universidad de mÁlaga - biblioteca uma · 2007-05-21 · d. alejandro serrano lozano, mÉdico...
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UNIVERSIDAD DE MÁLAGA
Facultad De Medicina
Tesis Doctoral
ESTUDIO INMUNOLÓGICO DE LA LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA DE
ESTIRPE B. ANÁLISIS DE LA POBLACIÓN LINFOIDE T
Inmaculada Pérez Fernández
MÁLAGA, 2003
UNIVERSIDAD DE MÁLAGA
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA, BIOLOGÍA MOLECULAR,
QUÍMICA ORGÁNICA E INMUNOLOGÍA
ESTUDIO INMUNOLÓGICO DE LA LEUCEMIA LINFÁTICA
CRÓNICA DE ESTIRPE B. ANÁLISIS DE LA POBLACIÓN
LINFOIDE T
TESIS DOCTORAL PRESENTADA POR Dª INMACULADA PÉREZ
FERNÁNDEZ PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN MEDICINA Y
CIRUGÍA
D. MIGUEL MORELL OCAÑA, CATEDRÁTICO Y DIRECTOR DEL
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA, BIOLOGÍA MOLECULAR, QUÍMICA
ORGÁNICA E IMNUNOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE MÁLAGA.
CERTIFICA:
Que la Memoria que, para optar al Grado de Doctor en
Medicina y Cirugía, somete la Licenciada Dª. Inmaculada Pérez
Fernández a la consideración del Tribunal que designe la
Comisión del Doctorado de la Universidad de Málaga, ha sido
realizada bajo mi dirección y que, una vez leída por mi, la
encuentro conforme para su presentación y defensa bajo el título:
ESTUDIO INMUNOLÓGICO DE LA LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA
DE ESTIRPE B. ANÁLISIS DE LA POBLACIÓN LINFOIDE T
Y, en cumplimiento de las disposiciones vigentes, firmo el presente
certificado en Málaga, a veinticinco de Junio de dos mil tres.
Fdo: Prof. D. Miguel Morell Ocaña
D. ALEJANDRO SERRANO LOZANO, MÉDICO ADJUNTO DEL
HOSPITAL REGIONAL CARLOS HAYA DE MÁLAGA
CERTIFICA:
Que la Memoria que, para optar al Grado de Doctor en
Medicina y Cirugía, somete la Licenciada Dª. Inmaculada Pérez
Fernández a la consideración del Tribunal que designe la
Comisión del Doctorado de la Universidad de Málaga, ha sido
realizada bajo mi dirección y que, una vez leída por mi, la
encuentro conforme para su presentación y defensa bajo el título:
ESTUDIO INMUNOLÓGICO DE LA LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA
DE ESTIRPE B. ANÁLISIS DE LA POBLACIÓN LINFOIDE T
Y, en cumplimiento de las disposiciones vigentes, firmo el presente
certificado en Málaga, a veinticinco de Junio de dos mil tres.
Fdo: D. Alejandro Serrano Lozano
D. MANUEL MUÑOZ GÓMEZ, PROFESOR TITULAR DEL
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA, BIOLOGÍA MOLECULAR, QUÍMICA
ORGÁNICA E IMNUNOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE MÁLAGA.
CERTIFICA:
Que la Memoria que, para optar al Grado de Doctor en
Medicina y Cirugía, somete la Licenciada Dª. Inmaculada Pérez
Fernández a la consideración del Tribunal que designe la
Comisión del Doctorado de la Universidad de Málaga, ha sido
realizada bajo mi dirección y que, una vez leída por mi, la
encuentro conforme para su presentación y defensa bajo el título:
ESTUDIO INMUNOLÓGICO DE LA LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA
DE ESTIRPE B. ANÁLISIS DE LA POBLACIÓN LINFOIDE T
Y, en cumplimiento de las disposiciones vigentes, firmo el presente
certificado en Málaga, a veinticinco de Junio de dos mil tres.
Fdo: Prof. D. Manuel Muñoz Gómez
AGRADECIMIENTOS
Al profesor Dr. D. Miguel Morell Ocaña, Director de esta Tesis Doctoral, por su
orientación y sobre todo por su afecto e infinita paciencia.
Al Dr. Alejandro Serrano Lozano, por su colaboración en la realización de este
trabajo, por su apoyo incondicional y porque me ha enseñado que la
honestidad y el esfuerzo personal consiguen superar barreras que en
ocasiones parecen insalvables.
A Emilio Vadillo Pérez-Cea, por dedicar tantas horas y esfuerzos a la
realización del estudio estadístico y por su disponibilidad en todo momento.
A Jose Luis Eseverri Gutierrez, por su capacidad de trabajo y por la ilusión y
entusiasmo en el montaje de las técnicas de citometría de flujo, sin cuyo apoyo
no hubiese sido posible la creación de esta Unidad.
A todos mis compañeros del Servicio de Hematología del Hospital Clínico
Universitario Virgen de la Victoria, por su comprensión, por su apoyo y
muestras de ánimo en los momentos áridos de este proyecto.
A mi maestra, Dra. Ana Siles, por sus enseñanzas, por haber sabido
transmitirme su entusiasmo por las técnicas de citometría de flujo, y por su
amistad.
A mi tutora durante mis años de residencia, Dra. Betancourt, que desde el
primer momento me hizo compartir su ilusión por la realización de la Tesis
Doctoral.
A la Dra. Villalta y Dra. Bailen, porque siempre han estado a mi lado cuando las
he necesitado y por su apoyo incondicional en los momentos difíciles.
A mi hermano Frank, porque su cariño y ayuda son imprescindibles para
alcanzar mis sueños, entre ellos la realización de esta Tesis. Gracias Frank.
A mis padres porque me han enseñado el valor del trabajo, del esfuerzo y la
coherencia personal y siempre estaré en deuda con ellos. Gracias.
ABREVIATURAS
HLA Sistema mayor de histocompatibilidad
CGP Células germinales pluripotentes
Ac Anticuerpos
MALT Tejido linfoide asociado a mucosas
Ig Inmunoglobulinas
APC Células presentadoras de antígenos
RCT Receptor antigénico de las células T
AcMo Anticuerpos monoclonales
CD Grupos de diferenciación o Cluster of Diferentiation
CMF Citometría de flujo
TdT Transferasa terminal desoxinucleotidasa
FSC Forward scatter o dispersión frontal.
SSC Side scatter o dispersion lateral
FITC Isocianato de fluoresceína
PE Ficoeritrina
PerCP Peridinchlorophyll proteina
Cy5 Ficoeritrina-cianina 5
SLPC Síndromes linfoproliferativos crónicos
LLC-B Leucemia linfática crónica de estirpe B
NK Natural killer o célula asesina natural
LDH Lacticodeshidrogenasa
EDTA Ácido etilen-diamino-tetra-acético
PBS Tampón fosfato
MFI Intensidad de fluorescencia media
ELF Escala logarítmica de fluorescencia
FAB Grupo Cooperativo Franco-Americano-Británico
I.- INTRODUCCIÓN
1
1.- Sistema inmune 2
1.1.- Bases estructurales del sistema inmune 2
1.1.1.- Órganos linfoides 2
1.1.2.- Base celular 5
1.1.2.1.- Linfocitos B 6
1.1.2.2.- Linfocitos T 8
1.1.3.- Manifestaciones antigénicas en la diferenciación linfoide 10
1.1.3.1.- Anticuerpos monoclonales 10
1.1.3.2.- Grupos de diferenciación 11
1.1.3.3.- Diferenciación linfoide B 12
1.1.3.4.- Diferenciación linfoide T 15
1.2.- Desarrollo de la respuesta funcional del sistema inmune 21
1.2.1.- Cooperación entre linfocitos T y B para la respuesta de
anticuerpos 22
1.2.2.- Respuesta mediada por células T 23
1.2.3.- Mecanismos de defensa antitumoral
24
2.- Citometría de flujo 26
2.1.- Fundamentos de la citometría de flujo 27
2.2.- Análisis celular. Fundamento de los sistemas de detección 27
2.3.- Componentes de un citómetro de flujo 29
2.4.- Fluorocromos más utilizados en citometría de flujo 35
2.5.- Aplicaciones en Hematología. Caracterización inmunofenotípica
de los síndromes linfoproliferativos crónicos
37
3.- Síndromes linfoproliferativos crónicos con expresión
hemoperiférica. Leucemia linfática crónica de estirpe B 37
3.1.- Epidemiología 41
3.2.- Etiopatogenia 41
3.3.- Citogenética y biología molecular 42
3.4.- Biología y cinética celular del linfocito B neoplásico 43
3.5.- Características inmunofenotípicas 44
3.6.- Alteraciones de la inmunidad 47
3.6.1.- Inmunidad celular 47
3.6.2.- Inmunidad humoral 48
3.7.- Manifestaciones clínicas 49
3.8.- Complicaciones 50
3.9.- Datos de laboratorio 52
3.10.- Diagnóstico 53
3.11.- Factores pronósticos 56
3.12.- Tratamiento 57
II.- PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS 61
III.- MATERIAL Y MÉTODOS 65
1.- Material 66
1.1.- Muestra biológica 66
1.2.- Aparatos 67
1.3.- Productos o reactivos 70
2.- Población de estudio 77
2.1.- Criterios de inclusión 78
2.2.- Criterios de exclusión 80
3.- Métodos 80
3.1.- Variables determinadas 80
3.2.- Obtención y preparación de la muestra 90
3.2.1.- Análisis por citometría de flujo 91
3.2.2.- Análisis por microscopía óptica 93
3.3.- Técnicas de inmunofenotipaje celular por citómetría de flujo 94
3.3.1.- Control de calidad 94
3.3.2.- Metodología seguida: combinaciones de anticuerpos
monoclonales y fluorocromos 99
3.3.3.- Proceso de adquisición de la muestra 101
3.3.4.- Análisis de los datos 103
3.3.5.- Criterios de positividad e intensidad de expresión para un
antígeno 107
3.3.6.- Criterios de identificación de poblaciones celulares 108
3.4.- Identificación morfológica de la población linfoide mediante
técnicas de microscopía óptica 110
3.5.- Método estadístico 110
IV.- RESULTADOS 113
1.- Características de los pacientes incluidos en el estudio 114
1.1.- Características clínicas 114
1.2.- Características hematológicas 115
1.3.- Características bioquímicas e inmunológicas 115
1.4.- Características farmacológicas 116
2.- Características de los pacientes en función de la edad 125
2.1.- Características clínicas en > y ≤ de 60 años 125
2.2.- Características hematológicas en > y ≤ de 60 años 126
2.3.- Características bioquímicas e inmunológicas en > y ≤ de 60 años 126
3.- Características fenotípicas de las leucemias linfáticas crónicas de
estirpe B incluidas en el estudio 134
3.1.- Características fenotípicas generales 134
3.2.- Características fenotípicas de la población B tumoral 134
3.3.- Características fenotípicas de la población T 136
4.- Poblaciones linfocitarias en los controles 142
5.- Comparación de las poblaciones linfocitarias en pacientes
leucémicos y controles 146
5.1.- Linfocitos T 146
5.2.- Linfocitos B
147
6.- Relación entre los linfocitos T de la leucemia linfática crónica y
distintos parámetros clínicos y de laboratorio 153
6.1.- Indicadores de carga tumoral 153
6.1.1.- Estadios clínicos de Rai y de Binet 153
6.1.2.- Otros indicadores de carga tumoral 154
6.2.- Inmunofenotipo de las LLC-B 155
6.3.- Hipogammaglobulinemia 156
V.- DISCUSIÓN 169
1.- Criterios de selección 173
2.- Datos epidemiológicos 174
3.- Parámetros clínico-biológicos en los pacientes leucémicos 175
4.- Estudio inmunofenotípico 181
5.- Alteraciones de la inmunidad en la leucemia linfática crónica B 194
6.- Relación entre las alteraciones de la inmunidad y parámetros clínico-
biológicos
203
VI.- CONCLUSIONES 208
VII.- BIBLIOGRAFIA 211
2
1. SISTEMA INMUNE
1.1. Bases estructurales
El sistema inmune está constituido por una compleja red de células y
moléculas distribuidas por todo el organismo y dotadas con diferentes
capacidades funcionales, que forman su base estructural. El componente
celular del sistema inmune está formado por los linfocitos y las denominadas
células accesorias. La base molecular está formada por el sistema de
complemento, las inmunoglobulinas y las linfocinas y monocinas. La activación
de los componentes celulares del sistema inmune, está estrechamente
relacionada con un grupo de moléculas expresadas en la membrana
citoplasmática de las células nucleadas del organismo, conocidas
genéricamente como sistema mayor de histocompatibilidad o sistema HLA, y
que son específicas de cada individuo (Álvarez-Mon y García Suárez, 1992).
1.1.1. Órganos linfoides
Los linfocitos se distribuyen por todo el organismo en forma de órganos
bien delimitados y encapsulados o en forma de acumulaciones difusas,
configurando en su conjunto lo que denominamos sistema linfático.
Inmunológicamente, los órganos linfoides se dividen en primarios (o centrales)
y secundarios (o periféricos).
Los órganos linfoides primarios son aquellos donde se originan y
maduran los linfocitos a partir de las células germinales pluripotentes (CGP)
(que son el origen de todas las líneas hematopoyéticas) (Abramson y cols,
1977) mediante un proceso independiente del estímulo antigénico; en los
mamíferos estos órganos son la médula ósea (y otros sitios hematopoyéticos
fetales) y el timo.
3
Los linfocitos que maduran en la médula ósea se denominan linfocitos B y
son los responsables de las respuestas frente al estímulo antigénico mediadas
por anticuerpos. Inician su aparición a partir de la 8ª semana de gestación, en
el hígado fetal, el epiplón y la esplacnopleura fetales y, más tarde, en la médula
ósea. Durante la vida postnatal, la linfopoyesis B solo ocurre en la médula
ósea.
Los linfocitos que maduran en el timo se denominan linfocitos T y son los
responsables de las respuestas inmunes mediadas por células, como el
rechazo de injertos, las reacciones de hipersensibilidad retardada y las
funciones de cooperación para que los linfocitos B produzcan anticuerpos (Ac).
La entrada de los progenitores linfoides (procedentes de las CGP de la médula
ósea) en el timo es escasa y se produce en forma de sólo dos o tres oleadas
durante el desarrollo embrionario. Estos progenitores proliferan y dan origen a
todos los demás timocitos, la mayoría de los cuales (más del 96%) mueren in
situ por un proceso de apoptosis. El contacto de los timocitos con las moléculas
del sistema HLA de clases I y II expresadas por las células epiteliales tímicas y
por las células dendríticas derivadas de la médula ósea, es esencial para la
maduración de las células T.
Una vez maduros, los linfocitos pasan a la periferia, distribuyéndose en los
órganos linfoides secundarios, donde desarrollan las respuestas frente al
antígeno. Tales órganos y tejidos no deben considerarse compartimentos
estancos, sino más bien como “estaciones” en el flujo migratorio continuo de
los linfocitos a través de las circulaciones sanguinea y linfática. Incluyen
órganos bien delimitados y encapsulados, como los ganglios linfáticos y el
bazo, y agrupaciones no encapsuladas, como el tejido linfoide asociado a
mucosas (MALT). Los órganos linfoides secundarios presentan en común el
mostrar áreas de linfocitos T y B, y el contener abundantes células auxiliares
como macrófagos y células dendríticas que no participan en el reconocimiento
específico del antígeno, pero que tienen importancia decisiva en el
4
procesamiento y la presentación del antígeno para que los linfocitos puedan
reconocerlo.
Los órganos linfoides secundarios se distribuyen de forma tal que
garantizan que cualquier sustancia extraña (antígeno) que aparezca en el
organismo ya sea por la sangre (bazo), ya sea en territorios viscerales
profundos o en los territorios cutáneos o mucosos (ganglios linfáticos y MALT)
pueda ser filtrada y retenida por ellos.
En la histología de un ganglio se hallan la corteza o zona de células B, la
paracorteza o zona de células T y una médula central con cordones medulares
donde se encuentran linfocitos T y B. La mayoría de los linfocitos se hallan en
la corteza y paracorteza. Las células B de la corteza se organizan formando
agrupaciones ovoides o folículos linfoides, los cuales pueden ser primarios o
secundarios. En los secundarios existe una zona central con intensa actividad
proliferativa, el centro germinal, que corresponde a los linfocitos B activados y
proliferantes en respuesta al estímulo antigénico.
Los linfocitos presentes en los órganos linfoides secundarios no son
componentes fijos, sino sólo residentes temporales mientras dura su tránsito a
través de ellos. Este tránsito continuo ocurre con los linfocitos “naive” o
“vírgenes” (los que no han entrado en contacto con el antígeno), así como con
los linfocitos de memoria que se generan tras la respuesta primaria a un
antígeno. Por el contrario, los linfocitos activados y proliferantes como
consecuencia de su respuesta a un antígeno, pierden su capacidad de circular
y quedan retenidos en el órgano o tejido linfoide secundario.
En los ganglios linfáticos y demás tejidos linfoides, los linfocitos tienen dos
vías de entrada, los vasos sanguíneos y los linfáticos aferentes, mientras que
sólo tienen una vía de salida, el vaso linfático eferente. Desde éste prosiguen
su tránsito a través de toda la circulación linfática, hasta llegar al conducto
torácico, por donde regresan de nuevo a la circulación sanguínea. A este
5
circuito (sangre-sistema linfático-sangre) se le denomina también circulación
linfocitaria y es recorrido por un linfocito en 16-24 horas (se calcula que cada
segundo entran en un ganglio unos 10.000 linfocitos). Este tránsito continuo
constituye un rasgo esencial de la fisiología del sistema inmune, puesto que
implica incrementar las probabilidades de que los escasos linfocitos T y B
específicos de un determinado antígeno tengan oportunidad de encontrarlo,
sea cual fuere su puerta de entrada.
1.1.2. Base celular
Existen dos tipos linfocitarios fundamentales, T y B, que a su vez
constan de diversas subpoblaciones, las cuales pueden ser diferenciadas en
virtud de características inmunológicas, enzimáticas, morfológicas y funcionales
(Jondal y cols, 1973). De acuerdo con los objetivos de este trabajo, nos
centraremos en el estudio exclusivo de ambos tipos celulares, cuyos rasgos
diferenciales básicos vienen detallados en la tabla 1.1
Tabla 1.1
Principales características de los linfocitos T y B maduros humanos
Características Linfocitos T Linfocitos B Origen Célula germinal hematopoyética linfoide Célula germinal hematopoyética linfoide
Adquisición de competencia
inmunológica
Timo Médula ósea
Longevidad Larga (habitualmente) Corta (habitualmente)
Recirculación Importante Menos importante
Ubicación en: Ganglio
Bazo
Zona subcapsular interfolicular
Zona periarteriolar de la pulpa blanca
Folículos linfoides primarios y secundarios
Folículos de pulpa blanca y dispersos en
la pulpa roja
Porcentaje en sangre
periférica
65-75% 10-20%
Antígenos de células T
Antígeno HLA-DR
Ig de superficie
Fragmento Fc de la IgM
Fragmento Fc de la IgG
+
-
-
+ (T colaboradores)
- (T supresores)
+ (T supresores)
- (T colaboradores)
-
+
+ cadena J
-
-
6
Tabla 1.1 (Cont.)
Principales características de los linfocitos T y B maduros humanos
Características Linfocitos T Linfocitos B Función primordial
Memoria inmunológica
Actividad citotóxica
Cultivo mixto linfocitario
Inmunidad celular
Función colaboradora (CD4)
Función supresora (CD8)
Sí
Sí
+
Síntesis de Ac (inmunidad humoral)
Sí
No
-
Características morfológicas
Tamaño
Gránulos citoplasmáticos
Cromatina
Basofilía citoplasmática
Pequeño o mediano
Presentes
Densa
Relativamente acentuada
Mediano o grande
Ocasionales
Menos densa
Menor
1.1.2.1. Linfocitos B
Los linfocitos B recibieron esta denominación por su proceso de
maduración en la bursa de Fabricio en las aves, o en su equivalente en los
mamíferos, la médula ósea (bone marrow). Desde el punto de vista funcional,
un linfocito B se define por su capacidad, única entre las células eucariotas, de
sintetizar inmunoglobulinas (Ig). Se puede considerar que la diferenciación B se
produce en dos fases diferentes y secuenciales que tienen lugar en áreas y
contextos funcionales diferentes.
La primera fase corresponde al trayecto de diferenciación desde la CGP
hasta el linfocito B funcionalmente maduro. Esta fase transcurre en la médula
ósea, es independiente del contacto con el antígeno, y tiene como objetivo
primordial dotar al sistema inmunitario de una colección grande y heterogénea
de linfocitos B inmunológicamente aptos; es decir, capaces de desarrollar en la
membrana, moléculas de Ig con una determinada especificidad, que es
diferente en cada célula. Es esta diversidad de características lo que confiere al
sistema la capacidad de reconocer una cantidad virtualmente ilimitada de
moléculas extrañas (Parreira y Parreira, 1992). En esta etapa se distinguen los
siguientes estadios secuenciales:
7
a) Células pro-B o progenitores linfoides que todavía no han empezado
a reordenar los genes de las inmunoglobulinas, si bien ya están
“comprometidos” para convertirse en linfocitos B.
b) Células pre-B iniciales (también denominadas pre-pre-B) que han
iniciado los primeros reordenamientos de los genes de las cadenas
pesadas de las Ig.
c) Células pre-B tardías, que ya sintetizan cadenas µ, las cuales
permanecen en el citoplasma en su mayor parte.
d) Linfocitos B inmaduros, que sintetizan cadenas ligeras (de tipo κ o λ)
y expresan IgM en la membrana (mIgM).
e) Linfocitos B maduros o linfocitos B que coexpresan mIgM y mIgD; en
un mismo linfocito B ambas inmunoglobulinas tienen las mismas
cadenas ligeras y la misma especificidad, y no las cambiarán a lo
largo de toda su existencia.
Las células pro-B y pre-pre-B tienen aspecto blástico y actividad
proliferativa, mientras que las pre-B tardías son ya quiescentes. La tasa de
producción de células B precoces en los sitios hematopoyéticos es enorme,
pero la mayoría (más del 75%) mueren in situ, por un proceso de apoptosis, y
representan menos del 1% del total de células presentes en la médula ósea de
un adulto. Estas células B eliminadas incluyen las que no han logrado
reordenar los genes de las inmunoglobulinas, así como aquellas que adquieren
mIgM de una especificidad fuertemente reactiva para los autoantígenos
presentes en el sitio hematopoyético.
La segunda fase o etapa de activación, ocurre en los órganos linfoides
secundarios y depende del contacto con el antígeno. Durante esta fase, el
sistema utiliza su enorme potencialidad cognitiva, seleccionando las células
que mejor se adaptan al determinante antigénico, confiriéndoles ventaja
proliferativa (entrada en fase G1 del ciclo celular) y promoviendo su maduración
para ser células secretoras de anticuerpos: célula plasmática. Aún así, no toda
la ascendencia del linfocito B maduro activado por el antígeno se diferencia a
8
célula plasmática, ya que algunas células entran nuevamente en fase G0 del
ciclo celular y constituyen una población en reposo que conserva la memoria
molecular del encuentro con el antígeno. El objetivo final será, por un lado el de
eliminar o neutralizar el agente invasor y, por otro, el de conservar la memoria
del primer encuentro con el antígeno, de manera que en contactos posteriores,
la respuesta inmunitaria sea más rápida y eficaz.
1.1.2.2. Linfocitos T
Un antígeno extraño al organismo es eliminado por la activación del
sistema inmune. En la respuesta inmune intervienen linfocitos T que, mediante
la liberación de linfocinas y por contacto celular, modulan la actividad de
linfocitos B, de los propios linfocitos T y de los monocitos.
Un antígeno extraño es reconocido como tal por unas moléculas
presentes en la superficie de células denominadas presentadoras de antígenos
(APC, antigen presenting cell), como son las células dendríticas o los
macrófagos. Estas células muestran los antígenos a los receptores antigénicos
de las células linfoides T (RCT). Así se inicia un proceso en el que los linfocitos
T estimulan la síntesis de Ig por los linfocitos B, se produce la expansión de
linfocitos T citotóxicos, y en el que también existe un mecanismo de freno,
suprimiendo otros linfocitos T la producción de Ig.
• Receptor antigénico de las células T (RCT). La función de los linfocitos T
en la respuesta inmune se basa en que estas células poseen en la
membrana receptores capaces de reconocer el antígeno. El RCT es un
heterodímero de dos cadenas polipeptídicas (α y β), presentes en la
superficie de los linfocitos T CD3+/CD4+ o CD3+/CD8+. Recientemente
se ha demostrado la presencia de otro RCT formado también por dos
cadenas polipeptídicas (en este caso denominadas γ y δ), presente en
una subpoblación de linfocitos T CD3+, CD4- y CD8- (Arstila y cols,
9
1999; Kruisbeek, 1993; Raulet y cols, 1991; Rudd, 1990; Winito y
Baltimore, 1989).
Asociado a las dos proteinas polimórficas que constituyen el RCT,
se encuentra un grupo de proteínas monomórficas denominadas CD3,
que forman así el complejo RCT-CD3. La molécula CD3 no participa en
el reconocimiento del antígeno pero es esencial para la transmisión de
señales activadoras al interior de la célula, así como para que el RCT se
exprese en la membrana.
Los linfocitos B reconocen antígenos mediante su receptor
antigénico de superficie (que es una Ig). En el caso de los linfocitos T, el
antígeno es primero degrado y procesado en el interior de las APC y los
fragmentos procesados son expuestos en la superficie de las mismas,
en el seno de una molécula del sistema HLA de clase I o clase II. Esto
implica que el haplotipo HLA heredado por un individuo determinado,
condiciona o restringe la especificidad del RCT de sus linfocitos T.
• Desarrollo de los linfocitos T en el timo. En el desarrollo de los linfocitos
T en el timo (timocitos), se distinguen tres estadios:
- Estadio I (timocitos iniciales o pretimocitos): constituyen una
población minoritaria (2-5% de los timocitos) localizada en la
zona subcapsular de la corteza, y corresponde a los
precursores linfoides inmaduros procedentes de la médula
ósea. Tienen aspecto blástico y están dotados de intensa
actividad proliferativa y se renuevan a sí mismos y a todas las
poblaciones tímicas. No expresan el RCT, aunque se ha
iniciado el reordenamiento de los genes de la cadena γ. El
pretimocito, al ponerse en contacto con el epitelio tímico e
influido por hormonas (timosina y timopoyetina) evoluciona
hacia otras fases en el proceso de maduración (Freedman y
Nadler, 1991; von Boehmer, 1993; Winoto, 1991).
10
- Estadio II (timocitos comunes): constituyen la población tímica
mayoritaria (80%) y se hallan en la corteza profunda; la
mayoría de ellos mueren in situ por apoptosis; son pequeños,
carentes de actividad proliferativa y funcionalmente
incompetentes. Expresan niveles intermedios o bajos de RCT
en su membrana.
- Estadio III (timocitos maduros medulares): constituyen el 5-
10% de los timocitos, se hallan en la médula y corresponden a
la pequeña proporción de timocitos comunes que sobreviven y
alcanzan la madurez, siendo indistinguibles fenotípicamente
de los linfocitos T maduros de la perifería. Expresan altos
niveles de RCT en la membrana.
1.1.3. Manifestaciones antigénicas en la diferenciación linfoide
1.1.3.1. Anticuerpos monoclonales
Desde el descubrimiento de la tecnología para la producción de
anticuerpos monoclonales (AcMo) en 1975 (Köhler y Milstein, 1975), el impacto
que esta metodología ha tenido en distintas ramas del saber médico ha sido
enorme. Podríamos decir que gran número de disciplinas diagnósticas
relacionadas con la medicina, han experimentado un gran avance al poder
utilizar anticuerpos altamente selectivos, de producción ilimitada y con
reacciones fácilmente reproducibles. En la hematología en concreto, el
desarrollo de reuniones internacionales para estudiar los antígenos de
diferenciación de leucocitos, ha establecido una nueva “ciencia” al identificar
numerosas moléculas denominadas grupos de diferenciación (Cluster of
Diferentiation o CD). Las reuniones de París (1982), Boston (1984), Oxford
(1986) y Viena (1988), han definido las moléculas que están presentes en los
distintos estadios madurativos de las líneas mielopoyéticas, linfopoyéticas y no-
linaje específicos (Knapp, 1989; McMichel, 1987; Reinheerz y cols, 1986).
11
Estas moléculas se corresponden con los fenotipos de los distintos procesos
leucémicos, siendo de gran utilidad diagnóstica en estas neoplasias.
La producción de AcMo, tecnología desarrollada en 1975 por Köhler y
Milstein, se basa en la fusión de linfocitos B con células de mieloma para dar
un hibridoma inmortal que segregue un único tipo de Ac. El proceso depende
del origen de los linfocitos B, de una célula de mieloma de fusión adecuada y
de una prueba de rastreo eficaz para seleccionar los clones híbridos
productores de los Ac deseados.
Esta técnica de fusión, selección y clonación permite obtener en pocos
meses gran número de AcMo altamente específicos y homogéneos, ya que
están producidos contra un mismo epítopo o grupo químico. Esta metodología
en su día revolucionaria, está ampliamente extendida en gran número de
laboratorios y se utiliza de forma constante para producir nuevos AcMo.
1.1.3.2. Grupos de diferenciación linfoide
Hasta hace pocos años, los procesos de maduración y diferenciación de
los leucocitos eran en gran parte un enigma. La morfología y algunos
marcadores enzimáticos permitían una comprensión escasa y una pobre
división de los procesos madurativos linfoides. Con la producción de AcMo
contra antígenos leucocitarios se han caracterizado moléculas que reciben
cada una de ellas el nombre genérico CD.
Un grupo de diferenciación se define caracterizando la molécula que lo
constituye. Esta caracterización debe abarcar la naturaleza bioquímica de la
molécula, su tamaño y a ser posible su estructura. También su aparición en los
distintos estadios de la diferenciación de las células que la posean y su
distribución en distintos tejidos. En tercer lugar, caracterizando el gen que la
codifica y, por último, analizando o intentando conocer la función que
desempeña. Cada grupo de diferenciación está denominado por la abreviatura
12
CD seguida de un número, por ejemplo CD3, CD4, CD5, etc. Habitualmente
varios AcMo se agrupan constituyendo un CD. Cada CD tiene una sola
molécula que lo constituye (Garrido y Ruiz Cabello, 1992).
Una vez que se posee un AcMo que reacciona con ciertas células
(normales o leucémicas) se procede a la caracterización del antígeno. La
identificación de los antígenos de la superficie celular mediante AcMo ha
significado un gran avance. La caracterización bioquímica de los antígenos de
los linfocitos ha proporcionado información acerca de la genética, estructura y,
en algunos casos, la función de estas moléculas.
1.1.3.3. Diferenciación B
La maduración de las células B en adultos tiene lugar en la médula ósea
a partir de las CGP (Quesenberry y Levitt, 1979). Aunque existía información
sobre este proceso, ha sido en los últimos años cuando se ha alcanzado un
conocimiento más exacto de los distintos estadios de maduración de los
linfocitos B en médula ósea normal y en procesos leucémicos (Krause y cols,
1988; Lovett y cols, 1984; Orfao y cols, 1992). Este avance ha sido posible
gracias al desarrollo de un gran número de AcMo asociados a células B y de
las técnicas de citometría de flujo (CMF) multiparamétricas.
En el proceso de diferenciación de los linfocitos B, se distinguen distintos
estadios madurativos definidos sobre la base de los patrones de expresión
antigénica (Loken y cols, 1987; Look y cols, 1984; Ryan y cols, 1986, 1987). No
obstante, existen algunas discrepancias al respecto, entre ellas, uno de los
puntos más controvertidos es el referido a la secuencia de expresión de los
antígenos CD34, CD19 y CD10. Así, Nadler (1986) propusieron que la
expresión de CD19 precede a la de CD10. En sentido contrario, Uckun (1990)
establecía la existencia de una población CD34+/CD10+/CD19- en médula
ósea fetal, sugiriendo que la expresión de CD10 precede a la de CD19.
Pontvert-Delucq y cols. (1993) en un estudio realizado en cultivos celulares in
13
vitro, observaron que las células CD10+/CD19- de médula ósea, estaban muy
elevadas en colonias de macrófagos pero no en células B. Recientemente, se
ha demostrado que las células B CD19+ de médula ósea normal, expresan
CD22, incluyendo la población CD19+/CD34+ (Hurwitz y cols, 1992).
Actualmente, estas discrepancias han sido clarificadas en el estudio
realizado por Ciudad y cols (1998) en el que se analiza la secuencia de
expresión antigénica de las células B en médula ósea normal, estableciendo
cinco estadios de diferenciación según el grado de maduración:
1- CD19+ /CD34+ /CD22+débil /CD10- /CD20- / CD45-/+débil.
(representan el 0.54±0.40% de las células CD19+ de médula ósea)
2- CD19+ /CD34+ / CD22+débil /CD10++ /CD20-/ CD45-/+débil.
(representan el 3.38±2.7% de las células CD19+ de médula ósea)
3- CD19+ /CD34- / CD22+débil /CD10+ /CD20-/ CD45+.
(representan el 3.5±2.3% de las células CD19+ de médula ósea)
4- CD19+ /CD34- / CD22+débil /CD10+ /CD20+/ CD45+.
(representan el 19±11% de las células CD19+ de médula ósea)
5- CD19+ /CD34- / CD22+ /CD10- /CD20++/ CD45++.
(representan el 73±19% de las células CD19+ de médula ósea)
De estos datos se deduce, que el porcentaje de los distintos tipos de
células B aumenta conforme avanzamos en el proceso de maduración,
indicando que la diferenciación B normal en la médula ósea es paralela al
grado de proliferación (Hollander y cols, 1988). Así mismo, a medida que la
maduración progresa se pierde el CD10, se adquiere el CD20 y aumenta la
intensidad de expresión del CD22 y CD45.
14
En los estadios más inmaduros las células no poseen Ig, pero sí
reordenamiento genético respecto al patrón de la línea germinal;
posteriormente aparecen cadenas pesadas µ en el interior del citoplasma en
ausencia de cadenas ligeras y de Ig de superficie, y parece estar relacionado
con la expresión de CD20 (Orfao y González de Buitrago, 1995). En estadios
más diferenciados se reordenan los genes de las cadenas ligeras que se
transcriben, se sintetizan y ensamblan con las cadenas µ. Las células pasan a
expresar IgM de superficie, poco después, pasan a linfocito maduro, que
sintetiza también IgD. La diferenciación de las células B posterior a la médula
ósea no se conoce muy bien, y no es posible definir con exactitud estadios
concretos por la expresión de antígenos particulares.
- Linfocito B activado. El linfocito B activado incrementa la expresión de las
Ig de superficie y de algunos antígenos de membrana como el CD19 y
CD20. En este momento de activación y proliferación aparecen en la
membrana nuevas moléculas que no se detectan en reposo, como son el
CD23, CD25, FMC7 y en ocasiones el CD10. En este estadio el linfocito
B pierde la IgD, disminuye la intensidad de expresión de la IgM y,
además, puede expresar IgG o IgA (Florensa y Woessner, 1994).
- Células plasmáticas. Representan el estadio final de la diferenciación B y
se caracterizan por una modificación radical del fenotipo de membrana,
con desaparición de los antígenos desarrollados por la mayoría de los
linfocitos B. En contrapartida, desarrollan consistentemente el antígeno
CD38 (Ling y cols, 1987; Ocqueteau y cols, 1998; Terstappen y cols,
1990). Se encuentra ausente la Ig de superficie, aunque son abundantes
las Ig de citoplasma.
- Linfocitos B CD5+. Recientemente se ha identificado una subpoblación
de linfocitos B que desarrollan en la membrana una glicoproteína
reconocida por el AcMo CD5. Esta proteína se consideraba como
exclusiva del linaje linfocitario T en la hematopoyesis normal,
15
admitiéndose que su manifestación en linfocitos B se limitaba a las
células de la leucemia linfática crónica B (LLC-B). Actualmente se
conoce la existencia de linfocitos B normales CD5+. Los linfocitos B
CD5+ son los primeros en aparecer en la ontogenia, y durante la vida
fetal predominan sobre los linfocitos convencionales CD5-, lo que ocurre
también en la sangre del cordón umbilical (50-70% de los linfocitos B) y
durante la infancia (40-60% de los linfocitos B circulantes a los 7 años de
edad); en el adulto (edad superior a 18 años) representan el 10-25% de
los linfocitos B circulantes. En los órganos linfáticos secundarios de los
humanos adultos se hallan en el manto folicular junto al borde del centro
folicular. Su proporción está incrementada en algunas enfermedades
autoinmunes, como la artritis reumatoide, aunque se ignora cuál es el
significado biológico de esta subpoblación linfocitaria (Hayakawa y Hardí,
1988; Riva y cols, 1998).
1.1.3.4. Diferenciación T
La descripción de la diferenciación T, sobre la base de la expresión de
antígenos celulares (de membrana o citoplasma) detectados por el marcaje con
AcMo se muestra en la tabla 1.2.
Tabla 1.2
Esquema de maduración de los linfocitos T
Etapa Antígeno independiente Antígeno dependiente
Órgano Médula ósea Timo Sangre periférica
Célula progenitora linfoide
ProtimocitoPretimocito cortical blástico
Timocitos comunes
Timocito maduro (medular)
Linfocitos T maduros
Reordenamiento de los genes RCT
δ γ β α
TdT + + + + - -
16
Tabla 1.2 (cont.)
Esquema de maduración de los linfocitos T
Etapa Antígeno independiente Antígeno dependiente
Órgano Médula ósea Timo Sangre periférica
Célula progenitora linfoide
ProtimocitoPretimocito cortical blástico
Timocitos comunes
Timocito maduro (medular)
Linfocitos T maduros
Expresión de moléculas
CD34 HLA-DR CD117
CD34 HLA-DR CD117 CD7 CD45RA
CD3ci CD7 CD2 CD5 CD38 CD71
CD7 CD2 CD5 CD3ci CD1a CD4/CD8δγRCT αβRCT
CD7 CD2 CD5 CD3m CD4 o CD8 δγRCT αβRCT
CD7 CD2 CD5
CD45 RA CD3
CD4 o CD8δγRCT
αβRCT CD3ci: CD3 de citoplasma. CD3m: CD3 de membrana
Los linfocitos proceden de una célula primitiva linfoide, progenitor común
a todos ellos, ubicada en la médula ósea y que desde el punto de vista
fenotípico se caracteriza por la expresión de marcadores que expresan
inmadurez.
El desarrollo de las células T en el timo se caracteriza por la adquisición
progresiva de las funciones y de los marcadores antigénicos específicos de los
linfocitos T (Boyd y Hugo, 1991). El esquema más aceptado en la actualidad
establece tres estadios de maduración intratímica (Florensa y Woessner, 1994;
Orfao y González de Buitrago, 1995b; Rudd, 1990):
- Estadio I o pretimocitos: CD2+, CD5+, CD7+. En esta población se
detectan también antígenos de activación/proliferación CD38, CD71, la
enzima transferasa terminal desoxinucleotidasa (TdT). Se caracterizan
por no expresar ni CD4 ni CD8 ni CD3-RCT, si bien expresan CD3
citoplasmático de localización perinuclear, el cual no se exporta a la
membrana porque todavía no se sintetiza el RCT, aunque se ha iniciado
el reordenamiento de los genes de las cadenas pesadas.
- Estadio II o timocitos comunes: en esta fase adquieren el CD1a y se
caracterizan por coexpresar CD4 y CD8 (“dobles positivos”). La molécula
17
de CD3 se encuentra en el citoplasma y aún tienen actividad para la
enzima TdT. La mayoría de los timocitos CD4+CD8+ mueren en el timo.
La muerte intratímica se calcula en el 95-99% de los linfocitos dobles
positivos.
Los linfocitos T experimentan procesos de selección positiva y negativa
durante los cuales se selecciona el CD4 o CD8, según que el RCT esté
restringido a antígenos HLA de clase II o de clase I. Las células que
abandonan el timo son linfocitos T CD4+ caracterizados por restricción
HLA de clase II y linfocitos T CD8+ caracterizados por restricción HLA de
clase I.
- Estadio III o timocito maduro: expresan altos niveles de CD3-RCT en la
membrana, han perdido CD1a, no tienen actividad de la enzima TdT y
pueden expresar CD4 o CD8, pero no ambos. El paso de timocito
maduro a célula T periférica viene señalado por la pérdida de parte de
reactividad del antígeno CD38.
Durante la maduración intratímica, los linfocitos T deben adquirir la
capacidad de reconocer los antígenos extraños al organismo y los antígenos
propios para un sistema inmune normofuncionante. La necesidad de producir
linfocitos T normocompetentes conduce a la eliminación programada de
timocitos con una reactividad demasiado elevada o demasiado escasa para los
antígenos. La masiva mortalidad de los timocitos refleja este proceso de
selección positiva y negativa al que se ven sometidos. Esta selección garantiza
que sólo sobrevivan, maduren y pasen a la periferia los timocitos que adquieren
un RCT capaz de reconocer a los antígenos exógenos presentados por las
moléculas HLA de clase I o de clase II del haplotipo HLA propio, siendo
eliminados aquellos que sean capaces de reconocer autoantígenos.
Subpoblaciones linfocitarias T. Los linfocitos T constituyen el 60-70% de las
células mononucleadas de sangre periférica. En términos generales, se definen
18
dos tipos de linfocitos T: los que expresan en la superficie el CD3 y RCTαβ
(linfocitoαβ), y los que expresan en la superficie el CD3 y RCTγδ (linfocitosγδ)
(Westerman y Pabst, 1990).
Linfocitos T ααααββββ. Los linfocitos T αβ tienen un fenotipo similar al de los
timocitos maduros, siendo o bien CD4+, o bien CD8+, predominando los
primeros sobre los segundos en una relación CD4/CD8: 1,5-2,5. Son los
linfocitos T predominantes en la sangre periférica. Los linfocitos T CD4+
reconocen al antígeno unido a la molécula HLA de clase II, y realizan
funciones de cooperación para todos los tipos de respuestas inmunes,
denominándose por ello linfocitos T colaboradores. Estas células una vez
activadas secretan citocinas como IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, etc. La IL-2
tiene un papel decisivo como factor de crecimiento que media de forma
autocrina y/o paracrina la expansión clonal de las propias células T
CD4+, así como, la de los linfocitos T CD8+. Las células CD4 son
imprescindibles para cooperar con las B en la respuesta de Ac. Dicha
cooperación implica interacciones por contacto y mediadas por citocinas
(como la IL-2, IL-4, IL-6, IL10) que actúan sobre los linfocitos B
promoviendo su activación/proliferación y maduración hacia la célula
secretora de Ac.
Datos recientes indican que los linfocitos T CD4+, cuando se hallan
activados de forma crónica y persistente por el antígeno, tienden a
diferenciarse en dos subtipos funcionales, denominados Th1 y Th2,
caracterizados por su capacidad para producir un diferente espectro de
citocinas en respuesta al estímulo antigénico. No hay marcadores
fenotípicos que identifiquen estas células, lo que sólo puede hacerse tras
su cultivo in vitro y análisis de las citocinas que producen. Los linfocitos
Th1 secretan, sobre todo, IL-2, IFNγ y TNF-β, mientras que los Th2
producen IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10. Los Th1 serían muy efectivos para
promover las reacciones de hipersensibilidad retardada, reacciones de
importancia decisiva para la erradicación de los gérmenes patógenos de
19
crecimiento intracelular. Los Th2, en cambio, serían más eficaces para
ayudar a los linfocitos B a desarrollar una respuesta de Ac,
particularmente de clase IgE, y podrían estar implicados en procesos
alérgicos por Ac de clase IgE, así como en las infecciones por parásitos
helmintos. Es interesante señalar que entre los linfocitos Th1 y Th2 se
establecen interacciones mutuamente inhibitorias. En la actualidad existe
gran interés por el estudio de esos subtipos funcionales de linfocitos T en
diversas enfermedades infecciosas y autoinmunes (Andrian y Mackay,
2000; Sallusto y cols, 1999).
Los linfocitos CD8+ reconocen al antígeno en asociación con las
moléculas HLA de clase I; al unirse al antígeno se activan y adquieren
actividad citotóxica y lisan las células que expresan dicho antígeno en su
membrana unido a las moléculas HLA de clase I. Se trata de linfocitos T
citotóxicos específicos de antígeno y restringidos por la molécula HLA de
clase I, y desempeñan un papel decisivo para eliminar las células
infectadas por virus. Se subclasifican en linfocitos “naive” y de
“memoria”, al igual que los linfocitos T CD4+.
Durante muchos años gozó de gran predicamento la idea de que
existía un subtipo de linfocitos T especializados en suprimir las
respuestas de un modo específico de antígeno (linfocitos T supresores),
al que se atribuía un papel esencial en la regulación de las respuestas,
así como en garantizar la tolerancia a lo propio. Se creía que estos
linfocitos T supresores constituían un subtipo de los linfocitos CD8+.
Actualmente estas nociones se consideran en su mayor parte como fruto
de una interpretación simplista de fenómenos complejos. De todas
formas, hay modelos experimentales en los que se puede demostrar la
existencia de fenómenos de supresión antigenoespecífico mediados por
células T, pero su naturaleza precisa está por aclarar.
20
Tras la activación los linfocitos T adquieren el receptor para la IL-
2. Además, los linfocitos T activados pueden expresar antígenos HLA-
DR, que normalmente no se expresan en reposo, y el CD71 que es el
receptor de la transferrina.
Linfocitos T γγγγδδδδ. Constituyen una pequeña proporción de los linfocitos
T de sangre periférica (menos del 5%). Su expresión en la membrana va
asociada a las moléculas CD3, al igual que ocurre con el RCTαβ. Los
timocitos con RCTγδ no pasan por el estadio de co-expresión de CD4 y
CD8, y en sangre periférica aparecen también sin expresar ni CD4 ni
CD8. Son proclives a albergarse en territorios epiteliales y en el hombre
son frecuentes en el tracto gastrointestinal. Su repertorio de
especificidades antigénicas es muy reducido. No se conoce con
exactitud la función fisiológica de estas células CD3γδ, ni su papel en la
respuesta inmune, aunque se ha demostrado un efecto citolítico contra
diferentes dianas, incluyendo células tumorales. Por este motivo se
sugirió que los linfocitos T γδ podían estar implicados en la vigilancia anti-
tumoral del organismo.
Linfocitos CD3+/CD4+/CD8+. Como hemos expuesto previamente, los
timocitos inmaduros co-expresan en su membrana los antígenos CD4 y
CD8 (timocitos comunes). Al progresar en el proceso de diferenciación
se produce la selección de una de las moléculas, de tal forma que la
mayoría de los linfocitos T maduros de sangre periférica, expresan CD4
o CD8, pero no ambos. Sin embargo, se ha demostrado que en sangre
periférica de individuos sanos existen linfocitos T que coexpresan CD4 y
CD8, en un porcentaje muy bajo (2%) (Blue y cols, 1985), cuya función y
ontogenia se desconocen, ya que es difícil realizar estudios funcionales
en esta subpoblación tan minoritaria.
Se ha descrito un aumento de los porcentajes periféricos de esta
subpoblación T CD4+/CD8+, en pacientes con síndrome de Behcet´s y
21
en pacientes con linfoma linfoblástico (Bernard y cols, 1981; Valesini y
cols, 1985). Hace unos años, se publicó el primer caso de un adulto sano
con un porcentaje muy elevado de linfocitos T CD4+/CD8+ en sangre
periférica, cuyo estudio demostró la ausencia de antígenos tímicos en
estas células y que, desde el punto de vista funcional, no respondían a
mitógenos ni IL-2. Sin embargo, estos linfocitos estimulan la proliferación
de células B y la síntesis y secreción de Ig, siendo pues parcialmente
inmunocompetentes (Key y cols, 1990).
1.2. Desarrollo de la respuesta funcional del sistema inmune
La antigenicidad de una molécula se refiere a que su estructura posee
partes (denominadas determinantes antigénicos o epítopos) capaces de unirse
específicamente a los Ac o de fijarse a las moléculas del HLA, de forma que
sean reconocidas por el RCT de los linfocitos T. La inmunogenicidad se refiere
a la capacidad de inducir la respuesta inmune. Una molécula inmunogénica
implica necesariamente que es antigénica, pero una molécula antigénica puede
no ser inmunogénica, ya que la inducción de una respuesta inmune implica
complejas interacciones entre linfocitos T colaboradores, APC y linfocitos B, lo
que depende de muchos otros factores aparte del reconocimiento del antígeno
por las Ig de membrana del linfocito B. Así, componentes orgánicos muy
simples pueden ser reconocidos como antígenos por las Ig de superficie de
ciertas clonas de linfocitos B, pero carecen de inmunogenicidad por sí mismos.
Este tipo de antígenos se denominan haptenos y para convertirse en
inmunogénicos deben unirse a una proteína portadora o “portador”.
Una molécula será tanto más antigénica e inmunogénica cuanto más
distinta sea su composición con respecto a las sustancias presentes en el
individuo y especie al que éste pertenece, y cuanto más compleja y de mayor
peso molecular sea su estructura (Bjorkman, 1987; Jaraquemada y Gallart,
2000).
22
Se entiende por respuesta inmune el conjunto de procesos que, como
consecuencia del contacto de las células del sistema inmunitario con un
antígeno inmunogénico, conduce a la expansión de las clonas linfocitarias
específicas para dicho antígeno, así como las diversas funciones efectoras que
éstas pueden desarrollar y la forma en que éstas o sus productos operan sobre
el antígeno (Gallard y Vives, 1994b).
1.2.1. Cooperación entre linfocitos T y B para la respuesta de anticuerpos
Para que los linfocitos B específicos contra determinados epítopos de un
antígeno puedan activarse, proliferar y diferenciarse, se requiere la ayuda de
linfocitos T específicos para otros epítopos del mismo antígeno. Actualmente se
sabe que esta cooperación T-B se establece gracias a que el linfocito B actúa
de APC para el linfocito T CD4+. Las Ig de superficie del linfocito B se unen al
hapteno y, como consecuencia de esta unión, se internaliza el conjunto
hapteno-portador. Éste es “procesado”, de forma que un fragmento del portador
es presentado unido a las moléculas del HLA de clase II en la membrana del
linfocito B, donde será reconocido por un linfocito T CD4+ cuyo RCT sea
específico del fragmento portador+HLA de clase II. Esta interacción física,
específica de antígeno y restringida por el HLA de clase II, entre linfocitos T y B
es esencial para que se active de forma óptima el linfocito B (Galagher y
Cambier, 1990; Shevach, 1990), ya que, en ausencia de un linfocito T CD4+
específico del portador, un linfocito B se activará parcialmente pero, en lugar de
proseguir su activación, probablemente muera.
Si la activación del linfocito T CD4+ es óptima pasará a secretar IL-2 y
otras citocinas (IL-4, IL-6, IL-10). La IL-4 contribuye a activar los linfocitos B y,
junto con la IL-2, promueve su proliferación. La IL-2 y la IL-4 median también la
proliferación del propio linfocito T CD4+ activado. La IL-4, la IL-2, la IL-6 y la IL-
10 promueven la maduración del linfocito B hacia células secretoras de Ac. La
IL-4, además, puede inducir el cambio de clase de las Ig de superficie (Bonilla y
cols, 1988).
23
El resultado final de este proceso es que se generan células secretoras
de Ac contra el hapteno, así como linfocitos B de memoria específicos del
hapteno y linfocitos T CD4 de memoria específicos del portador; en este símil
de hapteno-portador, el hapteno representa el epítopo reconocido por el
linfocito B de una molécula inmunogénica dependiente de los linfocitos T, y el
portador, un epítopo distinto del mismo inmunógeno reconocido por el linfocito
T CD4+.
1.2.2. Respuesta mediada por células T
Los linfocitos T CD4+ desarrollan un papel fundamental como células
cooperadoras, tanto para las respuestas de Ac por parte de los linfocitos B
como para las respuestas de citotoxicidad específica de los linfocitos T CD8+.
Los linfocitos T CD4+, a través de las interleucinas liberadas, son capaces de
activar los macrófagos y dar lugar a reacciones de hipersensibilidad retardada.
Los linfocitos T CD8+ reconocen al antígeno en asociación con las moléculas
HLA de clase I y, una vez activados, lisan a las células que lo presentan.
Además de estas acciones, los linfocitos T CD4+ y CD8+ de un individuo
reconocen, respectivamente, a las regiones polimórficas de las moléculas HLA
de clase I y II alogénicas expresadas por los individuos genéticamente distintos
de la misma especie; este fenómeno, denominado alorreactividad, constituye la
base del rechazo de los injertos entre individuos HLA-incompatibles y de la
reacción injerto contra huésped.
Se cree que el principal papel fisiológico de los linfocitos T citotóxicos es
intervenir en la eliminación de las células infectadas por virus. La mayoría de
los linfocitos T citotóxicos son CD8+. Sin embargo, existe cierta proporción de
linfocitos T CD4+ que pueden ser citotóxicos, pero su especificidad está
restringida por las moléculas HLA de clase II.
24
La generación de linfocitos T citotóxicos, al igual que la respuesta de Ac,
obedece a los mismos principios de selección por el antígeno del pequeño
número de linfocitos específicos preexistentes antes del estímulo antigénico y a
la amplificación clonal de tales linfocitos mediante un proceso de proliferación.
El número incrementado de linfocitos T específicos, como consecuencia de la
respuesta primaria, garantiza que la respuesta secundaria sea más potente y
rápida.
Los linfocitos T CD8+ citotóxicos, al unirse al antígeno acoplado a
moléculas HLA de clase I propias o presentes en células alogénicas (p. ej. las
de un órgano trasplantado HLA-incompatible) se activan y pasan a expresar
receptores de IL-2; para que puedan proliferar y expresar su función citolítica,
requieren una fuente de IL-2 que normalmente es proporcionada por los
linfocitos T CD4+ próximos, activados por su unión al antígeno. En respuesta a
la IL-2, además de proliferar, los linfocitos T CD8+ activados pueden efectuar
una lisis celular, de forma que, cuando entran en contacto con las células diana
que expresan el antígeno, las lisan (Gallard y Vives, 1994b; Henkart, 1990).
1.2.3. Mecanismos de defensa antitumoral
Hoy en día se acepta que la inmunidad mediada por células T tiene gran
importancia en el rechazo de tumores (Kripke, 1974). Recientemente se ha
demostrado, en el mastocitoma murino P815, la existencia de un gen que es
capaz de codificar un péptido antigénico tumoral que es reconocido
específicamente por linfocitos T citotóxicos CD8+. Asimismo, se ha
comprobado en tumores humanos que los linfocitos T citotóxicos de sangre
periférica derivados de pacientes con melanoma, son capaces de reconocer
específicamente las células diana (Boon, 1992). Estos estudios han permitido
identificar un gen que codifica un péptido que es presentado por la molécula
HLA a linfocitos T CD8+ citotóxicos autólogos. Al igual que en el mastocitoma
murino P815, los genes que codifican estos péptidos sólo se expresan en
25
células tumorales y son presentados por el sistema inmunológico a través de
una molécula determinada del HLA.
Otro de los mecanismo de defensa inmunológicos frente al desarrollo
tumoral son las células asesinas naturales (NK, natural killer), que se
caracterizan por ser activas contra células infectadas por virus, células
hematopoyéticas inmaduras y células con muy bajos niveles de diferenciación,
y pueden eliminar células tumorales por un mecanismo no restringido por los
antígenos del HLA. No es necesaria una sensibilización previa a un antígeno
determinado para activarlas, lo que indica que podrían actuar como primera
línea de defensa. Se ha demostrado que el tratamiento de células de sangre
periférica con la interleucina 2 activa una población de células denominadas
LAK (lymphokine-activated killer) que son capaces de eliminar células
tumorales resistentes a la acción de las células NK (Algarra y Garrido, 1994).
26
2. CITOMETRÍA DE FLUJO
La citometría de flujo (CMF) es, básicamente, un método analítico que
permite la medida de emisión de fluorescencia y dispersión de luz, inducidas
por la iluminación apropiada de células o partículas microscópicas, a medida
que desfilan, de una en una y arrastradas por un flujo portador, frente a un
sistema de detección.
La CMF aprovecha el desarrollo de un amplio número de moléculas
fluorescentes, que se unen específicamente a moléculas celulares, se
acumulan selectivamente en compartimentos celulares o que modifican sus
propiedades a través de reacciones bioquímicas específicas. De esta forma,
permite detectar y cuantificar estructuras y funciones de células individuales o
partículas biológicas aisladas, siguiendo una aproximación multiparamétrica.
Estas características la convierten en una técnica especialmente valiosa para
caracterizar poblaciones celulares heterogéneas a través de un amplio rango
de propiedades biológicas.
Debido al creciente número de parámetros biológicos analizables y al
desarrollo de citómetros de coste accesible, dotados de sistemas informáticos
de uso relativamente sencillo y de alta capacidad operativa, la CMF tiene en la
actualidad un amplio abanico de aplicaciones, tanto en la investigación como
en el diagnóstico clínico, permitiendo identificar células o partículas biológicas,
caracterizar sus propiedades y respuestas funcionales y, en algunos casos,
separarlas físicamente.
La citometría aporta a la hematología un método objetivo y reproducible
para el diagnóstico de clonas celulares anormales de varias líneas
hematopoyéticas, proporcionando información de un gran número de
parámetros de cada una de las células que se analizan, lo que permite
identificar en una muestra subpoblaciones celulares diferentes, incluso cuando
están escasamente representadas.
27
2.1. Fundamentos de la citometría de flujo
La CMF representa un método rápido, objetivo y cuantitativo de análisis
de células, núcleos, cromosomas u otras partículas en suspensión. Mediante
esta técnica son posibles los estudios del ciclo celular, el análisis de antígenos
celulares, la determinación de la ploidía en cánceres y los estudios de diversos
parámetros celulares (pH, apoptosis, etc) (Steward, 1992).
Desde un punto de vista práctico la CMF desarrolla sus aplicaciones a
través de un soporte físico: el citómetro de flujo. El principio en el que se basa
esta tecnología es simple: hacer pasar células u otras partículas en
suspensión, alineadas y de una en una por delante de un haz luminoso. La
interacción de las células o partículas con el rayo luminoso genera señales que
se llevan a los detectores adecuados. Las señales luminosas detectadas se
transforman en impulsos eléctricos, que se amplifican y se convierten en
señales digitales que se procesan en un ordenador.
2.2. Análisis celular. Fundamento de los sistemas de detección
La intersección del flujo de un fluido con la fuente luminosa genera
información sobre distintas características morfológicas, estructurales y
funcionales de las partículas contenidas en el primero. En términos generales
dicha información posee un valor relativo y se engloba en dos tipos de
parámetros: los derivados de la dispersión de la luz y aquellos que están
relacionados con la emisión de luz por fluorocromos presentes en la partícula al
ser excitados por la fuente de luz.
2.2.1. Dispersión de la luz
La dispersión de la luz es un proceso físico en el que una célula
interacciona con la luz incidente y como consecuencia de esta interacción
cambia la dirección de la luz, no la longitud de onda. Las características
28
celulares que contribuyen a la dispersión de la luz son el tamaño celular, la
membrana celular, el núcleo y el material granular del interior de la célula.
La luz no se dispersa igual en todas direcciones y la mayoría lo hace en
la dirección frontal:
• La luz dispersada hacia delante, en ángulos cercanos a 0º (forward
scatter, FSC), es una medida del tamaño celular.
• La luz dispersada en ángulo recto (side scatter, SSC) depende de la
estructura interna de la célula, la granularidad, y no del tamaño.
2.2.2. Fluorescencia
El resto de los parámetros medibles por el citómetro de flujo dependen
de la presencia de fluorocromos en la célula, ya sea de forma natural
(autofluorescencia), o unidos a ella artificialmente.
Los compuestos fluorescentes absorben energía luminosa de una
longitud de onda característica para cada compuesto. Esta absorción hace que
suba un electrón a un nivel energético superior. El electrón excitado cae
rápidamente al estado normal, desprendiendo energía. Esta transición radiante
se denomina fluorescencia.
El número de emisiones fluorescentes detectables de forma simultánea
es variable y depende principalmente del instrumento y los fluorocromos
utilizados. En la actualidad la mayoría de los citómetros de flujo que existen en
el mercado suelen disponer de detectores para emisiones fluorescentes de tres
o cuatro longitudes de onda (colores) diferentes, según estén equipados con
uno o dos emisores de láser respectivamente. Al igual que sucede con la luz
dispersada lateralmente, los detectores de fluorescencia están situados
ortogonalmente respecto al láser.
29
2.3. Componentes de un citómetro de flujo
Los citómetros de flujo presentan una configuración ortogonal con tres
ejes principales: el flujo de la muestra, el del rayo de luz y el de los detectores
de fluorescencia (figura 1.1).
Figura 1.1. Esquema de un citómetro de flujo.
Los citómetros de flujo constan de los siguientes componentes: sistema
de inyección de la muestra, cámara de flujo, fuente de luz, sistema óptico,
detectores, amplificador y sistema informático. A continuación se señalan las
principales características de cada uno de los componentes principales de un
citómetro de flujo.
2.3.1. Sistema de inyección de la muestra
Mediante el sistema de inyección, las células a analizar son introducidas
en el centro de un flujo de líquido isotónico o de agua que es impulsado a gran
velocidad a salir por un orificio estrecho. La diferencia de presión existente
entre la parte interna o central del flujo (muestra a analizar) y la porción externa
o periférica del mismo (líquido isotónico o agua) es regulada por el operador,
30
modificando la velocidad de paso de las células, que debe ser la idónea para
que la célula o partícula en estudio no esté sometida a presiones que alteren
sus características físico-químicas o morfológicas.
2.3.2. Cámara de flujo
La cámara de flujo constituye el centro del citómetro, ya que en ella se
genera el flujo laminar de células que posteriormente serán interceptadas por el
rayo luminoso. En la cámara de flujo, las células se introducen por un sistema
de presión en el centro del fluido envolvente, que es impulsado a gran
velocidad a salir por un orificio estrecho. Durante el trayecto, las células han de
permanecer en el centro de un caudal de líquido isotónico y deben cruzar
perpendicularmente, alineadas y de una en una, el rayo luminoso. La velocidad
de las células puede oscilar entre 1.000 y 1.000.000 por minuto.
En un corte transversal, el flujo está constituido por una porción interna
que contiene el líquido con la suspensión celular y una porción externa con el
líquido envolvente. La diferencia de presión entre los dos compartimentos hace
variar la proporción de cada uno de ellos en el área de sección del flujo, lo que
se traduce en cambios de la velocidad de paso de las células. Así, un
incremento del cociente entre la presión del líquido envolvente y la presión del
líquido con la muestra produce una disminución del volumen de muestra que
pasa por delante del rayo luminoso por unidad de tiempo, es decir, una menor
velocidad de paso de las células. A su vez, una disminución de este cociente
se traduce en una mayor velocidad de paso de las células por delante del rayo
luminoso.
2.3.3. Fuente de luz
En la mayoría de los citómetros de flujo la fuente luminosa es un rayo
láser, generalmente de argón con una potencia de emisión de 15 mW, aunque
también puede ser de helio-neón o criptón. En el tubo láser de argón, el rayo
31
láser se halla ajustado a una longitud de onda de 488 nm. Actualmente se
dispone de citómetros provistos de un segundo rayo láser que puede ser
también de argón o de criptón (Shapiro, 1993).
2.3.4. Sistema óptico
La mayoría de los citómetros de flujo poseen cinco sistemas ópticos de
medida: dos de dispersión de la luz (uno hacia delante y otro en ángulo recto) y
tres de fluorescencia. Mediante el sistema de dispersión de luz hacia delante se
determina el tamaño celular, y con el de dispersión en ángulo recto se
determina la granularidad celular, esto es, la complejidad interna de la célula.
Los sistemas de fluorescencia se sitúan en ángulo recto y mediante ellos se
determinan las células marcadas con compuestos fluorescentes (figura 1.2).
Figura 1.2. Representación esquemática del sistema óptico de un citómetro de flujo dotado de tres detectores de fluorescencia: FITC, PE y Cy5. DM: espejo dicroico. SP: Paso de longitudes de onda inferiores (del inglés”short pass”). LP: paso de longitudes de onda superiores (del inglés “ long pass”). (Orfao y cols. 1995)
32
La luz correspondiente a las diferentes emisiones fluorescentes se
recoge en ángulos cercanos a los 90º junto con la luz dispersada lateralmente.
Por ello se hace necesario un sistema óptico que permita separar la luz que,
aunque recogida lateralmente, aporta información diferente sobre las
características de cada célula: la complejidad interna y cada una de las
emisiones fluorescentes correspondientes a los diferentes fluorocromos
presentes en la célula y excitados de forma simultánea. Los fotones con
diferente longitud de onda se seleccionan por medio de un sistema óptico
compuesto por filtros y espejos dicroicos y se envían a un detector específico.
2.3.5. Detectores
Los pulsos de luz que llegan a los detectores contienen desde unas
centenas a varios miles de fotones. En la actualidad se utilizan tres tipos de
detectores:
• Fotodiodos: son detectores de estado sólido, habitualmente empleados
para recoger señales de luz de intensidad relativamente grande, como la
luz dispersada frontalmente. Ello se debe a que este tipo de detectores
son muy simples y transforman la señal luminosa que le llega en un
pulso.
• Fotomultiplicadores: multiplican la señal recibida. Al estar colocadas
estas placas de forma secuencial, el resultado es la multiplicación de la
señal luminosa.
• Detectores monocromáticos: son de reciente introducción en los
citómetros de flujo y se caracterizan por recoger la luz con una longitud
de onda muy concreta.
2.3.6. Amplificador
Cada detector genera una señal electrónica, que es proporcional a la
cantidad de luz dispersada o a la intensidad de la fluorescencia. Estas señales
se amplifican multiplicándolas por un factor lineal o logarítmico. El pulso
33
amplificado se lleva a un convertidor analógico/digital que convierte la altura del
pico, que es proporcional a la fuerza de la señal, en una señal digital que puede
manejarse por un ordenador. Para la mayoría de las aplicaciones, la dispersión
hacia delante y la dispersión lateral se analizan de forma lineal, mientras que la
fluorescencia se analiza logarítmicamente.
La cantidad de fluorescencia emitida por una célula, es proporcional a la
cantidad de compuesto fluorescente asociado con la célula, lo que, a su vez, es
proporcional a la señal producida sobre el detector fluorescente. Así, el tamaño
de la señal electrónica producida por una célula, es una medida cuantitativa de
la cantidad de compuesto fluorescente sobre su superficie, y refleja el número
de receptores/marcadores (Orfao y González de Buitrago, 1995).
2.3.7. Sistema informático
Como hemos visto, todas las señales luminosas que trasmiten distintos
tipos de información sobre las características de cada célula (dispersión de la
luz e intensidad de emisiones fluorescentes) son convertidas en impulsos
eléctricos, amplificadas y transformadas en códigos digitales para que puedan
ser analizadas por un ordenador.
El proceso de análisis de los resultados debe realizarse en tres pasos
consecutivos destinados el primero a la identificación y selección de los
parámetros a medir, el segundo a la identificación de subpoblaciones dentro de
ellos y el tercero a la caracterización de cada uno de los subgrupos
identificados. Cuando se analiza en una célula la reactividad para un
determinado AcMo específico para un antígeno, se obtiene información sobre
la presencia del epítopo del antígeno en la célula y sobre su nivel de expresión
(número de moléculas por célula). Como consecuencia de lo expuesto, los
programas informáticos permiten además de visualizar directamente las
poblaciones celulares, obtener información numérica objetiva, en forma de
34
porcentajes, valores medios o medidas de dispersión como la desviación
estándar y el coeficiente de variación, obtenido para los eventos estudiados.
De acuerdo con las necesidades del operador, el procesador elabora
histogramas con información sobre uno o dos parámetros diferentes. Un primer
histograma de dos parámetros se construye con la intensidad de la dispersión
de la luz en sentido frontal (FSC) y lateral (SSC). Si se analizan leucocitos de
sangre periférica, en este histograma se agruparán las células pequeñas y no
granuladas (linfocitos) en un lugar cercano al origen de ambos ejes; las células
grandes y granulares (polimorfonucleares) se ubicarán, por el contrario, lejos
del origen de ambos ejes; una tercera población de tamaño y granularidad
intermedia (monocitos) se localizará entre las dos poblaciones anteriores
(figura 1.3).
Figura 1.3. Análisis de las poblaciones
leucocitarias de sangre periférica. Rojo:
linfocitos (40%). Verde: monocitos (4%). Azul:
neutrófilos (56%).
35
Sin necesidad de preparar poblaciones enriquecidas en linfocitos, puede
definirse una “ventana electrónica” que aísle a esta población leucocitaria; los
histogramas restantes detectarán solo los eventos contenidos en la “ventana”
correspondientes a los linfocitos o al parámetro seleccionado. El histograma de
fluorescencia verde (FL1) permite la cuantificación del porcentaje de células a
las que se unió un AcMo conjugado con un fluorocromo que emite luz verde; el
histograma de fluorescencia naranja (FL2) permite la cuantificación de las
células a las que se unió un AcMo conjugado con un fluorocromo que emite luz
de este color. El histograma de doble fluorescencia permite además conocer la
proporción de células a las que se unieron de forma simultánea ambos AcMo.
Este tipo de análisis bidimensional es importante para cuantificar ciertas
poblaciones celulares que sólo son definibles por la coexpresión de más de un
antígenos en su membrana (Hoffman, 1988).
2.4. Fluorocromos más utilizados en citometría de flujo
El uso de compuestos fluorescentes, denominados fluorocromos, en
CMF ha sido fundamental en el desarrollo de esta técnica. Los láseres emiten
luz monocromática, esto es, luz de una única longitud de onda, por lo que para
que un fluorocromo pueda utilizarse en CMF debe absorber luz de la longitud
de onda del láser.
Cronológicamente, el isocianato de fluoresceína (FITC) fue el primer
fluorocromo utilizado en CMF. Este fluorocromo tenía un conjunto de ventajas
que permitían su uso de forma rutinaria. Por un lado, se trata de una molécula
relativamente pequeña con una importante afinidad por las proteínas. Por otra
parte, el FITC se excita con luz azul (488 nm), lo que permite el uso de láseres
relativamente pequeños y de mantenimiento económico. No obstante, la
fluoresceína presenta algunos inconvenientes relacionados fundamentalmente
con la cuantificación de señales de fluorescencia y con la detección de
antígenos expresados en cantidades relativamente bajas.
36
La ficoeritrina (PE), aunque de aparición posterior, es sin duda el
fluorocromo de mayor potencia en el inmunofenotipaje celular y de elección
para la detección y cuantificación de antígenos concretos, por su gran
absorción, rendimiento y fotosensibilidad. Se trata de un fluorocromo muy
sensible, ya que permite la detección de un pequeño número de moléculas del
antígeno.
La mayoría de los fluorocromos restantes empleados en el fenotipaje
inmunológico por CMF, más que fluorocromos individuales están constituidos
por grupos de fluorocromos unidos entre ellos, bien de forma natural como el
peridinclorofil-proteína (PerCP), o artificialmente, como la ficoeritrina-
cianina 5 (Cy5). En este tándem de fluorocromos, uno de ellos se excita
primariamente con la luz del láser, y la luz que emite se absorbe en su práctica
totalidad por el segundo fluorocromo, cuya emisión de luz es la que se mide.
Cuando se emplea de forma simultánea más de un fluorocromo en el
marcaje inmunofenotípico de células, estos deben cumplir un conjunto de
requisitos, de los que destacan el ser excitables por la luz con idéntica longitud
de onda, a no ser que el citómetro disponga de más de una fuente de luz
(láser), y el emitir en una zona distinta del espectro lo más distante posible.
Todos los fluorocromos mencionados se excitan a 488 nm (luz azul), si bien
emiten en la zona verde, naranja y roja, respectivamente.
Desde el punto de vista práctico, el uso de marcajes múltiples
simultáneos presenta ventajas importantes sobre los marcajes simples; en este
sentido, la utilización de marcajes triples aporta mayor información con relación
a los marcajes dobles, y así sucesivamente (Orfao y González de Buitrago,
1995).
37
2.5. Aplicaciones en Hematología. Caracterización inmunofenotípica de
los síndromes linfoproliferativos crónicos
El análisis multiparamétrico mediante CMF, junto con el enorme
catálogo de AcMo del que se dispone en la actualidad, al tiempo que ha
representado una herramienta fundamental para delinear la diferenciación de
las células hematopoyéticas normales, ha conducido a clasificar las neoplasias
derivadas de estas células, de acuerdo con la ontogenia de las mismas.
La CMF permite establecer el origen celular y el estadio de maduración
de los síndromes linfoproliferativos crónicos (SLPC); posee especial relevancia
al permitir un diagnóstico diferencial rápido entre una linfocitosis reactiva y un
proceso monoclonal, y en este caso contribuir a su filiación diagnóstica. En este
sentido, el empleo del triple marcaje CD19/Kappa/lambda es de gran utilidad en
la detección de monoclonalidad de los linfocitos de estirpe B.
El inmunofenotipo permite la clasificación diagnóstica de los SLPC en
neoplasias de origen B y T. Además, dentro de cada uno de estos subtipos de
hemopatías se han podido definir subgrupos fenotípicamente diferentes con
características clínico-biológicas específicas. En este sentido, dentro de los
SLPC de estirpe B, la leucemia linfática crónica (LLC-B) se caracteriza por
mostrar una infiltración periférica masiva por células que expresan los
marcadores B y positividad para el CD5 y CD23.
3. SÍNDROMES LINFOPROLIFERATIVOS CRÓNICOS CON EXPRESIÓN
HEMOPERIFÉRICA. LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA DE ESTIRPE B
Los SLPC con expresión hemoperiférica, constituyen un grupo de
enfermedades caracterizadas por la circulación en sangre periférica de una
proliferación clonal de células linfoides maduras no inmunocompetentes.
38
En 1989, el grupo FAB (French-American-British Cooperative Group)
propuso una clasificación basada fundamentalmente en la citomorfología y el
inmunofenotipo, que permitió una definición precisa de estas entidades (Bennet
y cols, 1989). Los avances en el conocimiento del inmunofenotipo y de las
alteraciones cromosómicas en las neoplasias linfoides malignas dieron lugar,
en el año 1993, a la aparición de una nueva clasificación de estos síndromes
conocida bajo el nombre de REAL (Revised European-American Classification
of Lymphoid Neoplasm), en la que se describen con exactitud los SLPC con
expresión hemoperiférica (Harris y cols, 1994). Así, según la estirpe de la célula
neoplásica, los SLPC se clasifican en SLPC de origen B o de origen T. A su
vez, en función de la presentación clínica, se distinguen los SLPC
primariamente leucémicos y los linfomas leucemizados. Recientemente, y por
iniciativa de la Organización Mundial de la Salud (OMS), las sociedades
Americana y Europea de Hematología, han establecido una nueva clasificación
conocida como clasificación OMS (Harris y cols, 1999), basada en la
clasificación REAL. Ambas clasificaciones tienen diferencias menores, la más
relevante es que la clasificación OMS ha reunido las diferentes entidades en
grandes grupos en función de si, en el momento del diagnóstico, se presentan
en forma predominantemente leucémica, nodal o extranodal. Los SLPC con
expresión hemoperiférica incluidos en la clasificación de la OMS se detallan en
la tabla 1.3.
SLPC con expresión hemoperiférica (clasificación OMS)
Linfomas de células B
- Células maduras
Leucemia linfática crónica
Leucemia prolinfocítica crónica
Linfoma B esplénico de la zona marginal
Leucemia de células peludas (tricoleucemia)
Linfoma folicular
Linfoma de células del manto
39
Linfomas de células T y de células NK (clasificación OMS)
- Células maduras
Leucemia prolinfocítica T
Leucemia de células T grandes granulares
Síndrome de Sézary
El diagnóstico de los SLPC se establece tras la integración de los datos
clínicos y de laboratorio. Los datos de laboratorio que pueden contribuir al
diagnóstico son:
• Citomorfología de las células linfoides de sangre periférica.
• Fenotipo inmunológico mediante una batería de AcMo.
• Histopatología de la médula ósea y de los órganos linfoides afectados.
• Citogenética y biología molecular.
El diagnóstico de estos procesos tiene gran importancia clínica, ya que
el pronóstico y el tratamiento dependen de la identificación precisa de cada una
de las entidades que conforman los SLPC.
Los SLPC de estirpe B son los más frecuentes y se originan por la
expansión clonal de linfocitos B en diferentes estadios de diferenciación. El
estudio del inmunofenotipo permite demostrar la monoclonalidad en la mayoría
de los casos. Las principales características inmunofenotípicas se muestran en
la tabla 1.4: LLC TL TL-V LP LEM LM LCF
IgS +/- ++ ++ ++ ++ -/+ ++
CD19 + ++ ++ + + + +
CD22/CD79b -/+ ++ ++ + ++ + +
CD23 ++ - - - - - -/+
CD5 + - - -/+ -/+ + -/+
CD10 - - - - - -/+ +
CD11c -/+ ++ ++ -/+ + -/+ -/+
CD103 - + + - -/+ - -
CD25 -/+ + - - -/+ -/+ -
FMC7 -/+ ++ ++ + + -/+ +/-
LLC:leucemia linfática crónica; TL:tricoleucemia; TL-V:TLvariante; LP: leucemia prolinfocítica; LEM: linfoma esplénico de la zona marginal; LM: linfoma del manto; LCF: linfoma centrofolicular
40
La LEUCEMIA LINFATICA CRONICA DE ESTIRPE B (LLC-B) es la
entidad más representativa de los SLPC. Es una enfermedad caracterizada por
la proliferación y acumulación de linfocitos no inmunocompetentes de pequeño
tamaño, aspecto maduro y fenotipo B (Dameshek, 1967; Dighiero y cols, 1996;
Galton, 1966; Vallespi y cols, 1999). Las manifestaciones clínicas de esta
enfermedad se deben a la infiltración progresiva de la médula ósea, ganglios
linfáticos y otros tejidos por dichos linfocitos, así como a las alteraciones
inmunológicas que acompañan a la misma (Monserrat y Rozman, 1995). La
LLC-B es la forma de leucemia más frecuente en los países occidentales, se
presenta en personas de edad adulta y su incidencia aumenta con la edad. El
curso clínico es sumamente variable: la mediana de supervivencia es de unos 8
años, pero hay pacientes que fallecen al poco tiempo de ser diagnosticados y
otros cuya esperanza de vida no se ve afectada por la enfermedad. Aunque se
han producido avances en el tratamiento, en la mayoría de los casos la LLC-B
es una enfermedad incurable (Monserrat, 2001).
La primera descripción de la LLC-B la realizó Türk en 1903. En 1924,
Minot e Isaacs llevaron a cabo los primeros estudios sobre las particularidades
clínicas y evolutivas de la LLC-B. Las bases de los conocimientos sobre esta
forma de leucemia fueron establecidas por Galton en la Conferencia Burroughs
de 1965 (Galton, 1966). A su vez, Dameshek (1967) formuló la clásica
definición de LLC-B como “enfermedad debida a la acumulación progresiva de
linfocitos no inmunocompetentes”. En 1975, Rai y cols publicaron su
clasificación de la LLC-B en estadios clínicos, lo que renovó el interés por esta
enfermedad y dio un considerable impulso a los estudios clínicos y biológicos
sobre la misma, desde una nueva perspectiva. En 1979, bajo la iniciativa de
Binet, se constituyó el International Workshop on CLL (IWCLL) que agrupa a
investigadores de muy diversos campos particularmente interesados en la LLC
y otros síndromes linfoproliferativos.
41
3.1. Epidemiología
La LLC-B es la leucemia más frecuente entre las personas adultas de los
países occidentales. El riesgo de desarrollar LLC-B se incrementa
progresivamente con la edad y predomina ligeramente en los varones (Diehl y
cols, 1999; Monserrat y Rozman, 1995). La edad media de los enfermos es de
65 años y sólo un 10-15% de los mismos tienen menos de 50 años en el
momento del diagnóstico (Monserrat, 1996). Sin embargo, debido a la práctica
creciente de análisis de forma rutinaria, la LLC-B se diagnostica cada vez con
mayor frecuencia en personas relativamente jóvenes y en la fase asintomática
de la enfermedad.
La LLC-B representa el 0.8% de todos los cánceres y existen notables
diferencias en frecuencia según las razas y países (Kipps, 2000). Así, en los
países occidentales representa el 30% de todas las leucemias, con una
incidencia que oscila entre 2.7 a 3 casos nuevos por 100.000 habitantes y año
(Dighiero y cols, 1991; Finch y Linet, 1992; Foon y cols, 1990). En cambio, en
los países orientales, como Japón o China, es una enfermedad rara,
representando el 3%-5% de todas las leucemias. Estas variaciones,
probablemente, no solo reflejan diferencias reales entre las poblaciones, sino
también variabilidad en la disponibilidad de métodos diagnósticos (Finch y
Linet, 1992). Finalmente, destacar que también se ha observado que la
incidencia de LLC-B puede ser diferente según el área geográfica de un mismo
país (Digiero y cols, 1991; Foon y cols, 1990).
3.2. Etiopatogenia
Aunque existen ciertos factores relacionados con la enfermedad, la
causa de la LLC-B no se conoce pero, a diferencia de lo que ocurre en otras
leucemias, no hay relación entre la LLC-B y la exposición a radiaciones
ionizantes (Rozman y Moserrat, 1995).
42
Se han descrito familias con varios miembros afectados de LLC-B y
otras en las que se han registrados diversos tipos de SLPC e
inmunodeficiencias, y se calcula que entre los familiares en primer grado de
una persona con LLC-B, el riesgo de padecer la enfermedad es de 2 a 7 veces
superior al de la población general. Todo ello podría sugerir que la enfermedad
tiene una base genética, aunque estudios del genoma en gemelos univitelinos
afectos de LLC-B han demostrado su naturaleza adquirida y hasta ahora no se
ha demostrado una alteración genética molecular asociada al desarrollo de la
enfermedad (Monserrat y cols, 1997; Yuille y cols, 1998).
Los factores ambientales no parecen tener un papel importante en la
patogénesis de este tipo de leucemias. De acuerdo con publicaciones previas,
un estudio reciente del Swedish Cancer no encuentra asociación entre el
desarrollo de la LLC-B y la exposición a los rayos solares, pesticidas ni
disolventes (Adami y cols, 1999).
Los virus tampoco han demostrado una influencia directa en la génesis
de la enfermedad. Así, aunque se ha sugerido que puedan contribuir al
desarrollo de neoplasias linfoides, no se ha demostrado una relación clara
entre el herpes-virus 7, el virus de la hepatitis C y el desarrollo de la LLC-B
(Daibata y cols, 1999; Paidas y cols, 1999). Sin embargo, el virus de Epstein-
Barr (VEB) se ha asociado con algunos casos de síndrome de Richter,
especialmente en pacientes con inmunodeficiencia severa (Ansell y cols, 1999).
En estos casos, es posible que la ausencia de vigilancia inmunológica conlleve
al desarrollo de enfermedades linfoproliferativas asociadas al VEB.
3.3. Citogenética y Biología Molecular
En la LLC-B se han descritos diversas alteraciones cromosómicas,
siendo la anomalía más frecuente la del(13q14), seguida por la del(11q22-q23)
y la trisomía del cromosoma 12 (Döhner y cols, 1999; Morgan y cols, 1999;
Stilgenbauer y cols, 1999). Sin embargo, no existen datos concluyentes que
43
asocien estas alteraciones genéticas con formas agresivas de la enfermedad
(Döhner y cols, 1997; García-Marco y cols, 1996), aunque algunos autores han
relacionado alteraciones citogenéticas complejas y la trisomia del cromosoma
12 como factores de mal pronóstico (Kipps, 2000; Wierda y Kipps, 1999).
Por otra parte, la relación entre la LLC-B y determinados genes (Bcl-1,
Bcl-2, Bcl-3) no está clara. En condiciones normales, el gen Bcl-2 previene la
apoptosis o muerte programada de las células. En la LLC-B es frecuente un
incremento de las proteinas Bcl-2 aunque, al contrario de lo que sucede en los
linfomas foliculares, el reordenamiento del gen es excepcional (Hanada y cols,
1993; Raghoebier y cols, 1991). Esto se relaciona con los defectos de la
muerte celular programada (apoptosis) de los linfocitos de la LLC-B y su
acumulación, en forma de células en fase G0 del ciclo celular, a lo largo del
tiempo. Aunque los niveles de expresión del gen Bcl-2 en las células
leucémicas no se corresponde con la masa tumoral, sí parece tener relación
con formas clínicas agresivas y con resistencia a la quimioterapia (Klein y
Miera, 2000; Pepper y cols, 1999).
3.4. Biología y cinética celular del linfocito B neoplásico en la LLC-B
La mayoría de las células de la LLC-B en sangre periférica no están en
una fase de mitosis del ciclo celular (suelen estar en fase G0), lo que sugiere
que la vida media de los linfocitos es muy larga. En este sentido, se ha
comprobado que las células B procedentes de un paciente con LLC-B
transferidas a ratones con inmunodeficiencia combinada severa pueden
sobrevivir durante semanas (Kobayashi y cols, 1992).
La contrapartida normal de los linfocitos de la LLC-B no está aclarada.
Así, en los ganglios linfáticos y sangre periférica de las personas normales
puede identificarse una pequeña población de linfocitos con características
fenotípicas similares a la de los linfocitos B de la LLC-B (CD5+). Estas células
son de aparición temprana en la ontogenia de los linfocitos B y se hallan
44
incrementadas en la sangre del cordón umbilical, lo que condujo a algunos
investigadores a sugerir que los linfocitos B (CD5+) de la LLC-B correspondían
a una expansión de un clon detenido en un estadio inmaduro, aunque esta
hipótesis no ha sido confirmada por otros autores (Dighiero, 1987, 1988).
De forma alternativa, se ha sugerido que las células B (CD5+) de la LLC-
B podrían corresponder a una línea celular aislada (Hayakawa y cols, 1985).
Sin embargo, no hay una demostración clara de que estas células
correspondan a una línea celular B diferente. Investigaciones recientes,
parecen indicar que la contrapartida normal del linfocito de la LLC-B se halla en
la zona del manto de los folículos linfoides. Alrededor del 50% de los casos
tienen mutaciones somáticas de los genes de las Ig, lo que sugiere un origen
de la enfermedad en las células B post-germinales, con memoria inmunológica.
En el resto de los casos, los genes de las Ig no están mutados; en tales casos,
la leucemia surgiría a partir de células B pregerminales, sin memoria
inmunológica (Damle y cols, 1999; Hamblin y cols, 1999).
El carácter monoclonal de los linfocitos de la LLC-B se pone de
manifiesto por la presencia de cadenas ligeras kappa o lambda, pero nunca
ambas, así como por estudio de las isoenzimas de la G-6PD en mujeres
heterocigotas para el mismo, análisis citogenéticos y estudio del
reordenamiento de los genes de las Ig (Foon y cols, 1990).
3.5. Características inmunofenotípicas de los linfocitos B en la LLC-B
Desde el punto de vista inmunofenotípico, las células de la LLC-B se
asemejan al de linfocitos relativamente inmaduros, aunque presentan un grado
de maduración mayor que el de los linfoblastos de la leucemia aguda. Así, las
células de la LLC-B expresan marcadores B, CD19, CD24, CD20 y CD22, con
intensidad inferior a la de los linfocitos B maduros normales de sangre
periférica (Witzig y cols, 1994) y tienen Ig de superficie, cuya monoclonalidad
viene determinada por la expresión de una única cadena ligera (Κ o λ), sobre la
45
membrana de la célula (Kipps, 1995). El 60% de los pacientes con LLC-B
expresan Ig con cadena ligera k y el 40% restante tienen cadena ligera λ. La Ig
de superficie más frecuente es Ig M, seguida de IgM mas IgD o IgD sola (Kroft
y cols, 1995). No obstante, el nivel de Ig expresada en la superficie de las
células leucémicas es bajo comparado con los niveles hallados en células B
normales o células neoplásicas de otros procesos linfoproliferativos (Geisler y
cols, 1991; Ternynch y cols, 1994).
Una característica inmunofenotípica relevante es que estas células
leucémicas suelen expresar CD5, un antígeno inicialmente descrito como
específico de células T (Huang y cols, 1999; Kipps, 2000; Zukerberg y cols,
1993) y, aunque un porcentaje pequeño de casos pueden ser CD5 negativo
(Kay y Peterson, 1991; Kurec y cols, 1992), los miembros del International
Workshop en LLC han recomendado que en los ensayos clínicos solo se
incluyan casos de LLC-B CD5+ (IWCLL, 1989).
Además, las células de la LLC-B suelen expresar CD23, un marcador de
activación de células B (Batata y Shen, 1992), que es útil para diferenciar la
LLC-B del linfoma del manto, ya que este último es positivo para el CD5 pero
negativo para CD23 (Harris y cols, 1994). Un 50% de casos expresan otro
marcador de activación celular, CD25, observado en la mayoría de los
pacientes con leucemia de células peludas (tricoleucemia) (Freedman, 1990;
Kroft y cols, 1995).
Otros marcadores menos específicos de LLC-B que se expresan en una
minoría de casos son: CD11c, que es un antígeno mielomonocítico
característico de la tricoleucemia (Hanson y cols, 1990; Wormsley y cols,
1990); el marcador FMC7 no suele presentar reactividad en la LLC-B, al
contrario de lo que sucede en la leucemia prolinfocítica de células B en la que
suele ser positivo (Catovsky y cols, 1981). El Ag CD10 (CALLA) suele ser
constantemente negativo.
46
El patrón fenotípico más ampliamente aceptado en la LLC-B es el
siguiente (Baldini y cols, 1990; Cheson y cols, 1996; Kurec y cols, 1992; Legac
y cols, 1991):
• Suelen expresar bajas cantidades de Ig en su superficie (kappa o
lambda).
• La mayoría de los casos expresan CD5 (con negatividad para el resto de
marcadores T) y CD23 en la membrana.
• Expresan marcadores B, CD19, CD24, CD20 y CD22, con intensidad
inferior a la de los linfocitos B maduros normales de sangre periférica.
Los procesos linfoproliferativos B representan una amplia variedad de
enfermedades, caracterizadas por distintos patrones clínicos, morfológicos
inmunofenotípicos e histológicos. Sin embargo, en ocasiones pueden presentar
datos comunes que dificultan el diagnóstico y reflejan la heterogeneidad de
estos procesos. Dado que la evolución clínica y respuesta al tratamiento son
muy diversas, establecer un diagnóstico correcto es de máxima importancia. En
este sentido, la realización de un análisis inmunofenotípico por CMF es
fundamental y precisa de la combinación de varios marcadores inmunológicos,
ya que el análisis de marcadores aislados es insuficiente para distinguir entre
los distintos procesos linfoproliferativos.
Diversos investigadores han intentado establecer un sistema de
puntuación incluyendo varios AcMo para tener una aproximación diagnóstica
fiable (Kurec y cols, 1992). De ellos destaca por su fácil reproductividad,
accesibilidad y simplicidad, el sistema creado por Matutes y cols. (1994) el cual
incluye cinco AcMo: CD5, CD22, CD23, FMC7 e inmunoglobulinas de
superficie, dando una puntuación de 0 a 1, según el patrón fuese típico o
atípico para LLC-B. Una puntuación de 5 indicaría que nos hallamos ante una
LLC-B típica y una puntuación de 0 ante una LLC-B atípica. Aplicando este
sistema a los pacientes con leucemias y linfomas estudiados por este grupo, un
87% de los casos de LLC-B tenían una puntuación de 5 y 4, y solo un 0.4%
mostraban un rango de 0 o 1; mientras el 89% de otras leucemias B y el 72%
47
de los linfomas tenían una puntuación de 0 a 1. Otros AcMo como CD25, CD10
y CD11c no mostraron poder discriminatorio.
Con posterioridad, este mismo grupo, intentó mejorar la precisión de su
sistema diagnóstico incluyendo un nuevo AcMo: CD79beta, así se pasó de un
nivel de precisión del 91.8% al 96.6%, convirtiéndose en uno de los esquemas
más utilizados por los hematólogos en el diagnóstico de los SLPC (Moreau y
cols, 1997). Este sistema de puntuación se describe en el apartado de Material
y Método.
3.6. Alteraciones de la inmunidad
3.6.1. Inmunidad celular
Se han descrito diversas alteraciones de los linfocitos T en la LLC-B,
siendo las más aceptadas el incremento en la cifra absoluta de los mismos
(Briggs y cols, 1991; Kimby y cols, 1987; Töterman y cols, 1989) y la alteración
del cociente CD4/CD8 en sangre periférica (Apostolopoulos y cols, 1990;
Burger y cols, 1990). También se han citado otras anomalías como el aumento
del número absoluto de células T CD8+ y CD4+ (Dighiero, 1993).
La etiopatogenia de estas alteraciones en la población T en la LLC-B y
sus implicaciones en el curso evolutivo de la enfermedad se desconocen,
aunque se han relacionado con estadios avanzados (Zaknoen y cols, 1990) y
con la hipogammaglobulinemia frecuentemente observada en estos pacientes
(Davey y cols, 1987). No obstante, los datos publicados son contradictorios y
no hay consenso en la literatura (Briggs y cols, 1990; Kunicka y Platsoucas,
1988).
Los datos respecto a la función cooperadora, NK y citotoxicidad celular
dependiente de antígeno son también conflictivos y difíciles de interpretar. El
crecimiento de colonias de linfocitos T en cultivo suele estar disminuido. Los
48
pacientes con LLC-B tienen disminuida la actividad NK, pero el número de
células NK suele ser normal o incluso está incrementado (Caligaris-Cappio y
Hamblin, 1999; Wierda y Kipps, 1999).
3.6.2. Inmunidad humoral
La hipogammaglobulinemia aparece en un 10 a 60% de los casos de
LLC-B, según los valores empleados como límite inferior (Dighiero, 1988;
Dighiero y cols, 1991), siendo esta la causa principal de infección en la LLC-B
(Anaissie y cols, 1999; Molica, 1994). Los pacientes con formas precoces de la
enfermedad pueden presentar respuestas defectuosas de Ac específicos frente
a la infección o la inmunización (Chapel y Buch, 1987).
Un marcado componente monoclonal de inmunoglobulinas,
generalmente IgM, solo es observable en un 5% de los pacientes pero,
utilizando técnicas de alta resolución, una pequeña proporción de componente
monoclonal puede detectarse en suero u orina en el 80% de los casos
(Beaume y cols, 1994).
Sobre la base de lo expuesto, los pacientes con LLC-B tienen una mayor
susceptibilidad a las infecciones debido a la hipogammaglobulinemia. Sin
embargo, pueden estar implicados otros factores, como niveles bajos de
complemento (Kipps, 2000), alteración en la expresión del HLA de clase II en
las células leucémicas (Veenstra y cols, 1996) y defectos de la función
granulocítica (Itala y cols, 1996).
Finalmente, anotar que en pacientes con LLC-B se han observado
fenómenos autoinmunes dirigidos contra componentes sanguíneos, cuya
patogenia es desconocida. Se han postulado diversas hipótesis, entre ellas,
destacamos las que implican las anormalidades en los linfocitos B no
neoplásicos como origen de estos procesos autoinmunes (Kipps y Carson,
1993; Montserrat y cols, 1997) y las que responsabilizan a las células
49
neoplásicas (Bartik y cols, 1998; Sthoeger y cols, 1993). Actualmente, se
investiga el papel que puede jugar la población T en la aparición de esta
complicación, al observar que la introducción de nuevos agentes terapéuticos
como son los análogos de las purinas, que producen una importante alteración
de las subpoblaciones linfocitarias T, ha conducido a un aumento en la
frecuencia de anemias y trombopenias de etiología autoinmunes (Pristch y cols,
1998).
3.7. Manifestaciones clínicas
La forma de presentación de la LLC-B ha variado sustancialmente a lo
largo de los últimos años debido, sobre todo, a la creciente práctica de análisis
de rutina. Así, en la actualidad más de la mitad de los casos se descubren de
forma casual, en personas asintomáticas a las que se les realizan exámenes
rutinarios de salud y se detecta en la analítica una leucocitosis con linfocitosis
(Dighiero y cols, 1991; Monserrat y Rozman, 1995;). En el resto, la astenia, la
aparición de adenopatías o las infecciones de repetición son las
manifestaciones que llevan a la sospecha diagnóstica. Por otra parte y a
diferencia de lo que ocurre en los linfomas, la fiebre, sudación y pérdida de
peso son poco frecuentes como forma de presentación de la enfermedad
(Monserrat y cols, 1997).
La exploración física puede ser completamente normal, aunque en cerca
del 40% de pacientes se detectan adenopatías de carácter simétrico. Las
adenopatías mediastínicas o la infiltración del anillo linfático de Waldeyer son
sumamente raras. El bazo suele palparse en el 20-30% de los casos. No es
extraño el hallazgo de hepatomegalia. De forma excepcional pueden detectarse
infiltrados linfoides en diversos tejidos, tales como piel, riñón, glándulas
lagrimales o salivares, pulmón u otros. En estos casos, sin embargo, es
obligado descartar una segunda neoplasia o la progresión de la enfermedad a
linfoma. Se han descrito casos de síndrome nefrótico acompañando a la LLC-
50
B, así como de hipertensión portal por hiperplasia nodular regenerativa del
hígado inducida por la infiltración linfoide del mismo (Monserrat y cols, 1997).
3.8. Complicaciones
Las complicaciones suelen derivar de las alteraciones del sistema
inmunitario, la alta masa tumoral y la progresión de la enfermedad. Entre ellas,
las más frecuentes son las infecciones, los fenómenos autoinmunes, la
transformación de la enfermedad y las segundas neoplasias.
3.8.1. Infecciones
Son más frecuentes en fases avanzadas de la enfermedad y se deben a
las alteraciones de la inmunidad que acompañan a la LLC-B y a las
complicaciones derivadas del tratamiento. Suelen ser de origen bacteriano y de
localización pulmonar; las infecciones virales, en especial por virus herpes, son
asimismo muy frecuentes. La introducción en los últimos años de nuevos
agentes terapéuticos como los análogos de las purinas, ha provocado la
aparición de infecciones oportunistas (Pneumocystis carinii, CMV, Legionella,
Listeria, micobacterias atípicas). Las infecciones son la primera causa de
morbimortalidad (Anaissie y cols, 1999).
3.8.2. Fenómenos autoinmunes
La prueba de Coombs directa es positiva en un 15-35% de los casos, al
inicio de la enfermedad o durante su evolución. Los Ac suelen ser de tipo IgG,
el más frecuente es el factor reumatoideo (Kipps y Carson, 1993). En
ocasiones, la positividad de la prueba de Coombs no se acompaña de una
anemia hemolítica franca. Menos frecuente es la trombocitopenia de tipo
autoinmune que acontece en un 2-5% de casos (Keating, 1999). En raras
ocasiones, la LLC-B se asocia a una aplasia pura de la serie roja, cuyo
51
diagnóstico, cuando la médula ósea está intensamente infiltrada por linfocitos,
no siempre es fácil (Monserrat y cols, 1997).
3.8.3. Transformación de la enfermedad
La forma más habitual (5-10% de los casos) es la transformación
prolinfocitoide, situación en la que en sangre periférica coexisten linfocitos
maduros con prolinfocitos; para la definición de leucemia prolinfocítica se ha
establecido, de forma arbitraria, que el porcentaje de prolinfocitos debe ser
superior al 55% (Melo y cols, 1986). A su vez, en el 3-10% de los pacientes se
asiste a la aparición de un linfoma de células grandes (síndrome de Richter),
posibilidad que deberá sospecharse siempre que el paciente sufra un
empeoramiento inexplicado del estado general, fiebre, aumento del tamaño de
los ganglios linfáticos o del bazo, incremento de la LDH sérica e hipercalcemia
(Giles y cols, 1998). En cerca de la mitad de los casos, el linfoma surge a partir
de la transformación de la clona propia de la LLC-B. Es excepcional que la
LLC-B se transforme en una leucemia aguda. Asimismo, es también posible la
aparición de un mieloma múltiple, que en la mayoría de los casos es un
fenómeno de novo, no relacionado con la clona celular de la leucemia
(Monserrat, 2001).
3.8.4. Segundas neoplasias
La incidencia de neoplasias en los enfermos con LLC-B es superior a la
de la población general. Alrededor de un 10% de los pacientes presentan esta
complicación. Se trata, por lo general, de carcinomas de piel, tubo digestivo y
pulmón. Las segundas neoplasias pueden aparecer de forma previa,
simultánea o tras el diagnóstico de la leucemia, en cuyo caso no guardan
necesariamente relación con el tratamiento (López-Guillermo y cols, 1989).
52
3.9. Datos de laboratorio
Entre las alteraciones analíticas, destaca la leucocitosis, que suele
estar comprendida entre 20 y 150 x 109/L con una linfocitosis superior al 75%.
El estudio morfológico de sangre periférica muestra unos linfocitos de pequeño
tamaño, núcleo redondeado, cromatina condensada en grumos y escaso
citoplasma. Estas células son anormalmente frágiles y se rompen con facilidad
al efectuar las extensiones, dando lugar a las típicas sombras de Gumprecht.
Puede haber un pequeño porcentaje, de linfocitos que presenten hendiduras
nucleares (linfocitos hendidos) y otros con nucléolos (prolinfocitos) (Harris y
cols, 1999; Vallespi y cols, 1999; Woessner y cols, 1991).
La anemia se detecta de forma inicial en el 15-20% de los casos. En
ocasiones es de carácter autoinmune, aunque los signos indirectos de
hemólisis (por ejemplo, reticulocitos) pueden faltar o ser poco evidentes y, por
ello, en todos los casos de LLC-B procede estudiar el test de Coombs. Otras
causas implicadas en la producción de anemia son: reducción en la producción
de hematies asociada a una infiltración masiva de la médula ósea, secuestro
esplénico o aplasia pura de serie roja de probable etiología inmune. La
trombopenia es menos frecuente. La neutropenia de origen inmune es
excepcional (Digiero y cols, 1991). Los niveles séricos de ácido úrico, láctico-
deshidrogenasa (LDH) y bilirrubina total pueden estar elevados.
La hipogammaglobulinemia es frecuente (20-60% de los casos), sobre
todo en los pacientes con enfermedad avanzada. La Ig que con mayor
frecuencia se halla descendida es la IgM, seguida de la IgG e IgA. En el 5-10%
de los casos puede detectarse una gammapatía monoclonal (sobre todo IgM o
IgG).
El aspirado de médula ósea revela una infiltración por elementos
linfoides. En la biopsia medular se han definido diferentes patrones de
infiltración: nodular, intersticial, mixto y difuso (Hernández-Nieto y cols, 1997).
53
El patrón nodular consiste en una infiltración por nódulos linfoides con
conservación de la grasa y celularidad hematopoyética normal. El patrón
intersticial tiene una infiltración linfocitaria intersticial, con celularidad
hematopoyética y adiposa conservada. El mixto consiste en una combinación
de los dos patrones anteriores. Finalmente, en el difuso casi no se observa
celularidad hematopoyética ni grasa debido a la existencia de una gran
infiltración por linfocitos. Los patrones nodular, intersticial y mixto se observan
en las fases iniciales de la enfermedad y el difuso en las más avanzadas
(Monserrat, 2001).
Los ganglios linfáticos tienen una infiltración difusa por linfocitos de
pequeño tamaño. En el bazo hay una infiltración que ocupa principalmente la
pulpa blanca en forma de nódulos linfoides.
3.10. Diagnóstico
Los criterios diagnósticos para la LLC-B han sido establecidos de forma
independiente por dos grupos de trabajo: el International Workshop on Chronic
Lymphocytic Leukemia (IWCLL, 1989) y el National Cancer Institute-
Sponsored Working Group (Cheson y cols, 1996).
• Criterios diagnósticos del International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia (IWCLL, 1989) :
1. Linfocitosis absoluta mantenida, con predominio de linfocitos pequeños
de aspecto maduro en sangre periférica y médula ósea. Deben ser
descartadas otras causas de linfocitosis secundarias.
2. Si la cifra de linfocitos es igual o superior a 10 x 109/L, es necesario
demostrar una infiltración de más de un 30% de linfocitos respecto a
células nucleadas en la médula ósea, o un patrón inmunofenotípico
característico de LLC-B (débil expresión de Ig de superficie y positividad
para CD5).
54
3. Si el contaje de linfocitos es menor a 10 x 109/L, es necesario cumplir
los dos criterios previamente descritos: infiltración por más de un 30%
de linfocitos en médula ósea y un patrón inmunofenotípico característico
de LLC-B.
• Criterios diagnósticos de National Cancer Institute-Sponsored Working
Group (NIC, 1996):
1. Cifra de linfocitos en sangre periférica mayor de 5 x 109/L. Desde el
punto de vista morfológico, estos linfocitos deben ser de aspecto
maduro, aunque se admite que pueden aparecer células grandes o
atípicas, linfocitos hendidos y prolinfocitos. El porcentaje de prolinfocitos
debe ser inferior al 55% o menos de 15 109/L.
2. Inmunofenotipo en sangre periférica característico de LLC-B. Los datos
fenotípicos necesarios para establecer el diagnóstico de LLC-B
incluyen: expresión en la población predominante de marcadores de
células B (CD19, CD20 y CD23) con positividad para CD5. Ausencia de
otros antígenos de células T. Demostración de clonalidad sobre la base
de la expresión de cadenas ligeras kappa o lambda de baja densidad.
La duración de la linfocitosis no es actualmente un criterio diagnóstico.
En la revisión previa establecida por este grupo (NIC) se exigía una linfocitosis
mantenida durante al menos 4 semanas (Cheson y cols, 1988), requisito que
no es necesario en el momento actual, debido a la introducción del
inmunofenotipaje celular por CMF que puede demostrar la clonalidad de la
proliferación.
La realización de aspirado y biopsia de médula ósea no es necesaria
para establecer el diagnóstico. El aspirado debe mostrar un porcentaje de
linfocitos igual o superior al 30% de las células nucleadas y la biopsia permite
conocer el patrón de infiltración que tiene implicaciones pronósticas.
55
El grupo FAB (French-American-British Cooperative Group) distingue tres
variedades morfológicas de LLC-B ( Bennett y cols, 1989):
1. Forma típica, constituida por linfocitos con citoplasma visible pero
escaso, homogéneo y débilmente basófilo, sin gránulos. La cromatina
nuclear es característicamente densa y cuarteada. El núcleo y
citoplasma tienen un contorno regular, aunque en algunos casos se
puede observar irregularidades nucleares con indentaciones. El
nucléolo no es visible mediante microscopia óptica. Deben tener menos
del 10% de linfocitos atípicos.
2. Forma mixta tipo LLC/PL, con un porcentaje de prolinfocitos
comprendido entre el 11% y el 54%.
3. Forma mixta, con linfocitos de tamaño diverso, grandes y pequeños,
pero con menos de un 10% de prolinfocitos.
Recientemente la OMS (Harris y cols, 1999) ha establecido una nueva
clasificación para las LLC-B :
1. LLC típica, en la que la proporción de linfocitos atípicos en sangre
periférica es igual o inferior al 10%.
2. LLC/leucemia prolinfocítica (LLC/LPL), cuando el porcentaje de
prolinfocitos se halla incrementado (por lo general, entre el 11 y el 54%).
3. LLC morfológicamente atípica, en la que existe una proporción variable
de células linfoides atípicas (prolinfocitos, linfocitos grandes y, más
raramente, células hendidas y centrocitos) pero el inmunofenotipo es
característico de la enfermedad.
4. LLC inmunofenotípicamente atípica, en la cual la morfología es típica de
la LLC-B, pero las células leucémicas tienen alguna característica
inmunofenotípica poco usual (p. ej; CD5 -, FMC7 +, CD11c+, SmIg de
fuerte intensidad).
56
Como norma general, no debe aceptarse el diagnóstico de LLC-B atípica
sin haber descartado antes otros procesos linfoproliferativos crónicos.
3.11. Factores pronósticos
La mediana de supervivencia de los pacientes con LLC-B es de 8-10
años, pero el curso clínico es muy variable de un enfermo a otro. Así, mientras
algunos pacientes fallecen pocos meses después del diagnóstico, otros
sobreviven durante más de 10 años, sin apenas problemas médicos y sin
precisar tratamiento. De forma excepcional puede asistirse a la remisión
“espontánea” de la enfermedad, a veces tras sufrir el enfermo una infección
viral (Bernard y cols, 1999; Kipps, 2000; Ribera y cols, 1987).
A partir de la idea de que las manifestaciones de la LLC-B se deben a la
acumulación progresiva de linfocitos, se han establecido diversos sistemas de
clasificación por estadios clínicos que reflejan la masa tumoral. La introducción
de estadios clínicos significó un gran avance en el pronóstico, siendo los
sistemas más utilizados el de Rai (1975) y el de Binet (1981). La supervivencia
disminuye desde los estadios iniciales (0 de Rai y A de Binet) a los estadios
avanzados (III y IV de Rai y C de Binet).
Diversos parámetros no incluidos en los sistemas de Rai y de Binet
pueden ser de utilidad para establecer un pronóstico más preciso, entre ellos
los más importantes son:
• Cifra de linfocitos en sangre periférica, discrimina muy bien dos grupos
con diferente pronóstico, según sea inferior o superior a 30 x 109/L
(Rozman y cols, 1982).
• Tiempo de duplicación del número de linfocitos, mayor o menor a 12
meses (Zwiebel y Cheson, 1998), aunque algunos autores establecen el
punto de corte en 6 meses (Cheson y cols, 1996).
• Patrón histológico de infiltración medular (difuso, no difuso) (Rozman y
cols, 1984).
57
• Alteraciones citogenéticas complejas, incluyendo la trisomia del
cromosoma 12 (Kipps, 2000).
Otros parámetros pronósticos han sido recientemente introducidos, entre
ellos destacamos, tasa de LDH, beta-2-microglobulina y cifras de células
CD19+ en sangre periférica (Hallek y cols, 1997; Molica, 1999). La beta-2-
microglobulina representa la cadena ligera de los antígeno HLA de clase I y su
expresión elevada en suero se acompaña de una disminución en la membrana
del tumor y para algunos autores es un importante factor pronóstico ( Keating,
1999).
En resumen, los enfermos con datos de buen pronóstico (estadio poco
avanzado, patrón no difuso en la biopsia ósea, cifras de linfocitos en sangre
periférica < 30 x 109/L, tiempo de duplicación > 12 meses y ausencia de
alteraciones citogenéticas) tienen un excelente pronóstico, con medianas de
supervivencias que superan los 10 años. Por el contrario, aquellos con factores
desfavorables tienen una esperanza de vida inferior a los 5 años.
Los pacientes en estadio A de Binet con patrón no difuso en la biopsia
medular, hemoglobina mayor o igual a 13 g/dl, cifra de linfocitos menor o igual
a 30 x 109/L y un tiempo de duplicación prolongado (> 12 meses), tienen muy
pocas probabilidades de progresar a un estadio más avanzado y una
supervivencia similar a la de una población control de igual sexo y edad (LLC
smoldering o quiescente) (Monserrat y cols, 1988).
3.12. Tratamiento
Actualmente no existe un tratamiento curativo para la LLC-B y, por ello,
el objetivo del mismo es prolongar la supervivencia de los enfermos y mejorar
su calidad de vida. Debido a que la influencia de la enfermedad en la
supervivencia de los pacientes es sumamente variable, las indicaciones
terapéuticas deben hacerse tomando en cuenta los factores pronósticos y la
edad del paciente. Antes de iniciar el tratamiento es necesario mantener al
58
paciente en observación unas cuantas semanas. Durante este período se
practicarán diversos recuentos sanguíneos para estimar el tiempo de
duplicación linfocitario y se completará el estudio diagnóstico.
Los estadios clínicos son una importante guía para tratar a los enfermos
con LLC-B:
• Pacientes con LLC-B de riesgo bajo (Binet A, Rai 0). No existe ninguna
prueba de que el tratamiento sea beneficioso en estos enfermos
(Dighiero y cols, 1998) y en un estudio multicéntrico publicado
recientemente, se demuestra que la supervivencia a los 10 años, fue
ligeramente peor en los pacientes con estadios precoces tratados de
forma inmediata con quimioterapia, respecto a aquellos en los que el
tratamiento fue diferido (CLLTCG, 1999). Así, la actitud aconsejada en
estos casos es la realización de controles cada 3-6 meses y solo iniciar
tratamiento en caso de progresión de la enfermedad.
• Pacientes con LLC-B de riesgo intermedio-alto (Binet B, C; Rai I-IV).
Algunos pacientes presentan un curso clínico poco agresivo, por lo que
no requieren tratamiento de forma inicial. La mayoría, sin embargo,
acaban por necesitar tratamiento.
Debe plantearse la posibilidad de iniciar tratamiento ante cualquiera de
las siguientes circunstancias (Cheson y cols, 1996; Monserrat, 2001):
• Presencia de síntomas generales (fiebre, sudación, pérdida de peso).
• Existencia de adenopatías o esplenomegalia de gran tamaño que
causen síntomas.
• Descenso paulatino de las cifras de hemoglobina o de plaquetas.
• Estadio clínico avanzado.
• Tiempo de duplicación linfocitario < 12 meses.
• Infecciones de repetición con hipogammaglobulinemia.
59
El clorambucilo ha sido el fármaco más utilizado en las últimas dos
décadas en el tratamiento de la LLC-B. Las posibilidades terapéuticas son las
siguientes:
• Monoquimioterapia: a. Clorambucilo. Respuestas globales 60%; respuestas
completas 10-20%. Para que el tratamiento resulte efectivo
debe efectuarse durante 6-8 meses. Su prolongación más allá
de este período no suele aportar ventaja alguna.
b. Ciclofosfamida. Es una alternativa al tratamiento con
clorambucilo.
• Poliquimioterapia: a. La combinación más utilizada es la de clorambucilo más
prednisona. Respuestas globales 35-90%; respuestas
completas no superan el 10%. En estudios aleatorizados este
esquema no se ha mostrado superior al clorambucilo solo, lo
que hace que, teniendo en cuenta los efectos secundarios de
los corticoides, sea preferible utilizar el clorambucilo de forma
aislada.
b. Otras combinaciones, como ciclofosfamida, adriamicina,
vincristina y prednisona o ciclofosfamida, melfalán, prednisona
no han demostrado ser más eficaces que el clorambucilo, por
lo que su empleo no está justificado (CLLTCG, 1999).
• Nuevas modalidades terapéuticas:
a. Análogos de las purinas. Fludarabina, 2-clorodeoxiadenosina.
La tasa de respuestas completas obtenidas por ambos
fármacos se situán entre el 25 y el 50%. Las respuestas, sin
embargo, no se mantienen y todos los enfermos acaban por
recaer. La mediana de intervalo libre de enfermedad en los
enfermos que responden es de unos 5 años. Los principales
60
efectos secundarios son la mielosupresión y la
inmunosupresión. La comparación de estos fármacos con
clorambucilo demuestra que, si bien la tasa de respuesta
completa y el intervalo libre de enfermedad es superior en los
enfermos tratados con análogos de las purinas, no existe
diferencia en la supervivencia global, por lo que no están
recomendados como tratamiento de primera línea, a no ser en
ensayos clínicos (Cheson, 1998).
b. Otras alternativas terapéuticas actualmente en investigación
son: trasplante de precursores hematopoyéticos y los
anticuerpos monoclonales dirigidos contra el Ag CD52 y CD20.
62
La respuesta inmunológica conlleva la producción de Ac dirigidos contra
el antígeno (inmunidad humoral), y la proliferación de células con capacidad
citotóxica (inmunidad celular). Existen dos tipos fundamentales de linfocitos, T
(inmunidad celular) y B (inmunidad humoral), que a su vez constan de diversas
subpoblaciones, las cuales pueden ser diferenciadas en virtud de
características inmunológicas, enzimáticas y funcionales. Estos dos sistemas
no son independientes sino que están íntimamente imbricados. Así, para que
los linfocitos B específicos contra determinados antígenos puedan activarse,
proliferar y diferenciarse, se requiere la ayuda de los linfocitos T y a su vez, los
linfocitos B actúan como células presentadoras de antígenos para los linfocitos
T.
Desde el punto de vista inmunofenotípico, los linfocitos B maduros se
definen por la expresión de antígenos característicos de línea B (CD19, CD22,
CD20) e Ig de superficie, y los linfocitos T se dividen en dos subpoblaciones
linfocitarias, en virtud de la expresión de los antígenos CD4 (linfocitos T
colaboradores) o CD8 (linfocitos T citotóxicos).
La LLC-B es la leucemia más frecuente entre las personas adultas de los
países occidentales. Se caracteriza por la proliferación y acumulación de
linfocitos no inmunocompetentes, aspecto maduro y fenotipo B. Desde un
punto de vista inmunológico, las células leucémicas presentan un perfil
fenotípico característico que puede ayudar a su diferenciación de otros
procesos linfoproliferativos. En este sentido, el inmunofenotipaje celular por
citometría de flujo contribuye de forma relevante a la investigación del origen
celular de estas hemopatías y a su clasificación.
La célula neoplásica de la LLC-B presenta defectos de la muerte celular
programada (apoptosis), lo que provoca su acumulación, en forma de células
en fase G0 del ciclo celular. Este proceso de acumulación progresiva de
linfocitos da lugar a las manifestaciones clínicas de la enfermedad. Se han
descrito alteraciones de la inmunidad celular y humoral en la LLC-B, que en
63
principio podríamos pensar que serían debidas a la sustitución de los linfocitos
T y B normales por células tumorales. Contrariamente a lo esperado, los
primeros estudios realizados en este sentido por Kimby y cols. (1987) y
Dighiero (1988) mostraron un aumento del número absoluto de linfocitos T y
una alteración del cociente CD4/CD8, datos no confirmados por otros autores
(Kurec y cols, 1992).
La etiopatogenia de estas alteraciones en la población T en la LLC-B y
sus implicaciones en el curso evolutivo de la enfermedad se desconoce.
Algunos autores lo han relacionado con estadios avanzados de la enfermedad;
(Apostolopoulos y cols, 1990; Burger y cols, 1990), aunque otros investigadores
no han encontrado esta relación (Briggs y cols, 1990).
Probablemente, estas discrepancias observadas en la literatura respecto
a la población linfoide T en la LLC-B se deban a la inclusión de poblaciones de
pacientes muy heterogéneas, sin criterios diagnósticos claros, y a las
dificultades técnicas para obtener la fracción de linfocitos T que está en muy
baja proporción (predominio de la población leucémica).
Los avances tecnológicos en el inmunofenotipaje celular por CMF han
conseguido una mayor objetividad y reproductividad diagnósticas, facilitando la
identificación de subpoblaciones de células diferentes, incluso cuando están
escasamente representadas. Así mismo, recientemente el National Cancer
Institute-Sponsored Working Group (NCI), ha establecido unos criterios
diagnósticos para la LLC-B que por su fácil aplicabilidad en la mayoría de los
laboratorios hematológicos, cuentan con una aceptación general y han
permitido mejorar la uniformidad de criterios
Los avances técnicos en el área diagnóstica, unido al considerable
significado clínico-biológico de las alteraciones de la inmunidad humoral y
celular en la LLC-B y a las discrepancias existentes al respecto, han llevado al
planteamiento de este trabajo, con la finalidad de estudiar las características
64
inmunofenotípicas de las células tumorales, y las alteraciones de los linfocitos
T, su mecanismo etiopatogénico y el papel en las complicaciones asociadas a
la enfermedad (hipogammaglobulinemia). En base a ello se han planteado los
siguientes objetivos:
1. Establecer un patrón inmunológico en las células leucémicas de la
LLC-B, ampliando las características definitorias del perfil
fenotípico.
2. Determinar las alteraciones de las distintas poblaciones de los
linfocitos T normales residuales en la LLC-B.
3. Relacionar las alteraciones de los linfocitos T con indicadores de
masa tumoral.
4. Relacionar las alteraciones de los linfocitos T con el patrón
inmunofenotípico de la célula leucémica.
5. Relacionar las alteraciones de la inmunidad celular con la
hipogammaglobulinemia presente en la LLC-B.
66
1. MATERIAL
1.1. Muestra biológica
El material biológico utilizado en este estudio ha sido sangre periférica
de 115 pacientes diagnosticados de LLC-B, desde Octubre de 1996 a Junio de
2001. La extracción se realizó por punción venosa en región antecubital
mediante material desechable. Se extrajeron 2 cc de sangre de cada paciente,
introduciéndola en un tubo que contenía como anticoagulante la sal dipotásica
del ácido etilendiaminotetraacético (K2EDTA), que realiza su acción mediante
un efecto quelante sobre el calcio fijándolo, pero sin llegar a precipitarlo. El
International Council for Standardization in Haematology (ICSH) considera a
este tipo de anticoagulante de elección en hematimetría (Vives y Aguilar, 1997),
en base a las siguientes ventajas:
- Respeta la morfología eritrocitaria y leucocitaria, de manera que
permite una demora de 2 horas en la realización de la extensión
sanguínea después de la extracción.
- Asegura la conservación de las células sanguíneas después de
24 horas si la sangre se mantiene a 4ºC.
- No ejerce ningún efecto de dilución sobre la sangre total al
suministrarse de forma seca.
- Al inhibir la aglutinación de plaquetas, facilita su recuento o su
apreciación semicuantitativa a partir de un estudio morfológico de
la extensión sanguínea.
Finalmente resaltar, que hemos considerado la sangre periférica como la
muestra de elección para la realización del estudio morfológico e inmunológico
en la LLC-B, porque en esta patología siempre existe expresión de células
tumorales en este fluido, así como, por su fácil obtención y procesamiento.
67
1.2. Aparatos
1.2.1. Citómetro de flujo
El citómetro de flujo utilizado ha sido FACScan (Becton Dickinson,
Mountain View, California), modular, analizador de células de 8 parámetros y
automatizado, que permite la realización de análisis con posibilidad de trabajar
con tres colores de fluorescencia.
• Óptica de excitación:
- Láser: de argón, de 15 miliwatios, emisión fijada a 488 nm.
• Óptica de emisión:
- Detectores/filtros: con tres fotomultiplicadores de alta eficacia con
filtros de paso de banda de 530 nm, 585 nm y 650 nm, que permite
trabajar, sin necesidad de cambiar de lentes, con FITC, PE y
complejos de PE.
• Óptica de dispersión:
- Gama de dispersión: la radiación se recoge por ángulos de medio
cono de 1.0 a 10 grados.
- Detector de dispersión directa: detector de silicona en estado sólido
con respuesta espectral de 300 nm a 1.100 nm.
- Detector de dispersión en ángulo de 90º: fotomultiplicador de alta
resolución, utilizando separador de rayo en el tren de emisión óptica.
- Reducción del “ruido de fondo” (background): con barrera de
oscurecimiento y hendidura de 100 µ para minimizar la radiación
innecesaria en el detector.
• Sistema de fluidos (en circuito cerrado de flujo):
- Cubeta de cuarzo: sección cruzada interna rectangular de 430 µ x
180 µ.
- Presión de aire: una bomba de aire interna proporciona una presión
del flujo externo de 45 psig y de la muestra de 4.6 y 5.0 psig.
- Velocidades de flujo: hay seleccionadas tres velocidades de flujo de
la muestra, alta 60 µl/min., media 35 µl/min. y baja 12 µl/min. La
68
diferencia de presión entre la cámara y la muestra es regulada y
monitorizada. La velocidad de las partículas en la cámara de flujo es
de 6m/seg.
- Modos de trabajo: el panel de control proporciona tres modos de
trabajo: run, prime y standby. Cuando está en standby se para el flujo
a través de la cámara.
- Concentración de la muestra: suspensión de células aisladas, en la
gama recomendada de 105 a 2 x 107 partículas/ml.
• Procesado de la señal:
- Resolución de medida: 1.024 canales en cada uno de los
parámetros.
- Modos de señal (amplificadores): cualquier combinación de selección
lineal o logarítmica para cada detector.
- Monitorización de la señal: representación pulsátil, independiente
para cada uno de los 5 parámetros, a través del control de amplitud
de pulsos. Histogramas y gráficas en tiempo real en la pantalla del
monitor.
- Compensaciones para fluorescencia doble: se puede compensar la
coincidencia espectral entre los canales de fluorescencia FL1 y FL2,
y entre FL2 y FL3.
- Sensibilidad de fluorescencia: el límite estimado de detección es
equivalente a 1.000 moléculas de fluoresceína por partícula.
- Resolución de Forward y Side Scatter: la función de dispersión está
optimizada para diferenciar linfocitos, monocitos y neutrófilos.
1.2.2. Contador celular hematológico
El contador celular utilizado ha sido Technicon H3 RTX (Bayer
Diagnóstica, Tarrytown, NJ). Este equipo proporciona un diferencial leucocitario
de 5 poblaciones, tras analizar, por un lado el tamaño y el contenido en
peroxidasa de los leucocitos (canal PEROX) y por otro, la lobularidad
leucocitaria junto con el número de basófilos (canal BASO).
69
Para obtener una información cuantitativa de las 5 poblaciones
leucocitarias, el Technicon H3 se basa en las lecturas obtenidas de dos
cámaras de flujo:
• CÁMARA DE PEROX. Las células provenientes de la cerámica de
muestras son incubadas y teñidas en la cámara de PEROX y
conducidas por una corriente a la cubeta de PEROX, en la que se
encuentran los fotodetectores, que suministrarán el recuento de
leucocitos y su distribución en función de su tamaño y grado de
absorbancia. Se obtiene así, información de 4 poblaciones: neutrófilos,
linfocitos, monocitos y eosinófilos.
• CÁMARA DE BASO. En esta cámara se acidifica el medio, con objeto de
alterar la composición citoplasmática de los leucocitos y posterior
alineamiento por una corriente envolvente. Las células son analizadas
en la cubeta RBC/BASO, en la que se enfrentan a una luz de láser de
helio-neón. Este canal ofrecerá un recuento de leucocitos y otro de
basófilos (no afectos por la manipulación realizada en la cámara).
Así, finalmente se dispone de un diferencial leucocitario de 5
poblaciones con la información obtenida por ambas vías.
1.2.3. Otros aparatos y materiales utilizados
• Microscopio óptico, marca Leitz, modelo Orthoplan.
• Centrífuga refrigerada, marca Izasa, modelo Jouan.
• Centrífuga refrigerada, marca Hettich. Modelo Rotina 35R
• Agitador vibracional, marca Velp Scientifica.
• Micropipetas de diversas marcas: Gilson, Menarini, Nichiryo,
Hirschmann.
• Tubos de polietileno (12 x 75 mm) para preparación de muestra en
citometría de flujo, marca Becton Dickinson, modelo Falcon 2052.
• Portaobjetos de 25 x 75 mm, marca Prestige.
70
• Estufa, marca Heraeus, modelo Function line.
• Material de vidrio diverso.
• Material fungible vario.
1.3. Productos o reactivos
1.3.1. Marcadores inmunológicos
A continuación se detallaran las especificidades y fuentes de los distintos
AcMo utilizados en este estudio.
• CD2
Clon: S5.2, deriva de la hibridación de células mielomatosas Sp2/0 de
ratón con células esplénicas de ratón BALB/c, inmunizadas con linfocitos
T activados por cultivo mixto linfocitario.
Composición de la cadena de Ig: el AcMo CD2 está compuesto por
cadenas pesadas IgG2a y cadenas ligeras kappa de ratón.
Molécula reconocida: reacciona con una glicoproteína transmembrana
de 45 a 50 KDa. Este antígeno es conocido también como LFA-2 y es el
receptor de las rosetas de hematíes de carnero.
Distribución del antígeno: el antígeno CD2 está presente en
aproximadamente el 75% de los linfocitos de sangre periférica normal y
en el 95 a 99 % de los timocitos. Reacciona con prácticamente todos los
linfocitos T y con un subtipo de linfocitos natural killer. Su interacción con
CD58 facilita el reconocimiento antigénico por los linfocitos T.
Procedencia: Becton Dickinson.
• CD3
Clon: SK7 deriva de la hibridación de células mielomatosas NS-1 de
ratón con células esplénicas de ratón BALB/c, inmunizadas con timocitos
humanos.
71
Composición de la cadena de Ig: el AcMo CD3 está compuesto por
cadenas pesadas IgG1 y cadenas ligeras kappa de ratón.
Molécula reconocida: reacciona con un antígeno linfoide T humano, de
22 a 28 KDa. El epítope reconocido por el anticuerpo CD3 es expresado
en la cadena épsilon del complejo RCT.
Distribución del antígeno: el AcMo CD3 está presente en el 61 a 85% de
los linfocitos de sangre periférica normal, en el 60 a 85% de los timocitos
y en la mayoría de los linfocitos T de los órganos linfoides periféricos.
Procedencia: Becton Dickinson.
• CD5
Clon: L17F12 deriva de la hibridación de células mielomatosas NS-1/Ag4
de ratón con células esplénicas de ratón BALB/c, inmunizadas con
células de leucemia linfoblástica aguda T humana.
Composición de la cadena de Ig: el AcMo CD5 está compuesto por
cadenas pesadas IgG2a y cadenas ligeras kappa de ratón.
Molécula reconocida: reacciona con una glicoproteína transmembrana
de 67 KDa expresada en los linfocitos T.
Distribución del antígeno: el antígeno CD5 está presente en
aproximadamente el 70% de los linfocitos de sangre periférica normal y
en todos los linfocitos T del timo y de la sangre periférica, así como, en
una subpoblación de células B normales. Reacciona con la mayoría de
las células en las áreas linfoides T del bazo y nódulos linfáticos, en la
LLC-B y en algunos linfomas/leucemias T.
Procedencia: Becton Dickinson.
• CD4
Clon: SK3 deriva de la hibridación de células mielomatosas NS-1 de
ratón con células esplénicas de ratón BALB/c, inmunizadas con linfocitos
T de sangre periférica humana.
Composición de la cadena de Ig: el AcMo CD4 está compuesto por
cadenas pesadas IgG1 y cadenas ligeras kappa de ratón.
72
Molécula reconocida: reconoce un antígeno de 59 KDa presente en los
linfocitos T-helper/inductores y monocitos.
Distribución del antígeno: el antígeno CD4 está presente en los linfocitos
T helper/inductores que representan el 28 a 58% de los linfocitos de
sangre periférica normal y en el 80 a 95% de los timocitos normales.
Está presente en baja densidad en la superficie celular de monocitos y
en el citoplasma de monocitos y macrófagos.
Procedencia: Becton Dickinson.
• CD8
Clon: SK1 deriva de la hibridación de células mielomatosas NS-1 de
ratón con células esplénicas de ratón BALB/c, inmunizadas con linfocitos
T de sangre periférica humana.
Composición de la cadena de Ig: el AcMo CD8 está compuesto por
cadenas pesadas IgG1 y cadenas ligeras kappa de ratón.
Molécula reconocida: reconoce un antígeno de 59 KDa presente en la
subunidad alfa de un complejo bimolecular disulfídrico.
Distribución del antígeno: el antígeno CD8 está presente en los linfocitos
T supresores/citotóxicos, así como, en un subtipo de células natural
killer. Es expresado en el 19 a 48% de los linfocitos de sangre periférica
normal y en la mayoría de los timocitos.
Procedencia: Becton Dickinson.
• CD19
Clon: 4G7 deriva de la hibridación de células P3-X63-Ag8.653 de ratón
con células esplénicas de ratón BALB/c, inmunizadas con células de
LLC humanas.
Composición de la cadena de Ig: el AcMo CD19 está compuesto por
cadenas pesadas IgG1 y cadenas ligeras kappa de ratón.
Molécula reconocida: reconoce un antígeno de 90 KDa presente en los
linfocitos B humanos.
73
Distribución del antígeno: el antígeno CD19 está presente en
aproximadamente el 7 a 23% de los linfocitos de sangre periférica
humana normal y en el 60% de los linfocitos esplénicos. Reacciona con
las áreas linfoides B de amígdalas y ganglios linfáticos normales. Se
expresa en todos los estadios de maduración de los linfocitos B pero se
pierde en el proceso de maduración final a célula plasmática.
Procedencia: Becton Dickinson.
• CD22
Clon: S-HCL-1 deriva de la hibridación de células mielomatosas NS-1 de
ratón con células esplénicas de ratón CD1, inmunizadas con células
totales y preparaciones de membrana de células de tricoleucemia.
Composición de la cadena de Ig: el AcMo CD22 está compuesto por
cadenas pesadas IgG2b y cadenas ligeras kappa de ratón.
Molécula reconocida: reconoce un antígeno de 135 KDa presente en los
linfocitos B humanos.
Distribución del antígeno: el antígeno CD22 se expresa en el citoplasma
de todos los linfocitos B pero solo está presente en la superficie celular
de los linfocitos B maduros. Este antígeno se detecta en las células
linfoplasmocitoides pero disminuye su expresión en las células
plasmáticas que han completado su proceso de maduración.
Procedencia: Becton Dickinson.
• CD23
Clon: EBVCS-5 deriva de la hibridación de células mielomatosas Sp2/0
de ratón con células esplénicas de ratón BALB/c, inmunizadas con una
línea celular de EBV modificadas en vitro.
Composición de la cadena de Ig: el AcMo CD23 está compuesto por
cadenas pesadas IgG1 y cadenas ligeras kappa de ratón.
Molécula reconocida: reconoce un antígeno de 50 KDa presente en el
proceso de diferenciación de los linfocitos B humanos.
74
Distribución del antígeno: el antígeno CD23 está presente en baja
intensidad en la mayoría de los linfocitos B y en alta intensidad en los
linfocitos B activados, linfoblastos activados por el virus de Epstein-Barr
y en las células de la LLC-B. El antígeno CD23 incrementa su intensidad
de forma transitoria en la superficie de los linfocitos B después de su
activación. Su expresión es inducida por la interleukina-4. Este antígeno
no está presente en los linfocitos B inmaduros de médula ósea ni en los
linfocitos T.
Procedencia: Becton Dickinson.
• CD25
Clon: 2A3 deriva de la hibridación de células mielomatosas NS-1 de
ratón con células esplénicas de ratón BALB/c, inmunizadas con linfocitos
T humanos activados con PHA.
Composición de la cadena de Ig: el AcMo CD25 está compuesto por
cadenas pesadas IgG1 y cadenas ligeras kappa de ratón.
Molécula reconocida: reconoce una glicoproteina de 55 KDa que es el
receptor humano de baja intensidad para la interleukina 2.
Distribución del antígeno: el antígeno CD25 está presente en los
linfocitos T, linfocitos B y macrófagos activados.
Procedencia: Becton Dickinson.
• CD45
Clon: 2D1 deriva de la hibridación de células mielomatosas NS-1 de
ratón con células esplénicas de ratón BALB/c, inmunizadas con células
mononucleadas de sangre periférica humana.
Composición de la cadena de Ig: el AcMo CD45 está compuesto por
inmunoglobulinas isotipo IgG1 y cadenas pesadas y ligeras de ratón.
Molécula reconocida: reacciona con las isoformas 180, 190, 205, 220
KDa del antígeno presente en la membrana de los leucocitos humanos.
Distribución del antígeno: el antígeno CD45 está presente en todos los
leucocitos humanos, incluyendo linfocitos, monocitos, eosinófilos,
75
basófilos y polimorfonucleares de sangre periférica, timo, bazo y
progenitores leucocitarios de médula ósea.
Procedencia: Becton Dickinson.
• Anti-Kappa/Anti-Lambda
Clon: el clon Anti-Kappa TB28-2 deriva de la hibridación de células
mielomatosas P3-X63-Ag8.653 de ratón con células CB6
(BC57bxBALB/c) de ratón BALB/c, inmunizadas con proteínas
mielomatosas IgG-k humanas. El clon Anti-Lambda 1-155-2 deriva de la
hibridación de células mielomatosas P3-X63-Ag8.653 de ratón con
células BALB C/J de ratón, inmunizadas con proteínas mielomatosas
IgA1-λ humanas.
Composición de la cadena de Ig: el AcMo Anti-Kappa está compuesto
por cadenas pesadas IgG1 y cadenas ligeras kappa de ratón. El AcMo
Anti-Lambda está compuesto por cadenas pesadas IgG1 y cadenas
ligeras kappa de ratón.
Molécula reconocida: el AcMo Anti-Kappa es específico para las
cadenas ligeras kappa de las inmunoglobulinas humanas. El AcMo Anti-
Lambda es específico para las cadenas ligeras lambda de las
inmunoglobulinas humanas.
Distribución del antígeno: las cadenas ligeras kappa y lambda de las
inmunoglobulinas se expresan en los linfocitos B normales y en las
células leucémicas.
Procedencia: Becton Dickinson.
• CD11c
Clon: S-HCL-3 deriva de la hibridación de células mielomatosas NS-1 de
ratón con células esplénicas de ratón CD1, inmunizadas con células
totales y preparaciones de membrana de tricoleucemia.
Composición de la cadena de Ig: el AcMo CD11c está compuesto por
cadenas pesadas IgG2b y cadenas ligeras kappa de ratón.
76
Molécula reconocida: reconoce un antígeno presente en los
monocitos/macrófagos humanos.
Distribución del antígeno: el antígeno CD11c está presente en monocitos
y en baja intensidad en granulocitos y linfocitos natural killer. También lo
expresan las células de la tricoleucemia y algunas leucemias mieloides
agudas.
Procedencia: Becton Dickinson.
• FMC7
Clon: FMC7
Composición de la cadena de Ig: el AcMo FMC7 está compuesto por IgM
y cadenas ligeras kappa.
Molécula reconocida: reconoce una glicoproteína de 105 KDa presente
en los linfocitos B.
Distribución del antígeno: el antígeno FMC7 está presente en los
linfocitos B de sangre periférica y amígdala. No lo expresan los
granulocitos, monocitos, plaquetas, eritrocitos, linfocitos T ni células NK.
Algunos estudios han demostrado que las células B normales FMC7
positivas son más maduras que las células B FMC7-negativas.
Procedencia: Dako.
• CD79Beta
Clon: SN8
Composición de la cadena de Ig: el AcMo CD79Beta está compuesto por
IgG1 y cadenas ligeras kappa.
Molécula reconocida: reconoce una glicoproteína de 34-39 kDa presente
en el complejo antígeno-receptor de las células B en asociación física
con las inmunoglobulinas de superficie de las células B maduras.
Distribución del antígeno: el antígeno CD79Beta está presente en las
células B normales y neoplásicas, estando ausente en otros tipos
celulares. Aparece en estadios precoces de la diferenciación B. En la
77
LLC-B su expresión es muy débil o negativa, siendo positiva en las
leucemias prolinfocíticas de estirpe B.
Procedencia: Dako.
• Control de inmunoglobulinas de ratón
Clon: X40 deriva de la hibridación de células mielomatosas Sp2/0-Ag14
de ratón con células esplénicas de ratón BALB/c, inmunizadas con KLH.
Composición de la cadena de Ig: está compuesto por cadenas pesadas
IgG1 y cadenas ligeras kappa de ratón.
Molécula reconocida: reconoce de forma específica el antígeno KLH, el
cual no es expresado por células ni líneas celulares humanas.
Procedencia: Becton Dickinson.
1.3.2. Otros productos utilizados
• Solución lisante. Origen: Becton Dickinson, FACS Lysing. La función de
esta solución es romper los hematíes sanguíneos como paso previo a la
realización de inmunofluorescencia directa con AcMo y al análisis por
citometría de flujo.
• Tampón fosfato (PBS).
• Solución de colorante May-Grünwald de eosina-azul de metileno
modificada para microscopia. Procedencia: Merck.
• Solución de colorante Giemsa de azur-eosina azul de metileno en
solución para microscopia. Procedencia: Merck.
• Agua destilada.
2. POBLACIÓN DE ESTUDIO
Este trabajo se realizó en el Servicio de Hematología del Hospital
Clínico-Universitario de Málaga, durante el periodo comprendido entre Octubre
de 1996 a Junio de 2001, siendo la población analizada la correspondiente al
78
distrito sanitario de éste Hospital y el grupo de estudio 115 pacientes
diagnosticados de LLC-B.
En los casos remitidos desde los hospitales de referencia (Hospital
Costa del Sol de Marbella y Hospital de la Serranía de Ronda), en nuestro
servicio se realizó la confirmación diagnóstica por análisis inmunofenotípico por
citometría de flujo, completándose el resto del estudio y el seguimiento en los
hospitales de procedencia.
El grupo control estaba compuesto por 121 individuos, procedentes en
su mayoría de donantes de sangre voluntarios y un grupo minoritario de sujetos
en los que se realizó análisis de rutina y que carecían de patología del sistema
inmunitario.
2.1. Criterios de inclusión
A. Población leucémica
• Edad superior a 14 años.
• Cumplir los criterios diagnósticos establecidos por el National Cancer
Institute-Sponsored Working Group en 1996 :
- Cifra de linfocitos en sangre periférica mayor de 5 x 109/L.
Desde el punto de vista morfológico, estos linfocitos deben ser
de aspecto maduro, aunque se admite que pueden aparecer
células grandes o atípicas, linfocitos hendidos y prolinfocitos.
El porcentaje de prolinfocitos debe ser inferior al 55% o menos
de 15 x 109/L.
- Inmunofenotipo en sangre periférica característico de LLC-B.
Los datos fenotípicos necesarios para establecer el
diagnóstico de LLC-B incluyen: expresión en la población
predominante de marcadores de células B con positividad para
el AcMo CD5 y ausencia de otros antígenos de células T.
79
Demostración de la clonalidad sobre la base de la expresión
de cadenas ligeras kappa o lambda de baja intensidad.
• Desde el punto de vista inmunofenotípico, solo se han incluido casos de
LLC-B positivas para el antígeno CD5, siguiendo las recomendaciones
para la realización de ensayos clínicos establecidas por el National
Cancer Institute-Sponsored Working Group, 1988.
• Las células leucémicas deben representar más del 50% de la población
linfoide (Moreau y cols, 1997; Newman y cols, 1993).
• Alcanzar un valor de 4 – 5 en el sistema de puntuación establecido por
la Dra. Matutes para el diagnóstico diferencial de LLC-B con otros SLPC
con expresión hemoperiférica (Matutes y cols, 1994; Moreau y cols,
1997), en el cual se incluyen cinco AcMo con los siguientes valores:
Puntuación
Marcador 1 punto O puntos
IgS Expresión débil moderada/intensa
CD5 positivo negativo
CD23 positivo negativo
FMC7 negativo positivo
CD22/CD79Beta débil/negativo moderada/intensa
IgS: Inmunoglobulinas de superficie
En aquellos casos en que la puntuación obtenida sea inferior a 4 es
necesario, para ser incluido en el estudio, tener una morfología típica de
LLC-B y la realización de una biopsia ganglionar para confirmar el
diagnóstico.
80
B. Grupo control:
• Edad superior a 14 años.
• Recuentos hemoperiféricos normales, incluyendo: cifras de hemoglobina,
plaquetas, leucocitos y contaje diferencial.
• Ausencia de hepatopatía, nefropatía o procesos cancerígenos actuales o
pasados (aún estando en remisión completa), siguiendo las
recomendaciones del International Federation of Clinical Chemistry (IFCC,
1987).
2.2. Criterios de exclusión
• Serán excluidos del análisis de las subpoblaciones linfocitarias T en los
enfermos leucémicos, así como, en el grupo control, los sujetos que
presenten enfermedad de etiología autoinmune, infecciones víricas agudas
o crónicas y vacunaciones recientes.
• Serán excluidos del análisis de las subpoblaciones linfocitarias T en los
enfermos leucémicos, aquellos que hayan recibido tratamiento
quimioterápico o inmunosupresor en los 3 meses previos al estudio.
3. MÉTODOS
3.1. Variables determinadas
3.1.1. Variables somáticas y clínicas
• Edad: cuantificada en años, en el momento del diagnóstico.
• Sexo.
• Antecedentes personales: incidiendo en patologías de etiología
autoinmune y procesos infecciosos.
• Motivo de consulta: indicando la causa por la cual el paciente es
derivado por primera vez a las consultas externas de hematología.
81
• Adenopatías: número de territorios afectos detectados por palpación
exploratoria o por técnicas de imagen, en el momento del diagnóstico.
• Visceromegalias: detección de hepatoesplenomegalia por palpación
abdominal o por técnicas de imagen, en el momento del diagnóstico.
• Tratamiento: en caso de haber recibido tratamiento, se determinará el
tipo de esquema terapéutico administrado y el tiempo, en meses, desde
que se administró la última dosis.
3.1.2. Variables bioquímicas
• Función renal: como parámetros se han incluido los metabolitos urea y
creatinina. Estos parámetros serán considerados patológicos si su valor
es superior a 1.26 veces el valor límite máximo de la normalidad,
siguiendo los criterios establecidos por la OMS.
• Función hepática: se han determinado las enzimas hepáticas aspartato-
amino-transferasa (GOT), alanil-amino-transferasa (GPT), gamma-
glutamil-transpeptidasa (GGT) y fosfatasa alcalina. Estos parámetros
serán considerados patológicos si su valor es superior a 1.26 veces el
valor límite máximo de la normalidad, siguiendo los criterios establecidos
por la OMS.
• Láctico deshidrogenasa (LDH), determinada en el momento del
diagnóstico.
3.1.3. Variables inmunológicas
• Dosificación de las inmunoglobulinas IgG, IgM, IgA. La determinación se
realizará en el momento del diagnóstico y durante todo el curso evolutivo
de la enfermedad.
• Proteinograma electroforético con detección de componente monoclonal.
La determinación se realizará en el momento del diagnóstico y durante
todo el curso evolutivo de la enfermedad.
82
• Test de Coombs directo. La determinación se realizará en el momento
del diagnóstico y durante todo el curso evolutivo de la enfermedad.
• β2-microglobulina. El valor de este parámetro se ajustará a la función
renal. En caso de insuficiencia renal los valores se determinarán según
el aclaración de creatinina. La determinación se realizará en el momento
del diagnóstico.
3.1.4. Variables hematológicas
• Como variables hematimétricas se han determinado las cifras de
leucocitos, linfocitos, hemoglobina y plaquetas.
• Tiempo de duplicación linfocitaria: tiempo en el que se produce la
duplicación numérica en el recuento de linfocitos de sangre periférica,
cuantificado en meses.
3.1.5. Variables morfológicas
Siguiendo las indicaciones del Grupo Cooperativo FAB (Franco-Americano-
Británico), se distinguen tres variedades morfológicas de LLC (Bennett y cols,
1989):
• Forma típica, constituida por linfocitos con citoplasma visible pero
escaso, homogéneo y débilmente basófilo, sin gránulos. La cromatina
nuclear es característicamente densa y cuarteada. El núcleo y
citoplasma tienen un contorno regular, aunque en algunos casos se
puede observar irregularidades nucleares con indentaciones. El nucléolo
no es visible mediante microscopia óptica. Deben tener menos del 10%
de linfocitos atípicos.
• Forma mixta tipo LLC/PL, con un porcentaje de prolinfocitos
comprendido entre el 11% y el 54%.
• Forma mixta, con linfocitos de tamaño diverso, grandes y pequeños,
pero con menos de un 10% de prolinfocitos.
83
En aquellos casos en los que el estudio citológico de sangre periférica no
mostrase una morfología típica, será necesario alcanzar un valor de 4-5 en el
sistema de puntuación establecido por Matutes y cols.
3.1.6. Variables inmunofenotípicas
Se ha realizado un estudio amplio de las características antigénicas de
las células linfoides T y B, con el objetivo de establecer una definición correcta
y precisa de la población tumoral y de los linfocitos residuales normales, así
como, de las distintas subpoblaciones celulares presentes en sangre periférica.
A continuación se detallarán las variables fenotípicas estudiadas para
cada población celular. Los valores absolutos (v. abs.) se han calculado como
el producto del recuento de linfocitos obtenidos de un contador celular
hematológico automático (Technicon H·3) y el porcentaje de los distintos
subtipos linfocitarios obtenidos por citometría de flujo (Hulstaert y cols, 1994).
La intensidad de expresión de cada antígeno se ha cuantificado como
intensidad de fluorescencia media (MFI) y en escala logarítmica de
fluorescencia (ELF). El patrón de dispersión del antígeno se ha determinado
como coeficiente de variación (CV) y en escala logarítmica (homogéneo-
heterogéneo). Estos términos serán definidos posteriormente en el apartado
3.3.5.
A. Linfocitos B
• CD19+ (%). Esta variable determina el porcentaje de células CD19
positivas totales, cuantificadas sobre la población linfoide.
• CD19+ (v. abs.). Esta variable indica el valor absoluto de células CD19
positivas.
• CD19+/CD5– (%). Porcentaje de células que son CD19 positivas y CD5
negativas, contabilizadas sobre la población linfoide.
84
• CD19+/CD5– (v. abs.). Valor absoluto de células que son CD19
positivas y CD5 negativas.
• CD19+/CD5+ (%). Porcentaje de células que son positivas para los
AcMo CD19 y CD5, contabilizadas sobre el área de células CD19
positivas.
• CD19+/CD5+ (v. abs). Valor absoluto de células que son positivas para
el CD19 y CD5.
• CD19+/CD5+ (MFI). Intensidad de expresión del antígeno CD5
determinada como MFI, contabilizada sobre el área de células CD19
positivas.
Débil: 1-70. Moderada: 71-130. Fuerte: > 130.
• CD19+/CD5+ (ELF). Intensidad de expresión del antígeno CD5
determinada como ELF, contabilizada sobre el área de células CD19
positivas.
• CD19+/CD5+ (heterogéneo-homogéneo). Variable que determina el
patrón de expresión antigénica, homogéneo o heterogéneo en escala
logarítmica, de las células CD5 positivas.
• CD19+/CD5+ (CV). Coeficiente de variación para el antígeno CD5,
cuantificado sobre el área de células CD19 positivas.
Homogéneo: 1-80. Heterogéneo: >80.
• CD19+/CD22+ (%). Porcentaje de células CD19 positivas que
coexpresan el CD22.
• CD19+/CD22+ (MFI). Intensidad de expresión del antígeno CD22
determinada como MFI, contabilizada sobre el área de células CD19
positivas.
Débil: 1-28. Moderado: 29-58. Fuerte: > 58.
• CD19+/CD22+ (ELF). Intensidad de expresión del antígeno CD22
determinada como ELF, contabilizada sobre el área de células CD19
positivas.
• CD19+/CD22+ (heterogéneo-homogéneo). Variable que determina el
patrón de expresión antigénica, homogéneo o heterogéneo en escala
logarítmica, de las células CD22 positivas.
85
• CD19+/CD22+ (CV). Coeficiente de variación para el antígeno CD22,
cuantificado sobre el área de células CD19 positivas.
Homogéneo: 1-45. Heterogéneo: >45.
• CD19+/FMC7+ (%). Porcentaje de células CD19 positivas que
coexpresan el AcMo FMC7.
• CD19+/FMC7+ (MFI). Intensidad de expresión del antígeno FMC7
determinada como MFI, contabilizada sobre el área de células CD19
positivas.
Débil: 1-35. Moderado: 36-75. Fuerte: >75.
• CD19+/FMC7+ (ELF). Intensidad de expresión del antígeno FMC7
determinada como ELF, contabilizada sobre el área de células CD19
positivas.
• CD19+/FMC7+ (heterogéneo-homogéneo). Variable que determina el
patrón de expresión antigénica, homogéneo o heterogéneo en escala
logarítmica, de las células FMC7 positivas.
• CD19+/FMC7+ (CV). Coeficiente de variación para el antígeno FMC7,
cuantificado sobre el área de células CD19 positivas.
Homogéneo: 1-65. Heterogéneo: >65.
• CD19+/CD23+ (%). Porcentaje de células CD19 positivas que
coexpresan el CD23.
• CD19+/CD23+ (MFI). Intensidad de expresión del antígeno CD23
determinada como MFI, contabilizada sobre el área de células CD19
positivas.
Débil: 1-70. Moderado: 71-135. Fuerte: >135.
• CD19+/CD23+ (ELF). Intensidad de expresión del antígeno CD23
determinada como ELF, contabilizada sobre el área de células CD19
positivas.
• CD19+/CD23+ (heterogéneo-homogéneo). Variable que determina el
patrón de expresión antigénica, homogéneo o heterogéneo en escala
logarítmica, de las células CD23 positivas.
• CD19+/CD23+ (CV). Coeficiente de variación para el antígeno CD23,
cuantificado sobre el área de células CD19 positivas.
86
Homogéneo: 1-75. Heterogéneo: >75.
• CD19+/CD11c+ (%). Porcentaje de células CD19 positivas que
coexpresan el CD11c.
• CD19+/CD11c+ (MFI). Intensidad de expresión del antígeno CD11c
determinada como MFI, contabilizada sobre el área de células CD19
positivas.
Débil: 1-60. Moderado: 61-170. Fuerte: >170.
• CD19+/CD11c+ (ELF). Intensidad de expresión del antígeno CD11c
determinada como ELF, contabilizada sobre el área de células CD19
positivas.
• CD19+/CD11c+ (heterogéneo-homogéneo). Variable que determina el
patrón de expresión antigénica, homogéneo o heterogéneo en escala
logarítmica, de las células CD11c positivas.
• CD19+/CD11c+ (CV). Coeficiente de variación para el antígeno CD11c,
cuantificado sobre el área de células CD19 positivas.
Homogéneo: 1-70. Heterogéneo: >70.
• CD19+/CD79beta+ (%). Porcentaje de células CD19 positivas que
coexpresan el CD79beta.
• CD19+/CD79beta+ (MFI). Intensidad de expresión del antígeno
CD79beta determinada como MFI, contabilizada sobre el área de células
CD19 positivas.
Débil: 1-80. Moderado: 81-120. Fuerte: >120.
• CD19+/CD79beta+ (ELF). Intensidad de expresión del antígeno
CD79beta determinada como ELF, contabilizada sobre el área de
células CD19 positivas.
• CD19+/CD79beta+ (heterogéneo-homogéneo). Variable que determina
el patrón de expresión antigénica, homogéneo o heterogéneo en escala
logarítmica, de las células CD79beta positivas.
• CD19+/CD79beta+ (CV). Coeficiente de variación para el antígeno
CD79beta, cuantificado sobre el área de células CD19 positivas.
Homogéneo: 1-52. Heterogéneo: >52.
87
• CD19+/kappa-lambda+ (%). Porcentaje de células CD19 positivas que
coexpresan la cadena ligera de superficie kappa o lambda.
• CD19+/kappa-lambda+ (MFI). Intensidad de expresión de las cadenas
ligeras kappa o lambda determinada como MFI, contabilizadas sobre el
área de células CD19 positivas.
Débil: 1-85. Moderada: 86-110. Fuerte: >110.
• CD19+/kappa-lambda+ (ELF). Intensidad de expresión de las cadenas
ligeras de superficie kappa o lambda determinadas como ELF,
contabilizada sobre el área de células CD19 positivas.
• CD19+/kappa-lambda+ (heterogéneo-homogéneo). Variable que
determina el patrón de expresión antigénica, homogéneo o heterogéneo
en escala logarítmica, de las cadenas ligeras kappa o lambda.
• CD19+/kappa-lambda+ (CV). Coeficiente de variación para las cadenas
ligeras kappa o lambda, cuantificadas sobre el área de células CD19
positivas.
Homogéneo: 1-70. Heterogéneo: >70.
• CD19+/CD25+ (%). Porcentaje de células CD19 positivas que
coexpresan el CD25.
• CD19+/CD10+. Porcentaje de células CD19 positivas que coexpresan el
CD10.
• CD19+/CD2+ (%). Porcentaje de células CD19 positivas que coexpresan
el CD2.
• Escore. Sistema de puntuación establecido por Matutes y cols. (1994,
1997), basado en la expresión de los AcMo previamente analizados:
CD5, CD23, FMC7, CD22/CD79beta, cadenas ligeras kappa/lambda.
B. Linfocitos T
• CD3+ (%). Porcentaje de células CD3 positivas, contabilizadas sobre el
área de linfocitos.
• CD3+ (v. abs.). Valor absoluto de células CD3 positivas.
88
• CD5+/CD19– (%). Porcentaje de células que expresan positividad para
el AcMo CD5 con negatividad para el CD19, contabilizadas sobre el área
de linfocitos.
• CD5+/CD19– (v. abs). Valor absoluto de células que son positivas para
el AcMo CD5 y negativas para el CD19.
• CD5+/CD19− (MFI). Intensidad de expresión del antígeno CD5
determinada como MFI, contabilizada sobre el área de linfocitos.
Débil: 1-70. Moderada: 71-130. Fuerte: >130.
• CD5+/CD19– (ELF). Intensidad de expresión del antígeno CD5
determinada como ELF, contabilizada sobre el área de linfocitos.
• CD5+/CD19– (heterogéneo-homogéneo). Variable que determina el
patrón de expresión antigénica, homogéneo o heterogéneo en escala
logarítmica, de las células CD5 positivas y CD19 negativas.
• CD5+/CD19– (CV). Coeficiente de variación para el antígeno CD5,
cuantificado sobre el área de linfocitos.
Homogéneo: 1-80. Heterogéneo: >80.
• Control de calidad interno. Esta variable compara los porcentajes de
linfocitos T obtenidos en dos tubos distintos y con AcMo dirigidos contra
diferentes antígenos T: (CD3+) − (CD5+/CD19–).
• CD2+/CD19– (%). Porcentaje de células que presentan positividad para
el AcMo CD2 con negatividad para el CD19, contabilizadas sobre el área
de linfocitos.
• CD2+/CD19– (v. abs). Valor absoluto de células que son positivas para
el AcMo CD2 y negativas para el CD19.
C. Subpoblaciones linfocitarias
• CD3+/CD4+/CD8– (%). Porcentaje de linfocitos T positivos para el AcMo
CD4 y negativos para el CD8, contabilizados sobre el área de células
CD3 positivas.
• CD3+/CD4+/CD8– (v. abs). Valor absoluto de células positivas para los
AcMo CD3 y CD4 con negatividad para el CD8.
89
• CD3+/CD8F+/CD4– (%). Porcentaje de linfocitos T positivos para el
AcMo CD8 con ELF fuerte y negativos para el CD4, contabilizados sobre
el área de células CD3 positivas.
• CD3+/CD8F+/CD4– (v. abs). Valor absoluto de células positivas para los
AcMo CD3 y CD8 con ELF fuerte y negativas para el CD4.
• CD3+/CD8M-D+/CD4– (%). Porcentaje de linfocitos T positivos para el
AcMo CD8 con ELF moderado-débil y negativos para el CD4,
contabilizados sobre el área de células CD3 positivas.
• CD3+/CD8M-D+/CD4– (v. abs). Valor absoluto de células positivas para
los AcMo CD3 y CD8 con ELF moderado-débil, y negativas para CD4.
• CD3+/CD8T+/CD4– (%). Porcentaje de linfocitos T positivos para el
AcMo CD8 (cifras totales, que incluye las distintas intensidades de
expresión del antígeno) y negativos para el CD4, contabilizados sobre el
área de células CD3 positivas.
• CD3+/CD8T+/CD4– (v. abs). Valor absoluto de células positivas para los
AcMo CD3 y CD8 (totales) y negativas para CD4.
• Cociente CD4/CD8F. Esta variable se obtiene de dividir el porcentaje de
células CD4 positivas entre las células CD8 positivas con ELF fuerte.
• Cociente CD4/CD8T. Esta variable se obtiene de dividir el porcentaje de
células CD4 positivas entre las células CD8 positivas totales (incluyendo
las distintas intensidades de expresión del antígeno).
• CD3+/CD4+/CD8F+ (%). Porcentaje de células CD3 positivas que
coexpresan CD4 y CD8 (con ELF fuerte).
• CD3+/CD4+/CD8F+ (v. abs). Valor absoluto de células que expresan
CD3, CD4 y CD8 (con ELF fuerte).
• CD3+/CD4+/CD8M-D+ (%). Porcentaje de células CD3 positivas que
coexpresan CD4 y CD8 (con ELF moderado-débil).
• CD3+/CD4+/CD8M-D+ (v. abs). Valor absoluto de células que expresan
CD3, CD4 y CD8 (con ELF moderado-débil).
• CD3+/CD4+/CD8T+ (%). Porcentaje de células CD3 positivas que
coexpresan CD4 y CD8 (cifras totales, que incluye las distintas
intensidades de expresión del antígeno).
90
• CD3+/CD4+/CD8T+ (v. abs). Valor absoluto de células que expresan
CD3, CD4 y CD8 (cifras totales, que incluye las distintas intensidades de
expresión del antígeno).
• CD3+/CD4–/CD8– (%). Porcentaje de células CD3 positivas que no
expresan los antígenos CD4 ni CD8.
• CD3+/CD4–/CD8– (v abs). Valor absoluto de células que son positivas
para el AcMo CD3 pero negativas para CD4 y CD8.
3.1.7. Factores pronósticos
Como variables pronósticas determinantes de la masa tumoral se han
determinado los siguientes parámetros (Bosch, 2002; Vallespi y cols, 1999):
• Estadios clínicos de RAI.
• Estadios clínicos de Binet.
• Cifra de linfocitos en sangre periférica. Estratificando los pacientes en
dos grupos según los valores de linfocitos en sangre periférica al
diagnóstico fuesen > o < de 30x109/L.
• Tiempo de duplicación linfocitaria. Estableciendo dos grupos en
función del tiempo en el que se produce la duplicación numérica en el
recuento de linfocitos en sangre periférica, fuese > o < de 12 meses.
• Cifras de beta-2-microglobulina.
• Cifras de LDH.
• Valores de células CD19+ en sangre periférica. Se estratifico la
población en función del valor porcentual (células CD19+ > o < del
80% de los linfocitos circulantes) y del valor absoluto (células CD19+
> o < de 20x109/L).
3.2. Obtención y preparación de la muestra
Como se ha descrito previamente la muestra utilizada en este estudio ha
sido sangre periférica. La extracción se realizó por punción venosa en región
91
antecubital. Se extrajeron 2 cc de sangre de cada paciente, introduciéndola en
un tubo que contenía como anticoagulante K2EDTA.
3.2.1. Análisis por citometría de flujo
Describimos a continuación las dos técnicas empleadas en la
preparación de la muestra para el análisis por citometría de flujo, según el
método seguido por el grupo de Orfao (Ciudad y cols, 1998).
A. Técnica de inmunofluorescencia directa para la determinación de
antígenos de superficie en sangre periférica
• El primer paso a realizar es un contaje diferencial de las células de sangre
periférica, en un contador celular hematológico automático (Technicon H3
RTX).
• Se ajustará la cantidad de muestra utilizada en función de las cifras de
leucocitos hemoperiféricos:
- 50 µl por tubo: si la cifra de leucocitos está entre 10 y 15x109/L
- 100 µl por tubo: si la cifra de leucocitos está entre 4 y 10x109/L
• Añadir el AcMo correspondiente:
- Identificar los tubos con las iniciales del nombre y los apellidos del
paciente (para evitar errores en caso de varios estudios simultáneos),
así como, los AcMo utilizados.
- El orden de los AcMo señalizados en el tubo será: en primer lugar el
marcado con el fluorocromo FITC, en segundo lugar el marcado con
PE y por último el tercer color.
- La cantidad de AcMo es de 10 µl independientemente de la casa
comercial utilizada.
- Al añadir el AcMo, llegar con la pipeta hasta la muestra y agitar bien.
Si estamos trabajando con una batería de tubos, tener la precaución
de cambiar de pipeta cada vez que cambiemos de AcMo.
• Incubar a temperatura ambiente y en oscuridad durante 15 minutos.
92
• Añadir la solución lisante, FACS Lysing, diluida con agua destilada a razón
de 1/10:
- 2 ml si la cantidad de muestra de sangre periférica que hemos
utilizado ha sido de 50 µl
- 4 ml si la cantidad de muestra que hemos utilizado ha sido de 100 µl.
• Agitar bien con una pipeta Pasteur cada tubo.
• Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad.
• Centrifugar 5 minutos a 2000 r.p.m.
• Desechar el sobrenadante y lavar con 4 ml de PBS, centrifugando a 2000
r.p.m. durante 5 minutos.
• Desechar el sobrenadante y reconstituir con 200 µl de PBS.
• Adquirir la muestra en el citómetro en las próximas 3 horas; en caso de
tardar en la lectura, mantener a temperatura ambiente y en oscuridad.
B. Técnica de inmunofluorescencia directa para la determinación de
antígenos y cadenas ligeras de inmunoglobulinas kappa/lambda de
superficie
• En primer lugar se realiza un contaje diferencial de las células de sangre
periférica en un contador celular hematológico automático (Technicon H3
RTX).
• Se ajustará la cantidad de muestra utilizada en función de las cifras de
leucocitos hemoperiféricos:
- 100 µl por tubo: si la cifra de leucocitos está entre 10 y 15x109/L
- 200 µl por tubo: si la cifra de leucocitos está entre 4 y 10 x109/L
• Realizar dos lavados con PBS; para ello llenar el tubo de PBS y centrifugar
a 2000 r.p.m. durante 5 minutos y decantar.
• Añadir 2 ml de PBS a cada tubo e incubar a 37º C en baño maría durante
30 minutos (teniendo la precaución de tapar el tubo).
• Centrifugar durante 5 minutos a 2000 r.p.m. y decantar (desechar todo el
sobrenadante).
• Realizar un lavado con PBS, para ello llenar el tubo de PBS y centrifugar a
2000 r.p.m. durante 5 minutos y decantar.
93
• Añadir el AcMo correspondiente:
- Identificar los tubos con las iniciales del nombre y los apellidos del
paciente (para evitar errores en caso de varios estudios simultáneos),
así como, los AcMo utilizados.
- El orden de los AcMo señalizados en el tubo será: en primer lugar el
marcado con el fluorocromo FITC, en segundo lugar el marcado con
PE y por último el tercer color.
- La cantidad de AcMo varía según el marcador: cadenas ligeras
kappa/lambda (Becton Dickinson): 5 µl; CD19 (Becton Dickinson):
10 µl.
- Al añadir el AcMo llegar con la pipeta hasta la muestra y agitar bien.
Si estamos trabajando con una batería de tubos, tener la precaución
de cambiar de pipeta cada vez que cambiemos de AcMo.
• Incubar la muestra 15 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad.
• Añadir la solución lisante, FACS Lysing, diluida con agua destilada a razón
de 1/10:
- 2 ml si la cantidad de muestra de sangre periférica que hemos
utilizado ha sido de 100 µl.
- 4 ml si la cantidad de muestra que hemos utilizado ha sido de 200 µl.
• Agitar bien con una pipeta Pasteur cada tubo.
• Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad.
• Centrifugar 5 minutos a 2000 r.p.m.
• Desechar el sobrenadante y lavar con 4 ml de PBS, centrifugando a 2000
r.p.m. durante 5 minutos.
• Desechar el sobrenadante y reconstituir con 200 µl de PBS.
• Adquirir la muestra en el citómetro en las próximas 3 horas; en caso de
tardar en la lectura mantener a temperatura ambiente y en oscuridad.
3.2.2. Análisis por microscopia óptica
El estudio morfológico se ha llevado acabo en extensión de sangre
periférica realizada mediante técnica manual, utilizando el método de los dos
94
portaobjetos. Este es el procedimiento de elección en la práctica clínica y
consiste en extender una gota fina de sangre sobre un portaobjetos (25 x 75
mm) mediante el canto esmerilado de otro portaobjetos de iguales
dimensiones. Para ello se recomienda seguir el método siguiente:
• Colocar una pequeña gota de sangre (aproximadamente 5 µL) de no más
de 3 mm de diámetro, sobre la superficie de un portaobjetos a 2 cm
aproximadamente de uno de sus extremos.
• Colocar el canto de otro portaobjetos esmerilado por la zona anterior a la
gota de sangre sobre la superficie del primer portaobjetos, formando un
ángulo de aproximadamente 45º, y desplazarlo suavemente hacia atrás
hasta que alcance la gota de sangre.
• Esperar a que por capilaridad toda la sangre se distribuya de manera
uniforme. Es aconsejable que la sangre no llegue a los lados del
portaobjetos sobre el que se realizará la extensión.
• Deslizar suavemente y a velocidad moderada un portaobjetos sobre el otro
en sentido longitudinal, hasta que la gota de sangre quede bien extendida
sobre la superficie del primer portaobjetos.
• Secado de la extensión a temperatura ambiente y en posición horizontal.
3.3. Técnicas de inmunofenotipaje celular para análisis en citómetro de
flujo
3.3.1. Control de calidad
Se ha realizado un control de calidad, tanto en la fase preanalítica como
en la analítica, estableciendo unos criterios claros y estrictos con el fin de
garantizar la fiabilidad de los resultados.
95
A. Fase preanalítica
• Solicitud de las pruebas. La petición para la realización de un estudio de
citometría de flujo se realiza en un formato que incluye: datos de filiación
(nombre y apellidos, edad, teléfono), número de historia clínica, hospital de
procedencia, servicio y médico peticionario, diagnóstico de sospecha
clínico, valores hemoperiféricos de hemoglobina, leucocitos y plaquetas y
origen de la muestra (sangre periférica, médula ósea, etc.).
• Obtención de la muestra. Se extrajeron 2 cc de sangre por punción venosa
en región antecubital, siguiendo la técnica estandarizada por el National
Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS,1984), y se introducirá
en un tubo que contenga como anticoagulante EDTA, siguiendo las
recomendaciones del International Council for Standardization in
Haematology (ICSH, 1993).
• Identificación de las muestras. Para la aceptación de una muestra en la
Unidad de Citometría de Flujo, esta debe estar correctamente identificada
incluyendo la rotulación del nombre y apellidos en el tubo junto con el
número de clave asignado en el laboratorio. La extracción e identificación
de la muestra se realizará en la unidad de citometría de flujo, no en sala
general de extracciones, y por el personal que posteriormente realizará la
técnica de inmunofenotipaje.
• Almacenamiento de la muestra. Las muestras que no son procesadas
inmediatamente deben ser almacenadas a temperatura ambiente y tratadas
en las primeras 24 horas.
• Medio de transporte. En caso de muestras derivadas de otros hospitales el
trasporte se realizará a temperatura ambiente.
B. Fase analítica
• Patrones de calidad de los reactivos. Los fluorocromos utilizados en CMF
deben presentar las siguientes características:
96
- Alto coeficiente de extinción a la longitud de onda de excitación
(probabilidad de absorber la luz).
- Alto rendimiento cuántico (emisión de luz).
- Elevada fotoestabilidad.
- Corto estado de excitación.
• Sistema de calibración. La calibración es el proceso por el cual se enfoca
ópticamente el láser y se mide su potencia. Como sistema de calibración se
ha utilizado el método seguido por el grupo de Orfao (Cuidad y cols, 1998),
utilizando sangre periférica para ajustar la autofluorescencia natural de las
células sanguíneas. A continuación se describe la técnica de calibración
utilizada para el citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson):
1. En primer lugar se describen los tubos, con los AcMo y
fluorocromos, necesarios para la realización del proceso:
- Control isotípico negativo con inmunoglobulinas de ratón: FITC /
PE / PerCP.
- CD22 FITC/CD8 PE
- CD8 PE
- CD8 PerCP
- CD3 FITC / CD8 PE / CD4 PerCP
- CD22 FITC / CD8 PE / CD4 PerCP
2. En el sistema informático seleccionamos el programa Cell Quest.
3. Se crean cuatro histogramas que serán útiles en los siguientes
pasos de la técnica:
- Eje de X= FSC, eje de Y= SSC.
- Eje de X= FSC.
- Eje de X= FL1-H, eje de Y= FL2-H.
- Eje de X= FL2-H, eje de Y= FL3-H.
4. Abrir en Inst-control los detectores, parámetros amplificadores,
umbral (threshold) y compensación:
97
- Detectores (voltaje): fijar los diferentes parámetros en su valor
mínimo (150).
- Parámetros amplificadores (Amp Gain): comprobar que los
parámetros FL1, FL2 y FL3 están en escala logarítmica y el resto
en escala lineal. Fijar los diferentes parámetros en su valor
mínimo (1).
- Umbral (Threshold): Seleccionar el parámetro FSC y dar un valor
cercano a 50.
- Compensación: Dejar todos los valores al mínimo (0).
5. Adquirir sin grabar los resultados (set-up) a velocidad alta, un tubo
de sangre lisada sin marcadores de superficie.
6. En el histograma de FSC al principio la imagen sale pegada al eje de
las Y, aumentar su señal en su correspondiente parámetro
amplificador (amp gain) hasta obtener una imagen correcta.
7. Cambiamos el parámetro seleccionado en el histograma a SSC.
Aumentamos la señal de su detector (voltaje) hasta obtener la
imagen correcta.
8. Establecer una región en el área de linfocitos.
9. Cambiamos el parámetro seleccionado en el histograma a FL1-H.
Aumentamos la señal de su detector (voltaje) hasta obtener la
imagen correcta.
10. Cambiamos el parámetro seleccionado en el histograma a FL2-H.
Aumentamos la señal de su detector (voltaje) hasta obtener la
imagen correcta.
11. Cambiamos el parámetro seleccionado en el histograma a FL3-H.
Aumentamos la señal de su detector (voltaje) hasta obtener la
imagen correcta.
12. Debemos comprobar que el ajuste realizado para las áreas
negativas de las fluorescencias FL1-H, FL2-H y FL3-H es
adecuado. Para ello, hay que hacer un estudio estadístico en el
sistema informático del CMF, y comprobar que las áreas negativas
98
tienen unas medias de fluorescencia entre dos y tres, en caso
contrario hay que ajustar la señal.
13. Cerrar las ventanas de los detectores, parámetros amplificadores y
umbral, dejando abierta sólo la ventana señalada como
compensación.
14. Seleccionar el histograma en el cual el eje de X= FL1-H, eje de Y=
FL2-H y adquirir sin grabar los resultados (set-up) a velocidad alta
el tubo CD22 FITC / CD8 PE; en este proceso se elimina del
detector de fluorescencia FL1-H la señal correspondiente a FL2-H
cuya luz no debe recogerse ni leerse en ese detector y viceversa,
se elimina de FL2-H la señal de fluorescencia de FL1-H.
15. Seleccionar el histograma en el cual el eje de X= FL2-H, eje de Y=
FL3-H y adquirir sin grabar los resultados (set-up) a velocidad alta
el tubo CD8 PE; en este proceso se elimina del detector de
fluorescencia FL3-H la señal correspondiente a FL2-H cuya luz no
debe recogerse ni leerse en ese detector.
16. Seleccionar el histograma en el cual el eje de X= FL2-H, eje de Y=
FL3-H y adquirir sin grabar los resultados (set-up) a velocidad alta
el tubo CD8 PerCP; en este proceso se elimina del detector de
fluorescencia FL2-H la señal correspondiente a FL3-H cuya luz no
debe recogerse ni leerse en ese detector.
17. Seleccionar los histogramas:
- Eje de X= FL1-H, eje de Y= FL2-H.
- Eje de X= FL2-H, eje de Y= FL3-H.
- Adquirir sin grabar los resultados (set-up) a velocidad alta los
tubos CD3 FITC / CD8 PE / CD4 PerCP y CD22 FITC / CD8 PE /
CD4 PerCP, para comprobar que las compensaciones son
correctas.
- Guardar los valores para utilizarlos en posteriores adquisiciones
de estudios de citometría de flujo.
99
• Control de calidad interno. El control de calidad se ha realizado mediante la
utilización de especímenes de control y el empleo de un sistema que nos
permita establecer la exactitud de la técnica:
- Especímenes de control.
� Control negativo. Se ha utilizado el control isotípico negativo
con inmunoglobulinas de ratón en los fluorocromos FITC, PE y
PerCP (Becton Dickinson, Mountain View, California).
� Control positivo. Como control positivo se ha utilizado el tubo
CD3-FITC / CD8-PE / CD4-PerCP, ya que en todas las
muestras de los pacientes con LLC-B debe existir una
población residual de linfocitos T y dentro de ellos las
subpoblaciones CD4+ y CD8+.
- Control de exactitud. Como control interno de medida de exactitud se ha
utilizado la población residual de linfocitos T presentes en la sangre
periférica de los pacientes con LLC-B. Para ello se ha calculado la
diferencia entre dos marcadores que miden la misma población de
linfocitos T, incluidos en dos tubos diferentes (tubo 1: CD5-FITC / CD19-
PE y tubo 2 CD3-FITC / CD8-PE / CD4-PerCP), de forma que
(CD5+/CD19 -) – (CD3+) = ± 5%
3.3.2. Metodología seguida: combinaciones de anticuerpos monoclonales y fluorocromos
A continuación se describen los distintos AcMo utilizados para la
realización del inmunofenotipaje celular por CMF:
Número de CD AcMo Procedencia
CD2 S5.2 Becton Dickinson
CD3 SK7 Becton Dickinson
CD4 SK3 Becton Dickinson
CD5 L17F12 Becton Dickinson
CD8 SK1 Becton Dickinson
100
Número de CD AcMo Procedencia
CD10 W8E7 Becton Dickinson
CD11c S-HCL-3 Becton Dickinson
CD19 4G7 Becton Dickinson
CD20 L27 Becton Dickinson
CD22 S-HCL-1 Becton Dickinson
CD23 EBVCS-5 Becton Dickinson
CD25 2A3 Becton Dickinson
CD45 2D1 Becton Dickinson
CD79beta SN8 Dako
CD103 Ber-ACT8 Dako
Anti-kappa TB28-2 Becton Dickinson
Anti-lambda 1-155-2 Becton Dickinson
No-CD FMC7 Dako
Control Ig de ratón X40 Becton Dickinson
La sistemática utilizada para el análisis de la expresión antigénica en la
superficie celular fue la aplicación de triple marcaje. Los AcMo conjugados con
los fluorocromos FITC, PE y PerCP, se combinaron para obtener una buena
discriminación de la población tumoral, para ello, el AcMo CD19 se incluyó
sistemáticamente en todos los tubos. Así mismo, en todos los casos se utilizó
un control isotípico negativo (AcMo contra antígenos de ratón no expresado por
células humanas) y un control positivo formado por CD4 / CD8 / CD4.
A continuación describimos las combinaciones de los AcMo y
fluorocromos utilizados en los distintos tubos:
1. Control negativo de la técnica de inmunofluorescencia directa
para la determinación de antígenos de superficie.
2. CD5 FITC / CD19 PE / CD45 PerCP
3. CD22 FITC / CD23 PE / CD19 PerCP
4. FMC7 FITC / CD11c PE / CD19 PerCP
5. CD79Beta FITC / CD19 PE / CD45 PerCP
6. CD2 FITC / CD19 PE / CD45 PerCP
101
7. CD25-FITC / CD19-PE / CD45 PerCP
8. CD3 FITC / CD8 PE / CD4 PerCP
9. Control negativo de la técnica de inmunofluorescencia directa
para la determinación de cadenas ligeras de inmunoglobulinas
Kappa/Lambda.
10. Anti-Kappa FITC / Anti-Lambda-PE / CD19 PerCP
En aquellos casos que el análisis inmunofenotípico ofrezca dudas
diagnósticas, se ampliará el panel de AcMo añadiendo los siguientes tubos:
11. CD10 FITC / CD19 / CD20 PerCP
12. CD103 FITC / CD19 PE / CD20 PerCP
Debido a que el origen tumoral de la proliferación linfocitaria viene
determinada por la expresión de una única cadena ligera de inmunoglobulina
(kappa o lambda) en la superficie celular y a las implicaciones diagnósticas que
ello conlleva, se ha utilizado un reactivo que contiene ambas cadenas ligeras,
conjugadas con distintos fluorocromos, en su composición, evitando errores
técnicos que llevarían a un diagnóstico incorrecto.
3.3.3. Proceso de adquisición de la muestra
El proceso de adquisición de la muestra consiste en hacer pasar las
células alineadas y de una en una por delante de un haz luminoso. Para ello,
se utiliza un sistema de inyección mediante el cual las células a analizar son
introducidas en el centro de un flujo de líquido isotónico que es impulsado a
gran velocidad a salir por un orificio estrecho. La diferencia de presión existente
entre la parte central del flujo (muestra a analizar) y la porción periférica del
mismo (líquido isotónico) es regulada por el operador. La interacción de las
células con el rayo luminoso genera señales que se llevan a los detectores
adecuados. Las señales luminosas detectadas se transforman en impulsos
102
eléctricos, que se amplifican y se convierten en señales digitales que se
procesan en un ordenador.
La adquisición se realizó en un citómetro de flujo FACScan (Becton
Dickinson) y el programa utilizado fue CellQuest (Becton Dickinson). La
sistemática aplicada en este proceso fue la siguiente:
• Selección de una velocidad de adquisición alta.
• Conexión del programa informático con el citómetro de flujo.
• Abrir la plantilla de adquisición previamente elaborada que incluye los
siguientes histogramas:
- Eje de X=FSC-H, eje de Y= SSC-H.
- Eje de X= FL1-H, eje de Y= SSC-H.
- Eje de X= FL2-H, eje de Y= SSC-H.
- Eje de X= FL3-H, eje de Y= SSC-H.
- Eje de X= FL1, eje de Y= FL2-H-H.
- Eje de X= FL1, eje de Y= FL3-H.
- Eje de X= FL2, eje de Y= FL3-H.
• Introducir los parámetros de la calibración.
• Elegir el lugar donde se almacenará la información.
• Identificar la muestra que se va a adquirir (número de estudio e iniciales
del nombre y apellidos del paciente).
• Seleccionar el panel previamente elaborado para el estudio de los
SLPC.
• El proceso de adquisición de la muestra se realiza en dos pasos:
- Se adquieren 10.000 células correspondientes a la población total.
- Seleccionar la población CD19+, para lo cual, se establece una
ventana para las células CD19+ en el histograma X: CD19, Y: SSC, y
se adquirieren 10.000 eventos. En el tubo CD3-FITC / CD8-PE /
CD4- PerCP la ventana se realiza en las células CD3+ del
histograma X: CD3, Y: SSC, se adquieren, así mismo, 10.000
eventos.
103
Al finalizar el proceso de adquisición la información está almacenada
en el sistema informático, donde posteriormente podrá ser analizada.
3.3.4. Análisis de los datos
El análisis de los datos se realizó con el programa Paint-A-Gate Pro
(Becton Dickinson), incluyendo la opción de transformación polinomial de los
valores del SSC, que permite una mejor definición de las células leucémicas de
acuerdo con las propiedades de dispersión de la luz de estas.
El análisis multiparamétrico se basó en la combinación de parámetros
que permitieran la identificación de las células blásticas y de los linfocitos B y T
normales residuales; para ello se establecieron los siguientes histogramas:
1. Eje de X=FSC-H, eje de Y= SSC-H.
2. Eje de X= FL1-H, eje de Y= SSC-H.
3. Eje de X= FL2-H, eje de Y= SSC-H.
4. Eje de X= FL3-H, eje de Y= SSC-H.
5. Eje de X= FL1, eje de Y= FL2-H-H.
6. Eje de X= FL1, eje de Y= FL3-H.
7. Eje de X= FL2, eje de Y= FL3-H.
En el primer histograma constituido con la intensidad de dispersión de la
luz en sentido frontal (FSC) y lateral (SSC), se analizan los leucocitos de
sangre periférica, las células pequeñas y no granulares (linfocitos) se
agruparán en un lugar cercano al origen de ambos ejes; las células grandes y
granulares (polimorfonucleares) se ubicarán, por el contrario, lejos del origen
de ambos ejes; una tercera población de tamaño y granularidad intermedia
(monocitos) se localizará entre las dos poblaciones anteriores.
Sin necesidad de preparar poblaciones enriquecidas en linfocitos, puede
definirse una “ventana” electrónica que “aísle” a esta población leucocitaria y
condicionar que la detección de fluorocromos se limite a ella. Los histogramas
restantes detectarán solamente los eventos contenidos en la “ventana”
104
correspondiente a los linfocitos: el histograma de fluorescencia verde (FL1)
permite la cuantificación del porcentaje de células a las que se unió un AcMo
conjugado con un fluorocromo que emite luz verde; el histograma de
fluorescencia naranja (FL2) permite la cuantificación de las células a las que se
unió un AcMo conjugado con un fluorocromo que emite luz de este color. El
histograma de doble fluorescencia permite además conocer la proporción de
células a las que se unieron de forma simultánea ambos AcMo. Este tipo de
análisis bidimensional es importante para cuantificar ciertas poblaciones
celulares que sólo son definibles por la expresión simultanea de más de un
antígeno en su membrana.
El análisis de los datos obtenidos mediante citometría de flujo
proporciona para cada célula dos tipos de información: cualitativa y cuantitativa.
Así, cuando se analiza en una célula la reactividad para un determinado AcMo
específico para un antígeno, se obtiene información sobre la presencia del
epítopo del antígeno en la célula y sobre su nivel de expresión (número de
moléculas por célula).
Cuando se consideran poblaciones celulares, la citometría de flujo añade
a la información anterior datos sobre la homogeneidad o heterogeneidad de las
medidas. Como consecuencia de lo expuesto, el programa informático permite
además visualizar directamente las poblaciones celulares, obtener información
numérica objetiva, en forma de porcentajes, valores medios o medidas de
dispersión como la desviación estándar y el coeficiente de variación obtenido
para los eventos estudiados.
El proceso de análisis se realizó en cuatros pasos consecutivos:
1. Cuantificar las distintas poblaciones leucocitarias en el histograma
FSC/SSC, tras excluir las células de desecho y los agregados (figura
3.1).
105
Figura 3.1. Cuantificación de las poblaciones leucocitarias en sangre periférica, en un paciente afecto de LLC-B. Rojo: linfocitos (75%). Verde: monocitos (3%). Azul: neutrófilos (22%).
2. Abrir una “ventana” electrónica en la población linfoide, definida en el
histograma anterior (figura 3.2).
Figura 3.2. Ventana electrónica en área de linfocitos.
3. Calcular los porcentajes de las distintas poblaciones linfocitarias en
esta área seleccionada: linfocitos B tumorales, linfocitos B normales,
linfocitos T y subpoblaciones T (Figura 3.3).
106
Figura 3.3. Triple marcaje para la identificación de las poblaciones linfocitarias en un paciente
con LLC-B. Rojo: linfocitos B (79%). Verde: linfocitos T (16%).
4. Abrir una “ventana” electrónica en la población a estudio y analizar
las positividades de los distintos AcMo e intensidad de expresión de
los mismos (figura 3.4).
Figura 3.4. Selección linfocitos B. Rojo: linfocitos B con coexpresión de CD19/CD5 (99,5%).
Verde: linfocitos B con positividad para CD19 y negatividad para CD5 (0,5%).
107
3.3.5. Criterios de positividad e intensidad de expresión para un antígeno
El análisis de los distintos antígenos expresados en la superficie celular
suele ser cuantitativo y definido en base a la positividad o negatividad de los
mismos. Para un análisis más completo y exhaustivo de los antígenos celulares
se han incluido los siguientes parámetros:
- Estudio del número de moléculas de un antígeno expresadas en cada célula
o intensidad de expresión. Esta información se puede obtener a través de
dos métodos:
1. Intensidad de fluorescencia media (MFI). Corresponde a los canales
medios de fluorescencia para la población positiva. Para realizar esta
determinación de forma correcta, a la fluorescencia medida en el
área positiva hay que sustraerle la fluorescencia del control negativo
medido en las mismas condiciones. Se establecieron distintos puntos
de corte, de forma arbitraria, para establecer las intensidades de
expresión débil, modera y fuerte para cada marcador.
2. Escala logarítmica de fluorescencia (ELF). Se determina en base a
los valores logarítmicos expresados en los histogramas de las
fluorescencias, definiéndose tres intensidades:
Débil: cuando el pico de positividades coincide con el primer percentil
logarítmico.
Moderado: cuando el pico de positividad coincide con el segundo
percentil logarítmico.
Fuerte: cuando el pico de positividad coincide con el tercer percentil
logarítmico.
- Patrón de dispersión del antígeno. Es la determinación de la
homogeneidad o heterogeneidad en la expresión del antígeno. Esta
información se puede obtener a través de dos métodos:
1. Coeficiente de variación (CV). Determina la dispersión en la
intensidad de expresión de un antígeno para las distintas
108
partículas que constituye la población celular a estudio. Se
establecieron distintos puntos de corte, de forma arbitraria, para
establecer el patrón de distribución homogéneo o heterogéneo
para cada marcador.
2. Escala logarítmica de fluorescencia (heterogéneo-homogéneo).
Un antígeno se considera homogéneo cuando su nivel de
expresión es inferior a una década de logaritmo en la escala de
intensidad de fluorescencia y heterogénea si es superior a dicha
medida.
- Determinación del porcentaje de células que expresan un marcador, de
forma independiente al concepto de positividad o negatividad del mismo,
es decir analizar cada antígeno como variables continuas
De acuerdo con lo expuesto, en este trabajo se han analizado para cada
marcador los siguientes parámetros:
• Positividad o negatividad del marcador. Un antígeno se considera
positivo si se expresa en más del 20% de las células tumorales,
señalizándose con la sigla +, y negativo si es inferior a dicho
porcentaje, señalizándose con la sigla -.
• Intensidad de expresión del antígeno. Determinada como MFI y en
escala logarítmica (ELF).
• Patrón de distribución del antígeno Determinada como CV y en
escala logarítmica (heterogéneo-homogéneo).
• Porcentajes de células que expresan un antígeno.
3.3.6. Criterios de identificación de las poblaciones celulares
La definición de las distintas poblaciones celulares se ha realizado de
acuerdo a la composición antigénica de la membrana celular, para ello como ya
se ha expuesto previamente, se ha utilizado una amplia batería de AcMo que
ha permitido identificar no solo la población tumoral sino también las células
109
normales residuales presentes en la sangre periférica de estos pacientes. Las
poblaciones linfocitarias vienen definidas por:
• Linfocito de estirpe B. Identificado por la positividad para el AcMo CD19.
• Linfocito de estirpe B normal residual. Cuya caracterización antigénica
es la siguiente:
- CD19 positivo
- CD5 negativo
- CD22 positivo moderado-fuerte
- Positividad para las cadenas ligeras de superficie kappa y lambda de
intensidad moderada-fuerte.
• Linfocito de estirpe B tumoral. Desde el punto de vista inmunofenotípico,
se define al linfocito B leucémico por la expresión monoclonal de las
cadenas ligeras de inmunoglobulina, kappa o lambda, en su superficie
celular, utilizando los criterios de monoclonalidad establecidos por Taylor
(1979) en base al cociente entre las cadenas ligeras kappa y lambda: ratio
κ:λ ≥3 y ratio λ:κ ≥ 2.
• Linfocito B tumoral perteneciente a la LLC. Para el diagnóstico
diferencial entre la LLC y otros SLPC de estirpe B se han utilizado, de
acuerdo con el sistema de puntuación establecido por Matutes (Matutes y
cols, 1994; Moreau y cols, 1997), los siguientes AcMo:
- CD23: positividad o negatividad.
- FMC7: positividad o negatividad.
- CD5: positividad o negatividad.
- CD79beta, CD22: positividad o negatividad, e intensidad de
expresión.
- Cadenas ligeras de superficie: intensidad de expresión.
Además se ha incluido el AcMo CD11c ya que aporta una información adicional
en el diagnóstico diferencial.
• Linfocitos de estirpe T. Los linfocitos T se han definido de acuerdo con la
expresión de los siguientes AcMo:
- CD3 positivo.
110
- CD2 positivo con negatividad para el CD19.
- CD5 positivo con negatividad para el CD19.
• Subpoblaciones linfocitarias T. Identificadas por la expresión de los
antígenos CD4 y CD8.
3.4. Identificación morfológica de la población linfoide mediante técnicas
de microscopia óptica
La clasificación de los distintos tipos de linfocitos tumorales se ha
realizado de acuerdo con las recomendaciones establecidas por el Grupo
Cooperativo Franco-Americano-Británico (FAB), sobre la base de determinadas
características morfológicas que se describen a continuación (Bennett y cols,
1989):
• Linfocitos pequeños: tamaño < 14 µm (< 2 hematíes), cromatina nuclear
densa y cuarteada de contorno regular, nucléolo ausente y escaso
citoplasma.
• Linfocitos grandes: tamaño > 14 µm (> 2 hematíes), cromatina nuclear
densa, nucléolo ausente o muy pequeño y mal definido, y citoplasma
relativamente abundante.
• Prolinfocitos: tamaño > 14 µm (> 2 hematíes), cromatina nuclear densa,
nucléolo central y prominente, y variable cantidad de citoplasma.
• Linfocitos hendidos: tamaño 7 - 14 µm, cromatina homogénea y densa,
nucléolo ausente o muy pequeño y mal definido, citoplasma no visible o
escaso y una hendidura nuclear de base angular.
3.5. Método estadístico
Para el análisis estadístico de todos los pacientes de la serie y del grupo
control, se ha realizado en primer lugar una análisis descriptivo con la intención
de obtener una idea global sobre los datos de la muestra, obteniendo las
medidas de centralización media, rango, desviación estándar y error estándar
111
de la media para las variables cuantitativas, y tablas de frecuencias para las
variables categóricas junto con gráficos de barras para la expresión de
frecuencias o porcentajes.
La tabla de registros fue analizada con la ayuda de los programas
informáticos SPSS y Epiinfo versión 6.0, mediante el análisis de comparación
de medias para variables independientes, comparación de proporciones y
estudio de correlación. Se aceptó una significación estadística cuando el error
alfa era menor de 0.05.
En el análisis descriptivo bivariante dependiendo del tipo de variable, se
han utilizado los siguientes tests:
• Variables cuantitativas: t-student o análisis de varianza cuando
podía asumirse una distribución normal y Kruskal Wallis en otros
casos.
• Variables categóricas: test de Chi cuadrado. Se han tenido en
cuenta las condiciones de validez del test.
Para el estudio estadístico fue preciso categorizar algunas variables para
permitir el análisis comparativo, definiéndose los siguientes grupos:
� Edad al diagnóstico
Pacientes con edad menor o igual a 60 años.
Pacientes mayores de 60 años.
� Intensidad de expresión antigénica (MFI)
Antígenos con intensidad de expresión débil.
Antígenos con intensidad de expresión moderada.
Antígenos con intensidad de expresión fuerte.
112
� Patrón de dispersión antigénica (CV)
Antígenos con patrón homogéneo.
Antígenos con patrón heterogéneo.
� Población linfoide T en los pacientes con LLC-B
Pacientes con valores de subpoblaciones T superiores a la
media del grupo control.
Pacientes con valores de subpoblaciones T inferiores a la media
del grupo control.
� Cifras de linfocitos en sangre periférica
Cifras de linfocitos inferiores a 30x109.
Cifras de linfocitos superiores a 30x109.
� Cifras de células CD19+ en sangre periférica
Células CD19+ < 20x109.
Células CD19+ < 20x109.
Células CD19+ < 80%.
Células CD19+ > 80%.
114
1. CARACTERÍSTICAS DE LOS PACIENTES INCLUIDOS EN EL ESTUDIO
1.1. Características clínicas
Se incluyeron 115 pacientes diagnosticados de LLC-B en el Servicio de
Hematología del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Victoria de Málaga,
entre Octubre de 1996 y Junio de 2001; la edad media fue de 66 años (29-84) y la
distribución por sexo de 64 (55,7%) varones y 51 (44,3%) mujeres, con un ratio de
1.3:1 (figuras 4.1 y 4.2). La incidencia de la LLC-B en nuestra área poblacional se
cifró en 3,5 casos nuevos por 100.000 habitantes y año.
Respecto al motivo de consulta, 2/3 de los pacientes fueron derivados a las
consultas externas de hematología por presentar anormalidades en la analítica de
rutina, aunque se encontraban asintomáticos. En el resto de los casos la astenia,
anorexia (16,7%) y los procesos infecciosos de repetición (12%) fueron las
manifestaciones más frecuentes que llevaron al diagnóstico de cuadro leucémico
(tabla 4.1).
En la exploración inicial no se detectaron afectación de territorios
adenopáticos en el 66,7% de los casos, mientras que el 22.2% presentaban
afectación de un solo territorio. La presencia de visceromegalias se objetivó en el
30,9% de los pacientes, siendo el bazo el órgano más frecuentemente afectado
(tabla 4.2).
El estadiaje clínico se realizó utilizando las clasificaciones de Rai y de Binet.
Como se observa en la tabla 4.3, según la clasificación de Rai el 51.3% de los
pacientes estaban en el grupo de bajo riesgo (0), el 42,6% en el grupo de riesgo
intermedio (I-II) y el 6,1% en alto riesgo (III-IV). En la clasificación de Binet, el
grupo de bajo riesgo (A) representó el 88.7% de los casos, el grupo de riesgo
intermedio (B) el 7% y el grupo de alto riesgo el 4.3%. Estos datos indican que la
115
mayor parte de los pacientes se diagnosticaron en fases iniciales de la
enfermedad.
1.2. Características hematológicas
En la tabla 4.4.A se muestran las características hematológicas generales
de los pacientes incluidos en el estudio, observándose importantes cambios en la
serie blanca, mientras que las series roja y megacariocítica están escasamente
afectadas. Los pacientes presentaban unas cifras de hemoglobina dentro de la
normalidad en el 87% de los casos (100 pacientes) y tan solo un 13% (15
pacientes) mostraban anemia. Respecto al recuento de plaquetas, un 3% de los
pacientes presentaban trombocitopenia con cifras inferiores a 100 x 109/L y por
encima de dicho valor obtuvimos el 97% de los casos (112 pacientes).
En lo que se refiere al recuento leucocitario, el 99,2% de los casos
presentaban valores anormales con cifras superiores a 10 x 109/L y tan solo 1
paciente estaba dentro de la normalidad. Así mismo, es de reseñar la gran
variabilidad en los valores de este parámetro con un rango que oscila entre un
límite inferior de 10 y uno superior de 556 x 109/L. La distribución de los pacientes
según el recuento leucocitario y linfocitario, muestra que el 68,7% presentaba < 30
x 109/L leucocitos y el 71,4% < 30 x 109/L linfocitos al diagnóstico (tabla 4.4.B).
Finalmente, evaluamos el tiempo de duplicación linfocitaria (tiempo en el que se
produce la duplicación numérica en el recuento de linfocitos en sangre periférica),
siendo este mayor de 12 meses en el 84,2% (tabla 4.4.C).
1.3. Características bioquímicas e inmunológicas
La tabla 4.5.A muestra los valores medios de los parámetros bioquímicos e
inmunológicos estudiados. Cuando se clasifican en función de la normalidad o
anormalidad de los resultados obtenidos, se observaron valores patológicos de β2-
116
microglobulina en más de la mitad de los pacientes, mientras que tan solo
presentaban cifras anormales de LDH y positividad para el test de Coombs directo
el 18% y 12% de los casos respectivamente. Además se encontró una función
hepática alterada en un porcentaje significativo de pacientes (tabla 4.5.B).
Respecto a las cifras de inmunoglobulinas, éstas se hallaron descendidas,
en algún momento de la evolución, en el 50.4% (58 pacientes) siendo el isotipo
más frecuentemente afectado la IgM (50%), seguido por IgA (26%) e IgG (24%). El
aumento de las mismas se detectó en el 12,1% de los casos (14 pacientes),
presentando componente monoclonal tan solo 3 pacientes (figura 4.3).
1.4. Características farmacológicas
De los 115 pacientes incluidos en el estudio, tan solo 15 (13%) recibieron
tratamiento quimioterápico, aunque este fue suspendido al menos 3 meses antes
de la inclusión en el estudio. El esquema terapéutico más frecuentemente
empleado fue la asociación de Clorambucil y Prednisona en pauta discontinua
(tabla 4.6). Ningún paciente había recibido tratamiento con análogos de las
purinas.
Figura 4.1. Distribución de los pacientes en función de la edad
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
14-50 años 51-60 años >60 años
Figura 4.2. Distribución de los pacientes en función del sexo
Varones56%
Mujeres44%
117
Tabla 4.1
Distribución de casos según el motivo de consulta
Frecuencia Porcentaje
(n=115)
Porcentaje válido
(n=108)
Porcentaje acumulado
Análisis de
rutina 73 63,5 67,6 67,6
Síndrome
constitucional 18 15,7 16,7 84,3
Infección 13 11,3 12,0 96,3
Anemia 2 1,7 1,9 98,1
Otros 2 1,7 1,9 100
Total 108* 93,9 100 100
*Nota: en 7 pacientes se desconocía el motivo de consulta
118
Tabla 4.2
Número de territorios adenopáticos afectados y presencia de visceromegalia en la exploración inicial
Frecuencia Porcentaje
(n=115)
Porcentaje válido
(n=108)
Porcentaje acumulado
0 72 62,6 66,7 66,7
1 24 20,9 22,2 88,9
2 7 6,1 6,5 95,4
4 2 1,7 1,9 97,2 5 2 1,7 1,9 99,1
6 1 0,9 0,9 100
Total 108 93,9 100 100
*Nota: en 7 pacientes no constaban estos datos en la Historia Clínica
Pacientes* Incidencia Porcentajes
Esplenomegalia 113 34 30,1% Hepatomegalia 113 14 12,4%
*Nota: en 2 pacientes no constaban estos datos en la Historia Clínica
119
Tabla 4.3 Clasificación de los pacientes según el estadio clínico al diagnóstico
A. Estadios clínicos de RAI
Frecuencia Porcentaje Porcentaje acumulado
0 59 51,3 51,3
I 20 17,4 68,7
II 29 25,2 93,9
III 4 3,5 97,4 IV 3 2,6 100
Total 115 100 100
B. Estadios clínicos de Binet
Frecuencia Porcentaje Porcentaje acumulado
A 102 88,7 88,7
B 8 7,0 95,7 C 5 4,3 100
Total 115 100 100
120
Tabla 4.4
Características hematológicas de los pacientes
A. Parámetros hematimétricos de los pacientes incluidos en el estudio
Parámetros m ± DEM
Mínimo Máximo
Leucocitos (x109/L) 35,84 ± 57,03 10 556 Linfocitos (x109/L) 28,12 ± 50,88 5,5 500 Hemoglobina (g/dL) 13,5 ± 1,8 6,2 16,5 Plaquetas (x109/L) 190,11 ± 59,10 40 389
B. Distribución de los pacientes según el recuento leucocitario y
linfocitario al diagnóstico.
Grupos Leucocitos x109/L
n % Linfocitos x109/L
n %
<15 x109/L 27 23,5 31 27,0
15-30 x109/L 52 45,2 51 44,4
30-50 x109/L 20 17,4 18 15,6 >50 x109/L 16 13,9 15 13,0
C. Distribución de los pacientes según el tiempo de duplicación linfocitaria.
Tiempo de duplicación n Porcentajes
< 12 meses 16 15,8
> 12 meses 85 84,2
121
Tabla 4.5
Características bioquímicas e inmunológicas de los pacientes
A. Parámetros bioquímicos e inmunológicos de la población de pacientes incluidos en el estudio
Parámetros
m ± DEM
Mínimo - Máximo
LDH 362,7 ± 172,1 133 1330
ββββ2-microglobulina 2,9 ± 1,5 0,7 7,9
IgG 1030,9 ± 451 292 3324
IgM 99,6 ± 207,4 10 1230
IgA 176,5 ± 135,6 24 849
B. Distribución por grupos de los diferentes parámetros
bioquímicos e inmunológicos en función de la normalidad o anormalidad de los valores
Parámetros Normal n %
Patológicos n %
LDH* 93 82,3 20 17,7
ββββ2-microglobulina* 29 42,6 39 57,4
IgG 81 71,1 33 28,9
IgM 52 45,6 62 54,4
IgA 80 70,1 34 29,9 Componente monoclonal**
84 96,6 3 3,4
Test de Coombs Directo**
64 87,7 9 12,3
Función hepática 99 87,6 14 12,4
Función renal 112 97,4 3 2,6
*Valores al diagnóstico; ** Normal = negativo; patológico = positivo 122
Figura 4.3. Niveles de inmunoglobulinas en los pacientes con LLC-B
50% IgM
26% IgA
24% IgG
Igs. Normales38%
Igs. Elevadas12% Igs. Descendidas
50%
123
Tabla 4.6
Quimioterapia utilizada en los pacientes tratados y distribución de los mismos
Pacientes
Incidencia Esquema de tratamiento
Pacientes tratados n (%)
No tratados
100 ---------- -------------
Tratados 15 Clorambucil + Prednisona 11 (9,6%)
Clorambucil pauta continua
2 (1,7%)
Otros 2 (1,7%)
124
125
2. CARACTERÍSTICAS DE LOS PACIENTES EN FUNCIÓN DE LA EDAD
Todos los parámetros anteriormente descritos fueron reanalizados
distribuyendo la muestra estudiada, en función de la edad, en mayores (n=84) y
menores o iguales a 60 años (n=31).
2.1. Características clínicas en > y < de 60 años
Los pacientes < de 60 años representaron el 27% de la población
leucémica general. La distribución por sexos en ambos grupos, mostró que en los
> de 60 años los hombres representaban el 52% (ratio 1.1:1), mientras que en el
grupo de < de 60 años el porcentaje aumenta al 65% (ratio: 1.8:1), sin que estas
diferencias alcanzasen significación estadística (figura 4.4 y 4.5).
Al igual que la población total, el motivo de consulta más frecuente fue el
hallazgo de anormalidades en la analítica de rutina, sin diferencias entre los
grupos etarios. Sin embargo, la consulta por síndrome constitucional fue
significativamente más frecuente en los menores de 60 años, mientras que se
observó un aumento de los procesos infecciosos, sin alcanzar significación
estadística, en el grupo de mayores de 60 años (tabla 4.7). Tampoco se
observaron diferencias significativas respecto al número de territorios
adenopáticos afectados ni en la presencia de visceromegalias entre los dos
subgrupos establecidos (tabla 4.8).
Respecto a los estadios clínicos de Rai y de Binet, aunque no se detectaron
pacientes de riesgo alto (estadios III-IV de Rai y C de Binet) en el grupo de
menores de 60 años mientras que si los hubo en el grupo de mayores de 60 años,
las diferencias entre ambos grupos no fueron significativas (tabla 4.9).
126
2.2. Características hematológicas en > y < de 60 años
Los recuentos leucocitarios y linfocitarios fueron significativamente mayores
en el grupo de pacientes < de 60 años, estando el recuento medio de linfocitos en
este grupo por encima de 30 x 109/L (x= 37,33x109/L); así mismo, los niveles de
hemoglobina fueron significativamente mayores en dicho grupo, aunque la
diferencia no es clínicamente relevante (tabla 4.10 A). Sin embargo, no hubo
diferencias respecto al tiempo de duplicación linfocitaria entre ambos grupos (tabla
4.10. B).
2.3. Características bioquímicas e inmunológicas en > y < de 60 años
En el análisis de los parámetros bioquímicos e inmunológicos globales de
los pacientes incluidos en el estudio, se observaron niveles significativamente
menores del isotipo IgM en el grupo de pacientes < de 60 años, así como, unas
cifras discretamente mayores de LDH en dicho grupo (tabla 4.11). Sin embargo, la
distribución por grupos en función de la normalidad o anormalidad de los valores
(tabla 4.12) no muestra diferencia significativas entre ambos grupos etarios,
aunque se observa un mayor porcentaje de pacientes que presentan alteraciones
de la función hepática en el grupo de < de 60 años (p= 0.07).
Figura 4.4. Distribución de los pacientes con LLC-B en función de la edad
27%
73%
< 60 años> 60 años
Figura 4.5. Distribución de los pacientes en función de la edad y sexo
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
< 60 años > 60 años
VaronesMujeres
127
Tabla 4.7
Distribución de casos según el motivo de consulta, en función de la edad
Pacientes ≤≤≤≤ 60 años Pacientes > 60 años
Motivo de
consulta Frecuencia Porcentaje Frecuencia Porcentaje
Análisis de
rutina
19 61,3 54 64,3
Síndrome
constitucional 8 25,8* 10 11,9
Infección 2 6,5 11 13,1
Anemia 0 0 2 2,4
Otros 0 0 2 2,4
Desconocido 2 5
Total 31 100 84 100
* p= 0.045
128
Tabla 4.8 Número de territorios adenopáticos afectados y presencia de visceromegalia en la exploración inicial, según la edad
Pacientes ≤≤≤≤ 60 años Pacientes > 60 años Frecuencia Porcentaje Frecuencia Porcentaje
0 20 64,5 52 61,9
1 7 22,6 17 20,2
2 1 3,2 6 7,1
4 1 3,2 1 1,2
5 1 3,2 1 1,2
6 0 0 1 1,2
Desconocido 1 3,2 6 7,1
Total 31 100 84 100
Hepatomegalia 5 16,1 9 10,7
Esplenomegalia 9 29,0 25 29,8 Diferencias NS
129
Tabla 4.9
Clasificación de los pacientes según el estadio clínico en función de la edad
Pacientes ≤≤≤≤ 60 años Pacientes > 60 años Frecuencia Porcentaje Frecuencia Porcentaje
A. Estadíos clínicos de Rai
Estadío 0 18 58,1 41 48,8
Estadío I 4 12,9 16 19,0
Estadío II 9 29,0 20 23,8
Estadío III 0 0 4 4,8
Estadío IV 0 0 3 3,6
B. Estadíos clínicos de Binet Estadío A 29 93,5 73 86,9
Estadío B 2 6,5 6 7,1
Estadío C 0 0 5 6,0
Diferencias NS
130
Tabla 4.10
Distribución de los pacientes según los parámetros hematimétricos al diagnóstico, en función de la edad
A. Parámetros hematimétricos de los pacientes incluidos en el estudio
Pacientes ≤≤≤≤ 60 años Pacientes > 60 años
m DEM m DEM
Leucocitos (x109/L) 46,76** 97,94 31,77 30,19
Linfocitos (x109/L) 37,33*** 88,64 24,44 25,43
Hemoglobina (g/dL) 14,2* 1,1 13,2 1,9
Plaquetas (x109/L) 197,74 49,64 187,25 62,30
*p=0,047 **p=0,025 ***p= 0,021
B. Distribución de los pacientes según el recuento leucocitario / linfocitario al diagnóstico y según el tiempo de duplicación linfocitaria, según la edad
Pacientes ≤≤≤≤ 60 años Pacientes > 60 años
Leucocitos x 109/L
Grupos Frecuencia Porcentaje Frecuencia Porcentaje
<15 x 109/L 8 25,8 19 22,6
15-30 x 109/L 15 48,4 37 44,0
30-50 x 109/L 3 9,7 17 20,2
>50 x 109/L 5 16,1 11 13,1
Linfocitos x 109/L
n % n %
<15 x 109/L 15 48,4 37 44,0
15-30 x 109/L 10 32,3 29 34,5
30-50 x 109/L 2 6,5 11 13,1
>50 x 109/L 4 12,9 7 8,3
Tiempo de Duplicación
n % n %
< 12 meses 5 17,9 11 15,1
> 12 meses 23 82,1 62 84,9
131
Tabla 4.11
Características bioquímica e inmunológicas en función de la edad
Pacientes ≤≤≤≤ 60 años Pacientes > 60 años m DEM m DEM
LDH 377,4 257,8 357,3* 128,6
ββββ2-microglobulina 2,5 1,2 3,1 1,6
IgG 887,8 303,9 1084,3 485,7
IgM 46,9 26,9 119,3** 239,9
IgA 148,7 88,3 186,9 148,6
* p = 0,049; ** p = 0,01
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133
134
3. CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS DE LAS LLC-B INCLUIDAS EN EL
ESTUDIO
3.1. Características fenotípicas generales
Las características fenotípicas generales de las poblaciones linfocitarias de
los pacientes con LLC-B se muestran en la tabla 4.13. Como cabría esperar, se
aprecia una inversión de la ratio linfocitos T/linfocitos B, a favor de estos últimos
(80.4%). La población B total, identificada por la expresión del Ac Mo CD19, está
formada mayoritariamente por los linfocitos B tumorales (CD19+/CD5+), que
representan un 76,9% de la celularidad linfoide. Así mismo, se identifica una
mínima población de linfocitos B (CD19+/CD5 -) y T normales residuales que
representan un 9% y un 16% respectivamente de la población linfoide de sangre
periférica. Además, es de destacar que el control de calidad interno de medida de
exactitud, rindiese valores del 1.4% de diferencia entre los recuentos realizados
con diferentes Ac Mo específicos de células T, situándose el límite superior
admitido de dicho control en el 10%.
3.2. Características fenotípicas de la población B tumoral
La distribución de los diferentes anticuerpos monoclonales, la intensidad de
expresión y el patrón de dispersión antigénica en la población tumoral se muestran
en la tabla 4.14. Así, el análisis por CMF de la expresión de antígenos de
superficie mostró que en todos los casos las células leucémicas expresaban
CD19, así como CD5, un marcador de células T. No se detectó positividad para
otros antígenos de células T (CD2 y CD3) en ningún caso de la serie.
La expresión de otros marcadores característicos de células B, como son el
CD22 y CD79Beta, fue positiva en más del 80% de los casos, mostrando una
intensidad de expresión débil y un patrón de dispersión homogéneo en la mayoría
135
de los pacientes. La evaluación de la clonalidad determinada por la expresión de
una única cadena ligera (kappa o lambda) sobre la membrana celular, mostró que
el 64,4% de los pacientes expresaban inmunoglobulinas con cadena ligera kappa
y el 35.6% restante tenía cadena ligera lambda, predominando un patrón débil y
homogéneo en las cadenas kappa, y moderado y heterogéneo en las cadenas
lambda.
Respecto a los marcadores de activación celular, el Ac Mo CD23 se
expresó en la mayoría de los casos (99,9%), mientras que el CD25 tan solo lo hizo
en el 21.1% de los pacientes. La expresión de CD23 fue de intensidad moderada y
su distribución heterogénea.
Finalmente, en lo que se refiere a la expresión de otros marcadores menos
específicos, el FMC7 presentó una intensidad débil y el CD11c moderada, en
ambos casos la distribución fue predominantemente homogénea.
Por otra parte, los valores cuantitativos de la intensidad de expresión y del
patrón de dispersión antigénica de los diferentes anticuerpos monoclonales en la
población CD19+ tumoral se muestran en la tabla 4.15; observándose una alta
intensidad de fluorescencia media y una gran heterogeneidad para el CD23 y
CD11c.
La tabla 4.16 muestra la distribución de los pacientes según el sistema de
puntuación del grupo de Matutes (1997). Aplicando este sistema un 86.8% de los
casos tenían una puntuación de 4 y 5, y tan solo un 3.5% mostraban un rango de
1 o 2, no se incluyó ningún caso con valor 0.
136
A modo de resumen, el patrón inmunofenotípico de las células tumorales de las
LLC-B de nuestra serie, fue el siguiente:
CD19+/CD5+moderado-heterogéneo/CD22+débil-homogéneo/CD23+moderado-heterogéneo/
CD79Beta+débil-homogéneo/FMC7+débil-homogéneo/cadenas kappa+débil-homogéneo/
CD11c -/CD25 -/CD10 -/CD2 -
3.3. Características fenotípicas de la población T
Las características fenotípicas de los linfocitos T normales residuales en los
pacientes con LLC-B se detallan en la Tabla 4.17; en ella, se muestran los valores
tanto absolutos como porcentuales (calculados sobre el área de células CD3+) de
las distintas subpoblaciones linfocitarias: linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+,
linfocitos T CD4+/CD8+ y linfocitos T CD4 -/CD8 -. Se observa un predominio de
los linfocitos CD4+ (54.3%) y linfocitos CD8+ (41.1%), respecto al resto de las
subpoblaciones, con un cociente CD4/CD8 de 1.6.
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2+
29
,1 ±
17,
2 15
12
0 46
,3 ±
14,
5 27
12
5
CD
19
+/C
D2
3+
18
2,3
± 11
5,6
33
547
95,9
± 1
8,6
57
143
CD
19
+/F
MC
7+
87
,5 ±
149
,5
16
942
64,9
± 3
3,3
24
155
CD
19
+/C
D1
1c
+
148
± 72
,2
47
321
70,4
± 2
0,5
43
139
CD
19
+/C
D7
9B
eta
+
56,1
± 3
1,8
19
132
46,6
± 8
,0
28
63
CD
19
+/k
ap
pa
35
,5 ±
42,
4 9
262
60,4
± 2
0,9
19
138
CD
19
+/L
am
bd
a
209,
0 ±
283,
824
15
95
60,4
± 2
0,9
19
138
139
Tabla 4.16
Distribución de casos según el sistema de puntuación de Matutes
Puntuación Frecuencia Porcentaje Porcentaje acumulado
1 1 0,9 0,9
2 3 2,6 3,5
3 11 9,6 13,2
4 57 50 63,2
5 42 36,8 100
Total 114 100 100
140
Ta
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4.1
7. L
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M
Mìn
imo
- M
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mo
CD
5+/C
D19
-
16,2
± 1
3,8
0,4
48,3
2,
489
± 1,
941
0,52
0 18
,50
CD
3+
16,0
± 1
3,9
0,5
49,8
2,
487
± 2,
051
0,42
0 20
,00
(CD
3+)-
(CD
5+)
1,4
± 2,
6 0
5,0
CD
3+/C
D4+
/CD
8-
54,3
± 1
4,9
12
88
1,4
± 1,
3 0,
190
12,6
0
CD
3+/C
D8
F+
/CD
4 -
38,2
± 1
4,3
6 82
0,
941
± 0,
765
0,07
5,
80
CD
3+/C
D8
M-D
+/C
D4
- 3,
3 ±
2,2
0 10
,8
0,08
6 ±
0,09
5 0
0,78
CD
3+/C
D8
T+
/CD
4 -
41,1
± 1
4,4
7 85
1,
017
± 0,
831
0,10
5 6,
60
CD
3+/C
D4+
/CD
8F+
0,
2 ±
0,5
0 4,
5 0,
007
± 0,
035
0 0,
37
CD
3+/C
D4+
/CD
8T+
2,
6 ±
3,2
0 20
,0
0,07
5 ±
0,17
0 0
1,65
CD
3+/C
D4+
/CD
8M
-D+
2,
4 ±
3,0
0 17
,5
0,06
8 ±
0,13
7 0
1,26
CD
3+/C
D4-
/CD
8-
4,0
± 3,
1 0
20
0,09
2 ±
0,10
1 0
0,72
Co
cien
te C
D4/
CD
8 F
1,9
± 1,
8 0,
15
14,6
Co
cien
te C
D4/
CD
8T
1,6
± 1,
4 0,
12
12,4
141
142
4. POBLACIONES LINFOCITARIAS EN LOS CONTROLES
El grupo control estuvo compuesto por 121 individuos, en su mayoría
donantes voluntarios de sangre, con una edad media de 41 años (18-70) y una
distribución por sexo de 75 (64.7%) varones y 41 (35.3%) mujeres, ratio 1.8:1
(figuras 4.6 y 4.7). Las características generales de las poblaciones linfocitarias de
dichos controles se muestran en las tablas 4.18 y 4.19, en las cuales los
porcentajes totales de linfocitos T y B se han calculado sobre el área de linfocitos y
las subpoblaciones T sobre el área de linfocitos T CD3+
Como cabría esperar, se aprecia un predominio de los linfocitos T (71%)
sobre los linfocitos B (9.3%). En lo concerniente a las subpoblaciones T, existe
una clara preponderancia de los linfocitos T CD4+ (61.9%) sobre los linfocitos T
CD8+ (31.5%), con un cociente CD4/CD8 de 2; el resto de las subpoblaciones T
representan poblaciones cuantitativamente minoritarias en la sangre periférica
normal. Por su parte, los linfocitos B, definidos por la positividad de CD19,
coexpresan el antígeno CD5 en un 12.8% de los casos (tabla 4.19).
Figura 4.6 Distribución de los controles en función de la edad
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
14-50 años 51-60 años >60 años
Figura 4.7. Distribución de los controles en función del sexo
Varones65%
Mujeres35%
143
Ta
bla
4.1
8. L
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T e
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Mìn
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áxi
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CD
5+/C
D19
-
71,0
± 6
,9
48
83
1,33
8 ±
0,44
1 0,
537
2,50
7
CD
3+
71,3
± 6
,9
50
83
1,32
7 ±
0,48
4 0,
561
3,20
7
(CD
3+)-
(CD
5+)
1,7
± 1,
3 0
4,2
CD
3+/C
D4+
/CD
8-
61,9
± 8
,2
42
79
0,83
8 ±
0,32
0 0,
408
2,37
3
CD
3+/C
D8
F+
/CD
4 -
30,7
± 6
,2
14
42
0,43
0 ±
0,18
3
0,19
4 1,
00
CD
3+/C
D8
M-D
+/C
D4
- 1,
9 ±
1,3
0 9
0,02
5 ±
0,02
0 0
0,12
8
CD
3+/C
D8
T+
/CD
4 -
31,5
± 5
,9
15
45
0,45
8 ±
0,17
0 0,
204
1,12
3
CD
3+/C
D4+
/CD
8F+
0,
14 ±
0,2
5 0
2 0,
002
± 0,
004
0
0,04
3
CD
3+/C
D4+
/CD
8T+
1,
26 ±
1,3
6 0,
1 7,
6 0,
018
± 0,
024
0,00
1 0,
151
CD
3+/C
D4+
/CD
8M
-D+
1,
12 ±
1,2
4 0,
1 7,
3 0,
016
± 0,
021
0,00
1 0,
130
CD
3+/C
D4-
/CD
8-
2,7
± 2,
3 0,
6 15
,6
0,04
8 ±
0,0
39
0,00
5 0,
307
Co
cien
te C
D4/
CD
8F
2,1
± 0,
6 1,
2 3,
9
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cien
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D4/
CD
8T
2 ±
0,6
1,1
3,5
144
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m ±
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o -
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o
m ±
DE
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Mìn
imo
- M
áx
imo
CD
19
T+
9,
3 ±
3,5
3 19
0,
177
± 0,
089
0,03
2 0,
527
CD
19
+/C
D5
-
8 ±
3 2,
5 16
0,
151
± 0,
079
0,02
9 0,
493
CD
19
+/C
D5
+
1,4
± 1
0
4,9
CD
19
+/C
D5
+ *
12
,8 ±
7,7
1
30
*
Por
cent
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sob
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rea
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as C
D19
+.
145
146
5. COMPARACIÓN DE LAS POBLACIONES LINFOCITARIAS EN PACIENTES
LEUCÉMICOS Y CONTROLES
5.1. Linfocitos T
En la tabla 4.20 se presentan las medias ± DE de las subpoblaciones
linfocitarias T en los pacientes leucémicos y en los controles, expresadas tanto en
porcentajes como en valores absolutos. El análisis comparativo de las mismas
(figura 4.8), muestra un significativo aumento del valor absoluto de los linfocitos T
totales en la población leucémica; por el contrario, el valor porcentual es
significativamente menor en los pacientes respecto a los controles.
En lo que respecta a las subpoblaciones de linfocitos T, el valor porcentual
de los linfocitos T CD4+ es menor en los pacientes leucémicos respecto a los
controles (p<0.05); sin embargo, al comparar las cifras absolutas se observa un
aumento de dicha subpoblación en el grupo de leucémicos (p=0.03). El valor
absoluto de los linfocitos T CD8+ totales en la población leucémica duplica al
hallado en los controles (figura 4.9). Este significativo aumento de los linfocitos
CD8+ se observa para las distintas intensidades de expresión del antígeno
(CD8fuerte y CD8moderado-débil), tanto en valores absolutos como porcentuales.
En consecuencia, el cociente CD4/CD8 está significativamente descendido en los
casos respecto a los controles.
Finalmente reseñar, que la población de linfocitos T dobles negativos
(CD3+/CD4-/CD8-) y linfocitos T dobles positivos (CD3+/CD4+/CD8+) se
encuentran significativamente aumentados en los pacientes leucémicos (figura
4.10). Así mismo, observamos diferencias en la intensidad de expresión del
antígeno CD8 en los linfocitos T dobles positivos y los linfocitos T CD8+/CD4-
(predominantes en sangre periférica), presentando en los primeros una expresión
débil-moderada y fuerte en los segundos.
147
En la tabla 4.21 se muestran los porcentajes de pacientes que presentan
valores patológicos de las distintas subpoblaciones linfocitarias respecto a los
controles, observándose que más de 2/3 de los pacientes muestran elevación del
valor absoluto de los linfocitos T (CD5+/CD19– y CD3+) y de la subpoblación
CD8+, en sus distintas intensidades de expresión del antígeno. Así mismo, más de
la mitad de los casos presentan un aumento del valor porcentual de dichos
linfocitos T CD8+.
5.2. Linfocitos B
El valor absoluto de los linfocitos B normales residuales en la sangre
periférica de los pacientes leucémicos (2.100x109/L), es significativamente
superior al grupo control (0.177x109/L) (p=0.009) (figura 4.11).
El estudio comparativo de la intensidad de expresión para el antígeno CD5
en linfocitos B tumorales, fenotípicamente definidos por la coexpresión de
CD19+/CD5+, y en los linfocitos T normales (CD5+/CD19-), muestra una
intensidad media de fluorescencia menor en la población tumoral (MFI=43.3)
respecto a los controles (MFI=88.4)(p=0.0001) (figura 4.12).
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4.2
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CD
5+
/CD
19
-
16,2
± 1
3,8*
71
,0 ±
6,9
2,
489
± 1,
941 *
1,
338
± 0,
441
CD
3+
16
,0 ±
13,
9*
71,3
± 6
,9
2,48
7 ±
2,05
1*
1,32
7 ±
0,48
4
CD
3+
/CD
4+
/CD
8-
54,3
± 14
,9
61,9
± 8
,2#
1,4
± 1,
3#
0,83
8 ±
0,32
0
CD
3+
/CD
8F+
/CD
4 -
38
,2 ±
14,
3#
30,7
± 6
,2
0,94
1± 0
,765
* 0,
430
± 0,
183
CD
3+
/CD
8M
-D+
/CD
4 -
3,3±
2,2
#
1,9
± 1,
3 0,
086
± 0,
095*
0,
025
± 0,
020
CD
3+
/CD
8T+
/CD
4 -
41
,1±
14,4
#
31,5
± 5
,9
1,01
7 ±
0,83
1*
0,45
8 ±
0,17
0
CD
3+
/CD
4+
/CD
8F+
0,
2± 0
,5#
0,14
± 0
,25
0,00
7 ±
0,03
5*
0,00
2 ±
0,00
4
CD
3+
/CD
4+
/CD
8T+
2,
6 ±
3,2*
1,
26 ±
1,3
6 0,
075
± 0,
170*
0,
018
± 0,
024
CD
3+
/CD
4+
/CD
8M
-D+
2,4
± 3,
0*
1,12
± 1
,24
0,06
8± 0
,137
* 0,
016
± 0,
021
CD
3+
/CD
4-/
CD
8-
4,0±
3,1
* 2,
7 ±
2,3
0,09
2 ±
0,10
1*
0,04
8 ±
0,0
39
Co
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CD
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1,8
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2,1
± 0,
6
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/CD
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1,6±
1,4
#
2 ±
0,6
#
p<
0.0
5; *
p<
0.01
148
Figura 4.8. Comparación de la población linfoide T general en los
pacientes y en el grupo control
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
CD3+ CD4+ CD8+
PacientesControles
149
Figura 4.9. Linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+
0
500
1000
1500
2000
2500
CD4+ CD8+
PacientesControles
Figura 4.10. Linfocitos T dobles negativos y linfocitos T dobles positivos en pacientes y controles
0
20
40
60
80
100
120
140
160
CD4+/C
D8+T
CD4+/C
D8+m-d
CD4-/CD8-
PacientesControles
150
151
Tabla 4.21
Porcentajes de pacientes que presentan valores patológicos de las distintas subpoblaciones T respecto a los controles
Subpoblaciones Porcentajes Células x109/L
Valores patológicos Valores patológicos
n % n %
CD5+/CD19 - 115 100 74 67.3
CD3+ 115 100 79 68.7 CD3+/CD4+/CD8- 17 14.8 65 56.5
CD3+/CD8F+/CD4 - 60 52.2 76 66.1
CD3+/CD8M-D+/CD4 - 49 42.6 73 63.5
CD3+/CD8T+/CD4 - 70 60.9 88 76.5
CD3+/CD4+/CD8F+ 15 13.0 28 24.3
CD3+/CD4+/CD8T+ 39 33.9 46 40.0
CD3+/CD4+/CD8M-D+ 41 35.7 54 47
CD3+/CD4-/CD8- 22 19.1 42 36.5
Cociente CD4/CD8F 26 22.6
Cociente CD4/CD8T 18 15.7
Figura 4.11. Valor absoluto de linfocitos B normales en pacientes y
controles
2100
177
0
500
1000
1500
2000
2500
Pacientes Controles
CD19+
Figura 4.12. Intensidad de expresión (MFI) para el marcador CD5 en
linfocitos B tumorales y linfocitos T normales
43
88
0102030405060708090
Linfocitos Btumorales
Linfocitos Tnormales
CD5+ MFI
Linfocitos B tumoralesLinfocitos T normales
152
153
6. RELACIÓN ENTRE LOS LINFOCITOS T DE LA LLC-B Y DISTINTOS
PARÁMETROS CLÍNICOS Y DE LABORATORIO
6.1 Indicadores de carga tumoral
6.1.1. Estadios clínicos de Rai y de Binet
En la tabla 4.22, se muestra la relación entre las alteraciones de las
distintas subpoblaciones T en los pacientes leucémicos y los estadios clínicos de
Rai y de Binet de la LLC-B. Para establecer dicha relación los linfocitos T de los
pacientes han sido categorizados en dos grupos, según que la media presente
valores > o < respecto al mismo parámetro en los controles.
Los resultados muestran una correlación entre los estadios clínicos de Rai y
de Binet y el porcentaje de pacientes que presentan unas cifras de linfocitos T
CD8+ superiores a la media de los controles. Así, el aumento de la subpoblación
linfocitaria CD8+, definida desde el punto de vista fenotípico como
CD3+/CD8+/CD4-, es mayor en los estadios clínicos avanzados respecto a los
estadios precoces de la enfermedad. Esto es así, tanto para la población total
(CD3+/CD8T+/CD4-) como para aquella que presenta una intensidad fuerte de
expresión del antígeno (CD3+/CD8F+/CD4-) y que suele ser la población CD8+
mayoritaria en la sangre periférica. En la población CD8+ con una intensidad de
expresión del antígeno débil-moderada (CD3+/CD8m-d+/CD4-) se observa esta
tendencia, aunque sin alcanzar significación estadística.
Los linfocitos T dobles negativos, definidos desde el punto de vista
fenotípico como CD3+/CD4-/CD8-, muestran valores porcentuales
significativamente superiores a los controles, en una mayor proporción de
pacientes de los estadios avanzados (III y IV de la clasificación de Rai y C de la
154
clasificación de Binet) con respecto a los precoces (0 de Rai y A de Binet) o
intermedios (I-II de Rai y B de Binet) (figura 4.13 y 4.14).
Finalmente, el valor absoluto de la población CD3+ aumenta con los
estadios de Binet, pero dicha progresión no alcanza significación estadística (tabla
4.22).
6.1.2. Otros indicadores de carga tumoral
En las tablas 4.23 y 4.24 se expresan la relación entre los parámetros de los
linfocitos T y los siguientes indicadores de carga tumoral:
• Cifras elevadas de β2- microglobulina
• Cifras de linfocitos en sangre periférica al diagnóstico, categorizadas en > o
< de 30 x109/L
• Cifras elevadas de LDH
• Tiempo de duplicación del número de linfocitos en sangre periférica
• Porcentaje de células CD19+ en sangre periférica
• Valor absoluto de células CD19+ en sangre periférica
Los resultados muestran el porcentaje de pacientes que presentan un valor
porcentual (tabla 4.23) o absoluto (tabla 4.24) por encima de la media del grupo
control para cada uno de los parámetros.
La elevación de los linfocitos T CD8+ por encima de la media del grupo
control, es mas frecuente en los pacientes que presentan cifras aumentadas de β2-
microglobulina, unas cifras de linfocitos > 30 x109/L, LDH elevada, porcentaje de
células CD19+ >80% y un valor absoluto de células CD19+ > 20 x109/L, aunque,
tan solo se halló significación estadística con el valor absoluto de células CD19+ >
20 x109/L (tabla 4.25 y 4.26) y unas cifras de linfocitos en sangre periférica >30
x109/L (tabla 4.27).
155
Así mismo, la elevación de los linfocitos T dobles negativos (CD3+/CD4-
/CD8-) es significativamente mas frecuente en los pacientes que presentan un
valor porcentual de células CD19+ >80% (tabla 4.28), un valor absoluto de las
mismas >20 x109/L (tabla 4.29) y unas cifras de linfocitos en sangre periférica >30
x109/L (tabla 4.30).
A modo de resumen, podríamos decir que entre todas las subpoblaciones
linfocitarias son los linfocitos CD8+ y los linfocitos T dobles negativos los que se
relacionan con una mayor carga tumoral, especialmente con estadios avanzados
de Rai y de Binet y con cifras elevadas de linfocitos y células CD19+ en sangre
periférica (tabla 4.31).
6.2. Inmunofenotipo de las LLC-B
Se estableció una correlación entre las subpoblaciones T y los distintos
parámetros fenotípicos evaluados en las LLC-B; observando que los pacientes
que presentaban unas cifras de linfocitos T CD8+ superiores a la media de los
controles, mostraban un patrón fenotípico característico:
CD22+fuerte,moderado-heterogéneo/CD79Beta+moderado-heterogéneo/
CD23+fuerte-homogéneo/cadenas ligeras lambda+moderado-heterogéneo/ CD25+
El estudio comparativo de dicho patrón fenotípico con el patrón fenotípico
general de las LLC-B de nuestra serie, se muestra en la tabla 4.32; en ella, se
observa como en el grupo de pacientes que presentaban unas cifras de linfocitos
T CD8+ superiores a la media de los controles, la intensidad de expresión de
marcadores característicos de células B, CD22 y CD79Beta, era superior al grupo
general, así mismo mostraban un patrón de dispersión antigénica heterogéneo.
Respecto a los marcadores de activación celular, la positividad para el marcador
156
de activación celular CD25 fue superior en dicho grupo, así como, una mayor
intensidad de expresión del Ac Mo CD23 que mostró una distribución homogénea.
Finalmente, la evaluación de la clonalidad determinada por la expresión de una
única cadena ligera (kappa o lambda) sobre la membrana celular, mostró que en
el grupo de pacientes con cifras de linfocitos T CD8+ superiores a la media de los
controles, predominaba la expresión de la cadena ligera lambda de intensidad
moderada y un patrón de dispersión antigénica heterogéneo, frente a un
predominio de la cadena kappa de intensidad débil y distribución homogénea en el
grupo general de LLC-B.
El análisis de las características inmunofenotípicas de las LLC-B en los
pacientes que presentaban unos valores de linfocitos T dobles negativos
superiores a la media de los controles, a diferencia que lo sucedido en los
linfocitos T CD8+, no mostró un patrón fenotípico definido y característico de dicho
grupo.
6.3. Hipogammaglobulinemia
El análisis de la correlación de los linfocitos T con la
hipogammaglobulinemia, no mostró relación entre las alteraciones de las distintas
subpoblaciones T y el descenso de las Ig en la LLC-B de nuestra serie.
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157
158
Figura 4.13. Relación entre los linfocitos T CD8+ y linfocitos T dobles
negativos y el estadio clínico de Binet
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
140%
Binet A Binet B Binet C
CD4-/CD8-CD8+
Figura 4.14. Relación entre los linfocitos T CD8+ y linfocitos T dobles
negativos y el estadio clínico de Rai.
0%20%40%
60%80%
100%120%
140%160%
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160
Tabla 4.25
Relación entre el porcentaje de linfocitos T CD8+ con expresión fuerte del
antígeno y los valores de células CD19+
Los resultados indican los pacientes que presentan un valor porcentual de
linfocitos T CD8+ con fuerte expresión antigénica, superiores o inferiores a la
media del grupo control, en los dos grupos categorizados según las cifras de
células CD19+.
CD19+
< 20x109 >20x109
Total
< Controles
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115
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161
Tabla 4.26
Relación entre el valor absoluto de linfocitos T CD8+ con expresión fuerte
del antígeno y los valores de células CD19+
Los resultados indican los pacientes que presentan un valor absoluto de
linfocitos T CD8+ con fuerte expresión antigénica, superiores o inferiores a la
media del grupo control, en los dos grupos categorizados según las cifras de
células CD19+.
CD19+
< 20x109 >20x109
Total
< Controles
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% CD8+F (v.abs)
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115
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162
Tabla 4.27
Relación entre los linfocitos T CD8+ totales
y las cifras de linfocitos en sangre periférica
Los resultados indican los pacientes que presentan un valor absoluto de
linfocitos T CD8+ totales, superiores o inferiores a la media del grupo control,
en los dos grupos categorizados según las cifras de linfocitos.
Linfocitos
< 30x109 >30x109
Total
< Controles
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% CD8+T
% del total
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% CD8+T
% del total
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Total
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% CD8+T
% del total
91
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113
100
100
163
Tabla 4.28
Relación entre los linfocitos T dobles negativos y el porcentaje de células CD19+ en sangre periférica
Los resultados indican los pacientes que presentan un valor absoluto de
linfocitos T dobles negativos, superiores o inferiores a la media del grupo
control, en los dos grupos categorizados según el porcentaje de células
CD19+.
CD19+
< 80% >80%
Total
< Controles
n
% CD4-/CD8-
% del total
41
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% del total
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Total
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% CD4-/CD8-
% del total
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114
100
100
164
Tabla 4.29
Relación entre los linfocitos T dobles negativos y el valor absoluto de células CD19+ en sangre periférica
Los resultados indican los pacientes que presentan un valor absoluto de
linfocitos T dobles negativos, superiores o inferiores a la media del grupo
control, en los dos grupos categorizados según las cifras de células CD19+.
CD19+
< 20x109 >20x109
Total
< Controles
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% CD4-/CD8-
% del total
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% del total
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Total
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165
Tabla 4.30
Relación entre los linfocitos T dobles negativos
y las cifras de linfocitos en sangre periférica
Los resultados indican los pacientes que presentan un valor porcentual de
linfocitos T dobles negativos, superiores o inferiores a la media del grupo
control, en los dos grupos categorizados según las cifras de linfocitos.
Linfocitos
< 30x109 >30x109
Total
< Controles
n
% CD4-/CD8-
% del total
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15
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13.3
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> Controles
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% CD4-/CD8-
% del total
14
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Total
n
% CD4-/CD8-
% del total
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113
100
100
166
Tabla 4.31
Correlación entre las subpoblaciones linfocitarias T
y el aumento de masa tumoral
La tabla muestra las subpoblaciones T que presentan correlaciones
significativas positivas con un aumento de la masa tumoral
Subpoblaciones Parámetros de carga tumoral
CD3+/CD8+/CD4 - Rai/Binet CD19+ > 20x109 Linfocitos >30x109
CD3+/CD4 -/CD8 - Rai/Binet CD19+ > 20x109
CD19+ > 80% Linfocitos > 30x109
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168
170
Los SLPC con expresión hemoperiférica constituyen una serie de
neoplasias hematológicas caracterizadas por la existencia de una proliferación
clonal de células linfoides maduras no inmunocompetentes en sangre
periférica. Aparecen generalmente en personas de edad avanzada, con un
cuadro clínico derivado de la presencia de síntomas constitucionales y de la
infiltración de órganos linfoides (adenopatías, esplenomegalia, etc). Desde un
punto de vista biológico, el rasgo más característico es la leucocitosis periférica
a expensas de células linfoides. El curso clínico, como su propio nombre indica,
es relativamente prolongado, si bien hay casos de evolución abrupta. Junto a
estos rasgos comunes existen importantes diferencias que confieren entidad
propia a cada una de estas enfermedades. La leucemia linfática crónica es la
enfermedad más característica y representativas de los SLPC.
La clasificación de los SLPC ha sido motivo de conflicto durante muchos
años para patólogos, citólogos y clínicos, y ha sufrido múltiples modificaciones
a lo largo del tiempo. Los avances en el conocimiento del inmunofenotipo y de
las alteraciones cromosómicas en las neoplasias linfoides malignas dieron
lugar, en el año 1993, a la aparición de una clasificación de estos síndromes
conocida bajo el nombre de REAL (Revised European-American Classification
of Lymphoid Neoplasm) (Harris y cols, 1994) en la que según la estirpe de la
célula neoplásica, los SLPC se clasifican en SLPC de origen B o de origen T.
Recientemente y por iniciativa de la Organización Mundial de la Salud (OMS),
las sociedades Americana y Europea de Hematología, han elaborado una
nueva clasificación de las neoplasias linfoides, en ella sólo se reconocen
enfermedades con características biológicas y clínicas definidas; la leucemia
linfática crónica se incluye dentro de las neoplasias de células B maduras
(Harris y cols, 1999).
El diagnóstico diferencial de estos procesos tiene gran importancia
clínica, ya que el pronóstico y el tratamiento dependen de la identificación
precisa de cada una de estas entidades. En este sentido, el inmunofenotipaje
171
celular por CMF contribuye de forma decisiva a la investigación del origen
celular de estas hemopatías, a su diagnóstico y clasificación.
La CMF constituye un método de análisis celular, mediante el estudio de
diversas propiedades físico-químicas y biológicas de la célula, que alcanza
especial relevancia al permitir un diagnóstico diferencial rápido entre una
linfocitosis reactiva y un proceso monoclonal tumoral. Su reciente introducción
en el análisis inmunofenotípico de las células linfoides, ha permitido establecer
el origen celular y estadio de maduración de los SLPC, así como, su
clasificación en neoplasias de origen B y T. El análisis multiparamétrico junto
con el enorme catálogo de AcMo del que se dispone en la actualidad, la han
convertido en una herramienta fundamental para delinear la diferenciación de
las células hematopoyéticas normales, al tiempo que han permitido clasificar
las neoplasias derivadas de estas células de acuerdo con la ontogenia de las
mismas.
La realización de un estudio inmunofenotípico por CMF precisa de la
combinación de varios marcadores inmunológicos, ya que el análisis de
marcadores aislados es insuficiente para distinguir entre los distintos procesos
linfoproliferativos. La LLC-B tiene un perfil inmunológico característico, pero
ningún marcador le es absolutamente específico. Diversos investigadores han
intentado establecer un sistema de puntuación incluyendo varios AcMo para
tener una aproximación diagnóstica fiable (Kurec y cols, 1992; Molica y cols,
1998). De ellos destaca por su fácil reproductividad, accesibilidad y simplicidad,
el creado por Matutes y cols en 1997, que utiliza cinco marcadores, valorando
su presencia o ausencia así como su intensidad de expresión, permitiendo
diferenciar la LLC-B de otros procesos linfoproliferativos B con expresión
leucémica.
La LLC-B es, como ya se ha mencionado, la entidad más representativa
de los SLPC. Es una enfermedad caracterizada por la proliferación y
acumulación de linfocitos no inmunocompetentes de pequeño tamaño, aspecto
172
maduro y fenotipo B. Es la forma de leucemia más frecuente en los países
occidentales, se presenta en personas adultas y su incidencia aumenta con la
edad. Las manifestaciones clínicas se deben a la infiltración progresiva de la
médula ósea, ganglios linfáticos y otros tejidos por linfocitos tumorales, así
como a las alteraciones inmunológicas que acompañan a la enfermedad.
Desde el punto de vista inmunofenotípico, las células de la LLC-B
expresan marcadores B con intensidad inferior a la de los linfocitos B maduros
normales de sangre periférica, y tienen Ig de superficie, cuya monoclonalidad
viene determinada por la expresión de una única cadena ligera sobre la
membrana celular. Una característica altamente relevante, es que estas células
leucémicas suelen expresar CD5 (un antígeno inicialmente descrito como
específico de células T), aunque un porcentaje pequeño de casos puede ser
CD5 negativos.
Los criterios diagnósticos para la LLC-B han sido establecidos de forma
independiente por dos grupos de trabajo: el International Workshop on Chronic
Lymphocytic Leukemia (IWCLL) (1989) y el National Cancer Institute-
Sponsored Working Group (NCI) (1996), y en esencia son la presencia de
linfocitosis, morfología típica y fenotipo compatible con este tipo de leucémia.
El curso clínico es sumamente variable: la mediana de supervivencia es
de unos 8 años, pero hay pacientes que fallecen al poco tiempo de ser
diagnosticados y otros cuya esperanza de vida no se ve afectada por la
enfermedad. En este sentido, la introducción de los estadios clínicos ha
significado un gran avance en el pronóstico, siendo los sistemas más utilizados
el de Rai y el de Binet. Finalmente, aunque se han producido avances en el
tratamiento, en la mayoría de los casos la LLC-B es una enfermedad incurable.
173
1. CRITERIOS DE SELECCIÓN
En nuestro estudio una de las premisas fundamentales fue la utilización de
unos criterios de inclusión y exclusión claros y exhaustivos, con la finalidad de
seleccionar tan solo aquellos casos que realmente correspondían a LLC-B. Tal
rigurosidad obedece a que los procesos linfoproliferativos incluyen una amplia
variedad de enfermedades, que en ocasiones pueden presentar datos
comunes que dificultan el diagnóstico y refleja la heterogeneidad de estos
procesos.
En este sentido, elegimos los criterios diagnósticos establecidos por el
NCI porque a diferencia del IWCLL, exige la demostración de clonalidad,
mediante técnicas de inmunofenotipaje por CMF, sobre la base de la expresión
de cadenas ligeras kappa o lambda en la superficie celular, siendo a nuestro
juicio un requisito imprescindible para diferenciar los procesos tumorales de las
linfocitosis reactivas. Así mismo, el NCI detalla aquellas características
morfológicas y fenotípicas que deben presentar las células leucémicas, y
considera que la realización de aspirado y biopsia de médula ósea no es
necesaria para establecer el diagnóstico, motivo por el cual dicho parámetro no
ha sido incluido en el estudio.
Desde un punto de vista inmunofenotípico, solo se incluyeron los casos
de LLC-B positivas para el AcMo CD5, siguiendo las recomendaciones para la
realización de ensayos clínicos establecidas por el National Cancer Institute-
Sponsored Working Group (Cheson y cols, 1988), pues existe controversia
sobre la autenticidad de aquellas LLC-B que son negativas para dicho AcMo.
Con este criterio se pretende incluir en los ensayos clínicos tan solo aquellos
procesos que realmente corresponde a la LLC-B, evitando el sesgo que
representaría la inclusión de otros cuadros linfoproliferativos distintos a este
tipo de leucemias. Para la diferenciación inmunofenotípica de los SLPC se
eligió el sistema de puntuación elaborado por el grupo de Matutes y cols.
debido a que es el más ampliamente utilizado y punto de referencia para poder
174
comparar nuestros resultados con los publicados por otros autores; se han
incluido las leucemias que presentaban una puntuación alta (4 o 5), indicando
un patrón inmunológico típico, y en aquellos casos con puntuaciones inferiores
a 4 fue necesaria la realización de biopsia ganglionar y de médula ósea para
confirmar el diagnóstico.
Con la finalidad de asegurar la expresión hemoperiférica del proceso
neoplásico se estableció que las células leucémicas debían representar más
del 50% de la población linfoide de sangre periférica, de acuerdo con lo
establecido por Moreau y cols (1997) y Newman y cols (1993).
Los criterios de inclusión del grupo control se realizaron de acuerdo con
las recomendaciones establecidas por la International Federation of Clinical
Chemistry (IFCC, 1987) para la elaboración de valores de referencia.
Finalmente, el análisis inmunofenotípico de las subpoblaciones
linfocitarias T constituía uno de los aspectos básicos del estudio, por ello, se
excluyeron aquellos pacientes que presentaban patología concomitante que
pudiese alterar los linfocitos T (enfermedades autoinmune, infecciones víricas,
administración de tratamientos inmunosupresores, etc).
2. DATOS EPIDEMIOLÓGICOS
La LLC-B, como se ha expuesto previamente, es la leucemia más
frecuente del adulto en los países occidentales, representando alrededor del
30% de todas las leucemias y el 90% de las leucemias crónicas. Su incidencia
ha ido aumentando en los últimos años, reflejando no solo un incremento real
de la misma sino también un cambio en la disponibilidad de métodos
diagnósticos y la práctica creciente de análisis de forma rutinaria. En nuestra
serie ésta se cifra en 3,5 casos nuevos por 100.000 habitantes y año, dato que
se aproxima a lo publicado en revisiones recientes por Kipps (2000) y Bosch
(2002), y difiere de lo descrito en la década de los 80 que se situaba en torno al
1.5 (Dighiero y cols, 1991; Foon y cols, 1990). Por último, señalar que la
175
incidencia en nuestra serie es aproximada, ya que el estudio no está diseñado
para la realización de un análisis epidemiológico de la población, y contó con
determinados elementos de confusión, pues la introducción de la CMF en
nuestra área hospitalaria, supuso la confirmación diagnóstica de linfocitosis
seguidas en consultas externas con anterioridad.
En nuestro estudio la edad media de los enfermos en el momento del
diagnóstico fue de 66 años, reflejando la tendencia actual de un aumento de la
misma, que la cifra en torno a 65-70 años (Bosch, 2002; Keating, 1999), lo que
contrasta con los 60 años de hace unas décadas (Gale y Foon, 1987). Estos
cambios pueden ser el resultado del aumento de la esperanza de vida en la
población general. Sin embargo, debido a la práctica creciente de análisis de
forma rutinaria, el diagnóstico se realiza cada vez con mayor frecuencia en
personas relativamente jóvenes; así, en los últimos años se ha observado un
creciente número de pacientes diagnosticado con menos de 50 años de edad;
en nuestra serie estos representan un 11% de todos los casos, coincidiendo
con los datos aportados recientemente que lo cifran en un 10-15% (Bosch y
Monserrat, 2002; Wierda y Kipps, 1999), frente al 5-7% en las series de Molica
(1994) y Catovsky (1995) a mediados de los 90. Además, coincidiendo con el
resto de autores observamos un predomio del sexo masculino (1,3:1).
3. PARÁMETROS CLÍNICOS Y BIOLÓGICOS EN LOS PACIENTES
LEUCÉMICOS
3.1. Población leucémica general
En nuestra serie el motivo de consulta más frecuente fue la realización
de un hemograma de rutina en personas asintomáticas, representando el 68%
de los casos, coincidente con los últimos datos publicados por el grupo de
Bosch y Montserrat (2002). En el resto de los pacientes la astenia, la anorexia y
los procesos infecciosos de repetición fueron las manifestaciones más
frecuentes que llevaron a la sospecha clínica y posterior diagnóstico del
176
proceso leucémico. A diferencia de lo que ocurre en los linfomas, la fiebre de
origen tumoral, la sudoración y la pérdida de peso, fueron poco frecuentes
como forma de presentación de la enfermedad, lo que concuerda con lo
publicado en por otros autores (Monserrat y Rozman, 1995; Monserrat y cols,
1997).
La exploración física puede ser completamente normal, no se detectó
afectación de territorios adenopáticos en el 67% de los casos, datos algo más
elevados que lo reseñado de forma clásica en la literatura que lo cifraba en un
40% (Rozman y Monserrat, 1995), pero que se asemejan a las series actuales
(Bosch y Monserrat, 2002).
El curso clínico de los pacientes con LLC-B es muy variable de un
enfermo a otro. El pronóstico puede variar desde una corta supervivencia hasta
una esperanza de vida igual a la de la población con la misma edad y sexo. A
partir de la idea de que las manifestaciones de la LLC-B se deben a la
acumulación progresiva de linfocitos, se han establecido diversos sistemas de
clasificación por estadios clínicos que reflejan la masa tumoral. La utilización de
los estadios clínicos significó un gran avance en el pronóstico y actualmente
constituyen el parámetro pronóstico más útil en la LLC-B. Los sistemas más
utilizados son el de Rai y el de Binet. La supervivencia disminuye desde los
estadios iniciales (0 de Rai y A de Binet) a los estadios avanzados (III y IV de
Rai y C de Binet). Con respecto a las formas más avanzadas de la enfermedad,
definidas por la presencia de anemia y/o trombopenia, es de reseñar que en
estos sistemas de estadiaje no se establece ninguna distinción en función del
mecanismo de la citopenia: infiltración de la médula ósea, hiperesplenismo o
inmune. La mayoría de los autores han sugerido que los enfermos con
citopenias de origen inmune tendrían un pronóstico mejor que aquellos en los
que la anemia o la trombopenia se deben a la infiltración medular (Mauro y
cols, 2000; Pritsch y cols, 1998; Sthoeger y cols, 1993). De acuerdo con ello,
en nuestro estudio las citopenias de etiología inmune no han sido consideradas
como definitorias de estadiaje, ya que consideramos que no se correlacionan
177
necesariamente con la masa tumoral. La utilización de uno u otro sistema de
estadiaje clínico depende de los grupos de trabajo, los investigadores europeos
tienden a emplear el sistema de Binet, mientras que los americanos suelen
utilizar el de Rai. En nuestra serie hemos incluido ambos porque pensamos que
pueden aportar información complementaria, tal como indican las
recomendaciones para la realización de ensayos clínicos establecidas por el
National Cancer Institute-Sponsored Working Group. Con ambos métodos
observamos un claro predominio de estadios precoces de la enfermedad en el
momento del diagnóstico.
El análisis de los parámetros clínicos de nuestra población, indican que
en la actualidad el aumento de la esperanza de vida, junto con la implantación
de los exámenes de salud preventivos y los avances tecnológicos en el área
diagnóstica, han llevado a un aumento en la incidencia de la LLC-B, junto con
un cambio en la forma de presentación, detectándose un predominio de las
fases asintomáticas y un aumento del porcentaje de pacientes con edades más
tempranas.
Entre los hallazgos de laboratorio, la característica principal de este tipo
de leucemias es la linfocitosis absoluta en sangre periférica, que puede
oscilar entre 5 x 109/L, hasta más de 100 x 109/L, pero la mayoría de los casos
se diagnostican con una linfocitosis moderada (20-50 x 109/L). Estos datos
concuerdan con los obtenidos en nuestra serie, en la cual la mayoría de los
pacientes presentaban unas cifras de linfocitos < a 30 x 109/L y tan solo en una
minoría de casos la linfocitosis era superior a 50 x 109/L. Los histogramas
bioparamétricos proporcionados por los actuales analizadores hematológicos
facilitan la detección de los casos con linfocitosis leve. Así, en nuestra serie
observamos que una cuarta parte de la población leucémica presentaba unas
cifras de linfocitos al diagnóstico inferior a 15 x 109/L.
El estudio morfológico de sangre periférica muestra unos linfocitos de
aspecto maduro, cromatina condensada en grumos, citoplasma agranular y
178
escaso, y la presencia de las características sombras de Gümprecht
producidas por la rotura mecánica de las células al realizar la extensión. Puede
haber un pequeño porcentaje de linfocitos que presenten hendiduras nucleares
(linfocitos hendidos) y otros con nucléolos (prolinfocitos). En nuestro estudio el
porcentaje de linfocitos debía ser inferior al 55%, ya que un valor superior
definiría otro tipo de proceso linfoproliferativo crónico como es la leucemia
prolinfocítica de estirpe B.
La anemia se detecta de forma inicial en el 15-20% de los casos. En
ocasiones es de carácter autoinmune, aunque los signos indirectos de
hemólisis (por ejemplo, reticulocitos) pueden faltar o ser poco evidentes. Por
ello, en todos los casos de LLC-B procede estudiar el test de Coombs, que es
positivo en un 15-35% de los casos, al inicio de la enfermedad o durante su
evolución, coincidiendo estos datos con los hallados en nuestra serie (12%).
Otras causas implicadas en la producción de anemia son: reducción en la
producción de hematíes asociada a una infiltración masiva de la médula ósea,
secuestro esplénico o aplasia pura de serie roja de probable etiología inmune.
La trombopenia es menos frecuente y en nuestra serie se presentó en un 3%
de los casos.
Respecto a los parámetros bioquímicos, es de reseñar, el hallazgo en
nuestra serie de un significativo porcentaje de pacientes que presentaban
alteración de la función hepática, (patrón de citolisis), en los cuales se
descartó patología concomitante causante de daño hepático. En la bibliografía
revisada no hemos encontrado la prevalencia general de este tipo de alteración
en la LLC-B, por lo que no podemos realizar un análisis comparativo de
nuestros resultados. Pensamos que la causa de esta alteración es la infiltración
leucémica hepática, que no conlleva a una insuficiencia hepatocelular grave,
por lo cual tan solo se realizaron controles analíticos periódicos sin estudio
histológico que hubiese conducido a un diagnóstico etiológico.
179
La hipogammaglobulinemia es frecuente (20-60% de los casos), sobre
todo en los pacientes con enfermedad avanzada. La Ig que con mayor
frecuencia se halla descendida es la IgM . En el 5-10% de los casos puede
detectarse una gammapatía monoclonal (sobre todo IgM o IgG). Esta gran
variabilidad en el porcentaje de casos que presentan hipogammaglobulinemia,
puede indicar la disparidad de criterios respecto a las determinaciones a
realizar en el diagnóstico y seguimiento de estos pacientes. En nuestra serie
ésta se cifra en un porcentaje elevado (50%), lo cual puede ser el reflejo de la
realización de dosificaciones periódicas de Ig en el curso evolutivo de la
enfermedad.
Finalmente, reseñar que los datos epidemiológicos y los parámetros
clínicos-biológicos que definen la población leucémica incluida en el estudio,
son coincidentes con lo publicado en la literatura por otros grupos de trabajo, lo
que sugiere que la muestra elegida es representativa de este tipo de neoplasia,
sin sesgos de selección importantes. Aspecto este que consideramos de una
gran relevancia para poder extraer conclusiones fiables del estudio
inmunofenotípico realizado sobre este grupo poblacional.
3.2. Pacientes menores de 60 años
La incidencia de la LLC-B varía con la edad, tal como se ha señalado
previamente; así, mientras que en los individuos menores de 30 años la
incidencia es inferior a un caso por cada 100.000 habitantes y año, en
pacientes mayores de 80 años es de 25 casos por 100.000 habitantes y año.
En la última década, se ha observado un interés creciente en evaluar la
influencia de la edad en la forma de presentación, el curso clínico y el
pronóstico de la enfermedad. Los enfermos jóvenes y mayores tienen una
mediana de supervivencia similar (de aproximadamente 10 años), pero las
causas de fallecimiento son diferentes. Mientras que los pacientes jóvenes
fallecen por causas relacionadas con la leucemia, hay una notable proporción
de enfermos mayores que fallecen por otras causas no relacionadas con el
180
proceso neoplásico, pues estos pacientes presentan un mayor número de
enfermedades intercurrentes, lo que podría influir en la supervivencia global y
en la tolerancia a los diferentes tratamientos.
En 1991 el Grupo Cooperativo Español para LLC, en un estudio
retrospectivo y multicéntrico, realizó un análisis comparativo respecto a la
forma de presentación y los factores pronósticos de este tipo de leucemias en
pacientes menores y mayores de 50 años, observando un incremento en la
proporción del sexo masculino y unos niveles mayores de las cifras de
hemoglobina en el grupo de pacientes jóvenes, no hallando diferencias
respecto a indicadores de carga tumoral como son los estadios clínicos de Rai
y de Binet, el contaje de linfocitos en sangre periférica y el tiempo de
duplicación linfocitaria. Así mismo, concluyeron que los factores pronósticos
que clásicamente se utilizaban en los pacientes mayores, eran igualmente
útiles en los pacientes jóvenes (Monserrat y cols, 1991). Estos resultados
fueron confirmados por otros estudios, entre los que destaca el realizado por
Mauro y cols. (1999), reafirmando que la mayoría de las características
examinadas eran similares entre los dos grupos, excepto para la concentración
de hemoglobina, la cual era 1 g/dL mayor en los pacientes jóvenes, y el
predomino del sexo masculino en dicho grupo. El límite de edad para la
inclusión de los pacientes en cada grupo varió según la series de 50 a 55 años.
En nuestro trabajo el límite para definir los grupos en función de la edad
se estableció en 60 años por varios motivos. En primer lugar porque se trata de
un estudio que incluye una única área hospitalaria (no-multicéntrico) y el
número de pacientes con edad < 50 años era bajo, lo cual dificultaba el análisis
comparativo. En segundo lugar, consideramos que esta división es más útil en
la práctica clínica, ya que los avances técnicos y el mayor conocimiento de las
medidas de soporte, han hecho posible que el límite de edad para la inclusión
de los pacientes en programas de quimioterapia intensiva (trasplante de
médula ósea) haya ido aumentando, situándose actualmente en este nivel (60
años). Nuestros resultados, de acuerdo con lo previamente descrito, muestran
181
un predominio del sexo masculino y unos niveles mayores de las cifras de
hemoglobina (1 g/dL) en el grupo de menores de 60 años. El predominio del
sexo masculino, que llevaría a un aumento de las cifras de hemoglobina en el
grupo, podría ser explicado por una hipotética función endocrina protectora en
las mujeres. El hallazgo de un aumento del porcentaje de pacientes
sintomáticos al diagnóstico en el grupo de menores de 60 años, junto con unas
cifras de linfocitos y LDH mas elevadas, así como un aumento de la
hipogammaglogulinemia (dato no recogido en otras series), podría sugerir una
evolución clínica diferente en dicho grupo. El situar el límite para la definición
de los dos grupos etarios en los 60 años frente a los 50-55 años establecido
por otros autores, puede reflejar, de una forma más precisa, la influencia de la
edad en el curso clínico y pronóstico de la enfermedad, no obstante, estos
datos tendrían que ser confirmados con otras series.
4. ESTUDIO INMUNOFENOTÍPICO
Los avances en el diagnóstico hematológico han ido asociados a la
incorporación de nuevas técnicas, que han contribuido a conseguir una mayor
objetividad y reproductividad diagnósticas, como punto de partida para la
utilización de una uniformidad de criterios. Así, al diagnóstico clínico en
hematología se ha unido el examen morfológico, las tinciones citoquímicas, el
recuento celular, los análisis citogenéticos, bioquímicos y moleculares. Más
recientemente, el estudio inmunofenotípico se ha incorporado a la batería
tecnológica, empleada en el diagnóstico hematológico.
En nuestro estudio la técnica utilizada para realizar el análisis
inmunofenotípico ha sido la CMF, que constituye un método reciente e
innovador de análisis celular, basado en el estudio de diversas propiedades
físico-químicas y biológicas de la célula, incluida en un flujo de líquido
isotónico, aportando fundamentalmente la posibilidad de realizar un análisis
multiparamétrico y célula a célula, de gran rapidez, sensibilidad y objetividad.
182
En ella se conjugan diversas tecnologías, como son la producción de
AcMo, la química de los fluorocromos, las tinciones citoquímicas, la tecnología
láser y la informática. El desarrollo sufrido por la informática en los últimos años
ha hecho posible que, de los primeros citómetros de flujo complejos y difíciles
de manejar, haya surgido una nueva generación de instrumentos pequeños y
sencillos que se han incorporado a la rutina de muchos laboratorios clínicos. La
hematología ha sido, sin duda, una de las especialidades biomédicas que más
se ha beneficiado de estas transformaciones debido, entre otros motivos, a la
facilidad en obtener células monodispersas en suspensión tanto a partir de
sangre periférica como de los órganos hematopoyéticos, al gran monomorfismo
celular de las hemopatías malignas y a la relativa facilidad para obtener
muestras para realizar estudios secuenciales en los pacientes hematológicos.
4.1. Control de calidad
En hematología, el laboratorio tiene como finalidad realizar medidas
(cualitativas, cuantitativas o estructurales) sobre materias o sistemas
relacionados con la sangre o los órganos hematopoyéticos que contribuyan al
diagnóstico, tratamiento o pronóstico de las enfermedades. Por ello, es de
extraordinaria importancia clínica que todas y cada una de las operaciones que
intervienen en la realización de estas medidas cumplan criterios de calidad.
Estos criterios no sólo afectan las etapas o fases implicadas en la realización
de los procesos analíticos o técnicas propiamente dichas (fase analítica), sino
también todos los procesos indirectamente relacionados con ellos y que se
realizarán antes (fase preanalítica) o después de ella.
Entre los procesos inherentes a la fase preanalítica destacan la solicitud
de las pruebas, la obtención de las muestras y la identificación de los
especimenes, y su transporte al laboratorio. La fase analítica propiamente
dicha, consiste en la realización técnica de las pruebas.
183
En citometría de flujo, como en todas las técnicas analíticas, para
proporcionar unos buenos resultados es fundamental un adecuado programa
de garantía de calidad, que implica la optimización del análisis, de forma que
las células idénticas den los mismos resultados en una muestra, en distintas
muestras en un mismo día, y día a día en un laboratorio, así como en distintos
laboratorios.
Por todo lo expuesto previamente, para conseguir el mayor grado
posible de rigor científico en la realización de un estudio, adquiere un papel
fundamental la garantía de calidad. Conscientes de todo ello, en este trabajo se
ha considerado un aspecto preponderante el control de calidad, estableciendo
unos criterios claros y estrictos, tanto en la fase preanalítica como en la
analítica, con el fin de garantizar la fiabilidad de los resultados.
4.1.1. Fase preanalítica
En la LLC-B la célula leucémica está presente tanto en médula ósea
como en sangre periférica, presentando el mismo perfil inmunológico en ambas
localizaciones. En nuestro estudio se eligió el análisis inmunofenotípico en
sangre periférica por su fácil accesibilidad, que nos permitía repetir la
extracción en caso de necesitar ampliar el estudio o confirmar determinados
resultados. Respecto al material utilizado para depositar la muestra, este puede
variar según los laboratorios (tubo con heparina, EDTA, etc), en nuestro caso,
seguimos las recomendaciones del International Council for Standardization in
Haematology que aconseja la utilización de un tubo que contenga EDTA como
anticoagulante (Vives y Aguilar, 1997), porque pensamos que es conveniente
seguir métodos estandarizados y aceptados por la mayoría de los grupos de
trabajo. Otro aspecto que consideramos importante fue la identificación de la
muestra, por ello, para evitar errores en esta fase del proceso analítico se
tomaron una serie de medidas, tal como se ha expuesto en el apartado de
material y métodos (doble sistema de identificación, extracción de la muestra
en la Unidad de Citometría), que aunque exhaustivas las consideramos
184
necesarias, ya que, en el laboratorio donde se realizó el estudio se procesan
una gran cantidad de muestras y se realiza análisis por CMF no sólo para los
procesos neoplásicos hematológicos, sino también para subpoblaciones
linfocitarias en pacientes inmunodeprimidos, en un espacio físico cercano.
Por último, reseñar que la temperatura y el tiempo de transporte y
almacenamiento pueden influir sobre la viabilidad celular y la expresión
antigénica, alterando de esta manera las poblaciones celulares, por ello en la
mayoría de los casos las muestras se procesaban en el día. En los casos en
los que fue necesario su almacenamiento, éste se realizó siguiendo las
recomendaciones del grupo de Orfao, por ser las más ampliamente aceptadas
por la mayoría de los laboratorios (Orfao y González de Buitrago, 1995)
4.1.2. Fase analítica
En la fase analítica es imprescindible emplear técnicas estandarizadas,
equipos convenientemente calibrados y reactivos de calidad garantizada. La
calidad de la fase analítica exige, además de la correcta selección de las
técnicas a emplear, la utilización de materiales de control.
Los reactivos empleados en este trabajo cumplen una serie de requisitos
que consideramos de gran importancia para obtener información sobre la
estructura y la distribución antigénica celular. Así los fluorocromos utilizados
presentan las siguientes características:
• Alto coeficiente de extinción a la longitud de onda de excitación
(probabilidad de absorber la luz).
• Alto rendimiento cuántico (emisión de luz).
• Elevada foestabilidad.
• Corto estado de excitación.
185
El sistema de calibración del citómetro de flujo es un aspecto básico y
fundamental de todo el proceso técnico, ya que garantiza la optimización de la
recogida de la señal óptica y el funcionamiento global de la electrónica del
aparato, asegurando la fiabilidad de los resultados obtenidos. En la citometría
de flujo la calibración es el proceso por el cual se enfoca ópticamente el láser y
se mide su potencia. Un aspecto fundamental en el proceso de calibración es la
compensación de fluorescencia. Para la mayoría de los fluorocromos utilizados
en los marcajes múltiples con AcMo, existe un cierto grado de interferencia al
introducirse la luz emitida por un fluorocromo concreto en más de un detector
de fluorescencia, ya que los espectros de emisión de los fluorocromos son
relativamente amplios. Con el fin de resolver este problema, se ha hecho
necesaria la compensación de fluorescencias como fase final del sistema de
calibración. Así pues, este proceso consiste en eliminar de un detector de
fluorescencia toda la señal correspondiente a un fluorocromo cuya luz no debe
recogerse y leerse en ese detector. De esta forma, se consigue que la señal
procesada en cada detector corresponda de forma exclusiva a la luz de un
fluorocromo y por lo tanto de un anticuerpo monoclonal/antígeno específico.
El sistema de calibración utilizado ha sido el método descrito por el
grupo de Orfao (Ciudad y cols, 1998) que utiliza sangre periférica en lugar de
microesferas comerciales. Este aspecto lo consideramos primordial, pues las
células sanguíneas presentan una autofluorescencia natural que hay que tener
en cuenta para realizar un ajuste adecuado de los distintos fluorocromos. En
los sistemas que utilizan las microesferas se puede cometer el error de
considerar como positivo un marcador cuando tan sólo indica un
desplazamiento del mismo por la autofluorescencia natural de las células
sanguíneas.
El control de calidad interno tiene como objetivo garantizar la fiabilidad
de las determinaciones que se realizan en el laboratorio e incide sobre todos y
cada uno de los procesos que se desarrollan en éste, de forma que la
relevancia clínica del resultado (es decir, su contribución al diagnóstico, el
186
tratamiento o la prevención de la enfermedad) quede siempre garantizada.
Para ello, el control de calidad interno consiste en disponer de todos los medios
adecuados para reconocer posibles errores y aplicar, en su caso, las medidas
correctoras necesarias.
En este trabajo se ha orientado el control de calidad interno en dos
aspectos fundamentales: la utilización de especimenes de control y el empleo
de un sistema que nos permita establecer la exactitud de la técnica. Los
controles son un material que produce unos resultados esperados (conocidos).
Se usan para monitorizar las prestaciones o reproductividad de los reactivos y
la calidad de los métodos de preparación celular. En nuestro trabajo se han
utilizado dos tipos de controles: positivos (reactivo que se debe unir a la
superficie de las células incluidas en la muestra) y negativos (reactivo contra
antígenos no presente en la superficie de las células utilizadas en la muestra).
Se necesitan controles negativos para descartar uniones inespecíficas del
fluorocromo (son causa de tinción inespecífica los fragmentos Fc de las
inmunoglobulinas, las células muertas, debrís, etc.) y seleccionar el umbral de
autofluorescencia. Los controles positivos son también esenciales para
comprobar que la técnica funciona, si no se emplean, los resultados negativos
de una muestra que se espera positiva no se sabe si son por alteración
antigénica o fallo en el marcaje. Para el control de exactitud se ha admitido,
que la diferencia entre los dos marcadores que miden la misma población de
linfocitos T, no sea superior al 5%; se ha establecido un porcentaje más
restrictivo que en otros trabajos publicados que admiten el 10% de porcentaje
diferencial (Ciudad y cols, 1998; Urbano y Villamayor, 1992) porque
consideramos que éste es un aspecto esencial en el control de calidad de la
técnica.
187
4.2. Criterios de positividad, intensidad de expresión y patrón de
dispersión para un antígeno
El análisis de los distintos antígenos expresados en la superficie celular
suele ser cuantitativo y definido en base a la positividad o negatividad de los
mismos. Así, el criterio de positividad establecido en nuestro estudio ha sido el
aceptado por la mayoría de los autores, que de forma arbitraria, consideran un
marcador positivo cuando se expresa en más del 20% de las células tumorales
(Lopez-Matas y cols, 2000; Molica y cols, 1998).
Para un análisis más completo de los antígenos celulares, incluimos
otros parámetros que ofrecieran una información más detallada y compleja
sobre la composición antigénica celular, así, se determinó el número de
moléculas de un antígeno expresadas en cada célula o intensidad de
expresión, y la homogeneidad o heterogeneidad en la expresión del mismo.
Esta información se obtuvo a través de dos métodos diferentes con la finalidad
de incrementar la veracidad de los resultados; un método establecido por el
grupo de Matutes (1994) y Orfao (1999), caracterizado por su simplicidad y
rapidez, basado en los valores logarítmicos expresados en los histogramas de
las fluorescencias; el segundo método, utilizado por algunos grupos de
investigadores como Molica (1998) y Lavabre (1994), es más complejo y
precisa consultar con el sistema estadístico del programa informático del
citómetro de flujo para determinar el MFI y CV de cada marcador. Es
interesante reseñar que los resultados son similares por ambos sistemas de
trabajo, por lo que se aconseja utilizar la técnica de Matutes y Orfao por las
ventajas, simplicidad y reproductividad, que supone su empleo en el estudio
inmunofenotipo que se realiza en los laboratorios de rutina.
4.3. Análisis inmunofenotípico de las LLC-B
Los linfocitos B maduros pasan de la médula ósea a la sangre periférica
(donde constituyen el 10-20% del pool de linfocitos circulantes) y se dirigen a
188
los órganos linfáticos periféricos para ubicarse en los folículos linfoides. Aquí,
bajo un estímulo antigénico adecuado, se activan y proliferan formando el
centro germinal en el interior del folículo linfoide. Si no se produce contacto con
el antígeno, los linfocitos regresan de nuevo a la circulación y mantienen su
comportamiento migratorio. Hay que considerar que la mayoría de los linfocitos
B maduros que salen de la médula ósea nunca encontrarán un antígeno. Estas
células morirán después de unos días o semanas, verificándose una enorme y
constante pérdida celular. A pesar de ello, el sistema se mantiene en
permanente equilibrio gracias a la producción diaria de nuevos linfocitos por la
médula ósea. Los linfocitos leucémicos de la LLC-B suelen estar en fase G0 del
ciclo celular, su tasa de proliferación es muy baja, y su acumulación no se
produce por un crecimiento desmedido, uno de los fenómenos implicados en el
desarrollo de la mayor parte de los tumores, sino por la inhibición de la muerte
celular programada (apoptosis).
En la diferenciación linfoide los primeros marcadores que definen una
célula como de estirpe B, son la adquisición del antígeno CD19 y el
reordenamiento de los genes que codifican la síntesis de las inmunoglobulinas.
Tras una serie de pasos madurativos, el linfocito adquiere las inmunoglobulinas
en la membrana, convirtiéndose así en una célula inmunocompetente, con
capacidad de reconocimiento del antígeno. La proliferación linfoide a partir de
este estadio va a constituir los SLPC-B. Por ello, en nuestro estudio el antígeno
CD19 se ha considerado un marcador de línea B definitorio de la población
tumoral y la expresión de una única cadena ligera (kappa o lambda) en la
superficie celular como un indicador de clonalidad.
La LLC-B es el proceso linfoproliferativo crónico más inmaduro desde el
punto de vista inmunofenotípico. Se caracteriza por la presencia de
inmunoglobulinas de superficie de baja intensidad y la expresión del antígeno
CD5 propio de la línea T. Esta proteína se consideraba como exclusiva del
linaje linfocitario T en la hematopoyesis normal, admitiéndose que su
manifestación en linfocitos B se limitaba a las células de la LLC-B. Actualmente
189
se conoce la existencia de linfocitos B normales CD5+, que son los primeros en
aparecer en la ontogenia, predominan durante la vida fetal sobre los linfocitos
convencionales CD5-, y han sido identificados en la sangre periférica de
individuos normales.
En nuestro trabajo hemos analizado los linfocitos B CD5+ en sangre
periférica de controles sanos, observando que representan una población
numéricamente menor de los linfocitos B circulantes (13%), dato que coincide
con lo publicado recientemente por Molica y cols. (1998) que lo cifran en un 10-
20%. Así mismo, analizamos las características fenotípicas del antígeno CD5
en las células leucémicas y en los linfocitos T, observando, que el número de
moléculas expresadas por los linfocitos tumorales era menor que en los
linfocitos T normales, esto podría indicar que el estadio de maduración en el
cual se adquiere este antígeno es diferente en ambas poblaciones.
El equivalente normal de los linfocitos de la LLC-B no está aclarado.
Investigaciones recientes, parecen indicar que la contrapartida normal del
linfocito de la LLC-B, no se halla en esta subpoblación de linfocitos B CD5+
presentes en la sangre periférica de individuos normales, sino en la zona del
manto de los folículos linfoides. Alrededor del 50% de los casos tienen
mutaciones somáticas de los genes de las Ig, lo que sugiere un origen de la
enfermedad en las células B posgerminales, con memoria inmunológica. En el
resto de los casos, los genes de las Ig no están mutados; en tales casos, la
leucemia surgiría a partir de células B pregerminales, sin memoria
inmunológica (Damle y cols, 1999; Hamblin y cols, 1999).
La LLC-B presenta un perfil inmunológico que permite su diferenciación,
en la mayoría de los casos, de otros SLPC-B. En nuestra serie se ha realizado
un estudio amplio de las características antigénicas de las células linfoides B,
con el objetivo de establecer una definición correcta y precisa de la población
tumoral. Debido a que el origen tumoral de la proliferación linfocitaria viene
determinada por la expresión de una única cadena ligera de inmunoglobulina
190
(kappa o lambda) en la superficie celular y a las implicaciones diagnósticas que
ello conlleva, proponemos la utilización sistemática de un reactivo que
contenga en su composición ambas cadenas ligeras, conjugadas con distintos
fluorocromos, evitando errores técnicos que llevarían a un diagnóstico
incorrecto.
El patrón inmunológico expresado por las células leucémicas de nuestra
serie coincide con lo publicado por la mayoría de los autores, confirmándose
una expresión de marcadores B (CD19, CD22, CD79Beta) con una intensidad
inferior a la de los linfocitos B maduros normales de sangre periférica (Witzig y
cols, 1994). No obstante, hemos hallado alguna discrepancia respecto al
porcentaje de casos que expresaban positividad para el AcMo CD22,
observando en nuestro trabajo un discreto aumento del mismo, respecto a lo
referido por otros autores (Bennett y cols, 1989; Kurec y cols, 1992). El motivo
de esta discrepancia podría deberse a la metodología técnica utilizada, ya que
en la década de los 80 y 90 el método empleado por estos investigadores era
la inmunofluorescencia indirecta con un marcaje simple de las células. En
nuestro trabajo hemos empleado un método de inmunofluorescencia directa,
realizando un triple marcaje con AcMo que nos permite ampliar la información,
ya que nos indica la expresión simultanea de los tres antígenos en una misma
célula; esto unido a un claro avance de los sistemas informáticos, ha permitido
aumentar la sensibilidad y especificidad de la técnica en la cuantificación de la
expresión antigénica de las células leucémicas. Por ello, pensamos que este
sistema de análisis aumenta la fiabilidad de los resultados y siempre que el
soporte técnico lo permita, debe realizarse inmunofluorescencia directa, triple
marcaje y un análisis informático que permita un estudio dinámico de los
diferentes marcadores. Este aumento porcentual de las leucemias que
expresaban el AcMo CD22, no se ha visto reflejado en un cambio del sistema
diagnóstico internacional de puntuación establecido por Matutes y cols. (1997),
ya que la mayoría de las leucemias tenían una expresión débil de estos
marcadores, y en este sistema se asigna la misma puntuación tanto a los casos
191
con negatividad para el marcador como aquellos que lo expresaban de forma
débil, no alterándose el diagnóstico final.
Los linfocitos B proliferantes expresan un menor número de moléculas
de Ig en su superficie celular en comparación con los linfocitos B normales, y la
monoclonalidad viene determinada por la expresión de una única cadena ligera
(kappa o lambda) sobre la membrana celular. En nuestra serie se confirman los
resultados reportados por Molica y cols (1998) y Catovsky (1995), que indican
un predominio de las leucemias que expresan la cadena ligera Kappa. Este
hallazgo podría explicarse porque en la hematopoyesis normal, las clonas que
generan linfocitos con cadenas ligeras kappa representan el doble de las que
originan linfocitos con cadenas lambda, con lo que la probabilidad de que
prolifere estas clonal kappa se duplica.
Tal como se ha reseñado previamente, una característica
inmunofenotípica fundamental es que estas células leucémicas suelen expresar
CD5, aunque un porcentaje pequeño de casos pueden ser CD5 negativos.
Actualmente se discute si las LLC-B con negatividad para el antígeno CD5,
pertenecen realmente a este tipo de leucemias o corresponde a otro SLPC, por
ello, el Internacional Workshop en LLC (1989) ha aconsejado que en los
ensayos clínicos solo se incluyan casos de LLC-B CD5+, siguiendo estas
recomendaciones en nuestra serie tan solo hemos incluido casos con
positividad para dicho marcador.
Las células de la LLC-B pueden expresar el receptor transmembrana
CD23, que funciona como un receptor para la IgE y parece tener un papel en el
control del crecimiento y la proliferación de los linfocitos. El porcentaje de
leucemias que expresan este marcador es controvertido, pues la literatura
recoge una variabilidad en la expresión según las series consultadas. Los datos
recogidos por Dighiero y cols (1991) lo cifran en el 60%, mientras que Newman
y cols (1993) lo sitúan en un 70% de los casos, nuestra serie muestra
porcentajes claramente superiores (99%) coincidentes con el grupo de Matutes
192
y cols. (1994). Pensamos que estas diferencias son debidas a la falta de
uniformidad en los criterios diagnósticos de los SLPC-B, pudiéndose incluir
casos como LLC-B que son CD5 positivos y CD23 negativos, cuando en
realidad se trataba de linfomas del manto. En este sentido, consideramos de
especial relevancia la elaboración del sistema de puntuación del grupo de
Matutes (1997), que es aceptado por la mayoría de los autores y colabora a
aunar criterios. Por todo lo expuesto, pensamos que la realización de un
estudio de SLPC-B debe incluir como requisito fundamental dicho sistema
diagnóstico, que permite comparar los resultados con otros grupos de trabajo y
aumentar el rigor científico de los mismos.
Otros marcadores menos específicos de LLC-B que se expresan en una
minoría de casos son: el CD11c, que es un antígeno característico de otro
SLPC-B, la tricoleucemia, pero que a diferencia de esta en que suele tener una
intensidad de expresión fuerte, en la LLC-B es moderada o débil, y el antígeno
CD10 (CALLA) que suele ser negativo, datos coincidentes con lo hallado en
nuestro estudio.
Respecto al marcador de activación celular CD25, en nuestra serie el
porcentaje de casos positivos es inferior al referido por otros autores (Newman
y cols, 1993). Esto podría ser debido a diferencias metodológicas o a que el
fluorocromo utilizado en nuestro estudio es el isocianato de fluoresceína (FITC)
que presenta algunos inconvenientes en la detección de antígenos expresados
en cantidades relativamente bajas. Para confirmar nuestros resultados se
debería realizar el marcaje con ficoeritrina (PE), que es sin duda el fluorocromo
de mayor potencia en el inmunofenotipaje celular y de elección para la
cuantificación de antígenos concretos, ya que permite la detección de un
pequeño número de moléculas.
En lo que se refiere a la expresión de otros marcadores de línea T,
distintos del CD5, no hallamos expresión de CD2 ni CD3 en ningún caso,
hallazgo similar a lo publicado en revisiones recientes que lo cifran en el 1%
193
(Cheson y cols, 1996); probablemente el aumento del tamaño muestral en
nuestra serie conduciría a porcentajes similares a los reseñados. Esto
contrasta con lo comunicado en 1992 por Kurec y cols que lo cifraban hasta en
un 28% de las leucemias, creemos que estas diferencias se deben a que las
muestras utilizadas por este autor probablemente estaban contaminadas por
linfocitos T normales, ya que el marcaje utilizado fue simple empleando un solo
AcMo en cada determinación, lo que dificulta la distinción de la población
tumoral de los linfocitos normales residuales.
A modo de resumen, podríamos decir que el perfil fenotípico de las LLC-
B aceptado por la mayoría de los autores es el siguiente:
• Expresión de bajas cantidades de cadenas ligeras en la superficie
celular.
• La mayoría de los casos expresan el marcador de activación celular
CD23 y el antígeno CD5 (con negatividad para el resto de marcadores
T).
• Expresan marcadores B, con intensidad inferior a la de los linfocitos B
maduros normales de sangre periférica.
Las leucemias incluidas en el estudio presentaban el patrón inmunológico
característico de las LLC-B previamente reseñado, sin embargo, consideramos
que se podía ampliar las características definitorias del perfil fenotípico
añadiendo un concepto nuevo como es la dispersión en la expresión
antigénica, es decir, determinar si las células de una misma leucemia
expresaban una intensidad antigénica similar (patrón homogéneo) o por el
contrario expresaban distintas intensidades para el mismo antígeno (patrón
heterogéneo). Este concepto fue empleado por el grupo de Orfao (1999) para
la caracterización fenotípica de la leucemia aguda promielocítica, pero no había
sido utilizado en los procesos linfoproliferativos crónicos. Así mismo, pensamos
que era interesante establecer un sistema cuantitativo que permitiese
establecer con exactitud las distintas intensidades de expresión y la dispersión
194
de los marcadores, por ello se estableció, de forma arbitraria, distintos puntos
de corte para el MFI y el CV para cada AcMo, que aunque conscientes de que
no es un método ágil para ser empleado de forma rutinaria, si puede servir para
los casos en que el sistema de escala logarítmica de los histogramas ofrezca
dudas. En base a ello, el patrón inmunológico de la LLC-B puede quedar
definido de la siguiente forma:
• Expresión de marcadores B, con intensidad inferior a la de los linfocitos
B maduros normales de sangre periférica, y un patrón homogéneo.
• La mayoría de los casos expresan el marcador de activación celular
CD23 y el antígeno CD5 (con negatividad para el resto de marcadores
T), con intensidad débil o moderada y un patrón heterogéneo.
• Baja intensidad de expresión de cadenas ligeras en la superficie celular,
con un patrón homogéneo para las cadenas kappa y heterogéneo para
las cadenas lambda.
5. ALTERACIONES DE LA INMUNIDAD EN LA LLC-B
El sistema inmune está constituido por una compleja red de células y
moléculas distribuidas por todo el organismo y dotadas con diferentes
capacidades funcionales, que forman su base estructural. La característica
biológica esencial y distintiva de este sistema, es la capacidad que algunos de
sus componentes poseen de reconocer de forma específica fragmentos
moleculares o antígenos. Esta capacidad de reconocimiento, con la
subsiguiente activación celular y desarrollo de los mecanismos efectores,
conceden al sistema inmune una función relevante entre los mecanismos de
defensa del organismo frente a infecciones y neoplasias. Escapar al control del
sistema inmune es una de las estrategias de persistencia tumoral, en el caso
de la LLC-B, se añade la peculiaridad de que las propias células neoplásicas
son parte de la respuesta inmune.
195
El componente celular de este sistema está formado por una serie de
poblaciones de características morfológicas y funcionales muy heterogénea.
Existen dos tipos linfocitarios fundamentales, T y B, que a su vez constan de
diversas subpoblaciones, las cuales pueden ser diferenciadas en virtud de
características inmunológicas, enzimáticas, morfológicas y funcionales.
Los linfocitos T constituyen el 60-70% de las células mononucleadas de
sangre periférica. En términos generales, se definen dos tipos de linfocitos T:
los que expresan en la superficie el antígeno CD3 y RCTαβ (linfocitoαβ), y los
que expresan en la superficie el CD3 y RCTγδ (linfocitosγδ):
• Linfocitos T ααααββββ. Los linfocitos T αβ tienen un fenotipo similar al de los
timocitos maduros, siendo o bien CD4+, o bien CD8+, predominando los
primeros sobre los segundos en una relación CD4/CD8: 1,5-2,5. Son los
linfocitos T predominantes en la sangre periférica. Los linfocitos T CD4+
desarrollan un papel fundamental como células cooperadoras, tanto para
las respuestas de Ac por parte de los linfocitos B como para las
respuestas de citotoxicidad específica de los linfocitos T CD8+. Los
linfocitos T CD8+ reconocen al antígeno y una vez activados, lisan a las
células que lo presentan, se trata de linfocitos T citotóxicos y
desempeñan un papel decisivo para eliminar las células infectadas por
virus y están implicados en los mecanismos de defensa antitumoral.
• Linfocitos T γγγγδδδδ. Constituyen una pequeña proporción de los linfocitos T
de sangre periférica, menos del 5%, en nuestra serie representan el 4%.
Su expresión en la membrana va asociada a las moléculas CD3, al igual
que ocurre con el RCTαβ. Los timocitos con RCTγδ no pasan por el
estadio de coexpresión de CD4 y CD8, y en sangre periférica aparecen
también sin expresar ni CD4 ni CD8. No se conoce con exactitud la
función fisiológica de estas células CD3γδ, ni su papel en la respuesta
inmune.
196
• Linfocitos CD3+/CD4+/CD8+. La mayoría de los linfocitos T maduros
de sangre periférica, expresan CD4 o CD8, pero no ambos. Sin
embargo, se ha demostrado que en sangre periférica de individuos
sanos existen linfocitos T que coexpresan CD4 y CD8, en un porcentaje
muy bajo que en nuestro estudio se sitúa en el 1.3%, cuya función y
ontogenia se desconocen, ya que es difícil realizar estudios funcionales
en esta subpoblación tan minoritaria.
En este trabajo se ha realizado un análisis de estas subpoblaciones
linfocitarias T en individuaos sanos y en pacientes con LLC-B.
5.1. Poblaciones linfocitarias en controles
La determinación de las distintas subpoblaciones linfocitarias en un
grupo control, que sirviera de rango de referencia para realizar un posterior
estudio comparativo con la población leucémica, requería establecer unos
criterios metodológicos estandarizados y que contasen con el mayor consenso
entre los distintos grupos de trabajo, pues de la veracidad de estos resultados
dependía la fiabilidad del análisis comparativo, así, errores en la selección de la
población, la muestra utilizada, los reactivos o la metodología, invalidarían los
resultados y las conclusiones derivadas de ellos. La revisión de la literatura
mostraba poca uniformidad en las técnicas, criterios de análisis o de
expresividad de los distintos marcadores, en base a ello, en 1994 se elaboró un
documento consenso para la obtención de valores de referencia de las
subpoblaciones linfocitarias (McCoy y cols, 1994), en el se establecían las
distintas condiciones que deben reunir este tipo de estudios y que han sido
seguidas en el nuestro:
� El método de elección es el inmunofenotipaje celular por CMF.
� Se aconseja la utilización de marcajes múltiples (dobles o triples) que
permiten un análisis multiparamétrico de la expresión antigénica.
197
� Establecen como requisito básico la realización de un control de calidad
interno.
� Aconsejan elaborar la técnica en las primeras 24 horas tras la
extracción, y en el caso que las muestras tengan que ser guardadas se
realice a temperatura ambiente.
� Utilización de técnicas de lisado de hematíes para facilitar la separación
de la población linfocitaria.
� Los datos poden ser expresados en porcentajes o valores absolutos.
Entre las variables biológicas que pueden influir en los valores de las
subpoblaciones linfocitarias se encuentra la edad, así, nos planteamos si
teníamos que establecer un rango de edad estricto en el grupo control o por el
contrario este podía ser amplio. Hay consenso en la literatura respecto a la
existencia de diferencias entre la infancia y la edad adulta, los hallazgos
sugieren que el porcentaje de células que expresan CD4 (linfocitos T
colaboradores) y células CD19 positivas (linfocitos B), así como, el número
absoluto de linfocitos es mayor en la infancia y decrece con la edad. Por el
contrario, el porcentaje de células que expresan CD8 (linfocitos T supresores)
es menor en la infancia y se incrementa con la edad. Respecto a las
variaciones en las distintas etapas de la edad adulta, la revisión de la literatura
muestra que existen pocos cambios antes de los 65 años, sin embargo, a partir
de los 65-70 años se sugiere una tendencia a un débil descenso en el
porcentaje y valor absoluto de las células T CD3+ y que esto es debido a un
descenso de los linfocitos T CD8, que conlleva a un incremento del cociente
CD4/CD8. En relación con las repercusiones clínicas de estos cambios, en la
mayoría de los ensayos clínicos estas diferencias no son significativas (Goto y
Nishioka, 1989; Tollerud y cols, 1990), y el documento de consenso (McCoy y
cols, 1994) indica que actualmente no existe ninguna razón para establecer
unos rangos específicos en la etapa geriátrica en los laboratorios de citometría
de flujo ni en la evaluación de las leucemias agudas o crónicas. En nuestro
estudio la edad media del grupo control era menor que en la población
leucémica, y pensamos que de existir algún nivel de sesgo, éste sería el
198
hallazgo de unos porcentajes de CD8 inferiores en los casos, pero por el
contrario, como se discutirá posteriormente, se hallo un aumento significativo
de células CD8 en los casos respecto al grupo control, lo que indica que a
pesar del descenso de la población CD8 con la edad en los pacientes
leucémico se producía un aumento relevante de dicha subpoblación.
Otra variable biológica a considerar era el sexo, en este sentido, algunos
estudios señalan un débil aumento del número de células T CD4+, un
descenso de linfocitos CD8+ y el mismo número de linfocitos T CD3+ en
mujeres comparadas con los hombres (Goto y Nishioka, 1989). Estas
diferencias son mínimas y no han sido confirmadas por todos los
investigadores, al mismo tiempo, algunos datos indican que si estas diferencias
existen, desaparecerían con el aumento de la edad. En este sentido, el
documento consenso establece que si la población a estudio incluye ambos
sexos deben ser utilizados rangos de referencias comunes, criterio que hemos
seguido en nuestro trabajo.
Para la realización de un estudio comparativo entre nuestros resultados
y lo publicado por otros investigadores, era aconsejable alcanzar un buen nivel
de reproductibilidad y que las series comparadas utilizaran unos criterios de
estandarización similares tanto en la fase preanalítica como en la analítica. En
este sentido, recientemente el grupo italiano ha publicado un estudio
multicéntrico para establecer los valores normales de referencia de las
subpoblaciones linfocitarias de sangre periférica en adultos sanos
(Santagostino y cols, 1999). En este estudio el tamaño muestral era de 1311
controles, el método utilizado el inmunofenotipaje celular por CMF requiriendo
la adquisión de 10.000 eventos y la creación de una ventana en el área de
linfocitos; la fase pre-analítica y analítica se realizó siguiendo los criterios del
International Federation of Clinical Chemistry (IFCC), así mismo, utilizaron un
aspecto metodológico que consideramos fundamental, como es el empleo de
un doble marcaje que incluya el AcMo CD3, que permite la definición de las
subpoblaciones linfocitarias T CD4+ y CD8+. Tradicionalmente se ha empleado
199
un marcaje simple (CD4 o CD8) que es una fuente potencial de confusión, ya
que, tan solo el 80% de las células CD8 expresan CD3, incluyéndose como
linfocitos T las células NK. Todo ello, conduce a que el cociente CD4/CD8 haya
sido de forma convencional menor que lo recogido por publicaciones más
actuales. En nuestro trabajo se siguen criterios metológicos similares a los
empleados por el grupo italiano y los resultados son similares a lo reseñado por
dicho grupo, tanto en lo referente a los valores porcentuales como absolutos, y
a su vez coincide con lo publicado en otra serie reciente por Hulstaert y cols
(1994). Por último reseñar, que en ninguna de las series mencionadas se han
cuantificado dos poblaciones minoritarias en sangre periférica, los linfocitos T
dobles negativos (CD4-/CD8-) y los linfocitos dobles positivos (CD4+/CD8+),
para ello se ha recurrido a lo publicado por Stewart y Stewart (1993), que
analizan estas subpoblaciones estableciendo límites máximos y mínimos,
observando datos similares a los obtenidos en nuestro estudio.
5.2. Poblaciones linfocitarias en pacientes
En la LLC-B las primeras investigaciones se centraron en el estudio de la
célula B tumoral, alcanzándose un avance significativo en el conocimiento de la
biología del clon maligno. Recientemente numerosos estudios han sido
orientados al análisis de las células inmunoreguladoras no malignas
circulantes, para determinar la existencia de defectos inmunes que pudiesen
estar implicados en el origen de la neoplasia y en su comportamiento maligno.
El primer atributo de las células de la LLC-B es su autonomía, por la cual
no responderán de manera apropiada a la compleja serie de mecanismos
reguladores que gobiernan la proliferación y la diferenciación de las células
linfoides normales. El proceso por el que se genera la neoplasia puede ser
debido a una serie de cambios celulares por los que una célula normal, o un
clon celular, se vuelve refractaria a la regulación de su diferenciación y
proliferación.
200
Las células que han sufrido de ese modo un cambio en su
comportamiento biológico y se han trasformado en malignas, podrían expresar
antígenos alterados y ser reconocidas y destruidas por las células citotóxicas
de vigilancia inmunológica. Por tanto, para el desarrollo del proceso leucémico
son necesarios otros cambios, además de la pérdida de la disciplina de
crecimiento, como, por ejemplo, la supresión de la expresión de moléculas de
superficie necesarias para el reconocimiento inmune. Otro mecanismo que
explicaría el desarrollo neoplásico es la existencia de una alteración simultánea
del sistema de vigilancia inmunológica. En este sentido, nuestro estudio analiza
la población linfoide T y sus distintas subpoblaciones para investigar posibles
alteraciones de la inmunidad celular y su relación con las características
clínicas y biológicas de la enfermedad.
La revisión de la literatura muestra resultados discordantes respecto a
los cambios en las subpoblaciones linfocitarias T, que pueden reflejar
diferencias en los criterios diagnósticos establecidos para seleccionar la
población a estudio, así como, en las técnicas utilizadas. Los primeros estudios
se realizaron con suspensiones de linfocitos T enriquecidos que podían estar
contaminados con linfocitos B, posteriormente se utilizaron técnicas de
inmunofenotipaje celular con marcaje simple que dificultaba la discriminación
de las distintas subpoblaciones. Las series publicadas en la década de los 80
presentaban algunas limitaciones técnicas que unido al escaso número de
pacientes incluidos dificultaba la elaboración de conclusiones. En los últimos
años los avances en el inmunofenotipaje celular por CMF con la introducción
de citómetros que permiten realizar un análisis multiparamétrico, el desarrollo
de AcMo de alta sensibilidad y la elaboración de unos criterios diagnósticos que
gozan de una amplia aceptación y consenso, nos han llevado a realizar un
nuevo análisis de estas las subpoblaciones T y sus implicaciones en la
patogenia de la enfermedad.
En los pacientes con LLC-B la célula predominante es el linfocito B
tumoral, representando los linfocitos T un mínimo porcentaje de las células de
201
sangre periférica. Sería lógico pensar, que la acumulación de los linfocitos
leucémicos en la médula ósea llevaría a una anulación del resto de las series
incluidos los precursores linfoides T. Sin embargo, nuestros resultados
muestran un aumento significativo del valor absoluto de los linfocitos T en los
pacientes leucémicos respecto a los controles, confirmando lo publicado en la
literatura por la mayoría de los autores (Brigss y cols, 1991; Kimby y cols, 1987;
Tötterman y cols, 1989). No obstante, una revisión exhaustiva sobre este
aspecto, nos ha llevado a encontrar resultados contradictorios en el estudio
reciente realizado por Frolova y cols. (1995) que no encuentran un aumento de
los valores absolutos de los linfocitos T. Sin embargo, estos hallazgos no
deben cuestionar los resultados anteriores, ya que, el diseño del estudio estaba
más orientado a un análisis genético que inmunofenotípico, y el escaso número
controles (11 controles) incluidos imposibilita la elaboración de valores de
referencia para realizar el análisis comparativo y ponen en duda la veracidad
de los resultados.
La expansión de esta población de células T es probablemente de
naturaleza policlonal como parece deducirse de la ausencia de anormalidades
cromosómicas y la heterocigozidad para la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.
La razón para esta expansión policlonal de células T en la LLC-B se
desconoce. Para explicar este aumento de las células T, establecimos la
hipótesis que podría ser un mecanismo reactivo del sistema inmune de lucha
antitumoral, por ello, como posteriormente veremos, estas alteraciones se
relacionaron con parámetros clínicos-biológicos de carga tumoral.
Respecto a las distintas subpoblaciones linfocitarias, la revisión de la
literatura mostraba datos discordantes. La mayoría de los investigadores
coincidían en reseñar un aumento de los linfocitos T CD8+ y un descenso del
cociente CD4/CD8 (Burger y cols, 1990; Tötterman y cols, 1989), aunque otros
hallaban un incremento de los linfocitos T CD4+ con normalidad o aumento del
cociente (kimby y cols, 1989; Vuiller y cols, 1988).
202
Pensamos que estas divergencias de resultados podían ser debidas a
diferencias metodológicas. Así, observamos que en la mayoría de los casos el
estudio inmunofenotípico se realizaba con marcaje simple, es decir, para la
identificación de las distintas subpoblaciones se empleaba un solo AcMo, CD4
o CD8, sin inclusión del CD3, como consecuencia se podía incluir un factor de
confusión, al contabilizar como linfocitos T CD8+, células NK. Las células NK
se definen desde el punto de vista inmunológico por la positividad para el
antígeno CD56, negatividad para CD3 y expresión débil de CD8. Para una
cuantificación precisa de las poblaciones T es necesario realizar como mínimo
un doble marcaje de las células con los AcMo CD3-CD4, y CD3-CD8. Pero con
este sistema no se puede cuantificar los linfocitos dobles negativos (CD4 -
/CD8-) ni la población doble positiva (CD4+/CD8+), siendo necesario para ello
la introducción de técnicas con triple marcaje.
Otro de los motivos para la heterogeneidad de resultados podía ser
debido a la inclusión de pacientes que habían recibido los tres meses previos al
estudio tratamiento citostático, pues, como demostró Kimby y cols. (1989), tras
la administración de quimioterapia se producía una disminución de los linfocitos
T CD8+ y un incremento del cociente CD4/CD8.
Por todo lo expuesto previamente, para evitar estos posibles elementos
de sesgo, en nuestro estudio se realizó inmunofenotipaje celular por CMF con
utilización de técnica de triple marcaje e inclusión de pacientes que no habían
recibido tratamiento citostático o éste había dejado de ser administrado al
menos tres meses antes del estudio inmunológico.
Nuestros resultados muestran un porcentaje de linfocitos T CD4+
significativamente menor en los pacientes leucémicos respecto a los controles,
por el contrario, los linfocitos T CD8+ están aumentados y el valor absoluto de
los mismos en la población leucémica duplica el hallado en los controles, en
consecuencia, el cociente CD4/CD8 está significativamente descendido en los
casos respecto a los controles. Estos datos coinciden con lo publicado
203
recientemente por otros autores que utilizan una metodología similar a la
empleada en nuestro trabajo (Dianzani y cols, 1994; Podhorecka y cols, 2001),
y, así mismo, confirman lo publicado previamente por otros investigadores que
aunque tenían algunos defectos técnicos, el gran predominio de la población T
CD8+ les condujo a conclusiones similares.
Finalmente, quisiéramos reseñar que aunque la mayoría de los linfocitos
T maduros expresan CD4 o CD8, en la sangre periférica de individuos sanos
existen linfocitos T que coexpresan ambos antígenos (linfocitos T dobles
positivos) y linfocitos T que no expresan ninguno de los dos marcadores
(linfocitos T dobles negativos), representando un porcentaje muy bajo de la
celularidad linfoide, que en nuestro estudio se sitúa en el 1.3% y 2,7%
respectivamente, y cuya función y ontogenia se desconocen. En nuestra serie
ambas poblaciones se encuentran elevadas en los pacientes leucémicos, sin
embargo, estos datos no han podido ser contrastados, pues, en las revisiones
realizadas no hemos encontrado ninguna publicación que analice estas
poblaciones minoritarias de sangre periférica.
6. RELACIÓN ENTRE LAS ALTERACIONES DE LA INMUNIDAD EN LA
LLC-B Y PARÁMETROS CLÍNICOS-BIOLÓGICOS
6.1. Indicadores de masa tumoral
En nuestro estudio se han analizado distintas variables determinantes de
la masa tumoral, entre ellas destacan los estadios clínicos desarrollados a
principios de los años 80 por Rai y por Binet, basados en parámetros biológicos
y clínicos fáciles de obtener, siendo extremadamente importantes en la
definición del pronóstico de los pacientes con LLC-B, y continúan constituyendo
el criterio más ampliamente utilizado en la práctica clínica y en los ensayos
terapéuticos.
204
La relación de las distintas subpoblaciones linfocitarias con los estadios
clínicos de Rai y de Binet en nuestra serie, mostró que el porcentaje de
linfocitos T CD8+ era significativamente mayor en estadios clínicos avanzados
respecto a estadios precoces. Estos hallazgos confirman lo publicado por otros
autores (Aguilar-Santelises y cols, 1995; Geisler y cols, 1991; ZaKnoen y Kay,
1990) y, aunque su patogenia es desconocida, pensamos que las alteraciones
de la inmunidad celular pueden estar relacionada con la severidad clínica de la
enfermedad.
Otra subpoblación que se hallo incrementada en los estadios clínicos
avanzados de la LLC-B en nuestro estudio, fue los linfocitos T dobles
negativos. Estos datos no han podido ser contrastados con otras series, porque
en las revisiones realizadas no hemos encontrado ninguna publicación que
analice esta subpoblación linfocitaria en este tipo de leucemias.
El análisis de otros indicadores de carga tumoral mostró que la elevación
de los linfocitos T CD8+ por encima de la media del grupo control, fue más
frecuente en los pacientes que presentaban cifras elevadas de β2-
microglobulina, LDH, linfocitos y células CD19+ en sangre periférica, aunque
tan solo alcanzaron significación estadística las cifras de linfocitos y células
CD19+. Resultados similares se hallaron en la subpoblación de linfocitos T
dobles negativos. Al igual que en el apartado anterior, estos datos no han
podido ser comparados con otras series porque en la literatura consultada tan
solo se han evaluado los estadios clínicos de Rai y de Binet, sin inclusión de
otros parámetros pronósticos.
En síntesis, podríamos decir que los hallazgos de nuestro estudio
muestran que entre todas las subpoblaciones linfocitarias son los linfocitos T
CD8+ y los linfocitos T dobles negativos los que se relacionan con una mayor
carga tumoral. Pensamos que estas alteraciones de la inmunidad celular en la
LLC-B podrían ser debidas a una respuesta inmunitaria específica frente al
proceso leucémico. Los linfocitos T CD8+ reconocen péptidos unidos a
205
moléculas HLA de clase I y se comportan como linfocitos T citotóxicos frente a
determinadas proteínas sintetizadas por las células, como los antígenos
tumorales. Por ello, los linfocitos T CD8 podrían jugar un papel relevante frente
a los procesos tumorales. Respecto a los linfocitos T dobles negativos no se
conoce con exactitud la función fisiológica de estas células, ni su papel en la
respuesta inmune, aunque se ha demostrado un efecto citolítico contra
diferentes dianas, que podría incluir las células tumorales, por este motivo se
ha sugerido que pueden estar implicados en la vigilancia anti-tumoral del
organismo.
6.2. Patrón inmunofenotípico de las LLC-B
En nuestro estudio se analizó la posible correlación entre las
subpoblaciones T y los distintos parámetros fenotípicos de la LLC-B,
observando que en el grupo de pacientes que presentaban unas cifras de
linfocitos T CD8+ superiores a la media de los controles, las células leucémicas
mostraban unas características inmunológicas diferentes a las del grupo
general. Así, la intensidad de expresión de los antígenos característicos de
células B, CD22 y CD79β, y del marcador de activación celular CD23 era
superior al grupo general, con un patrón de dispersión distinto. La positividad
para otro marcador de activación celular, el CD25, fue superior en dicho grupo
y la cadena ligera predominante en la superficie celular fue la cadena lambda
de intensidad moderada. Estos datos no han podido ser contrastados porque
en las revisiónes de la literatura realizadas, no hemos encontrado ningún
estudio que relacione las alteraciones de la población T con las características
inmunofenotípcas de las células leucémicas.
Todo ello sugiere que un determinado patrón inmunofenotípico en la
célula leucémica, con expresión de un mayor número de moléculas
antigénicas y cambios en el patrón de dispersión, podría ir asociado a un
aumento de linfocitos T CD8+. Una explicación de este hallazgo, podría ser que
esta expresión antigénica, favorecería el reconocimiento en la célula leucémica
206
de determinados péptidos y supondrían una señal de activación del mecanismo
citotóxico mediado por los linfocitos CD8+.
6.3. Alteraciones de la inmunidad humoral
La hipogammaglobulinemia es la principal causa de infección en los
pacientes con LLC-B, aunque su patogenia no está completamente dilucidada,
puesto que este fenómeno es raro en otras neoplasias de células B.
Entre los posibles mecanismos patogénicos se incluye el propuesto por
Briggs y cols. (1990) que sugieren como causa de la hipogammaglobulinemia
el desplazamiento de los linfocitos normales por el clon leucémico. Sin
embargo, como se demuestra en nuestro estudio, los valores absolutos de
linfocitos T y células B no tumorales son normales o están aumentados en
estos pacientes.
Respecto al papel que las distintas subpoblaciones T pudieran
desempeñar en el desarrollo de la hipogammaglobulinamia, los datos sobre las
células cooperadoras y supresoras son contradictorios y no hay consenso al
respecto en la literatura (Apostolopoulos y cols, 1990; Chapel y Buch, 1987;
Kunicka y Platssoucas, 1988). En este sentido, en nuestro estudio no se hallo
relación entre las alteraciones de las subpoblaciones T y el descenso de las
cifras de inmunoglobulinas. Pensamos que el origen de la
hipogammaglobulinemia es probablemente multifactorial e incluiría alteraciones
funcionales de los linfocitos T que, aunque presentan valores normales, son
funcionalmente incompetentes (defectos en la secreción de determinadas
citoquinas) para realizar la activación de las células B no tumorales.
Finalmente, las alteraciones de la inmunidad celular y sus implicaciones
con determinadas características biológicas de la LLC-B halladas en nuestro
trabajo, podrían sugerir la posibilidad de manipular la respuesta inmunitaria en
estrategias terapéuticas contra el cáncer. En este sentido, los esfuerzos
207
actuales van encaminados a aumentar la potencia y especificidad de la
respuesta inmunitaria frente a los tumores. Así, un área de creciente interés es
el empleo de células dendríticas modificadas, que presentarían antígenos
tumorales, generando una respuesta muy potente de células T CD8+
citotóxicas específicas frente a ese tumor. Otra estrategia empleada en la
inmunoterapia de las leucemias es la manipulación de las mismas células
leucémicas para potenciar su inmunogenicidad y estimular la respuesta del
sistema inmune frente a ellas. Actualmente se están diseñando ensayos
clínicos para investigar los efectos inmunológicos y clínicos que producen las
células dendríticas y las vacunas con células tumorales modificadas.
Por todo lo anteriormente expuesto, pensamos que el análisis de las
características inmunofenotípicas de las poblaciones linfocitarias realizadas en
nuestro estudio, puede contribuir a un mejor conocimiento del papel que las
alteraciones del sistema inmunorregulador pueden tener en la LLC-B.
209
1. Los linfocitos B CD5+ son las células predominantes en la sangre periférica de
los pacientes con LLC-B, en cambio en los individuos sanos representan una
población numéricamente menor de los linfocitos B circulantes. El análisis
inmunofenotípico del antígeno CD5 muestra que el número de moléculas
expresadas por los linfocitos tumorales es menor que en los linfocitos T
normales, lo que podría sugerir que el estadio de maduración en el cual se
adquiere el antígeno es diferente en ambas poblaciones.
2. El perfil inmunofenotípico característico de la LLC-B, en base a nuestros
resultados, puede quedar definido de la siguiente forma:
• Expresión de marcadores B, con intensidad inferior a la de los linfocitos
B maduros normales de sangre periférica y un patrón homogéneo.
• Expresión del marcador de activación celular CD23 y el antígeno CD5,
con intensidad débil o moderada y un patrón heterogéneo.
• Expresión de bajas cantidades de cadenas ligeras en la superficie
celular, con un patrón homogéneo para las cadenas kappa y
heterogéneo para las cadenas lambda.
3. El estudio de las células inmunorreguladoras no malignas circulantes muestra
un aumento del valor absoluto de los linfocitos T y células B normales en los
pacientes leucémicos respecto al grupo control.
4. El análisis inmunofenotípico por citometría de flujo de las distintas
subpoblaciones T en los pacientes con LLC-B, mostró un descenso del
porcentaje de linfocitos T CD4+ y un aumento de los linfocitos T CD8+, de los
linfocitos T dobles positivos y de linfocitos T dobles negativos.
210
5. La relación de las distintas subpoblaciones linfocitarias con los indicadores de
masa tumoral, mostró que el porcentaje de linfocitos T CD8+ y linfocitos T
dobles negativos se relacionan con una mayor masa tumoral. Pensamos que
estas alteraciones de la inmunidad celular en la LLC-B podrían ser un
mecanismo reactivo del sistema inmune de lucha antitumoral.
6. Nuestros datos indican que un determinado patrón inmunofenotípico en la
célula leucémica, con expresión de un mayor número de moléculas
antigénicas y cambios en el patrón de dispersión, se asocian a un aumento de
linfocitos T CD8+. Una explicación de este hallazgo, podría ser que esta
expresión antigénica, favorecería el reconocimiento en la célula leucémica de
determinados péptidos y supondrían una señal de activación del mecanismo
citotóxico mediado por los linfocitos CD8+.
7. Las alteraciones del sistema inmunorregulador y sus implicaciones con
determinadas características biológicas de la LLC-B halladas en nuestro
trabajo, sugieren la posibilidad de emplear estrategias de inmunoterapia en
este tipo de neoplasias, encaminadas a aumentar la potencia y especificidad
de la respuesta inmunitaria frente al tumor.
212
Abramson S, Miller RG, Phillips RA. The identification in adult bone marrow of pluripotent and restricted stem cells of the myeloid and lymphoid systems. J Exp Med 1977; 145: 1.567-1579.
Adami J, Gridley G, Nyren O. Sunlight and non-hodgkin´s lymphoma: a
population-based cohort study in Sweden. Int J Cancer 1999; 80: 641-645. Aguilar-Santelises M, Loftenius A, Ljungh C, Svenson B, Andersson B,
Mellstedt H, et al. Serum levels of helper factors (IL-1α, IL-1β and IL-6), T-cell products (sCD4 and sCD8), sIL-2R and β2-microglobulin in patients with B-CLL and bening B lymphocytosis. Leukemia Research 1995; 16 (6): 607-613.
Algarra I, Garrido F. Inmunidad y tumores. En: Castillo R, Estapé J, Foz M,
Lience E, Monserrat E, Revert LL, editors. Medicina Interna. 13ª ed. Madrid: Hacourt Brace 1994; 2729-2731.
Álvarez-Mon M, García Suárez J. Bases estructurales del sistema inmune. En:
López Borrasca A, Arocha C, Campos C, Parreira A, Pavlovsky S, Ruiz Arguelles G, editors. Enciclopedia Iberoamericana de Hematología. 1ª ed. Salamanca: Ediciones Universidad de Salamanca 1992; 67-80.
Anaissie EJ, Kontoyiannis DP, O´Brien S, Kantarjian H, Robertson L, Lener S.
Infections in patients with chronic lymphocytic leukemia treated with fludarabine. Ann Intern Med 1999; 6: 253-261.
Andrian UH, Mackay CR. T cell function and migration. N Engl J Med 2000;
343(14): 1020-1034. Ansell SM, Li CY, Lloyd RV. Epstein-Barr virus infection in Richter´s
transformation. Am J Hematol 1999; 60: 99-104. Apostolopoulos A, Symeonidis A, Zoumbos N. Prognostic significance of
immune function parameters in patients with chronic lymphocytic leukaemia. Eur J Haematol 1990; 44: 39-44.
Arker DC. T cell-dependent B cell activation. Ann Rev Immunol 1993; 11: 331-
340. Arstila TP, Casrouge A, Baron V, Even J, Kanellopoulos J, Kourilsky P. A direct
estimate of the human αβ T cell receptor diversity. Science 1999; 286: 957-61.
Baldini L, Cro L, Cortelezzi A, Calori R, Nobili L, Maiolo AT, et al.
Immunophenotypes in classical B-cell chronic lymphocytic leukemia. Cancer 1990; 66: 1738-1742.
Bartik M, Welker D, Kay NE. Impairment in immune cell function in B cell
chronic lymphocytic leukemia. Seminars in Oncology 1998; 25: 27-33.
213
Batata A, Shen B. Immunophenotyping of subtypes of B-chronic (mature) lymphoid leukaemia. Cancer 1992; 70: 2436-2443.
Beaume A, Brizard A, Dreyfus B. High incidence of serum monoclonal Igs
detected by a sensitive immunoblotting technique in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 1994; 84: 1216-1219.
Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, Flandrin G, Galton DAG, Gralnicck HR, et
al. Proposals for the classification of chronic (mature) B and T lymphoid leukemias. J Clin Pathol 1989; 42: 567-584.
Bernard A, Bomsell L, Reinherz EL, Nadler LM, Ritz JH, Coppis H, et al. Cell
surface characterization of malignant T cells from lymphoblastic lymphomas using monoclonal antibodies: Evidence for phenotypic differences between malignant T cells from patients with acute lymphoblastic leukemia and lymphoblastic lymphoma. Blood 1981; 57: 1105-1113.
Bernard M, Drenou B, Pangault C. Spontaneous phenotypic and molecular
blood remission in a case of chronic lymphocytic leukaemia. Br J Haematol 1999; 107: 213-214.
Bidwell J. DNA-RFLP analysis and genotyping of HLA-DR and DQ antigens.
Immunol Today 1988; 9: 18-25. Binet JL, Auquier A, Dighiero G. A new prognostic classification of chronic
lymphocytic leukemia derived from a multivariate survival analysis. Cancer 1981; 48: 198-206.
Bjorkman PA. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-
A2. Nature 1987; 329: 506-510. Blue ML, Daley JF, Schlossman SF. Co-expression of T4 and T8 on peripheral
Blood T cells demonstrated by two-color fluorescence flow cytometry. J Immnunol 1985; 134: 2281-2288.
Bonilla F, Álvarez-Mon M, Merino F, De la Hera A, Ales JE, Durantez A.
Interleukin 2 induces cytotoxic activity in lymphocytes from regional axillary nodes of breast cancer patients. Cancer 1988; 61: 629-634.
Boon T. Toward a genetic analysis of tumor rejection antigens. Adv Cancer Res
1992; 58: 177-210. Borsos S, Leonard EJ. Physiologic functions of complement in
immunophysiology. In: Oppenheim JJ, Shevach EM, editors. New York: Oxford university press 1990; 152-165.
Bosch F, Montserrat E. Chronic Lymphocytic Leukemia. In: Schering, editors. I
Simposio Internacional de Avances en Oncología. Nova Sidonia 2002.
214
Bosch F. Factores pronósticos en la leucemia linfática crónica. Hematología molecular 2002; 1: 12-26.
Boyd RL, Hugo P. Towards an integrated view of thymopoiesis. Immunol.
Today 1991; 12: 73-80. Briggs PG, Kraft N, Atkins RC. T cells and CD45R expression in B-chronic
lymphocytic leukemia. Leukemia Research 1990; 14: 155-159. Briggs PG, Kraft N, Atkins RC. T-lymphocyte response to cytokines in B-
Chronic lymphocytic leukemia. Leukemia Research 1991; 15: 859-865. Burger T, Molnár L, Schmelczer M, Tovari E, Szabó A, Paál M. Changes of T-
lymphocyte-subsets and their consecuences in B-CLL. Folia Haematol 1990; 117: 115-125.
Caligaris-Cappio F, Hamblin TJ. Chronic lymphocytic leukemia: a brid of a
different feather. J Clin Oncol 1999; 17: 399. Call Tg, Phyliky RL, Noel P. Incidence of chronic lymphocytic leukemia in
Olmstead country, Minnesota, 1935 through 1989, with emphasis on changes in initial stage at diagnosis. Mayo Clin Proc 1994; 69: 323-328.
Catovsky D, Cherchi M, Brooks D. Heterogeneity of B cell leukemias
demonstrated by the monoclonal antibody FMC7. Blood 1981; 58: 406. Catovsky D. Chronic lymphoproliferative disorders. Current Opinion in Oncology
1995; 7: 3-11. Chapel H, Buch C. Mechanisms of infection in chronic lymphocytic leukemia.
Semm Hematol 1987; 24: 291. Cheson BD, Bennett JM, Grever M, Kay N, Keating MJ, O´Brien S, et al.
National Cancer Institute-Sponsored Working Group guidelines for chronic lymphocytic leukemia: revised guidelines for diagnosis and treatment. Blood 1996; 87: 4990-4997.
Cheson BD, Bennett JM, Rai KR, Grever M, Kay N, Schiffer CA, et al.
Guidelines for clinical protocols for chronic lymphocytic leukemia: Recommmendations of the National Cancer Institute-Sponsored Working Group. American Journal of Hematology 1988; 29: 152-163.
Cheson BD. Therapy for previously untreated chronic lymphocytic leukemia: A
reevaluation. Semin Hematol 1998; 35(Supl 3): 14-21. Ciudad J, Orfao A, Vidriales B, Macedo A, Martínez A, González M, et al.
Immunophenotypic analysis of CD19+ precursors in normal human adult bone marrow: implications for minimal residual disease detection. Haematologica 1998; 83: 1069-1075.
215
CLL Trialists´s Collaborative Group: Chemotherapeutic options in chronic lymphocytic leukemia: A mata-analysis of the randomized trials. J Natl Cancer Inst 1999; 91: 861-868.
Daibata M, Kamioka M, Wakiguchi H. Human herpesvirus 7 and lymphocytic
leukemia [letter]. Br J Haematol 1999; 104: 934. Dameshek W. Chronic lymphocytic leukemia - an accumulative disease of
immunologically incompetent lymphocytes. Blood 1967; 29: 566-584. Damle RN, Wasil T, Fais F. Ig V gene mutation status and CD38 expression as
novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood 1999; 94: 1840-1847.
Davey FR, Kurec AS, Tomar RH, Smith JR. Serum immunoglobulins and
lymphocyte subsets in chronic lymphocytic leukemia. Am J Clin Pathol 1987; 87: 60-65.
Dianzani U, Omedè P, Marmont F, DiFranco D, Fusaro A, Bragardo M.
Expansion of T cells expressing low CD4 or CD8 levels in B-cell chronic lymphocytic leukemia: correlation with disease status and neoplastic phenotype. Blood 1994; 83: 2198-2205.
Diehl LF, Karnell LH, Menck HR: The American College of Surgeons
Commission on Cancer and the American Cancer Society: the National Cancer Data Base report on age, gender, treatment, and outcomes of patients with chronic lymphocytic leukemia. Cancer 1999; 86: 2684-2692.
Dighiero G, Kipps T, Schroeder W, Chiorazzi N, Stevenson F, Silberstein LE, et
al. What is the CLL B-Lymphocyte?. Leuk Lymphoma 1996; 22: 13-39. Dighiero G, Maloum K, Desablens B. Chlorambucil in indolent chronic
lymphocytic leukemia. N Engl J Med 1998; 338: 1506-1514. Dighiero G, Travade P, Chevret S, Fenaux P, Chastang C, Binet JL, et al.
(French Cooperative Group on CLL). B-cell chronic lymphocytic leukemia: Present status and future directions. Blood 1991; 78: 1901-1914.
Dighiero G. An attempt to explain disordered immunity and
hypogammaglobulinemia in B-CLL. Nouv Rev Fr Hematol 1988; 30: 283-288.
Dighiero G. Biology of the neoplastic lymphocyte in B-CLL. Baillière´s Clinical
Haematology 1993; 6: 807-818. Dighiero G. Revelance of murine models in elucidating the origin of B-CLL
lymphocytes and related immune associated phenomena. Semin Hematol 1987; 24: 240.
216
Döhner H, Stilgenbauer S, Döhner K, Bentz M, Lichter P. Chromosome aberrations in B-cell chronic lymphocytic leukemia: reassessment based on molecular cytogenetic analysis. J Mol Med 1999; 77: 266-281.
Döhner H, Stilgenbauer S, James MR. 11q Delections identify a new subset of
B-cell chronic lymphocytic leukemia characterized by extensive nodal involvement and inferior prognosis. Blood 1997; 89: 2516-2522.
Finch SC, Linet MS. Chronic leukemias. Baillière´s Clin Haematol 1992; 5: 27-
56. Florensa L, Woessner S. Hematopoyesis: mielopoyesis y linfopoyesis.
Morfología de los elementos formes de la sangre y órganos hematopoyéticos. En: Sans-Sabrafen J, Besses C, Castillo R, Florensa L, Pardo P, Vives Corrons JL, editors. Hematología clínica. 3ª ed. Barcelona: Doyma Press 1994; 19-28.
Foon KA, Rai KR, Gale RP. Chronic lymphocytic leukemia: new insights into
biology and therapy. Ann Intern Med 1990; 112: 525-539. Freedman AS, Nadler LN. Immunologic markers in non Hodgkin´s lymphoma.
Hamatol Oncol Lin North Am 1991; 5: 871-889. Freedman AS. Immunobiology of chronic lymphocytic leukaemia. Hematol
Oncol Clin N Amer 1990; 4: 405-429. Frolova EA, Richards SJ, Jones RA, Rawstron A, Master PS, Teasdale J.
Immunophenotypic and DNA Genotypic Analysis of T-Cell and NK-Cell Subpopulations in Patients with B-Cell Chronic Lymphocytic Leukaemia (B-CLL). Leukemia and Lymphoma 1995; 16: 307-318.
Galagher RB, Cambier JC. Signal transmission pathways and lymphocyte
function. Immunol Today 1990; 11: 187-193. Gale RP, Foon KA. Biology of Chronic Lymphocytic Leukemia. Seminars in
Hematology 1987; 24 (4): 209-229. Gallart T, Pacheco A, Regueiro JR. Moléculas que reconocen el antígeno:
anticuerpos y receptor antigénico de las células T. En: Castillo R, Estapé J, Foz M, Lience E, Monserrat E, Revert LL, editors. Medicina Interna. 13ª ed. Madrid: Hacourt Brace 1994; 2678-2689.
Gallart T, Vives J. Respuestas inmune. En: Castillo R, Estapé J, Foz M, Lience
E, Monserrat E, Revert LL, editors. Medicina Interna. 13ª ed. Madrid: Hacourt Brace 1994; 2715-2720.
Galton DAG. The pathogenesis of chronic lymphocytic leukemia. Can Med
Assoc J 1966; 94: 1005-1010.
217
García-Marco J, Price CM, Ellis J. Correlation of trisomy 12 with proliferanting cells by combined immunocytochemistry and fluorescence in situ hybridization in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia 1996; 10: 1705-1711.
Garrido F, Ruiz Cabello F. Anticuerpos monoclonales y su aplicación en
hematología. En: López Borrasca A, Arocha C, Campos C, Parreira A, Pavlovsky S, Ruiz Arguelles G, editors. Enciclopedia Iberoamericana de Hematología. 1ª ed. Salamanca: Ediciones Universidad de Salamanca 1992; 145-160.
Garside P, Ingulli E, Merica RR, Johson JG, Noelle RJ, Jenkins MK.
Visualization of specific B and T lymphocyte interactions in the lymph node. Science 1998; 281: 96-99.
Geisler CH, Larsen JK, Hansen NE, Hansen MM, Christensen BE, Lund B, et
al. Prognostic importance of flow cytometric immunophenotyping of 540 consecutive patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 1991; 78: 1795-1802.
Giles FJ, O´Brien S, Keatig MJ. Chronic lymphocytic leukemia in Richter´s
transformation. Semin Oncol 1998; 25: 117-125. Goto M, Nishioka K. Age and sex-related changes of the lymphocytes subsets
in healthy individuals: An análisis by two-dimensional flow cytometry. J Gerontol 1989; 44(2): 51-56.
Hallek M, Kuhn-Hallek I, Emmerich B. Prognostic factors in chronic lymphocytic
leukemia. Leukemia 1997; (Suppl 2): S4-S13. Hamblin TJ, Davis Z, Gardiner A, Oscier DG, Stevenson FK. Unmutated Ig HV
genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Blood 1999; 94: 1848-1854.
Hanada M, Delia D, Aiello A. Bcl-2 gene hypomethylation and high-level
expression in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 1993; 82: 1820-1828.
Hanson CA, Gribbin TE, Schnitzer B, Schlegelmilch JA, Mitchell BS, Stoolman
LM. CD11c (Leu-M5) expression characterizes a B-cell chronic lymphoproliferative disorder with features of both chronic lymphocytic leukaemis and hairy-cell leukaemia. Blood 1990; 76: 2360-2367.
Harris NL, Jaffe E, Diebold J, Flandrin G, Muller-Hermelink H, Vardiman J et al.
World Healt Organization Classification of Neoplastic Diseases of the Hematopoietic and Lymphoid Tissues: Report of the Clinical Advisory Committee Meeting-Airlie House, Virginia, November 1997. J Clin Oncol 1999; 17: 3835-3849.
218
Harris NL, Jaffe E, Stein H, Banks PM, Chan J, Cleary ML et al. A revised European-American classification of lymphoid neoplasms: a proposal from the International Lymphoma Study Group. Blood 1994; 84: 1361-1392.
Hayakawa K, Hardy R. Normal, autoinmune, and malignant CD5+ B cell: The
Ly-1 B lineage?. Ann Rev Immunol 1988; 6: 197-218. Hayakawa K, Hardy RR, Herzenberg LA. Progenitors for Ly-1 B cells are
distinct from progenitors for other B cells. J Exp Med 1985; 161: 1554. Henkart PA. Lymphocyte cytotoxic mechanisms in immunophysiology. In:
Oppenheim JJ, Shevach EM, editors. New York: Oxford university press 1990; 350-364.
Hernández-Nieto L, Montserrat E, Muncunill J, Rozman C. Bone marrow
patterns and clinical staging in chronic lymphocytic leukaemia. Lancet 1997; 1: 1269.
Hoffman R. Approaches to multicolor immunofluorescence measurements.
Cytometry 1988; 3: 18-22. Hollander Z, Shah VO, Civin CI, Loken MR. Assessment of proliferation during
maturation of the B lymphoid lineage in normal human bone marrow. Blood 1988; 71: 528-531.
Huang JC, Finn WG, Goolsby CL. CD5- small B-cell leukemias are rarely
classifiable as chronic lymphocytic leukemia. Am J Clin Pathol 1999; 111: 123-130.
Hulstaert F, Hannet I, Deneys V, Munhyeshuli V, Reichert T, De Bruyere M et
al. Age-related changes in human blood lymphocyte subpopulations. Clinical Immunology and Immunopathology 1994; 70 (2): 152-158.
Hurwitz CA, Gore SD, Stone KD, Civin CL. Flow cytometric detection of rare
normal human marrow cells with immunophenotypes characteristic of acute lymphoblastic leukemia cells. Leukemia 1992; 6: 233-239.
International Federation of Clinical Chemistry. Approved Recommendation on
the Theory of Reference Values. J Clin. Chem. Clin. Biochem 1987; 25 (9): 639-644.
International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia. Chronic lymphocytic
leukemia: recommendations for diagnosis, staging, and response criteria. Annals of Internal Medicine 1989; 110: 236-238.
Itala M, Vainio O, Remes K. Functional abnormalities in granulocytes predict
susceptibility to bacterial infections in chronic lymphocytic leukaemia. Eur J Haematol 1996; 57: 46-53.
219
Jaraquemada D, Gallart T. Antígenos. Reconocimiento del antígeno por los anticuerpos y los linfocitos T. En: Castillo R, Estapé J, Foz M, Lience E, Monserrat E, Revert LL, editors. Medicina Interna. 13ª ed. Madrid: Hacourt Brace 1994; 2696-2699.
Jondal M, Wigzell H, Ainti F. Human lymphocyte subpopulations: classification
according to surface markers and/or functional characteristics. Transplant Rev 1973; 16: 163-195.
Kay NE, Peterson L. Heterogeneity of CD5 membrane expression on B-chronic
lymphocytic leukemia cells. Leukemia and Lymphoma 1991; 5: 49-55. Keating MJ. Chronic lymphocytic leukemia. Seminars in Oncology 1999; 26:
107-114. Key N, Bone N, Hupke M, Dalmasso A. Expansion of lymphocyte population co-
expressing T4 (CD4) and T8 (CD8) antigens in the peripheral blood of normal adult male. Blood 1990; 75(10): 2024-2029.
Kimby E, Mellstedt H, Nilsson B, Björkholm M, Holm G. Differences in blood T
and NK cell populations between chronic lymphocytic leukemia of B cell type (B-CLL) and monoclonal B-lymphocytosis of undetermined significance (B-MLUS). Leukemia 1989; 3: 501-504.
Kimby E, Mellstedt H, Nilsson B, Björkholm M, Holm G. T lymphocyte
subpopulations in chronic lymphocytic leukemia of B cell type in relation to immunoglobulin isotype(s) on the leukemic clone and to clinical features. Eur J Haematol 1987; 38: 261-267.
Kipps TJ, Carson DA. Autoantibodies in chronic lymphocytic leukemia and
related systemic autoimmune disease. Blood 1993; 81: 2475-2487. Kipps TJ. Chronic lymphocytic leukemia and related diseases. In: Beutler E,
Lichtman MA, Coller BS, Kipps TJ, editors. Hematology. New York: McGraw-Hill Inc 1995; 1017-1039.
Kipps TJ. Chronic lymphocytic leukemia. Current Opinion in Hematology 2000;
7: 223-234. Klein A, Miera O. Chemosensitivity of B cell chronic lymphocytic leukemia and
correlated expression of proteins regulating apoptosis, cell cycle and DNA repair. Leukemia 2000; 14: 40-46.
Knapp W. Leucocyte Typing IV, White Cell Differentiation Antigens. Knapp W,
editors. Vienna, 1989. Kobayashi R, Picchio G, Kirven M. Transfer of human chronic lymphocytic
leukemia to mice with severe combined immune deficiency. Leuk Res 1992; 16: 1013-1023.
220
Köhler B, Milstein G. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975; 256-495.
Krause JR, Penchansky L, Contis L, Kaplan SS. Flow cytometry in the
diagnosis of acute leukemia. Am J Clin Pathol 1988; 89: 341-346. Kripke ML. Antigenicity of murine skin tumors induced by ultraviolet light. J Natl
Cancer Inst 1974; 53: 1333-1336. Kroft SH, Finn WG, Peterson LC. The pathology of the chronic lymphoid
leukaemias. Blood Reviews 1995; 9: 234-250. Kruisbeek AM. Development of αβ T cells. Curr. Opin. Immunol 1993; 5: 227-
234. Kunicka JE, Platssoucas CD. Defective Helper function of purified T4 cells and
excessive suppressor activity of purified T8 cells in patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia. T4 suppressor effector cells are present in certain patients. Blood 1988; 71(6): 1551-1560.
Kurec AS, Threatte GA, Gittlieb AJ, Smith JR, Anderson J, Davey FR.
Immunophenotypic subclassification of chronic lymphocytic leukaemia (CLL). Br J Hematol 1992; 81: 45-51.
Lavabre-Bertrand T, Exbrayat C, Bourquard P, Lavabre-Bertrand C, Fégueux N,
Ponceler P et al. CD23 antigen density is related to serum gamma globulin level, bone marrow reticulin pattern, and treatment in B chronic lymphocytic leukemia. Leukemia and Lymphoma 1994; 13: 89-94.
Legac E, Chastang C, Binet JL, Michel A, Debre P, Merle-Beral H. Proposals
for a phenotypic classification of B-chronic lymphocytic leukemia; relationship with prognostic factors. Leuk lymphoma 1991; 5(Suppl): 53-58.
Ling NR, MacLennan IC, Mason DY. B-cell and plasma cell antigens: new and
previously defined clusters. McMichel AJ, editors. Leucocyte Typing III. Oxford University Press, Oxford, 1987; 303-335.
Loken MR, Shah VO, Dattilio KL, Civin CL. Flow cytometric analysis of human
bone marrow: II. Normal B lymphocyte development. Blood 1987; 70: 1316-1324.
Look AT, Melvin SL, Brown LK, Dockter ME, Roberson PK, Murphy SB.
Quantitative variation of the common acute lymphoblastic leukemia antigen (gp 100) on leukemic marrow blasts. J Clin Invest 1984; 73: 1617-1628.
López-Guillermo A, Reverter JC, Cervantes F. Neoplasias asociadas a la
leucemia linfática crónica: incidencia y características en una serie de 232 pacientes. Med Clin 1989; 93: 681-683.
221
Lopez-Matas M, Rodriguez-Justo M, Morilla R, Catovsky D, Matutes E. Quantitative expression of CD23 and its ligand CD21 in chronic lymphocytic leukemia. Haematologica 2000; 85: 1140-1145.
Lovett EJ, Schnitzer B, Keren DF, Flint A, Hudson JL, McClatchey KD.
Application of flow cytometry to diagnostic pathology. Lab Invest 1984; 50: 115-140.
Macedo A, Orfao A, Gonzalez M, Vidriales MB, López-Beres MC, Martínez A, et
al. Immunological detection of blast cell subpopulations in acute myeloblastic leukemia at diagnosis: implications for minimal residual disease studies. Leukemia 1985; 9: 993-998.
Matutes E, Owusu-Ankomah O, Morilla R, Garcia J, Houlihan A, Catovsky D.
The immunological profile of B-cell disorders and proposal of a soring system for the diagnosis of CLL. Leukemia 1994; 8: 1640-1645.
Mauro FR, Foa R, Cerretti R, Giannarelli D, Coluzzi S, Mandelli F et al.
Autoimmune hemolytic anemia in chronic lymphocytic leukemia: clinical, therapeutic, and prognostic features. Blood 2000; 95(9): 2786-2792.
Mauro FR, Foa R, Giannarelli D, Cordone I, Crescenzi S, Pescarmona E et al.
Clinical characteristics and outcome of young chronic lymphocytic leukemia patients: a single institution study of 204 cases. Blood 1999; 94(2): 448-454.
McCoy M, Roy Overton W. Quality Control in Flow Cytometry for Diagnostic
Pathology: II. A Conspectus of Reference Ranges for Lymphocyte Immunophenotyping. Cytometry 1994; 18: 129-139.
McMichael AJ. Leucocyte Typing III, White Cell Differentiation Antigens.
McMichael AJ, editors. Oxford, 1987. Melo JV, Catovsky D, Galton DAG. The relationship between chronic
lymphocytic leukaemia and prolymphocytic leukaemia . I. Clinical and laboratory features of 300 patients and characterization and an intermediate group. Br J Haematol 1986; 63: 377-387.
Miller RH, Linet MS, Van Natta ML. Serum protein electrophoresis patterns in
chronic lymphocytic leukemia. Arch Intern Med 1987; 147: 1614-1617. Minot GP, Isaacs R. Lymphatic leukemia. Age incidence, duration and benefit
derived from irradiation. Boston Med Surg J 1924; 191: 1-9. Molica S. Comparison of younger versus older B-cell chronic lymphocytic
leukemia patiens for clinical presentation and prognosis: a retrospective study of 53 cases. Eur J Haematol 1994; 52: 216-221.
Molica S, Levato D, Dattilo A, Mannella A. Clinico-prognostic relevance of
quantitative immunophenotyping in B-cell chronic lymphocytic leukemia
222
with emphasis on the expression of CD20 antigen and surface immunoglobulins. Eur J Haematol 1998; 60: 47-52.
Molica S. Infections in chronic lymphocytic leukemia: risk factors and impact on
survival, and treatment. Leuk Lymphoma 1994; 13: 203-214. Molica S. Is it time for a reassessment of prognostic features in B-cell chronic
lymphocytic leukemia?. Hematol Cell Ther 1999; 41: 87-93. Moller G. Germinal centers in the immune response. Immunol Rev 1992;
126:165-178. Montserrat E, Bosch F, Rozman C. B-cell chronic lymphocytic leukemia: Recent
progress in biology, diagnosis, and therapy. Ann Oncol 1997; 8(Supl 1): 93-101.
Montserrat E, Gomis F, Vallespí T, Rios A, Romero A, Soler J et al. Preseting
features and prognosis of chronic lymphocytic leukemia in younger adults. Blood 1991; 78(6): 1545-1551.
Montserrat E, Rozman C. Chronic lymphocytic leukemia: Present status. Annals
of Oncology 1995; 6: 219-235. Montserrat E, Villamor N, Reverter JC. Bone marrow assessment in B-cell
chronic lymphocytic leukaemia: aspirate or biopsy?. Br J Haematol 1996; 93: 111-116.
Montserrat E, Viñolas N, Reverte JC, Rozman C. Natural history of chronic
lymphocytic leukemia: on the progression and prognosis of early clinical stage. Nouv Rev Franç d´Hématol 1988; 30: 359-361.
Montserrat E. Leucemia linfática crónica. En: Sans-Sabrafen J, Besses C, Vives
JL, Castillo R, Woessner S, editors. Hematología clínica. 4ª ed. Madrid: Ediciones Harcourt 2001; 417-427.
Montserrat E. Síndromes linfoproliferativos crónicos de expresión leucémica:
leucemia linfática crónica y enfermedades afines. García-Conde J, editors. Leucemias y linfomas en el adulto. Madrid: Ediciones Ergon 1996; 137-158.
Moreau E, Matutes E, A´Hern R, Morilla AM, Morilla RM, Owusu-Ankomah KA,
et al. Improvement of the chronic lymphocytic leukemia scoring system with the monoclonal antibody SN8 (CD79b). Am J Clin Pathol 1997; 108: 378-382.
Morgan R, Chen Z, Richkind K. PHA/IL2: an efficient mitogen cocktail for
cytogenetic studies of non-hodgkin lymphoma an chronic lymphocytic leukemia. Cancer Genet Cytogenet 1999; 109: 134-137.
223
Nadler LM. B cell/leukemia panel workshop. In: Reinherz EL, Haynes BF, Nadler LM, Berstein ID, editors. Leukocyte Typing II. New York: Springer-Verlag 1986: 3-43.
National Committee for Clinical Laboratory Standards. Procedures for the
Collection of Diagnostic Blood Speciments by Venipuncture. Approved H3-A2. NCCLS, Villanova, PA, 1984.
Newman R, Peterson B, Davey F, Brabyn C, Collins H, Brunetto V et al.
Phenotypic markers and BCL-1 gene rearrangements in B-cell chronic lymphocytic leukemia: a cancer and leukemia group B study. Blood 1993; 4: 1239-1246.
Noesel C, Lier R. Architecture of the human B-cell antigen receptors. Blood
1993; 82(2): 363-373. Ocqueteau M, Orfao A, Almeida J, Bladé J, González M, García-Sans R et al.
Immunophenotypic characterization of plasma cells from monoclonal gammopathy of undetermined significance patients. AJP 1998; 152(6): 1655-1665.
Orfao A, Chillón MC, Bortoluci AM, López-Berges MC, García-Sanz R,
González M, et al. The flow cytometric pattern of CD34, CD15 and CD13 expression in acute myeloblastic leukemia is highly characteristic of the presence of PML-RARα gene rearrangements. Haematologica 1999; 84: 405-412.
Orfao A, González de Buitrago JM. Detección y cuantificación de antígenos
celulares. En: Antoja F, Carrera T, Concustell MR, Frey E, Galimany R, Hernández JM, editors. La citometría de flujo en el laboratorio clínico. 1ª ed. Salamanca: Sociedad española de bioquímica clínica y patología molecular 1995; 31-35.
Orfao A, González de Buitrago JM. Fundamentos de la citometría de flujo. En:
Antoja F, Carrera T, Concustell MR, Frey E, Galimany R, Hernández JM, editors. La citometría de flujo en el laboratorio clínico. 1ª ed. Salamanca: Sociedad española de bioquímica clínica y patología molecular 1995; 11-29.
Orfao A, González M, Ciudad J, López Bergés MC, López A, San Miguel JF et
al. Aplicaciones de la citometría de flujo en el diagnóstico hematológico. Biol Clin Hematol 1992; 14: 193-203.
Orfao A, Ruiz-Arguelles A. Citometría de flujo y su aplicación en Hematología.
En: López Borrasca A, Arocha C, Campos C, Parreira A, Pavlovsky S, Ruiz Arguelles G, et al, editors. Enciclopedia Iberoamericana de Hematología. 1ª ed. Salamanca: Ediciones Universidad de Salamanca 1992; 160-175.
224
Pangalis GA, Moutsdopoulos HM, Papadopoulos NM. Monoclonal and oligoclonal immunoglobulins in the serum of patients with B-chronic lymphocytic leukemia. Acta Haemat 1988; 80: 23-27.
Parreira L, Parreira A. Linfopoyesis B. En: López Borrasca A, Arocha C,
Campos C, Parreira A, Pavlovsky S, Ruiz Arguelles G, editors. Enciclopedia Iberoamericana de Hematología. 1ª ed. Salamanca: Ediciones Universidad de Salamanca 1992; 235-246.
Paydas S, Kilic B, Sahin B. Prevalence of hepatitis C virus infection in patients
with lymphoproliferative disorders in Southern Turkey. Br J Cancer 1999; 80: 1303-1305.
Pepper C, Thomas A, Hoy T. Antisense-mediated suppression of Bcl-2
highlights its pivotal role in failed apoptosis in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Br J Haematol 1999; 107: 611-615.
Platsoucas CD, Galinski M, Kempin S, Reich L, Clarkson B, Good RA.
Abnormal T lymphocyte subpopulations in patients with B cell chronic lymphocytic leukemia: an analysis by monoclonal antibodies. Journal of Immunology 1982; 129: 2305-2312.
Podhorecka M, Dmoszynska A, Rolinski J, Wasik-Szczepanek E. Intracellular
interleukin-2 expression by T-cell subsets in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Haematologica 2001; 86: 549-552.
Pontvert-Delucq S, Breton-Gorius J, Schmitt C. Characterization and functional
analysis of adult human bone marrow cell subsets in relation to B-lymphoid development. Blood 1993; 82: 417-429.
Pritsch O, Maloum K, Dighiero G. Basic biology of autoimmune phenomena in
chronic lymphocytic leukemia. Seminars in Oncology 1998; 25: 34-41. Quesenberry P, Levitt L. Hematopoietic stem cells. N Engl J Med 1979; 301:
760-775. Raghoebier S, van Krieken JH, Kluin-Nelemans JC. Oncogene rearrangements
in chronic B-cell leukemia. Blood 1991; 77: 1560-1564. Rai KR, Sawitsky A, Cronkite EP, Chanana AD, Levy RN, Pasternack BS.
Clinical staging of chronic lymphocytic leukemia. Blood 1975; 46: 219-234. Raulet DH, Spencer DM, Hsiang YH. Control of γδ T cell development. Immunol
Rev 1991; 120: 185-204. Reinheerz E, Haynes B, Nadler L. Leucocyte Typing II. Springer Verlag: Berlin,
1986.
225
Ribera JM, Viñolas N, Ispízua U. “Spontaneous” complete remissions in chronic lymphocytic leukemia: Report of three cases and review of the literature. Blood cells 1987; 12: 471-479.
Riva M, Schena M, Bergui L, Tesio L, Gaidano G, Marchisio P, et al.
Comparative analysis of normal and malignant CD5+ B lymphocytes. Nouv Rev Fr Hematol 1998; 30: 289-291.
Rozman C, Montserrat E, Feliu E. Prognosis of chronic lymphocytic leukemia: a
multivariate survival analysis of 150 cases. Blood 1982; 59: 1001-1005. Rozman C, Montserrat E, Rodríguez-Fernández JM. Bone marrow histologic
patterns-the best single prognostic parameter in chronic lymphocytic leukemia. A multivariate survival analysis of 329 cases. Blood 1984; 64: 642-648.
Rozman C, Montserrat E. Chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med 1995;
333: 1052-1057. Rudd CE. CD4, CD8 and TCR-CD3 complex: a novel class of protein-tyrosine
kinase receptor. Immunol Today 1990; 11: 400-409. Ryan D, Kossover S, Mitchell S, Frantz C, Hennessy L, Cohen H.
Subpopulations of common acute lymphoblastic leukemia antigen-positive lymphoid cells in normal bone marrow identified by hematopoietic differentiation antigens. Blood 1986; 68: 417-425.
Ryan DH, Chapple C, Kossover SA, Sandberg AA, Cohen HJ. Phenotypic
similarites and differences between CALLA-positive B cell precursors. Blood 1987; 70: 14-21.
Sallusto F, Lenig D, Forster R, Lipp M, Lanzavecchia A. Two subsets of
memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions. Nature 1999; 401: 708-712.
Santagostino A, Garbaccio G, Pistorio A, Bolis V, Camisasca G, Pagliaro P, et
al. A Italian national multicenter study for the definition of reference ranges for normal values of peripheral blood lymphocyte subsets in healthy adults. Haematologica 1999; 84: 499-504.
Schlesinger M, Broman I, Lugassy G. The complement system is defective in
chronic lymphotic leukemia patients and in their healthy relatives. Leukemia 1996; 10: 1509-1513.
Shapiro HM. Trends and developments in flow cytometry instrumentation. Ann
NY Acad Sci 1993; 677: 155-161. Shevach EM. Intercellular interactions in the immune response in
immunophysiology. In: Oppenheim JJ, Shevach EM, editors. New York: Oxford university press 1990; 104-128.
226
Stewart CC, Stewart SJ. Imological monitoring utilising novel probes. N Y Acad Sci 1993; 677: 94-112.
Stewart CC. Clinical applications of flow cytometry. Immunologic methods for
measuring cell membrane and cytoplasmic antigens. Cancer 1992; 69: 1543-1547.
Sthoeger ZM, Sthoeger D, Shtalrid M, Sigler E, Geltner D, Berrebi A.
Mechanism of autoimmune hemolytic anemia in chronic lymphocytic leukemia. American Journal of Hematology 1993; 43: 259-264.
Stilgenbauer S, Leupolt E, Kröber A. Molecular cytogenetic analysis of B-CLL:
Incidence and prognostic significance of the most frequent chromosome aberrations. Blood 1999; 94(Supl 1): 543a.
Taylor CR. Results of multiparameter studies of B cell lymphomas. Am J Clin
Pathol 1979; 72: 687. Ternynch T, Dighiero D, Follezou JY, Binet JL. Comparison of normal and CLL
lymphocytes surface Ig determinants using peroxidase labelled antibodies. Detection and quantification of light chain determinants. Blood 1994; 43: 789.
Terstappen L, Johnsen S, Segers-Nolten I, Loken M. Identification and
characterization of plasma cells in normal human bone marrow by high-resolution flow cytometry. Blood 1990; 76: 1739-1747.
Tollerud DJ, Ildsap ST, Brown LM, Clark JW. T-cell subsets in healthy
teenagers: Transition to the adult phenotype. Clin Immunol Immunopathol 1990; 56(1): 88-96.
Tötterman TH, Carlsson M, Simonsson B, Bengtsson M, Nilsson K. T-cell
activation and subset patterns are altered in B-CLL and correlate with the satge of the disease. Blood 1989; 74: 786-792.
Türk W. Ein System der Lymphomatosen. Wien Klin Wochenshr 1903; 16:
1073-1089. Uckun FM. Regulation of human B-cell ontogeny. Blood 1990; 76: 1908-1923. Urbano A, Villamayor N. Linfopoyesis. Regulación, aspectos morfológicos y
funcionales. En: López Borrasca A, Arocha C, Campos C, Parreira A, Pavlovsky S, Ruiz Arguelles G, editors. Enciclopedia Iberoamericana de Hematología. 1ª ed. Salamanca: Ediciones Universidad de Salamanca 1992; 225-233.
Valesini G, Pivetti-Pezzi P, Mastraudrea F, Moncada A, Cuomo M, Natali PG.
Evaluation of T cell subsets in Behct´s syndrome using anti-T cell monoclonal antibody. Clin Exp Immunol 1985; 60: 55-62.
227
Vallespí T, Montserrat E, Sanz MA. Chronic lymphocytic leukaemia: prognostic value of lymphocyte morphological subtypes. A multivariate survival analysis in 146 patients. British journal of Haematology 1991; 77: 478-485.
Vallespí T, Vidriales MB, Acebedo G, Blanco A, Orfao A, García Hernández JL,
et al. Diagnóstico y clasificación de los síndromes linfoproliferativos B con expresión leucémica. Haematologica 1999; 84: 62-69.
Veenstra H, Jacobs P, Dowdle EB. Abnormal association between invariant
chain and HLA class II alpha and beta chains in chronic lymphocytic leukemia. Cell Immunol 1996; 171: 68-73.
Videbaek A. Chronic lymphocytic leukemia: Historical aspects. En: Polliack A,
Catovsky D, editors. Chronic Lymphocytic Leukemia. Harwood Academic Publishers Chur 1988; 1-9.
Vives JL, Aguilar JL. Técnicas de laboratorio en hematología. En: Vives JL,
Aguilar JL, editors. Estandarización y normalización en hematología. Valores de referencia y formas de expresar los resultados. 2ª ed. Masson S.A 1997; 25: 44.
von Boehmer H. The development biology of T lymphocytes. Annu Rev
Immunol 1993; 6: 309-326. Vuillier F, Tortevoye P, Binet JL, Dighiero G. CD4, CD8 and NK subsets in B-
CLL. Nouv Rev Fr Hematol 1988; 30: 331-334. Westermann J, Pabst R. Lymphocyte subsets in the blood: a diagnostic window
on the lymphoid system?. Immunol Today 1990; 11: 406-414. Wierda WG, Kipps TJ. Chronic lymphocytic leukemia. Curr Opin Hematol 1999;
6: 253-261. Winito A, Baltimore D. Separate lineages of T cells expressing the αβ and γδ
receptors. Nature 1989; 338: 430-432. Winoto A. Regulation of the early stages of T cell development. Curr Opin
Immunol 1991; 3: 199-203. Witzig TE, Li CY, Tefferi A, Katzmann JA. Measurement of the intensity of cell
surface antigen expression in B-cell chronic lymphocytic leukaemia. Am J Clin Pathol 1994; 101: 312-317.
Woessner S, Lafuente R, Florensa L. Síndromes linfoproliferativos crónicos B y
T con expresión hemoperiférica. En: La citología óptica en el diagnóstico hematológico. Barcelona: Médicis 1991; 193-217.
Wormsley SB, Baird SM, Gadol N, Rai KR, Sobol RE. Characteristics of
CD11c+CD5+ chronic B-cell leukaemia and the identification of novel
228
peripheral blood B-cell subsets with chronic lymphoid leukaemia immunophenotypes. Blood 1990; 76: 123-130.
Yuille MR, Houlston RS, Catovsky D. Anticipation in familial chronic lymphocytic
leukemia. Leukemia 1998; 12: 1696-1698. Zaknoen SL, Kay NE. Immunoregulatory cell dysfunction in chronic B-cell
leukemias. Blood Reviews 1990; 4: 165-174. Zukerberg L, Medeiros L, Ferry J, Harris N. Diffuse low-grade B-cell
lymphomas: Four clinically distinct subtypes defined by a combination of morphologic and immunophenotypic features. Am J Clin Pathol 1993; 100: 373.
Zwiebel JA, Cheson BD. Chronic lymphocytic leukemia: Staging and prognostic
factors. Semin Oncol 1998; 25: 42-59.