UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS - ESPEDEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA

CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y BIOQUÍMICA DE CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y BIOQUÍMICA DE CEPAS DE RIZOBIOS ASOCIADOS A CULTIVOS DE ARVEJA CEPAS DE RIZOBIOS ASOCIADOS A CULTIVOS DE ARVEJA ((Pisum sativum Pisum sativum L.), CHOCHO (L.), CHOCHO (Lupinus mutabilisLupinus mutabilis S.), S.), FRÉJOL (FRÉJOL (Phaseolus vulgaris Phaseolus vulgaris L.), HABA (L.), HABA (Vicia fabaVicia faba L.) Y L.) Y VICIA (VICIA (Vicia Vicia sp.) EN SUELOS DE LA PROVINCIA DE sp.) EN SUELOS DE LA PROVINCIA DE IMBABURA Y OBTENCIÓN DE UN BANCO DE CEPAS.IMBABURA Y OBTENCIÓN DE UN BANCO DE CEPAS.

PREVIA A LA OBTENCIÓN DE GRADO ACADÉMICO O TÍTULO DE:

INGENIERA EN BIOTECNOLOGÍA

María José Carpio Espinosa

Febrero, 2014

PROYECTOPROYECTO

PIC 12 INIAP 009código: 2153902800021703

“Manejo adecuado de abonos verdes y microorganismos fijadores de nitrógeno dentro de sistemas de producción agroecológicos”

Soraya Alvarado, Ph.D

Fertilizantes nitrogenados

Uso de rizobios

INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN

Inoculación exitosa: identificación y selección de

cepas

Cepas foráneas

Último estudio rizobios 2004

Caracterización fenotípica rizobios

Preservación bacteriana

Evaluación de FBN en invernadero y

campo

Producción inoculantes a nivel

nacional

Arveja = 185 kg N/ha

Chocho = 400-900 kg N/ha.

Haba = 150-500 kg N/ha.

Fréjol = 60 kg N/ha

Vicia = 125-300 kg N/ha.

Recolectar cepas de rizobios a partir de nódulos de arveja, chocho, fréjol, haba y vicia en suelos de Imbabura.

Caracterizar morfológica y bioquímicamente las cepas de rizobios.

Formar un cepario de rizobios a partir de las cepas de INIAP y las recolectadas.

OBJETIVOSOBJETIVOS

Recolección de nódulos

A. Selección de mejor planta en

floración

B. Excavación de raíces y

verificación del color del nódulo

C. Nódulos en tubos con sílica-gel

MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS

Desinfección de nódulos

A. Hidratación de nódulos en agua estéril

A. Nódulos en etanol (95%) e

hipoclorito (3%)

C. Lavado de nódulos en

agua estéril.

Aislamiento de rizobios recolectados de Imbabura

A. Aislamiento a partir de nódulos

B. Purificación por agotamiento

C. Multiplicación

Reactivación de rizobios banco INIAP

A. Cepa liofilizad

a

B. Siembra de cepa con solución

peptona 0,1%

C. Crecimiento bacteriano

D. Purificación por

agotamiento

Cepas medio LMA

refrescamiento

Nistatina + PCNB

MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS

Pruebas de autentificación

GPA + PBC (púrpura)

LLA + RB (blanco)

LMA + PBC (café) LMA + ABT (verde)

Tinción de Gram Liofilización

A. Peptona(10%)+ sacarosa(20%)

B. Tubos eppendorf con solución y cepa

C. Liofilización de cepas

Caracterización morfológica (Prescott, 2004)

CARACTERISTICAS 

ESPECIFICACIONES  

textura elástica cremosa acuosa gomosa

gomosidad abundante mediana escasa nula

elevación pulvinada convexa elevada plana

apariencia opaca brillante translúcida  

margen entero ondulado erosionado  

color Rosado intenso Rosado coral Rosado palo  

tamaño pequeña (<2mm)

mediana (2-5mm)

grande (>5mm)

 

forma circular elongada irregular  

Caracterización bioquímica

A. Escala de McFarland

B. Suspenciones bacterianas

C. Relación McF [4] y

suspensión 109 cel/mL

109 cel/mL 105 cel/mL Dilución agua estéril

PRUEBAS BIQUÍMICAS

- Fuentes de carbono

- Fuentes de nitrógeno

- Metales pesados

- Antibióticos

- Urea

- NaCl

- pH

RESULTADOS Y DISCUSIÓNRESULTADOS Y DISCUSIÓN

Áreas de muestreo

Nódulos de arveja, fréjol, haba y vicia

Nódulos

chocho

Sherman et al. (1991)

Aislamiento de rizobios

Todos los rizobios

Crecimiento rápido

Crecimiento lento

cepa “C8 B”

3 días

7 días

105 cepas rizobios

Imbabura

Dieciséis cepas INIAP

Diecinueve no viables

Grisales y Fuentes (2005), CIAT (1988).

Dos cepas colonias

rojas

Kuykendall et al. (2005)

Pruebas de autentificación

A. GPA+PBC: no cambio de color

B. LLA+RB: no cambio

de color

D. LMA+ABT:Reacción

ácida

Rhizobium etli

A. GPA+PBC: no cambio de color

B. LLA+RB: no cambio

de color

C. LMA+PBC:

reacción ácida

C. LMA+PBC:

reacción alcalina

D. LMA+ABT:Reacción alcalina

Bradyrhizobium

Rhizobium leguminosar

um

A. GPA+PBC: no cambio de color

B. LLA+RB: Cambio

parcial de color

C. LMA+PBC:

reacción ácida

D. LMA+ABT:Reacción

ácida

A. Acidifica

el medio a los dos

días

B. Retorno parcial de color a los tres días

C. Retorno total de

color a los cinco días

Medio GPA+PBC

Tres cepas :

TAL 1236FB 481

FR 1063

Norris (1965): cepas suelos

alcalinos

A. GPA+PBC: cambio de

color

B. LLA+RB: Cambio de

color

C. LMA+PBC:

Reacción ácida

D. LMA+ABT:Reacción

ácida

Agrobacterium

Tinción de Gram

Bacilos Gram -

C. R. leguminosarum

B. R. etli

A. R. tropici

Se autentificaron100 cepas como rizobios

Dos cepas : R-FR-PE-2b / R-HA-PE-3

Caracterización morfológica

elástica

Abundante goma

rosado coral

Mediano (2-5 mm)

opaca

Rhizobium etli

Rhizobium tropici

translúcida

acuosa

rosado pálido

Sin goma

convexaCrecimient

o rápido

Rizobios de arveja, fréjol, haba y vicia:

entero circular

Kuykendall et al. (2005), CIAT (1988)

elástica

Mediano(2-3 mm)

opaca

gomosa

Pequeño (1 mm)

Rosado coral

Bradyrhizobium

Crecimiento lento

pulvinada

Abundante goma

Ochrobactrum

Rizobios de chocho:

Crecimiento rápido

Martínez (2007): Bradyrhizobium

Trujillo et al. (2005): Ochrobactrum,

ARVEJA: 7 gruposCS: 0.86

CHOCHO: 6 gruposCS: 0.86

FRÉJOL: 6 gruposCS: 0.88

HABA: 5 gruposCS: 0.89

VICIA: 4 gruposCS: 0.86

Caracterización bioquímicaMayoría de cepas

sensibles: - pH 4.5 y 8.5

- NaCl 1% y 2%- zinc

- kanamicina y cloranfenicol- citrato y glicina (Romero, 2009)

Rizobios tolerantes a condiciones hostiles

Cepas INIAP y chocho

Fuentes carbonoA. xylosa

B. fructosaC. glucosa

D. galactosaE. maltosaF. sacarosaG. dulcitolH. eritritolI. tartratoJ. lactato

K. sorbosaM. citrato

R-CH-MO-78b

Cepa muy resistente

AntibióticosA. ácido nalidíxico

B. cloranfenicolC. kanamicina

D. estreptomicinaMetales pesados

A. zincB. plomoC. cobre

D. aluminio UreaA. 20 ppm C. 100

ppm B. 50 ppm D. 500

ppm

Fuentes nitrógenoA. triptófano

B. tirosinaC. glicina

NaClA. 0.5%

B. 1% (NC)C. 2% (NC)

pHA. 4.5B. 5

C. 8.5

Diversidad genética rizobiosContreras et al. (2007), Cuadrado et al.

(2009), Marquina et al. (2011), Martínez (2003)

Resultados en laboratorio

Matos y Zuñiga (2002)

Cepa “C8 B”Bradyrhizobiu

m

No resistente Odee et al. (1997) y Cuadrado et al. (2009),

Shamseldin & Werner (2005), Matos et al. (2001)

ARVEJA: 11 gruposCS: 0.89

CHOCHO: 6 gruposCS: 0.89

FRÉJOL: 13 gruposCS: 0.86

HABA: 11 gruposCS: 0.89

VICIA: 8 grupos

CS: 0.92

mediana y abundante nodulación en raíz secundaria

crecimiento rápido productoras de ácido

morfología característica

Capacidad resistencia condiciones de estrés

CEPASDE

ARVEJAFRÉJOLHABAVICIA

CEPAS DE

CHOCHO

escasa nodulación en raíz primariamorfología característica

crecimiento rápidoproductoras de ácido

Gran capacidad resistencia condiciones de estrés

CEPA“C8B”

DECHOCHO

crecimiento lento

productora de alcalinidad

Baja capacidad adaptación condiciones de estrés

morfología característica

Rhizobium

Ochrobactrum

Bradyrhizobium

CONCLUSIONESCONCLUSIONESLas cepas de rizobios de fréjol, arveja, haba y vicia pertenecen al género Rhizobium.

Las cepas de rizobios de chocho pertenecen al género Ochrobactrum.

La cepa C8 B, del banco del INIAP, pertenece al género Bradyrhizobium.

Catorce cepas de rizobios fueron las más resistentes a condiciones de estrés y fuentes nutricionales.

Las pruebas bioquímicas sirven para esbozar la diversidad genética de los rizobios y su papel ecológico.

Existe una alta diversidad morfológica y bioquímica de los rizobios aislados de suelos de Imbabura.

El banco germoplásmico de rizobios servirá como una colección de referencia para futuras investigaciones.

RECOMENDACIONESRECOMENDACIONES

Caracterizar molecularmente las cepas.

Estudiar los suelos de las localidades donde se recolectaron los nódulos.

Evaluar a nivel de invernadero y campo la fijación de nitrógeno de las cepas.

RECOMENDACIONESRECOMENDACIONES

Desarrollar pruebas de biofertilización con rizobios más resistentes.

Recolectar nódulos en otras regiones del país.

Sincronizar la fecha de recolección con la época de floración.

AGRADECIMIENTOSAGRADECIMIENTOSA la ESPE, Departamento de Ciencias de la Vida, Facultad de Ingeniería en Biotecnología, por mi formación académica profesional.

Al INIAP, DMSA, por haberme permitido la ejecución e instrumentación para realizar este trabajo.

A la SENESCYT por haber financiado este proyecto.