionina como fuente de azufre a los 6 y 8 dias de

incubación para el nivel de 0.25% de azufre.

CUADRO 2. Digestibilidad de ceiulosa pura por hongos del rum?n bajo la suplementación dediferentes fuentes de azufre con 3 niveles y L :‘empos de incubación en elmedio de cultivo In vitre.

Tiempo de

incubación NIVELES DIGESTIE -iDAU Yo .

(DIAS)

TESTIGO METIONINA SULFURO 3E SODIO S + M EEM

2 0.1 5%

0.25%

0.35%

4 0.1 5%

0.25%

0.35%

6 0.15%

0.25

0.35%

8 0.15%

0.25%

0.35%

28.86abc

23.79bcd

22.4Ocd

29.44cd

29.06cd

24.60def

25.93cde

33.99abc

26.99cd

22.90def

32.63bcd

30.76cd

29.54ab

26.72bc

17.31de

36.03ab

26.54cde

19.88f

36.47ab

22.50de

18.65e

35.06abc

22.80ef

19.55f

35.26a

25.59br

15.24f

40.82a

30.27~

23.43e’

39.95a

34.45ar-:

27.690:.:

34.35ac :d

35.31 ah:

34.13akd

30.10ab 1tll.3

34.39a

17.65de

31.07bc +8.3

35.54b

24.60def

42.07a *14.3

37.02a

25.08de

42.45a k8.2

39.67ab

28.89cde

Medias con la misma letra para cada tiempo de incubación no drfieren significativamente

(PC 0.01)

M + S = Mezcla de sulfuro de sodio y metionina como fuentes de azufre

EEM = Error estándar de la media para cada tiempo de incubaclon

_:: 32 36

202 4 6 a

Dias de mcubacih

Figura 4. Evo:.ción de la digestibilidad al 0.15 % de Azufre (ver cuadro 2)

44

2 36.z.Z2 32E

iY 28ae

24 / <.............;

20 i4 6 8

Dias de incubación

Figura 5. Evoxión de la digestibilidad al 0.25 % de Azufre (ver cuadro 2)

36 /l ..o32 1 :’iri Jk3l / .:.’0 20.

,,/,...” &.

.s .; _ _- . ..__..._.. -.--- -3-: -.: :

1 6

-Es

-;

TESTIGO

METIONINA

SULFURO DE

S + M

.

SCOIO

-o- TESTIGO

.? MET IONINA

--)- SULFURO DE SODIO-:i- s+M

-e- TESTIGO

7 MET IONINA

---‘3-- SULFURO DE SODIO12 L

1 4 6 8 ~-:- S+M

Dias de incuoación

Figura 6. Evoxión de la digestibilidad al 0.35 % de Azufre (ver cuadro 2)

A los 8 días de incubación, erpleando sulfuro de sodio como fuente de

azufre, no se encontraron diferer:-ias significativas en los resultados de

digestibilidad de la celulosa para nin+no de los 3 niveles de azufre utilizados

Cuando se utilizó la mezcla :e sulfuro de sodio mis metionina como

fuentes de azufre a los 2 días de irrubación no hubo diferer,:ia significativa

con el nivel de 0.35%. Lo mismo oc¿-re a los 4 y 8 dias de incubación. En los

tratamientx con 0.15 y 0.25% arro,?n resultados estadística-riente iguales.

mientras que el tratamiento co7 0.35% de azufre resultó diferente

estadísticamente en todos los tiemp-rs de incubación en relaciin a los niveles

de 0.15 y 2.25%

Los valores cle digestibilidad ~5 ceiuiosa obtenidos en 5 testigo fueron

estadisticamente iguales para los 3 r- veles a los 2! 4. 6 y 8 dias de incubación.

Los resultados indícan que z los dos dias de incuba: ón los valores

para las tres fuentes de azufre evalsadas no se obtuvo difere-via estadística.

obteniéndose los valores más altos erl el nivel de 0.15% con @ores de 29.54,

35.26 y 30.10 % de digestibilidad para las fuentes de metio?ina, sulfuro de

sodio y la mezcla de metionina y sulfxo de sodio respectivamente. Asi mismo

para el nivel de 0.25% para la mezcla de metionina y sulfuro ce sodio con un

valor de 34.39% de digestibilidad. El testigo resultó más alto a’ utilizar el nivel

de 0.15% con una digestibilidad de 28.86%.

Al cuarto dia de incubacióg se presentaron los resultados más

sobresalientes para el nivel con 0 15% para la mezcla de metionina con

36.03% de digestibilidad y sulfuro de sdio con 40.82% de digestibilidad. En

este tiempo de incubación el testigo mostró los resultados más bajos de

digestibilidad, siendo de 29.44, 29.06 y 24.60.

74

A los 6 días de incubación los datos más sobresalientes son para ei

nivel 0.15% con 36.47% de digestibilidad para la metionina, 39.95% para e;

sulfuro de sodio y 42.07% gara la mezcla de metionina rrlás sulfuro de sodio.

Al igual para el nivel de 0.25% para la fuente oe sulfuro de sodio cor

34.45% de digestibilidad y la mezcla de sulfuro de sodio más metionina con

37.02%. Para este nive; el testigo también mostk un valor mayor de.3igestibilidad con un valor de 33.99.

Los resultados más sobresalientes a los 8 dias de incubación, se

--egistran con el nivel 0.15Y de azufre siendo de 35.06üL de digestibilidad par-2

.a metionina, 34.35% pars el sulfuro de sodio y 42.45% para la mezcla de

cr7etionina más sulfuro de sodio. También sobresalió ei Gel de 0.25% para la

‘uente de sulfuro de sodio con 35.31% de digestibilidac y la mezcla de sulfure

de sodio más metionina co? 39.67%. Solo en este per ado sobresalió el nive:

de 0.35% de azufre al utilizar el sulfuro de sodio con 34 Í3% de digestibilidad

Como se observa en el cuadro 2, los valores encontrados para el nivei

de 0.15% de azufre superó a los demás niveles, excepto cuando se evaluó la

mezcla de sulfuro de sodic y metionina a los 4 dias de incubación al presntar

un valor de 31.07% de digestibilidad.

El análisis estadístlco nos indíca que existe una diferencia altamente

significativa (PC 0.01) para los tratamientos a los 2,4.6 y 8 dias de incubación

evaluados durante el estudio. El mismo análisis nos presenta una diferencia

altamente significativa (PC 0.01) por efezto del uso de las fuentes de azufre

utilizadas a los 4, 6 y 8 dias de incubación de los hongos, sobresaliendo la

fuente de sulfuro de sodio y la mezcla de metionina más sulfuro de sodio. En

75

relación a los niveles de azufre utilizados en cada uno de las fuentes de

azufre, también nos señala una diferencia altamente significativa (P =C 0.01) a

los 2.4,6 y 8 dias de incubación, sobresaliendo, el nivel de 0.15% de azufre.

4.2 Concentración de glucosa

Los valores que se muestran en el cuadro 3 y figuras 7, 8 y 9

corresponden a la -concentración de glucosa que se produjo probablemente a

partir de la celulolisis por ios hongos del Turnen mediante el proceso

fisicoquímico de la degradación de celulosa.

El análisis de varianza de estos datos nos indica que existe una

diferencia altamente significa?;va (P 0.01) con respecto a las fuentes de

azufre. Sobresaliendo con los valores más altos a los 6 días de Incubación los

niveles de 0.25 y 0.35% de azufre para las 3 fuentes de azufre.

Al analizar la interacción entre las fuentes y niveles de azufre. se

encontró una diferencia altamente significativa (PC 0.01) para los 2, 4 y 8 días

de incubación y una diferencia significativa (PC 0.05,! a los 6 días de

incubación. Se observa que a los 2 días de incubación se obtuvo una mayor

concentración de glucosa de 3.94 ~moles/mI al utilizar el nivel de 0.35% de

azufre al adicionar la mezcla de sulfuro de sodio más metionina. A los 4 días

de incubación, los resultados más altos de glucosa se obtuvieron al adicionar

la mezcla de sulfuro de sodio más metionina 3.92 ~moleslml y el sulfuro de

sodio con 3.83 ~moles/mI al utilizar el nivel de 0.35% de azufre. A los 6 días

de incubación, los resultados más altos de glucosa se registraron al adicionar

la metionina con 3.05 ~moles/ml, sulfuro de sodio con 3.16 ~moles/ml, y la

mezcla sulfuro de sodio y metionina con 3.33 ~moles/ml. para el nivel de

0.25%; al igual que al que cuando se utilizó el nivel de 0.35% con valores de

3.99 ~moles/ml para fuente de metionina 4.16 ~moles/ml para el sulfuro de

sodio y 4.10 ~moles/ml para la mezcla de sulfuro de sodio más metionina.

Las figuras 7?8 Y 9 muestran que a[utilizar la mezcla de metionina y sulfuro

de sodio se obtuvieron los valores más sobresalientes, siendo el efecto más

77

CUADRO 3

Tiempo de

incubación

(DIAS)

Concentración de glucosa (~Lmoliml) en el sobrenadante en los medios decultivo para los hongos del rumen utilizando 2 fuentes de azufre y lacombinación de las dos con 3 niveles WI 4 tiempos de incubación in vitre.

NIVELES CONCENTRAClON DE GLUCOSA.

TESTIGO METIONINA SULFURO DE SODIO S + M EEM

4 0.15% 2.78~

0.25% 1.39d

0.35% 1.27d

6 0.15%

0.25%

0.35%

8 0.15%

0.25%

0.35%

2 0.15%

0.25%

0.35%

0.99g

1.39fg

1.66ef

0.99d

1.89cd

1.05d

1.17de

1.33de

1.44de

1.83e

2.33cd

2.66c

2.78~

3.11b

1.44d

1.50d

3.05ab

3.99ab

1.28de

1.50cde

3.16bcd

1.33fg

1.94de

1.94de

l . l l d

1.61d

3.83a

2.66bc

3.16ab

4.16a

1.66cde

1.94cde

0.83e

3.33b

3.44b

3.94a

-0.1

2.45~ I 0.5

3.07bc

3.92a

2.78bc

3.33ab

4.10a

ro.3

2.99abc

3.82ab

4.16a

10.1

Medias con la misma letra para cada tiempo de incubación no difieren significativamente

(P¿ 0.01)

M + S = Mezcla de sulfuro de sodio y metionina como fuentes de azufre

EEM = Error estándar de la media para cada tiempo de incubación

3.2

: 2.0:;cj 1.6.1

1 . 2

0.8 L

4.0

3.4=E2 2.8

j 2.2

3(3 1.6

1.0

-- - TESTIGO

7 MET IONINA

--- SULFURO DE 50DIO

--:- S+M

Dias de inwbación

Figura 7 Evolución de la glucosa al 0.15 % de Azufre ‘$er cuadro 3)..

2 4 6 8

Dias de incubación

Figura 8 Evoluckm de la glucosa al 0.25 % de Azufre ter cuadro 3).

--r TESTIGO

:-- METIONINA

--)-- SULFURO DE SODIO--2- S+M

2.5 -. _:’

s 2.0.; ‘.

8 3’ ,.

< 1.5~-+- TESTIGO

1.0 :‘0

METIONINA

->--.0.5

SULFURO DE SODIO2 4 6 8 --:- S+M

Dias de incubación

Figura 5 Evolución de la glucosa al 0.35 % de Azufro ‘ier cuadro 3).

79

marcado z los 2 y 8 dias de incubación para los niveles de 0.15 0 25 y 0.35%

d e azufre Los resultados más bajos se reportaron con eI testigo al

compararlos con los 3 niveles de azufre.

A ìos 8 dias de incubación se registraron los valores miás altos en la

concentración de glucosa los cuales se presentaron al utilizar ia mezcla de

metionina y sulfuro de sodio, dichos valores fueron de 2.92. 3.8% y 4.16

~moles/~I para las concentraciones de 0.15. 0.25 y 0.35% de azuirg

Los valores más bajos que se obtuvieron a los 2 días de incubación al

utilizar ei sulfuro de sodio y el nivel de 0.15%, fueron de 1.33 ,moles/ml. Un

comportamiento similar se observó en el testigo cuando se utilizó el nivel de

kl5% de azufre obteniendose valores de 0.99 vmoles/ml.

A los 4 días de incubación los resultados más bajos de concentración de

glucosa se reportaron para las fuentes de sulfuro de sodio con el nivel de 0.15

y 0.25% de azufre con valores de 1.11 y 1.61 ~~moles/ml respectivamente.

Resultó un comportamiento similar con el testigo para los niveles de 0.25%

con valor de 1.39 pmoles/ml y 0.35% con 1.27 ~moleslml

A los 6 días, los valores más bajos de glucosa se reportaron al adicionar

metionina al utilizar el nivel de 0.15% de azufre, encontrando 1.50 ~moles/ml.

De la misma manera en el testigo a una concentración de 0.99 ;Imoles/ml.

4.3 Determinación de pH

Los resultados para los valores de pH del sobrenadante de cada uno de

los tratamientos por el efecto ca las fuentes y niveles de azufre y el tiempo de

incubación se exponen en el cLadro 4 y en las figuras 10. ll y 12.

El análisis de varianza TOS indíca que existe una diferencia altamente

significativa (PC 0.01) en los 5 4) 6 y 8 días de incubación por efecto del uso

de las fuentes evaluadas.

En relación a los niveies de azufre evaiuados para cada una de las

fuentes, el mismo análisis ncs indíca una diferencia altamente significativa

(PcO 01) para los 2: 6 y 8 días de incubación, sobresaliendo el nivel de 0.35%

de azufre al presentarse los mayores valores con este tratamiento.

Para las interacciones entre las fuentes y niveles de azufre el análisis

estadístico nos indíca una diferencia altamente significativa (P~0.01) para los

2, 6 y 8 días de incubación y diferencia significativa (P ~0.05) para los 4 días

de incubación.

Las figuras 10, 11 y 12 muestran que el pH se incrementó al adicionar

sulfuro de sodio como fuente de azufre a las concentraciones de 0.15! 0.25 y

0.35% de azufre, siendo más altos para los 2 y 4 dias de incubación. Los

valores más bajos se expresan al utilizar la metionina como fuente de azufre

para todos los niveles, con el efecto más marcado a los 4 y 6 días de .

inm ~harifín

X1

CUADRG 4. Valores de pF del sobrenadante del medio c? cultivo de los hongos del fumenutilizando 2 fuentes de azufre y la combinacin de las dos con 3 niveles en 4tiempos de iwgbación in vitr-o.

Tiempo de

incubación NIVELES PH .

(DIAS)

TES’IGO METIONINA SULFURC 3E SODIO S+M ,.EE”

2 0.15% 7.952

0.25% 7.7?2

0.35% 7.35’

4 0 . 1 5 % 7.58~

0.25% 7.71 abc

0 . 3 5 % 7.45c

6 0 . 1 5 % 7.59bcd 6.9Og

0.25% 7.55Me 7.20f

0.35% 7.47ors 7.lf

8 0.15% 7.58bcde

0.25% 7.84ab

0.35% 7.32de

i.cxg7.61de

7.750

6.931

7.28e

7.37de

8.:2,:

8.2:3b

8.4:~

7 7Eabc

8.663

8.4-ab

7.46cde

7.6t;bc

7.8:a

7.6Cxd

7.7iaoc

7.93a

7.60de

7.30fg

7.43ef

to. L

7.52bc

7.32~

7.51 bc

kl 3

7.42cde

7.43de

7.68ab

10.2

7.38de

7.36de

7.47cde

kO.5

Medias con la misma letra para cada tiempo de incubackn no difieren significativamen:e(P< 0.01)

M + S = Mezcla de sulfuro d+ sodio y metionina como fuentes de azufre

EEM = Error estándar de la qedia para cada tiempo de incuoación

82

8.4 r

8.2

:;: L -._,, î ,;

x --Lt---~a 7.4 -4L---.

7 . 2

7.0 + TESTIGO-.6.8 _

.: METIONINA

6.6--+--- SULFURO DE SODIO

2 4 6 8 --2- S+M

Dias de incubación .

Figura 10. Evolución del pH al 0 .15 % de Azufre (ver cuadro 4).

8.8

8.6 0.

..,.

8.4

8.2

8.0IQ 7.8 ^

3

7.6 :

7.4 ‘.---LL.=- -------

- -o- TESTIGO

7.2 --- ..~.... ‘y-- METIONINA

7.0 --o-- SULFURO DE S O D I O-2 4 6

0-z- S+M

Dias de incubación

Figura l l . Evolución del pH a l 0 .25 % de Azufre (ver cuadro 4) .

8.2‘.

8.0. . 3

7.8 ‘+5 7.

7.6 -i_//- ‘.

7.4+ TESTIGO

7 . 2 -- . ---:-- METIONINA

7.0---o-.- SULFURO DE SODIO

2 4 6 8 -x- S+M

Dias de incubación

Ffgura 12. Evolución del pH al 0 .35 % de Azufre (ver cuadro 4) .

83

A los 2 días de incubación, los valores más altos de pH se registraron al

utilizar sulfuro de sodio como fuente de azufre para los niveles de 0.25 y

0.35Ok de azufre siendo estos de 8.25 y 8.45 respectivamerx

A los 4 días de incubación, los valores más altos ;3~ pH se obtuvieron

al utilizar el sulfuro de sodio para las 3 concentraciones US azufre con valor

de 7.73. para el 0.15%: con pH 8.64 para 0.25% y pH E 47 para el nivel de

0.35O/c de azufre..

En el tratamiento de incubación por 6 dias, los resJkados de pH más

altos se obtuvieron al utilizar el tratamiento de sulfuro de scdio y la mezcla de

metionina y sulfuro de sodio con el nivel de 0.35% de azufre para ambos

tratamentos; los valores de pH obtenidos fueron de 7.83 p;--a sulfuro de sodio

y 7.68 para la mezcla de las dos fuentes.

A los 8 días de incubación1 los valores más altos 23 pH se obtuvieron

cuando se utilizó sulfuro de sodio en los niveles de 0.25 :, 0.35% de azufre,

con valores de 7.77 y 7.93 respectivamente.

Solo se presentaron valores de pH más elevados para el testigo con el

nivel 0.25% de azufre con un valor de 7.84.

No se encuentró diferencia significativa (P> 0.05) para los 4 días de

incubación en relación a los niveles de azufre evaluados.

El pH más bajo se obtuvo al utilizar la el nivel de 0.15% de azufre con

la metionina como fuente- de azufre a los 2, 6 y 8 dias de incubación con un

valor de 7.07, 6.90 y 6.93 respectivamente.

5. DISCUSION

Para promover la máxima retención de nitrógeno, es necesario una

proporción adecuada de nitrógeno-azufre en la dieta (Whanger, 1972). La

metionina es el,primer aminoácido azufrado limitante en ganado lechero y s,

deficiencia quizá origina cambios en el metabolismo de los lípidos (Bull !

Vandersall, 1972).

En los estudios que se han realizado en relación al efecto del azufre FI

forrajes fertilizado y no fertilizados ha demostrado que la fertilización còn azufre

incrementa el consumo voluntario y reduce los niveles de amoniaco en el

rumen. lo cual es indicador de una elevada actividad microbiana en el rumeq.

además se encuentra un efecto marcado en la contribución de los hongos a a

degradación de celulosa cuando estos tienen una adecuada proporción ee

azufre (Akin et al., 1983).

Orpin y Greenwood (1986) mencionan que una deficiencia de azufre e?

la dieta podría limitar el crecimiento de los hongos en el fumen asi como s;1

contribución en la digestibilidad de las paredes celulares de plantas.

El metabolismo del azufre y nitrógeno se encuentran estrechamente

asociados en rumiantes. La acción de la microflora del rumen quizá se altere

completamente la forma de la dieta para ambos de estos elementos (Kandylis.

1984). Se sugiere que para que el metabolismo sea óptimo por parte de la

microbiota y el animal hospedero, la cantidad y formas requeridas de azufre

necesaria en dietas a base de forraje: esto puede ser exitoso y aún no se ha

establecido (Weston et al., 1988).

La capacidad de digestión celulolítica por los hongos, la cual es

superior a 45% del peso seco de los tejidos de las plantas en cultivos in vitre

sugiere que ellos tienen-.un potencial por contribuir significativamente en la

digestión de lignocelulosa en el hospedero animal (Orpin, 1988).

La habilidad para utilizar diferentes carbohidratos para el crecimiento de

los hongos del rumen y para producir diferentes productos finales de la

fermentación en cultivos puros explicaria la variación en las propiedades de

los diferentes aislamientos fungales en el rumen en el rumen. La información

sobre los sustratos y productos finaies podría aportar una comparación

funcional a las diferentes especies de yongos del rumen, siendo aislados del

rumen de ovinos y bovinos en diversas zonas geográficas y regiones

climáticas (Phillips y Gordon, 1988).

La importancia de encontrar los requerimientos nutricios de azufre para

los microorganismos del rumen en dietas bajas en azufre ayudaría al

incremento ce la digestibilidad de lignocelulosa en 7.3 y 18.3 % (Weston et al.,

1988).

Al supiementar las dietas de baja zalidad nutritiva con fuentes de azufre

se ha mostrado que la degradación de: sustrato presente en el wmen podría

ser mejorado (Morrison et al.. 1990).

El incremento en la proporción de la producción microb!ana por

suplementación de aminoácidos debe ser benéfico para el mejoramiento del

desarrollo animal, particularmente para animales alimentados con forrajes de

mala calidaci y suplementados con nitrógeno no proteico. Se ha demostrado

que el sulfuro de sodio, asi como la metionina, tienen efecto sobre los

microorganismos. Reflejándose este en una mayor síntesis microbiana

(Fujimaki et al., 1992).

En la actualidad se conoce que los hongos del rumen se consideran

importantes en los rumiantes, ya que por su modo de crecimiento como una

extensión hiial engloban una poderosc actividad celulolítica y debido a su

actividad fibrolítica se ha considerado su uso en digestores anaerobios.

Actualmente se estan aplicando técnicas biotecnológicas potenciales para

86

clonar genes de enzimas celulasas de estos hongos con expresión en otros

microorganismos como las bacterias con el propósito de mejorar el

funcionamiento del turnen (Teunissen et al., 1993)

Las dietas para rumiantes a base de fuentes de azufre quizá alteran el

equilbrio ácido - base y en esto SE; considera que los requerimientos

específicos para su crecimiento está reiacionada con la cantidad de materia

seca ingerida y digestibilidad de la misma (Qi et al., 1993)

Evaluar la relación nitrógeno-azufre en suplementos de baja calidad

quizá tenga un impacto considerable sobre el desarrolio de ios animales

rumiantes (Morrison et al., 1994)

Es muy probable que los hongos del rumen ptiedan sintetizar su

proteina celular a partir de aminoácidos y ser aprovechados por la céiula y

utilizarla para su rápido crecimiento (Onoda et al., 1996).

5.1 Digestibilidad de celulosa

En los cuatro periodos de incubación que se evaluaron en el presente

experimento, se obtuvieron los mayores resultados en ia digestibilidad de

celulosa al evaluar el sulfuro de sodio y la metionina con ia concentración de

0.15% de azufre. Para ambas fuentes se encontró que la concentración de

azufre es importante en el crecimiento o proliferación de los microorganismos

presentes en el medio ya que al adicionar el nivel de 0.35% de azufre se

obtuvo un decremento en la digestibilidad de la celulosa, pudiendo ser

indicativos de que a niveles crecientes de azufre se afecta el desarrollo de los

microorganismos obteniendose respuesta negativa en la digestibilidad de la

celulosa.

87

Como no se encontró diferencia significativa entre fuentes y niveles a

los dos dias de incubación, se supondría que el efecto de ambos tratamientos

se manifiestan después de este tiempo de incubación. Además se pudo

observar que en el tiempo de incubación por 8 días al utilizar 0.35% de azufre

se incrementa la digestibilidad de celulosa solamente con el sulfuro de sodio

como fuente de azufre, lo que indicaría la reducción de esta fuente al

transcurso de este tiempo, difiere de la metionina y la mezcla de sulfuro de

sodio más metionina, logrando identificar que el tiempo que se exponga el

sustrato en un medio donde se tengan microorganismos que lo degraden, asi

como la fuente de azufre podría influir sobre la actividad microbiana.

Los resultados encontrados muestran que la digestibilidad se mejoró de

22 a 42% en comparación con el grupo testigo, efectos similares han sido

mostrados por Akln (1982), Akin et al. (19831, Guardiola et al. (1983). Otros

trabajos in vivo realizados por Barton et al. (1971), Spears (1976, 1977: 1978)

han mostrado que con la suplementación de azufre se incrementa la

digestibilidad de la celulosa contenida en los forrajes, estos estudios indican

que el azufre es esencial para el crecimiento óptimo de los microorganismos

del rumen.

También Bird (1972) encontró que la digestibilidad aparente de la

materia seca se incrementó de 43.8 a 65.7% cuando se adicionó sulfato de

sodio a raciones deficientes en azufre. Como se observa en el presente

trabajo, las fuentes de azufre tienen efecto positivo (P < 0.05) respecto al

grupo testigo sobre la digestibilidad de celulosa, aunado a los cambios de pH y

concentración de glucosa que se produce después de la fermentación por los

hongos como lo menciona Williams y Withers (1985).

Entre los tratamientos de los niv_eles de azufre, sobresalió el 0.15%

respecto al testigo: concordando con los resultados encontrados por Guardiola

et a/. (1980, 1983) quienes encontraron que adicionando fuentes de azufre a

88

un medio de cultivo con microorganismos del rumen se incrementó la

digestibilidad de celulosa in vitre significativamente (P < 0.05) para todos los

niveles evaluados con 0.05, 0.10 y 0.15% de azufre, al utilizar una fuente de

azufre inorgánica y orgánica de sulfato de sodio y metionina: no encontrando

diferencia significativa (P i 0.05) entre ambas fuentes de azufre y la mayor

digestibilidad se presentó cuando la metionina fue adicionada como donadora

de azufre: no coincidiendo estos resultados con los obtenidos por Hume y Bird

(1970): quienes encontraron un incremento en la digestibilidad de materia seca

después del incremento en los niveles de azufre de 0.231 y 0.432% de azufre.

Con respecto a la utilización de la mezcla de sulfato de sodio y

metionina, los resultados del presente trabajo y los obtenidos por Guardiola et

al. (1983) no concuerdan ya que ellos no encuentran diferencia entre las 2

fuentes evaluadas, solamente que ellos evalúan el sulfato de sodio y en el

presente estudio se utilizó sulfuro de sodio como fuente de azufre inorgánica.

Los resultados encontrados wgiere que las fuentes de azufre orgánica

e inorgánica tuvieron efectos sobre los hongos del Turnen, lo que concuerda

con reportes obtenidos por Fujimakl et al (1992), quienes al evaluar diferentes

fuentes de azufre incluyendo los aminoácidos azufrados como nutrientes

encuentraron un efecto muy marcado sobre la producción microbiana del

rumen de caprinos.

Los resultados encontrados en este trabajo en lo que respecta a la

digestibilidad de la celulosa concuerda con los reportados por Bull y Vandersal

(1972) quienes al utilizar diferentes fuentes de azufre orgánico e inorgánico

evaluaron la digestibilidad de celulosa in vifro y encontraron una mayor

degradación con la fuente inorgánica de azufre para los tiempos 4, 6, 12, 24 y

48 h siendo menor con metionina como fuente orgánica de azufre. Además

otros autores como Mur-y ef al (1991) mencionan el azufre inorgánico puede

ser utilizado por los microbios del rumen para sintetizar la proteína microbiana.

8 9

El efecto observado en el presente experimento sugiere que mediante la

utilización de una mezcla Ge hongos obte.nidos del fumen de cabras estos son

capáces de usar compuestos de azufre para incorporarlos dentro de

compuestos orgánicos y con ello contribuír a mejorar la digestìbìlìdad del

sustrato presente en el tracto digestivo; además, los resultados nos sugieren

que la determinación del nivel. más que la fuente de azufre es determinante

para desarrollar un medio adecuado para una proliferación de los hongos y de

esta manera obtener una mayor degradación fisico-química de los compuestos

celulósicas de una manera mecánica - enzimática en los rumiantes. lo que se

reflejaria en la mayor eficiencia en el aprovechamiento del alimento ingerido

por el animal, mejorando de esta manera los parámetros productivos.

4.2 Concentración de glucosa

En el presente estudio se demostró la presencia de glucosa generada

dentro del medio de cult!vo a partir de la degradación de celulosa por los

hongos del rumen in vibro. Las concentraciones de glucosa encontradas en e!

oresente experimento! mostraron una diferencia altamente significativa para

íos cuatro periodos de incubación (P < 0.01) en relación a los niveles de

azufre utilizados, sobresaliendo el nivel con 0.35% con el cual se obtuvieron

valores hasta de 4.16 ~lmoleslml a los 6 y 8 dias de incubación para las

fuentes sulfuro de sodio y la mezcla de metionina ,y sulfuro de sodio. En

relación con el testigo que presentó valores de 0.99~tmoVml. Estos resultados

no concuerdan con los encontrados por Mor-van et al. (1996) quienes

encontraron una cantidad mayor de azúcares reductores al cuarto dia de

incubación en un cultivo en asociación de hongos con bacterias del rumen y

monocultivo de hongos.

Este efecto podría explicar la c@idad de celulosa digerida por los

hongos del rumen, de donde se deduce que a niveles crecientes de azufre

ocurre un efecto negativo para los microorganismos y por lo tanto se reprime el

crecimiento de los hongos esto se podría deducir por la relación que se tlene

con la digestibilidad y la concentración de glucosa como se observa en los

cuadros 2 y 3, lo que sugeriría que la menor cantidad de glucosa encontrada

en el medio de cultivo se podria deber a su utilización por los microorganismos

para su metabolismo y crecimiento

En la mayoría de los tratamientos se encontró que al incrementar el

tiempo de incubación se incrementan los valores de glucosa, no concordando

con los resultados obtenidos por Morgavi et al. (1994), quienes encontraroh

una cantidad menor de glucosa al incrementar el tiempo de incubación, hecho

que explican como una represión en la producción de celulasa fungal.

unicamente que en este caso no se evaluó ningún suplemento para los

hongos.

4.3 Determinación de pH

En relación al pH se encontraron los valores más bajos al utilizar la

metionina como fuente de azufre, siendo más marcado para los 2, 6 y 8 dias

de incubación con valores de 7.07, 6.90 y 6.93 repectivamente. Los resultados

encontrados muestran que mediante la adición de azufre como sulfuro de

sodio se incrementó el pH y el efecto fue más marcado cuando se utilizó la

concentración de 9.25 y 0.35% de azufre para los 2, 4: 6 y 8 dias de

incubación.

Al relacionar el pH con la digestibitidad se observa que la degradación

de celulosa fue mayor cuando se adicionó el nivel de 0.15% de azufre,

considerandose los valores óptimos similares a los que se encuentran en el

rumen que son desde 5.8 a 6.8 como óptimo lo cual concuerda con lo

argumentado por Kudo (1990) quieq establece que para asegurar un

desarrollo microbiano óptimo in vitre, se requiere que se mantenga un pH igual

0 cercano a 6.8.

En este experimento se muestra que a mayor concentración de azufre

como sulfti-o de sodio el pH se e!wa considerablemente, considerandose

como un fsctor que influye sobre la digestibilidad por los microorganismos

sobre la digestibilidad de celulosa.

Los cesultados encontrados nc concuerda con los resultados obtenidos

por Qi et a: 1992, quienes al evaluar el efecto de la suplementación de fuentes

de azufre on cabras sobre el balance ácido base no encuentran diferencia

significativo (P> 0.05) sobre el pH pw 0-fecto de la suplementación de fuentes

de azufre.

Al u: iizar metionina y sulfuro ce sodio con el nivel de 0.15% de azufre

se registra-:,n valores de 6.83 y 7.73 para los 4 dias de incubación, lo cual se

relaciona czn la digestibilidad obtenida en este mismo trabajo, encontrandose

una mayor digestibilidad en pH cercanos a 6.8. Esto concuerda con los

resultados 3btenidos por Whanger I 1972) quien encontró que el pH óptimo

para la rec’xción de compuestos de azufre.presentes en la dieta es de 6.5 a

6.8, el misyo autor menciona que el.grado de reducción no muestra diferencia

a los camhs en el pH, no siendo muy sensitivo a este efecto.

El pH inicial disminuyó a los 4 dias de incubación y se incrementó a los

6 y 8 dias lo que concuerda con los resultados obtenidos por Morgavi ef al.

(1994), ellcs encontraron que el pH decrece a la mitad de la incubación con un

tiempo de :O dias y se vuelve a incrementar en tiempo posterior, este cambio

sugiere que la solución buffer que se adicionó al medio previene que este

disminuya o aumente y mantenga un medio propicio para el desarrollo de los

microorganlismos.

Las condiciones de anaerobios%, temperatura, asepsia, tiempo de

incubació? y componentes del medio de cultivo son muy específicas y se

requiere uYlformidad en estas variables y su modificación provocó inseguridad

92

en la viabilidad de los microot-gantsmos. Debido a esto fue necesario realizar

demasiados ensayos para lograr los objetivos.

Ei efecto del azufre sobre ia digestibilidad de celulosa sugiere que se

pueden encontrar los requerimientos específicos para cualquier tipo de

microorganismo presente en el rurnen y que existe la posibilidad de evaluar

otros sustratos que puedan ser aprovechados por los rumiaws. Lo cual podría

contribuir positivamente sobre la producción de leche, carne c lana.

Al mismo tiempo deberán tomarse otras mediciones en relacl’ón a los

productos finales después de la fe:mentación del sustrato Fara poder explicar

lo que sucede dentro del animal.

Gordon y Ashes (1984) incitaron que la respuesta a a digestibilidad de

la dieta con metionina por los hongos en el rumen sugerir!? que estos quizá

requieren metionina o metabolitos de metionina para su crecimiento, ellos

consideran necesario determinar las fuentes de azufre qde prefieren estos

hongos y su posible incremento en la digestión en las paredes celulares in vitre

para ser explotado en rumiantes.

Mountfort y Kaspar (1986) wsualizaron que la producción de hidrógeno

por los hongos puede ser de utilidad para la hidrogenación de hidrocarburos

insaturados para producir combustible como alcano en presencia de paladio.

Esto puede establecer un nuevo campo en el uso de los hongos para la

producción de ácidos grasos volátiles como alimento para ganado en cocultivo

con bacterias metanogénicas que utilizan hidrógeno o a través de la

eliminación de hidrógeno catalítico

El papel de los hongos en la degradación de la lignwpermanece sin

esclarecerse. Además, existe la necesidad de desarrollar trabajos con la

finalidad de evaluar su átributo en la degradación de las paredes celulares en

:elación a la dieta y sus posibles interacciones en el medio ambiente

:Mountfort, 1994).

Los mayores problemas que se tienen con estos microorganismos se

-elacionan con la determinación de su biomasa dent:o del rumen, pero para

3sto se deberán emplear pruebas orientadas a técnicas de biologia molecular

Theodorou et al., 1990).

Se requiere de investigaciones que vayan encaminadas hacia el

Intendimiento de las bases bioquímicas de traduccikni de energía hacia otros

-7icroorganelos de esta clase de hongos anaerobios para el establecimiento

:e la producción de ATP.

A la fecha no se tienen estudios sobre la L!ilidad de cultivar estos

-ongos en la producción de bioactivos, antibióticos f farmaceuticos. además,

sn la síntesis de compuestos poco utilizados como esreroles y una variedad de

:erpenos,

Asi como la modificación de la fermentaciór para la producción de

combustibles u otros metabolitos.

Los estudios sobre estos hongos en otros campos aportarán cambios y

sportunidades en el futuro. pero para esto es necesario continuar hacia un

-mejor entendimiento del verdadero papel de los hongos en la digestión de las

Daredes celulares contenidas en la dieta de los rumiantes, asi como los daños

sn el medio ambiente (Mountfort, 1994).

Aunque se han tenido logros considerables e importantes sobre el papel

3e los hongos dentro del rumen! existe mucha especulación sobre la

significancia de las paredes celulares y su fermentación.

Todavia se tiene poca información sobre su contribución en el

-metabolismo del rumen sobre diferentes fuentes alimenticias (Mounffort, 1994).

94

El aislamierk de nuevas especies y generos de hongos contribuiGn al

esclarecimiento de wevas ideas sobre la distribución, especialización, r,-ígen

y función de estos microorganismos en medios anaerobios. Sus es:ddios

deben aportar un *eta exitoso para especialistas en microbiología yc: que

muchos aspectos bioquímicos, ecofisiológicos y moleculares de estos

organismos permar?cen poco entendidos (Theodorou ef al., 1994).

El efecto de cada uno de los tratamientos abordados en el presente

trabajo indica que ;s cantidad de celulosa digerida por los hongos del r,-nen,

asi como la concer::.*ación de glucosa en el medio y los cambios de pH i 3nen

una relación intrínseca con los niveles. Los cuales tienen un efecto negai Jo al

incrementarse en sa concentración y niveles de oxidación sobre los hs-gos,

reprimiendo su cre::miento. Esto conduce a que halla una menor cantIrad y

cualidad de nutrier:?s disponibles en el medio en que se desarrollan, ~2 que

los hongos tiene- requerimientos específicos para su crecimier:o y

reproducción.

Los efectos zue se obtuvieron en este experimento, sugieren aue la

presencia y concew-aciones diferentes de compuestos de azufre, constwyen

un factor que modifica la población fungal; esto al registrarse un efecto positivo

sobre la digestibilidad de celulosa por los hongos del rumen con el efec:o de

los tratamientos e: Auados con sulfuro de sodio, metionina y la mezc 3 de

sulfuro de sodio m2c metionina.

95

LITERATURA (DISCI-XON)

Akin. D.E. 1982. Section to slide technique for the study of forage anatomy anddigestion. (i.ql. Sci. 22: 444-446.

Akin. D.E.,Gordon G. L. R., and Hogan J.P. 1983. Rumen bacteria! and fungaldegradation of Digitaria pentzlr grown with or vithout sulfur. Appl.Environ. Microbiol. 461738-748.

Bartcn, J.S., Bull, L.S. and Hemken, R.W. 1971. Effects of various levels ofsulfur upon cellulose digestion in purified diets and lign&ellulosedigestion in pur-ified diets and lignoceliulose digestion in corn fodderpellets in vifro J. Anim. Sc¡. 33: 682

Bird. P.R. 1972. Sulphur metabolism and excretion studles in ruminants. IX.Sulphur, nitrogen and energy utilization by sheep fed a sulphur-deficientand a sulphate-suplemented roughage-based diet. Aust. J. Biol. Sc;. 25:1073-I 085

Bretcn, A. Bernalier, A., Dusser. M. 1990. Anaeromyces mucronatus nov. gen.,nov. sp. A new strictly anaerobic rumep fungus with polycentric thallus.FEMS microbio1 /et?-70: 177-q 82

Bull. L.S. and Vandersall J.H. 1972. Sulfur source for in vitre cellulosedigestion and in vivo ratio utilization, nitrogen metabolism, and sulfurbalance. J. Dairy. Sci. 56: 106

Fujimaki, T., Kobayashi, Y., Wakita M. and Hoshino, S. 1992. Amino acidsupplements: a least combination that increases microbial yields ofwashed cell suspension from goat rumen. J. Anim. Physiol. a. Anim. Nutr.67.41-50

Guardiola, C. M, Fahey, G.C., Spears, J. W. and Garrigus U.S. 1980. Effect ofsulphur suplementation on in vitre cellulose digestion and on nutrientutilizatión and nitrogen metabolism of lambs fed low quality fescue hay.Can. J. Anim. ScL,- 60: 337-344.

Guardiola, C. M, Fahey, G.C.. Spears, J.W. and Garrigus U.S. 1983. Theeffects of sulphur supplementation on cellulose digestion and on nutrientdigestion, nitrogen metabolism and rumen characteristics of lambs fed ongood quality fescue and tropical Star grass hays. Anim. Feed Sc;. andTechnol. 8: 129-l 38.

Gordon, G.L.R. and Ashes, J.R. 1984. In vitro digestion of wheat straw bydifferent rumen anaerobic fungi. Can. J. Anim. Sci. 64: 156-157

Hume, I.D., and Bird, P R. 1970. Synthesis of microbial protein in the rumenIV. The influente cf level and form of dietary sulphur. Ausf. J. Agr. Res21: 315.

Kandylis, K. 1984. The role of sulphur in ruminant nutrition. tivesfock Prod. SCLll:61 1. A review

Morgavi, D. P., Sakurada. M., Mizokami, M., Tomita. Y. and Onodera, R. 1994Effects of Rumina’ Lirotozoa on cellulose degradation and the growth of ananaerob ic ruminal fungus, piromyces sp. s!rain OTSI, in vitre. AppiEnviron. Microbio/ 60: 3718-3723

Morvan, B., Rieu-Lesmf F., Fonty, G. and Gouet. P. 1996. In vitre interactionsbetween rumen Hz- producing cellulolytic microorganisms and HZ: utilizingacetogenic and sulfate-reducing bacteria. Anarrobe.-2: 175-l 80

Mountfort, D.O. 1994. Anaerobic Fungi: Future perspectives In: The anaeroblcfungi (de. C. G. OrUin and D.O. Mountfort). Marcel Dekker: New York. Ii!press.

Mountfort, D.O. an Kaspar, H.F. 1986. Paladium-nediated’ hydrogenation ofunsaturated hydrccarbons with hydrogen gas released during anaerobiccellulose degradatlon. Appl. Environ. Microbioi 52: 744-750.

Morrison, M., Murray M. and Boniface, A.N. 1990. Metabolism and rumenmicroorganisms iri sheep fed a poor- cuality tropical grass haysupplemented with sulphate. J. of Agrc. Sci. Cambrigde ll 5: 269- 275

Morrison, M., Boniface A.N. and Murray M. 1994. Alteration of supplementnitrogen:sulphur râtio by increasing sulphate supplementation affects theratte rather than the extent of fibre degradation in catle feed a maturedtropical grass hay. J. Sc;. Food Agrie. 65: 449-455

Murray, P. J.: Rowe, P. J. and Speijers, E. J. 1991. Sulfur suplementation and theuse fluvomycin wit!~ lupin grain for sheep. Ausf. J. Agrie. Res. 42: 1323-1333

Onoda, A.; Kobayashi Y. Hoshino S. 1996. Effects of anino acids on the growthof an anaerobic rumen fungus Neocallimasfix sp N 13. Reprod. Nutr, Dev.36: 311-320

Orpin. C.G. and Greenwood, Y. 1986. Nutritional and germinationrequerements of the rumen chytridiomycete Neocallimastix patriciarum.Trans. Br. Mycol, Soc. 86:( 1) 103-l 09.

Orpin, C.G. 1988. Nutrition and biochemistri of anaerobic chytridiomycetes.BioSistems 21: 365-370.

Phillips, M.W. and Gordon, G. L. R. - 1988. Sugar and polysaccharidefermentation by rumen anaerobic fungi from Australia, Britain and newzealand. Biosystems. 21: 377-383

37

Qi, K., Lu C. D. and Owens F. N. 1993. Sulfate supplementation of growinggoats: effects on pefformance, acid-base balance. and nutrientdigestibilities. J. Anim. Sci. 71.! 579.

Spears, J.W., Ely D. G., Bush L. P. and Buclcner R. C. 1976. Sulfursupplementation and in vifrc; digestion of forage cellulose by rumenmicroorganisms. J. Anim. Sc;. 43:513.

Spears. J.W., Bush, L.P. and Eiy. D.G. 1977. Influente of nitrate andmo!ybdenum on sulphur utilization by fumen microorganisms. J. Dairy Sc;.60.-l 889.

Spears. J. W., Ely, D.G. and Busfi: L. P. 1978 Influente of supplementalsulphur on /n vitre and in iv.5 microbial fermentation oí Kentuky 31 tallfessue. J. Anim. Sc¡ 47: 552.

-.

Teunissen, M.J., Hermans, J.M.H. Huis in t Veld Veld, J.H J.! Vogels, G. D.1953 Purification and charac:?rization of a complex boclnd and free p-encoxylanase from the culture fluid of the anaerobic !Gngus Pkomycessp strain E2. Arch. Microbiol. 159: 265-271

Theodor,zu, M.K.. Gill. M. King-Spconer C. Breever, D. 1992 Enumeration ofanaerobic chytridiomycetes as thallus-forming units: ?avel method forquantification of fibrolytic fucgal populations from the digestive tractecosistem. Appl. Environ. MicrrJbiol. 56: 1073-I 078.

Whange-. P.D. 1972. Sulfur in rumirant nutrition. World Rev. hutr. Dietect:15.225. A Review.

Webb, J Theodorou, M.K. 1991 Neocallimasfix hurleyensis, a new species ofanaerobic fungus from the ovine rumen. Can. J. Bof. 69: 1220-I 224

Weston. R.H., Lindsay J. R, Purser D. B., Gordon G. L. R. and Davis P. 1988.Feed intake and digestion responses in sheep to the addition of inorganicsulfur to a herbage diet of low sulfur content. Aust. J . Agric. Res .39.7 107-I 119.

98

ANEXO

.-\). Método para la determinac:ón de azúcares reductores propuesto por Jue y Lipkeí 1985).

Se adicionó 1 g azul C? tetrazoliorn (sigma) a 500 ;7:\ de hidróxido de sodio 0 1Yl La mezcla fué calentads. a 60°C‘ con movimientos rigurosos. La preparaciónpermaneció en material de \-iirio color- ambar. El reacti1.c %e dispònible para su usodespués de una semana. El rrtrato doble de sodio y pi?iasio (Fisher Scientific) fuejisuelto en agua destilada a 12 :.3ncentración de 1 .O M.

Se colocaron 40 1~1 de zxestra en tubos de 13 x 100 mm y se adicionaron 4 ml de.d mezcla del reactivo que cc%--.r:nia tetrazolium azul 0. 1qe. ?dróxido de sodio 0.05 hl.x-trato doble de sodio y pote<.,> 0.5 hl. Esta mezcla se cai=ntó en agua hirviendo por 3minutos, los tubos se enfria:-,:,? en corriente de agua, se secaron y la absorhancia fileieterminada a 664 i nm en espe;:: :~fotómetro ( Modelo: 001838.3. \:rra: Bausch Lnntb :i i).

B). Medio de cultivo para los ~‘ot-tSos del rumen descrito Po: Joblin (198

<olución A”’ 17 mllolución B”’ 17 mlFluido del rumen clarificado 15 mlCellobiosa’ 200 mgExtracto de levadura 50 mgTripticasa 100 mggemina O.O5?/ó 0.2 mi!0.05% en 1: 1 etanol con hidrìxido de sodioL.05 M)Rezarzurina, 0. l?,ó (peso/volu:xen) 0.3 mlCarbonato de sodio (NaHCO.; 500 mgL-cisteina.HCl.H20 30 mgIgua destilada 50.5 ml

a ) Solución A (Hungate, 196~ ! KH2P04, 3 g; NaCl, 6 g; !\H4)2S04, 3 g; CaCL2, 0 3

3. MgS04, 0.3 g (0.6 g si es -H20); aforado a 1000 ml con agua destilada,21

b) Solución B (Hungate, 196~ 1K2HP04, 3 g. para aforar a 1000 ml de agua destilada

c) Si es necesario se puede wr::plazar por glucosa (100 rns\

C). Procedimiento para la detcrminacion de proteina del forraje utilizado para ia dirta delos caprinos (Método de Kjendhal)

1 Se colocó 1 g de muestra en un matraz, Kjendhal que contenía 20 mi de acidosulfYnic0 al 98% y 6 y de seknio para acelerar la reacción, colocando además 5 Feriasde vidrio para controlar la ebullición.2. La mezcla se calentó a ebuliicibn hasta su clarificación JI una \.ez fria la solu~ion sedepositaron 200 ml de agua destilada. a esta misma se colocaron 100 ml de hidroydo desodio al 15% y 7 granallas de zinc para su posterior destilación.3. Para lc recuperacion del hid:-oxido de amonio se se colocaron 75 rnl de ácido bc~r:co al4% en UII matraz er:enmeyer de 500 ml y 3 gotas Qe rojo de metilo como indicador4. El desrilado se aiL:sró a un \oiumen de 200 rnl\. jubsecuenmente se tituló para rl%enerla cantidad de nitrógeno de la muestra5. La carxidad de nkroyeno obtenido t%e multipli:aJo por factor 6.25 para ca:.:..iar elporcentaje de protek (Tejada. 1985).