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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA Y FARMACIA
PROYECTO DE TITULACIÓN PREVIO, AL TITULO DE QUÍMICO Y
FARMACÉUTICO
MODALIDAD: INVESTIGACIÓN
TITULO:
“EVALUACIÓN DE LA ABSORCIÓN INTESTINAL DE GEMFIBROZILO
INCORPORADO EN CRISTALES LÍQUIDOS ESTABILIZADOS CON TWEEN 80”
AUTORES
LUIS FERNANDO LOJA CARREÑO
JORGE MIGUEL MOROCHO CORONEL
TUTOR(A):
Lcda. MARIA ELIZABETH HERRERA PAREDES M.Sc.
COTUTOR(A):
FERNANDA KOLENYAK DOS SANTOS Ph.D
GUAYAQUIL – ECUADOR
2018
FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA
UNIDAD DE TITULACIÓN
FICHA DE REGISTRO DE TESIS/TRABAJO DE GRADUACIÓN
TÍTULO Y SUBTÍTULO:
EVALUACIÓN DE LA ABSORCIÓN INTESTINAL DE
GEMFIBROZILO INCORPORADO EN CRISTALES LÍQUIDOS
ESTABILIZADAS CON TWEEN 80
AUTOR(ES) (apellidos/nombres):
LOJA CARREÑO LUIS FERNANDO
MOROCHO CORONEL JORGE MIGUEL
REVISOR(ES)/TUTOR(ES) (apellidos/nombres):
Q.F. SARMIENTO TOMALA GLENDA MARCELA M.Sc., REVISOR(A)
LCDA. HERRERA PAREDES MARIA ELIZABETH M.Sc., TUTOR(A)
KOLENYAK DOS SANTOS FERNANDA Ph.D, COTUTOR(A)
INSTITUCIÓN: UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
UNIDAD/FACULTAD: FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
MAESTRÍA/ESPECIALIDAD:
GRADO OBTENIDO: TERCER NIVEL – QUÍMICO FARMACÉUTICO
FECHA DE PUBLICACIÓN: 2018 No. DE PÁGINAS: 74
ÁREAS TEMÁTICAS: CIENCIA Y TECNOLOGÍA FARMACÉUTICA
PALABRAS CLAVES/
KEYWORDS:
Gemfibrozilo, solubilidad, microemulsiones, cristales líquidos absorción
intestinal.
RESUMEN/ABSTRACT (150-250 palabras):
El proceso de absorción de los fármacos destinados a la administración oral depende tanto de las propiedades
fisicoquímicas del mismo como de las características fisiológicas del área de absorción lo que influye en su
solubilidad y permeabilidad. Actualmente existe un gran interés por encontrar vehículos ideales que permitan
mejorar la liberación de la forma farmacéutica y el transporte a través de las membranas, de manera que mejoran
el problema en la disolución y permeabilidad. El objetivo del presente trabajo de titulación procura evaluar el
proceso de absorción del gemfibrozilo incorporado en cristales líquidos utilizando un ensayo ex vivo “saco
intestinal invertido” utilizando solución buffer TC 199 con glucosa para ayudar al transporte a través de las
membranas. Los resultados demostraron que la microemulsión favorece al proceso de disolución y trasporte del
fármaco aumentado de esta manera la biodisponibilidad. En conclusión este modelo ex vivo brinda datos fiables
para evaluar investigaciones cinéticas de fármacos poco solubles.
ADJUNTO PDF: SI NO
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AUTOR/ES:
Teléfono: 0986585645
0990771833
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Nombre: SEDE CIENCIAS QUÍMICAS
Teléfono: 04-229-3680
E-mail: [email protected]
X
XI
XII
AGRADECIMIENTO
Doy gracias en primer a Dios, por guiarme en el transcurso de mi vida, por darme la
sabiduría e inteligencia para culminar con éxito una etapa de mi vida, y de esta manera poder
contribuir a la sociedad con los conocimientos adquiridos. A mis queridos padres Patricio y
Belgica por su apoyo incondicional, constante motivación y amor, enseñándome a jamás darme
por vencido hasta conseguir lo que se desea alcanzar. A mi hermana Lisseth por representar un
ejemplo de dedicación y superación, a mi hermano Victor por ser el motor y siempre
demostrarme su inmenso amor, a mi tía Ruth por siempre aconsejarme para convertir de mí en
un mejor ser humano y a mi sobrino Matheo por llenarme de alegrías constantemente. A mis
abuelos, tíos(as), primos(as) por siempre estar presente, demostrándome el respaldo absoluto
y más sincero de cada uno de ustedes. A Génesis Farías Delgado por su motivación, paciencia
y ayuda que han sido un pilar fundamental para lograr las metas propuestas.
A Luis Loja por ser mi mano derecha durante todo este tiempo y ahora por formar parte de
esta nueva etapa profesional, a Vanessa Luna por apoyarme sin limitaciones en los proyectos
que me he propuesto, a Karina Villao por su total ayuda, disposición y estar en todo tipo de
situaciones; y a Yuliana Olaya por estar presente en cada decisión tomada en mi vida. Muchas
gracias por su sincera amistad colegas.
Jorge Morocho Coronel
Primeramente agradezco a Dios por darme fuerza para seguir adelante con mis estudios para
lograr formarme como químico farmacéutico, a mis padres y hermano que me apoyaron
siempre y me brindaron su confianza, a Katherine Jessenia Alarcón Moreno que gracias a ella
pase los mejores momentos en la facultad ayudándome siempre cuando más lo necesitaba.
Luis Loja Carreño
Queremos expresar nuestro más franco y grande agradecimiento a nuestras docentes Dra.
María Elizabeth Herrera y Dra. Fernanda Kolenyak Dos Santos por su dirección, enseñanza y
colaboración no solo durante el trabajo de tesis, sino también por brindarnos las herramientas
necesarias para desarrollarnos profesionalmente y poder seguir cultivando nuestras virtudes.
Ambos
XIII
Índice General
RESUMEN ....................................................................................................................... XXI
ABSTRACT ................................................................................................................... XXII
ABREVIATURAS ........................................................................................................ XXIII
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 1
CAPÍTULO I ......................................................................................................................... 4
PROBLEMA ......................................................................................................................... 4
1.1 Formulación del problema ....................................................................................... 5
1.2 Justificación e importancia ...................................................................................... 5
1.3 Hipótesis .................................................................................................................. 6
1.4 Variables .................................................................................................................. 6
1.4.1 Independiente ....................................................................................................... 6
1.4.2 Dependiente .......................................................................................................... 6
1.4.3 Operacionalización ............................................................................................... 6
1.5 Objetivos .................................................................................................................. 7
1.5.1 Objetivo General .................................................................................................. 7
1.5.2 Objetivos específicos ........................................................................................... 7
CAPÍTULO II ....................................................................................................................... 8
MARCO TEÓRICO .............................................................................................................. 8
XIV
2.1 Antecedentes ............................................................................................................ 8
2.2 Sistemas de liberación prolongado de fármacos: Microemulsiones (ME) y Cristales
Líquidos (CL)....................................................................................................................... 10
2.2.1 Conceptualización .......................................................................................... 10
2.2.2 Clasificación de Cristales Líquidos ................................................................ 11
2.2.2.1 Cristales Líquidos liotrópicos ................................................................... 11
2.2.2.2 Cristales Líquidos termotrópicos .............................................................. 12
2.3 Diferencia e importancia ....................................................................................... 16
2.4 Diagrama de fases .................................................................................................. 16
2.5 Incorporación de fármacos .................................................................................... 17
2.6 Gemfibrozilo .......................................................................................................... 18
2.6.1 Propiedades fisicoquímicas ................................................................................ 19
2.6.2 Actividad farmacológica .................................................................................... 19
2.6.2.1 Características farmacocinéticas. ................................................................ 19
2.6.2.2 Características farmacodinámicas ............................................................... 20
2.7 Fisiología de la absorción gastrointestinal............................................................. 21
2.7.1 Sitios de absorción intestinal de fármacos ......................................................... 21
2.7.2 Mecanismos de absorción .................................................................................. 22
2.7.2.1 Difusión pasiva ............................................................................................ 23
2.7.2.2 Transporte activo ......................................................................................... 25
2.7.2.3 Proteínas Transportadoras ........................................................................... 26
XV
2.8 Estudios del proceso de absorción de fármacos .................................................... 27
2.8.1 Modelo ex-vivo: Saco intestinal invertido .......................................................... 27
CAPÍTULO III .................................................................................................................... 30
MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................... 30
3.1 Diseño de investigación ............................................................................................ 30
3.2 Obtención de datos .................................................................................................... 30
3.3 Métodos ..................................................................................................................... 30
3.3.1 Preparación de los Cristales Líquidos ................................................................ 30
3.3.2 Microscopía de luz polarizada ........................................................................... 31
3.3.3 Evaluación ex – vivo de la absorción intestinal del gemfibrozilo por el método del
saco intestinal invertido ................................................................................................... 31
3.3.4 Análisis estadístico ............................................................................................. 32
CAPÍTULO IV .................................................................................................................... 34
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................................... 34
4.1 Preparación de los cristales líquidos ......................................................................... 34
4.2 Microscopía de luz polarizada .................................................................................. 34
4.3 Evaluación ex – vivo de la absorción intestinal del gemfibrozilo por el método del
saco intestinal invertido ....................................................................................................... 37
CONCLUSIONES .............................................................................................................. 40
RECOMENDACIONES ..................................................................................................... 41
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 42
XVI
GLOSARIO ......................................................................................................................... 59
ANEXOS ............................................................................................................................. 61
XVII
Índice de Tablas
Tabla I. Composición de los Cristales Líquidos con y sin gemfibrozilo. ........................... 31
Tabla II. Promedio de las concentraciones expresado en mg/mL. ...................................... 39
XVIII
Índice de Anexos
Anexo 1. Absorbancias y concentraciones obtenidas para la muestra de Microemulsión .. 61
Anexo 2. Absorbancias y concentraciones obtenidas para la muestra de Ácido Oleico ..... 61
Anexo 3. Absorbancias y Concentraciones obtenidas para la muestra de Gemfibrozilo a una
concentración de 70 mg/ml ................................................................................................. 62
Anexo 4. Absorbancias y concentraciones obtenidas para la muestra de Tween 80 .......... 62
XIX
Índice de Figuras
Figura 1. Estructuras de cristales liotrópicos. Fase lamelar. ............................................... 12
Figura 2. Estructuras de cristales liotrópicos. Fase hexagonal. ........................................... 12
Figura 3. Cristales líquidos calamíticos. ............................................................................. 13
Figura 4. Cristales líquidos nemáticos. ............................................................................... 13
Figura 5. Cristales líquidos esméticos. ................................................................................ 13
Figura 6. Cristales líquidos colestéricas. ............................................................................. 14
Figura 7. Cristales líquidos discóticos. ............................................................................... 14
Figura 8. Cristales líquidos sanídicos. ................................................................................. 15
Figura 9. Cristal líquido cúbico fase micelar. ..................................................................... 15
Figura 10. Cristal líquido cúbico fase bicontinua. .............................................................. 16
Figura 11. Representación esquemática de un diagrama de fases. ..................................... 17
Figura 12. Ácido 5-(2,5-dimetilfenoxi)-2,2-dimetilpentanoico. ......................................... 19
Figura 13. Biotransformación del GMZ. ............................................................................. 20
Figura 14. Estructura de la membrana plasmática. ............................................................. 23
Figura 15. Ruta transcelular. ............................................................................................... 24
Figura 16. Ruta paracelular. ................................................................................................ 25
Figura 17. Transporte simporte. .......................................................................................... 26
Figura 18. Tranporte antiporte ............................................................................................ 27
Figura 19. Modelo del saco intestinal invertido. ................................................................. 28
XX
Figura 20. Cristales Líquidos durante el tiempo de almacenamiento. ................................ 34
Figura 21. Microscopía de luz polarizada de los sistemas sin gemfibrozilo. ...................... 35
Figura 22. Microscopía de luz polarizada de los sistemas con gemfibrozilo. ..................... 36
Figura 23. Efecto de los cristales líquidos y excipientes en la absorción del gemfibrozilo, en
el intestino delgado y colon. Las barras representan la media de las concentraciones absorbidas
durante 90 minutos con un p-valor<0,05 (*) estableciendo diferencias estadísticamente
significativas. ........................................................................................................................... 38
XXI
RESUMEN
El proceso de absorción de los fármacos destinados a la administración oral depende tanto de
las propiedades fisicoquímicas del mismo como de las características fisiológicas del área de
absorción lo que influye en su solubilidad y permeabilidad. Actualmente existe un gran interés
por encontrar vehículos ideales que permitan mejorar la liberación de la forma farmacéutica y
el transporte a través de las membranas, de manera que mejoran el problema en la disolución
y permeabilidad. El objetivo del presente trabajo de titulación procura evaluar el proceso de
absorción del gemfibrozilo incorporado en cristales líquidos utilizando un ensayo ex vivo “saco
intestinal invertido” utilizando solución buffer TC 199 con glucosa para ayudar al transporte a
través de las membranas. Los resultados demostraron que la microemulsión favorece al proceso
de disolución y trasporte del fármaco aumentado de esta manera la biodisponibilidad. En
conclusión este modelo ex vivo brinda datos fiables para evaluar investigaciones cinéticas de
fármacos poco solubles.
Palabras Claves: Gemfibrozilo, solubilidad, microemulsiones, cristales líquidos, absorción
intestinal.
XXII
ABSTRACT
The process of absorption of drugs destined for oral administration depends on both
physicochemical properties of it as well as the physiological characteristics of the absorption
area, which influences the solubility and permeability. Currently there is great interest in
finding ideal vehicles that would allow a better release of the pharmaceutical form and transport
among membranes, thus improving the permeability and dissolution issue. The aim of this
paper is to evaluate the process of absorption of gemfibrozil by incorporating liquid crystals,
using an ex vivo essay “everted gut sac” using a TC 199 buffer solution with glucose to aid the
transport through the membrane. The results showed that the micro-emulsion favors the
dissolution process and the transport of the drug, increasing the bioavailability. In conclusion
the ex vivo model brings reliable results to evaluate kinetic research of low solubility drugs.
Keywords: Gemfibrozil, solubility, microemulsions, liquid crystals, intestinal absorption.
XXIII
ABREVIATURAS
Apo Apolipoproteina
ATP Adenosina trifosfato
CL Cristales Líquidos
GMZ Gemfibrozilo
HDL High density lipoprotein
INSPI Instituto Nacional de Salud Pública e Investigación
ME Microemulsión (es)
MRP Multidrug resistance proteins
O/W Aceite en agua
PPAR Peroxisome proliferator-activated receptor Alpha
SAXS Small-angle X-ray scattering
SGI Sistema gastrointestinal
UDP Uridin difosfato
VLDL Very-low-density lipoprotein
W/O Agua en aceite
1
INTRODUCCIÓN
Investigaciones relacionadas con la obtención de sustancias desconocidas que mantenían su
estado físico entre sólido, líquido y gaseoso se reportaron desde finales del siglo XIX aunque
su denominación de cristales líquidos llegó años más tarde al igual que sus aplicaciones, es así,
que se emplearon inicialmente como materiales para la fabricación de pantallas de televisión y
poco a poco se extendió su uso en otras áreas como alimentos, medicina, tecnología
farmacéutica, entre otras.
Por otro lado, el término de microemulsión se reconoció en 1943 por Hoar y Schulman
recibiendo el nombre de “hidro-micela oleofática”, además identifican a estos sistemas como
dispersiones transparentes de agua en aceite. En 1948 se establecen cuatro tipos de sistemas
llamados Winsor I, II, III y IV, que se basan en el equilibrio de fases a partir de mezclas de
agua, aceite y un compuesto anfifílico (Winsor, 1948; citado por Zemb, et al., 2015).
Años más tarde, Danielsson y Lindman, en 1981 definen a las microemulsiones (ME) como
un sistema líquido simple y transparente, compuesto por agua, aceite y surfactante. Años más
tarde, la combinación de estas fases inmiscibles produce una inconsistencia de la estructura
molecular, siendo necesario la adición de tensoactivos (estabilizadores) para alcanzar un grado
consistente de estabilidad (Kundu, et al., 2014; Bera y Belhaj, 2016).
Las concentraciones altas de tensoactivos ocasionan un choque de partículas dentro de la
micela, interacción que da como resultado el aparecimiento de compuestos más complejos que
toman el nombre de mesofases que tienen un comportamiento ordenado paralelamente con la
capacidad de desplazarse en su superficie y que se caracterizan por ser de formas alargadas y
usar cantidades de energía muy pequeñas para movilizarse en relación a su eje (Malkondu y
Kocak, 2013; Santanna, et al., 2013; Liyanage, et al., 2015).
2
En la industria farmacéutica, durante las últimas décadas, estos sistemas se emplean como
vehículos ideales para fármacos debido a que optimizan los procesos de liberación y absorción
facilitando el transporte de principios activos administrados por diferentes vías, principalmente
la oral, ya que en función del compuesto elevan su capacidad de solubilización, estabilidad
termodinámica y reducen la viscosidad mejorando su paso a través de las barreras fisiológicas
existentes (Huang, et al., 2013; Patel, et al., 2013; Karambeigi, et al., 2016).
Reportes científicos ponen de manifiesto que el proceso de absorción es determinante para
que los fármacos en concentraciones adecuadas puedan llegar a su sitio blanco garantizando
un mayor porcentaje de efectividad terapéutica (Holm, et al., 2013). Esta ventaja que aporta la
absorción de los compuestos activos según sus características físico-químicas, puede
convertirse en una limitante dando como resultado tratamientos poco efectivos o incrementos
de dosis que precisaría una minuciosa evaluación beneficio-riesgo con el fin de no afectar la
calidad de vida de los pacientes (Yamashita, et al., 2013; Chillistone y Hardman, 2017;
Álvarez, et al., 2018). Es así como se vuelven aplicables una serie de ensayos ex vivo para
evaluar la absorción de agentes terapéuticos en sitios como el intestino donde este proceso tiene
lugar en proporciones considerables (Bojcsev, Almási, Simon, Perjési, y Fischer, 2013).
Uno de los métodos ex vivo aplicados para evaluar la absorción intestinal es conocido como:
modelo de saco intestinal invertido (Wilson y Wiseman, 1954) que tiene como objetivo estudiar
la absorción de fármaco dentro del intestino delgado en ratas y/o cobayos. Especies de elección
para este tipo de ensayos son las ratas (Amenta, et al., 2018), ratones, hámsteres además de la
Cavia porcellus conocida comúnmente como cobayo (conejillo de indias) o también como cuy
o curiel en América Latina y el Caribe (Vasconcelos, et al., 2013).
El uso de cobayos en experimentación se comenzó a popularizar en el siglo XIX, dado a sus
características morfológicas y fisiológicas similares al ser humano. De manera que contribuyó
en el desarrollo de vacunas para la tuberculosis, modelo experimental de infección por
Trypanosoma cruzi (Castro-Sesquen, et al., 2011), transfusión de sangre (Fredholm, et al.,
3
2012), hipertiroidismo (Brandão, et al., 2013), colelitiasis (Bochmann, et al., 2016),
medicamentos para el asma y válvulas cardíacas, haciendo a esta especie como un modelo in
vivo viable con resultados óptimos (Shomer, et al., 2015, pág. 248).
El uso de biomodelos en técnicas experimentales involucra la aplicación de normas éticas
que exigen el adecuado manejo y cuidado de los animales con fines de experimentación en
base al principio de las “tres R” (reemplazar, reducir y refinar) (Russell y Burch, 1959; citado
por Beekhuijzen, 2017). Las consideraciones éticas mejoran notablemente la respuesta de las
especies empleadas en investigación y cada una de sus premisas se viabilizan con diseños
estadísticos adecuados que garanticen resultados estadísticamente significativos y
biológicamente confiables (Hossy, et al., 2018).
4
CAPÍTULO I
PROBLEMA
Los procesos de formulación y elaboración de sustancias terapéuticas poco solubles
representan un desafío en la industria farmacéutica (Lipp, 2013; Lu, Wenslow y Newman 2015,
434). Una de las causas es que las propiedades fisicoquímicas que posee un principio activo
para liberase de la forma farmacéutica y posteriormente disolverse en el medio biológico
repercuten sobre la biodisponibilidad (Kumar y Burgess, 2014; Al-Kassas y Bansal, 2017). En
este contexto, la mayoría de los fármacos destinados a la administración oral presentan escasa
solubilidad acuosa que refleja directamente un déficit durante el proceso de absorción (Kupetz,
Preu, Kunick, y Bunjes, 2013). Entre ellos se puede mencionar el gemfibrozilo (GMZ), que se
prescribe ampliamente para el tratamiento de trastornos del metabolismo de lípidos provocando
efectos como el decrecimiento en la concentración de triglicéridos en plasma y un aumento de
las lipoproteínas de alta densidad (HDL, por sus siglas en inglés) (Nordestgaard y Varbo 2014;
Wang, et al., 2015).
Para alcanzar los niveles plasmáticos de fármaco efectivos al cabo de una a dos horas
considerando su elevada unión a proteínas (95%) se maneja terapéuticamente rangos de dosis
diaria en pacientes adultos que varía de 900 a 1200 mg respectivamente (Ahmad, Feizbakhsh,
Karimpour y Moniri, 2013).
Según estos antecedentes se hace visible la necesidad de presentar alternativas que mejoren
las características de absorción del fármaco siendo una de ellas la incorporación de GMZ en
sistemas de liberación controlada por lo que el aporte de esta investigación consiste en evaluar
si estos sistemas procuran la mejora en el proceso de absorción del fármaco.
5
1.1 Formulación del problema
¿Podrán los cristales líquidos favorecer la absorción intestinal del Gemfibrozilo?
1.2 Justificación e importancia
La acción hipolipomiante del GMZ hace de este fármaco el tratamiento de elección en
pacientes que presentan dislipidemias con aumento de triglicéridos y aunque la tolerancia a
este medicamento es elevada se trabaja con dosis superiores a 1000 mg/día (Choi, et al., 2015).
Con lo mencionado, sería de gran importancia la búsqueda de nuevas alternativas tecnológicas
que puedan disminuir la dosis de GMZ y también el tiempo de administración garantizando su
efecto y prolongando su acción.
Los sistemas nanoestructurados se consideran una alternativa viable para arreglar las
limitaciones de este fármaco. Dentro de estos, se encuentran las ME como sistemas isotrópicos
espontáneos y termodinámicamente estables que pueden actuar como transportadores de
fármacos (hidrofílicos y lipofílicos) por su conveniente tamaño de partícula que se encuentra
alrededor de 200nm (Yasir y Sara, 2014).
Los estudios de absorción intestinal se consideran un parámetro importante que ayuda a
conocer la concentración de fármacos absorbida a partir de la mucosa intestinal. Razón por la
que en el presente proyecto se pretende evaluar la absorción intestinal del GMZ incorporado a
ME.
6
1.3 Hipótesis
Las microemulsiones estabilizadas con tween 80 favorecen la absorción intestinal del
gemfibrozilo.
1.4 Variables
1.4.1 Independiente
Microemulsión
1.4.2 Dependiente
Absorción intestinal
1.4.3 Operacionalización
Variable Conceptualización Indicador Índice Escala
Independiente Microemulsión
Mezclas
homogéneas entre
agua, aceite y
tensoactivos.
Cristales
líquidos
Concentración
de
Gemfibrozilo
Ordinal
Dependiente Absorción
intestinal
Captación de
moléculas a través
de las membranas.
Modelo
ex vivo
Saco
intestinal
invertido
Nominal
7
1.5 Objetivos
1.5.1 Objetivo General
Evaluar la absorción intestinal de gemfibrozilo incorporado en cristales líquidos
estabilizados con tween 80.
1.5.2 Objetivos específicos
Valorar la capacidad transportadora de cristales líquidos a través de la mucosa
intestinal.
Identificar el componente de los cristales líquidos que facilita el transporte de
gemfibrozilo.
Cuantificar la concentración de gemfibrozilo absorbida en el saco intestinal.
8
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
2.1 Antecedentes
Una de las primeras investigaciones que docuementa científicamente las propiedades fisicas
de los CL fue realizada por el biólogo Julius Planer (1861) quien observó y describió un efecto
óptico en un derivado del colesterol (cloruro de colesterol); posterior a este evento, el botánico
australiano Friedich Richard Reinitzer (1889) durante su estudio de la fórmula química del
colesterilbenzoato, un derivado del colesterol, encontró la existencia de mezclas con dos puntos
de fusión y una fase intermedia, además de cambios en la coloración al momento de incidir un
haz de luz. Estas características las corroboró en colaboración del físico Lehmann (1889) con
quien por medio de un microscopio de polarización observó una estructura cristalina que
permanecía en estado líquido. Un siglo después, las explicaciones teóricas fueron desarrolladas
por el fisico De Vries (1951) y más tarde James Ferguson (1963) describe la propiedad del
cambio de color al aplicar temperatura registrando de esta manera los rayos infrarrojos térmicos
no visibles para el ojo humano (De Vries, 1951; Ferguson, 1963; citados por Nazarenko, et al.,
2018).
Con el descubrimiento de nuevas propiedades el interés de conocer acerca de los CL se
expandió rápidamente hasta que el fisico Pierre-Gilles de Gennes (1991) descubre que los
métodos desarrollados para estudiar los fenómenos de orden en sistemas simples pueden
generalizarse a formas más complejas de la materia (cristales líquidos y polímero) (De Gennes,
1991; citado por Nazarenko, et al., 2018).
La acción de estos sistemas dentro del ámbito farmacéutico se realiza aproximadamente
desde los sesenta y setenta por Haleblian y McCrone, quienes evaluaron la estabiliadad y
biodisponibilidad de moléculas polimórficas sugiriendo de manera el uso de estos sistemas en
moléculas sólidas, rigidas y pequeño tamaño (Halablian y McCrone, 1969). Estas
9
investigaciones sirvieron como preliminares para que en la década de los noventa se los tome
a prueba en la evaluación de principios activos que tienen una baja solubilidad (Lund, Pagola,
Orendt, Ferraro, y Facelli, 2016).
En 1954 Wiseman y Wilson aplican por primera vez el modelo del saco intestinal invertido,
al evaluar las diferentes regiones de absorción intestinal y rutas del transporte del fármaco por
medio de nutrientes como la glucosa y aminoácidos (Wilson y Wiseman, 1954). En años
posteriores, estudios histológicos realizados por Levine, et al. (1970) demostraron la influencia
de la temperatura en estos ensayos y reportan que morfológicamente los sacos intestinales
sufren deterioro después del periodo de incubación, en treinta minutos disminuye
aproximadamente un 75% del epitelio normal y al cabo de una hora el daño presentado era
total (Levine, et al., 1970).
Un severo daño sobre las criptas y microvellosidades de los intestinos extraídos al cabo de
veinte minutos en soluciones tapones simples, se reportó en otros estudios, de manera que tomó
realce la preservación de la integridad estructural y funcional de los enterocitos en dependencia
directa del adecuado monitoreo en el transcurso de la extracción e incubación del saco intestinal
(Plumb, et al., en 1987).
La viabilidad en la morfología del tejido se reflejaba como un factor a tener en cuenta por
la influencia de soluciones salinas simples empleadas en estos procedimientos, razón por la
que se realizaron modificaciones sobre el método básico empleando un medio de cultivo tisular
nombrándolo como TC 199 que optimiza el sistema y el saco intestinal, comprobándose con
éxito al momento de cuantificar las concentraciones de fármaco captados por la capa intestinal
8mediante endocitosis en un modelo in vitro (Bridges, et al., 1980; citado por Ming, Inge,
Graaf, Geny, Groothuis, 2016).
10
La modificación anterior se utilizó en estudios para evaluar la absorción intestinal de:
liposomas (Rowland y Woodley, 1981), polímeros sintéticos (Pató, et al., 1994; Barthe L. , et
al., 1998). También se empleó en la evalución del metabolismo del primer paso (Emoto, et al.,
2000), interacción entre los fámacos imipenem y ácido valproico (Torii, et al., 2001),
metabolismo de isoflavonas (Wilkinson, et al., 2003), cinética de absorción (Liu, et al., 2005),
influencia de la temperatura en relación a la captación de xenobioticos (Kleinow , et al., 2006),
inhibicion en la recaptación de glucosa (Kashimura y Nagai, 2007; Therasa, et al., 2014 ).
Además se aplica para determinar cantidades aceptables para la ingesta de suplementos
alimenticios (Park, Kwon y Sun, 2009), estudios de biodisponibilidad e identificación de sitios
de absorción (Ibrahim, et al., 2012).
Los últimos ensayos con la aplicación del modelo del saco intestinal invertido se enfocan
en sistemas formados por la incorporación de fármacos a vehículos nanotecnológicos entre
ellos los CL, con resultados efectivos reportando una notable mejora en el paso del principio
activo a circulación sistémica (Gabr, Mortada, y Sallam, 2017).
2.2 Sistemas de liberación prolongado de fármacos: Microemulsiones (ME) y
Cristales Líquidos (CL)
2.2.1 Conceptualización
En 1888 el botánico de origen Austriaco Friedrich Reinitzer fue el primero en trabajar con
cristales líquidos encontrándolos en algunos elementos orgánicos como el colesterol, este
científico observo que al someter dichos elementos a una temperatura de 145 ºC el sólido que
lo conformaba se convertía en un líquido con aspecto turbio, sin embargo cuando la
temperatura alcanzo los 179 ºC también se observó que el líquido turbio se transformó a un
líquido completamente claro, un año después el científico Friedrich Lehmann se percató que el
líquido turbio tenía propiedades ópticas y con características en su estructura muy similares a
las de un sólido cristalino recibiendo el nombre de cristal líquido (CL) (Reinitzer, 1888; citado
por Mitov, 2014).
11
La selección de los componentes o sustancias adecuadas evitará que en los cristales líquidos
(CL) puedan existir problemas a nivel de su formulación y evitar que éstas causen irritación al
momento de su administración (Montalvo, et al., 2013; Hörmann y Zimmer, 2015; Ma,
Davidson, y Zhong, 2016). Para evitar este tipo de inconvenientes se debe realizar una elección
cuidadosa de los componentes y el fármaco que debe poseer una gran capacidad de
solubilización al ser incorporado en el sistema así como la capacidad de formarlo (Kushwaha,
et al., 2014; Zabara y Mezzenga, 2014; Lampis, et al., 2018).
Por otra parte los CL o también llamados mesofases forman estructuras organizadas
autoensambladas con una condensación distinta a la de otros líquidos debido a que las
moléculas o iones que los conforman se encuentran de manera ordenada (Jia, et al., 2014); las
fases que forman los CL se dividen en termotrópicos (Lehtinen, et al., 2017) porque van a
depender de la temperatura para mantener su estabilidad y liotrópicos (Shivanandareddy, et al.,
2018) por la adición de solventes donde se requiere al menos dos componentes para formar su
estructura una molécula anfifílica y un solvente hidrofílico que se van a encontrar unidos por
puentes de hidrógeno (He, et al., 2017).
2.2.2 Clasificación de Cristales Líquidos
2.2.2.1 Cristales Líquidos liotrópicos
De acuerdo a su estructura y al alcance de las mismas los CL se van a clasificar en dos
grupos, el primero estará formado por elementos reticulados lamelares (Figura 1) de una a tres
dimensiones dándoles un orden y un largo alcance a su estructura, por otro lado existe otro
grupo que depende de la cantidad de agua y de la temperatura para obtener una orientación
perpendicular y un desorden total en su estructura de este modo se pueden encontrar cadenas
elongadas con libre rotación y cadenas con un enrollamiento helicoidal que forman hélices en
la estructura de los CL termotrópicos (Figura 2), (Lillini, et al., 2016).
12
Figura 1. Estructuras de cristales liotrópicos. Fase lamelar.
Fuente: Pasquali, Bregni y Serra, (2006).
Figura 2. Estructuras de cristales liotrópicos. Fase hexagonal.
Fuente: Pasquali, et al., (2006).
2.2.2.2 Cristales Líquidos termotrópicos
Cristales Líquidos calamíticos
Las moléculas de estos cristales se encuentran ubicadas en forma de varilla (Figura 3),
debido a esta estructura se presentan tres tipos de mesofases por un lado los CL nemáticos
(Figura 4), que se caracterizan por la carencia de orden posicional pero con un mismo sentido
de orientación, además están los cristales esméticos (Figura 5) que a diferencia de los
nemáticos se acomodan en forma de capas y poseen un orden distinto con semejanza a una
estructura sólida y finalmente los CL colestéricos o nemáticos quirales (Figura 6), con un largo
alcance en su orientación pero a su vez con un corto alcance en su orden posicional (Andrienko,
2018).
13
Figura 3. Cristales líquidos calamíticos.
Fuente: Andrienko, (2018).
Figura 4. Cristales líquidos nemáticos.
Fuente: Andrienko, (2018).
Figura 5. Cristales líquidos esméticos.
Fuente: Andrienko, (2018).
14
Figura 6. Cristales líquidos colestéricas.
Fuente: Andrienko, (2018).
Cristales Líquidos discóticos
Estos cristales se presentan en forma de discos (Figura 7), y se caracterizan por tener un
orden en su orientación formando fases nemáticas con un corto alcance en su orden posicional,
las moléculas se ubican una encima de otra formando una columna vertical y exhibiendo una
desviación a lo largo del empaque, esto va a permitir que se constituyan nuevas fases como la
columna hexagonal y rectangular (Mănăilă-Maximean, et al., 2017).
Figura 7. Cristales líquidos discóticos.
Fuente: Andrienko, (2018).
Cristales Líquidos sanídicos
Su característica principal es que presentan forma de tableros (Figura 8), y surgen de
moléculas en forma de disco o varillas en dependencia del tamaño de su eje principal
exhibiendo sus propiedades mesomórficas (Kumar, Kannojia, y Mishra, 2017).
15
Figura 8. Cristales líquidos sanídicos.
Fuente: Kumar, Kannojia, y Mishra (2017).
Cristales Líquidos cúbicos
Cuando a estas estructuras se les añade un estabilizador estas se dispersan en el agua
originando la formación de cubosomas y hexosomas, estos dos sistemas tienen diversas
propiedades y un gran potencial en el uso medicinal entre las cuales resalta su fluidez,
extensibilidad y afinidad a capas de la piel, gracias a su la composición lipídica estas van a
favorecer el paso de medicamentos polares y no polares, otras estructuras que se pueden
apreciar son la micelar (Figura 9) y la bicontinua (Figura 10) que se originan por el
autoensamblaje de moléculas anfifílicas (Quirino, et al., 2017).
Figura 9. Cristal líquido cúbico fase micelar.
Fuente: Quirino, et al., (2017).
16
Figura 10. Cristal líquido cúbico fase bicontinua.
Fuente: Quirino, et al., (2017).
2.3 Diferencia e importancia
Las ME a diferencia de los CL van a poseer una estructura molecular distinta siendo estas
más estables termodinámica y cinéticamente hablando, lo que resalta su papel fundamental en
la administración de fármacos por su capacidad de solubilización que facilita tanto la
incorporación de mayor cantidad de principio activo como también la protección de las
formulaciones estudiadas (Kumar, Kushawaha, y Kumar, 2013). Por otra parte, los CL se
encuentran de forma intermedia entre el estado líquido y el sólido cristalino, por tanto debido
a presentarse como fases intermedias o semisólidas, sus moléculas o iones mantienen un estado
mesomórfico para obtener un largo alcance en cuanto a su orientación molecular y un desorden
en su posición molecular sumado a esto, la viscosidad que poseen incrementa la disolución de
fármacos tanto hidrosolubles y liposolubles (Aubery, Solans, Prévost , Gradzielski, y Sanchez-
Dominguez, 2013; Terescenco, et al., 2018).
2.4 Diagrama de fases
La formación, seguimiento y elección de las mezclas adecuadas para formar sistemas
estables (ME y CL) se representan gráficamente a través de diagramas de fases en los cuales
se observa la interacción proporcional entre agua, aceite y tensoactivos (Figura 11). Uno de
los fines de estos diagramas ternarios es evaluar la composición y comportamiento de las
diferentes fases, es decir, la construcción de un diagrama de fases, en el cual el 100% de cada
17
uno de los componentes se representa individualmente en los vértices, brinda información
macroscópica sobre los cambios estructurales de los sistemas, donde es posible identificar
emulsiones, separación y transición de fases, además de sugerir la posible formación de
microemulsiones y/o cristales líquidos (Acharya, Guru, y Dash, 2016; Chiappisi, Noirez, y
Gradzielski, 2016).
Figura 11. Representación esquemática de un diagrama de fases.
2.5 Incorporación de fármacos
El interés del uso de las ME como sistemas de liberación de fármacos ha incrementado en
los últimos años, ya que estos agregados permiten la liberación del fármaco de manera lenta
esto enfatiza un efecto prolongado sin alcanzar concentraciones plasmáticas por encima de lo
necesario; el sistema coloidal formado por agua y aceite subsecuentemente gana importancia
en el desarrollo de formulaciones por su uso como vehículos para la liberación del fármaco en
especial aquellos que son poco hidrosolubles (Hussain, et al., 2015; Lee, et al., 2016).
18
Otras alternativas para la liberación de fármacos son las ME lipídicas del tipo O/A por su
estructura básica formada por un lípido neutro en la región interna, con este sistema se puede
solubilizar en la región hidrofóbica una cantidad considerable de fármacos liposolubles, de esta
forma se manifiesta su potencial aplicación terapéutica para ser usado como transportadores de
fármacos (Starkloff, Palma, y Gonzalez-Vidal, 2013; Spillmann, Naciri, Algar, Medint, y
Delehanty, 2014).
Los CL presentan regiones alternas hidrofílicas y lipofílicas en donde los fármacos se
pueden incorporar colocándose en estas dos regiones y también en la bicapa de los cristales
dependiendo de nuevamente del grado de solubilidad del fármaco (Hussain, et al., 2016; Shao,
et al., 2014).
Una vez incorporado el principio activo las interacciones existentes influirán en el proceso
de liberación considerando la estructura y propiedades fisicoquímicas del fármaco,
características que permiten que los CL se empleen como transportadores con capacidad de
controlar la liberación (Delehanty, Breger, Gemmill, Stewart, y Medintz, 2013).
2.6 Gemfibrozilo
Los efectos terapéuticos producidos por este fármaco son visibles en la clínica por su acción
como agente reductor lipídico (Millan, et al., 2018); investigaciones realizadas por Stalenhoef,
et al., (2000) mostraron que en promedio se pueden reducir los triglicéridos hasta un 38% y
aumentar el colesterol total hasta en un 8%, haciendo a este fármaco la primera elección en el
tratamiento de la hipertrigliceridemia, hiperlipidemia mixta y especialmente la dislipidemia
aterogénica del síndrome metabólico y diabetes (Davidson, et al., 2014; Keene, Price, Shun-
Shin, y Francis, 2014).
19
2.6.1 Propiedades fisicoquímicas
El GMZ es una molécula pequeña derivada del ácido fenoxifentanoico no halogenado cuyo
nombre químico es ácido 5-(2,5-dimetilfenoxi)-2,2-dimetilpentanoico (Figura 12). Tiene
aspecto sólido de color blanco con un punto de fusión igual a 62°C, punto de ebullición 158.5
° C a 2.00E-02 mm Hg, con densidad de 1,3 g/cm3, posee un coeficiente de partición de 2.4, una
solubilidad del 0.0019% equivalente a 0.01 mg/mL en agua y ácido, en presencia de alcohol se
disuelve por completo y aproximadamente el 1% se disuelve en base diluida (Kohli, et al,
2010).
Figura 12. Ácido 5-(2,5-dimetilfenoxi)-2,2-dimetilpentanoico.
Fuente: Hussain, et al., (2017).
2.6.2 Actividad farmacológica
2.6.2.1 Características farmacocinéticas.
Luego de la administración oral, el GMZ se absorbe en el tracto gastrointestinal, su
metabolización en el hígado implica reacciones de Fase I por oxidación del grupo metilo
formando un metabolito intermedio activo (hidroximetilo) que al conjugarse con el ácido
glucurónico se transforma en un conjugado que toma el nombre de gemfibrozil 1-beta-
glucuronido (Figura 13) (Watanabe, et al., 2011). Los niveles plasmáticos son
proporcionales a la dosis empleada y no presenta acumulación en dosis repetidas, pero sí
una afinidad a proteínas que oscila entre 95% a 98%. El fármaco se excreta en mayores
proporciones por la orina tanto en forma pura (2%) como en conjugado glucurónido (70%)
y por las heces se elimina tan solo un 6% del GMZ en estado puro (Macha, et al., 2014). El
tiempo de vida media en dosis única se establece en una hora con cincuenta minutos,
20
mientras que en dosis múltiples es de una hora con veinte minutos, por otro lado el
vaciamiento gástrico afecta es un factor a tener en cuenta para que exista o no el efecto
buscado.
Figura 13. Biotransformación del GMZ.
Fuente: Grenni, et al., (2018).
2.6.2.2 Características farmacodinámicas
Los mecanismos de acción del GMZ para regular las fracciones lipídicas tienen escasos
reportes en la literatura, por ejemplo algunos autores sugieren que interactúa con los receptores
activados por proliferadores de peroxisomas (PPAR, por sus siglas en inglés) encargados de la
regulación en la transcripción de algunos genes (Villar, et al., 2013). Se conoce que los fibratos
interactúan directamente con el PPAR-α presente en la mayoría de los hepatocitos y tejido
adiposo; por otro lado en riñones, corazón y músculo esqueleto la cantidad es mínima. De esta
manera estimula la lipolisis periférica de las lipoproteínas por medio de una β-oxidación que
provoca un descenso de los triglicéridos a nivel plasmático, aumento del colesterol total y
lipoproteínas de alta densidad (HDL, por sus siglas en inglés); además es responsable en la
inhibición de la síntesis y depuración de la apolipoproteína (Apo) β (portador del VLDL, por
UDP-glucoronil
Transferasa
Gemfibrozilo Gemfibrozil 1-beta-
glucuronide
21
sus siglas en inglés), de esta manera aumenta las subfracciones de lipoproteína de alta densidad,
HDL-2 y HDL-3, así como la apolipoproteína A-I y A-II (Hussain, et al., 2017),
En la presente investigación nuestro grupo ha desarrollado CL y ME estabilizadas con tween
80 para la incorporación de GMZ, los resultados muestran que el fármaco tiene una interacción
positiva al ser agregados a los CL, esto dio paso a una nueva estructura de ME que favoreció a
la absorción intestinal.
2.7 Fisiología de la absorción gastrointestinal
2.7.1 Sitios de absorción intestinal de fármacos
Para que el principio activo pueda interactuar con sus sitios diana es primordial que sea
absorbido hasta la circulación sistémica en concentraciones que permitan la aparición de los
efectos esperados en un tiempo determinado; para esto es importante el proceso cinético por el
que atraviesa para liberarse de la forma farmacéutica que le permitió ingresar al organismo
(Bolger y Technics, 2018).
Los fármacos en especial por vía oral pasan por del Tracto Gastrointestinal (TGI),
comprendido por esófago, estómago, intestino delgado, intestino grueso y colon, cada uno de
ellos con funciones específicas, por ejemplo: para la mayor parte de xenobióticos y sustancias
endógenas, el proceso de absorción se realiza principalmente por el intestino delgado aunque
no solo a este órgano le corresponde esta acción; es aquí donde también entra en juego el
tamaño, forma y las características de solubilidad de los compuestos exógenos o endógenos
tanto en medio acuoso como oleoso, siempre considerando que es de gran interés la solubilidad
relativa de los mismos, expresada por el coeficiente de partición, para poder predecir si el
compuesto primordialmente aquellos que son farmacológicamente activos pueden pasar a
través de las capas de lípidos que conforman las membranas celulares o si es mayor la
posibilidad de que permanezcan en las zonas acuosas (Sauer y Merchant, 2018).
22
Estudios enfocados desde el punto de vista histológico reportan la compleja conformación
del intestino ya que no solo consta de capas mucosas, submucosas sino que también presenta
capas muscules y serosas. No obstante el sitio de interés para que se dé lugar la absorción de
diferentes sustancias es la zona mucosa donde se encuentra el epitelio que morfológicamente
se identifica como aparentes pliegues circulares dirigidos hacia la luz intestinal que se conocen
como vellosidades las cuales tienen relación directa con la superficie de absorción y además
contienen las células de absorción denominadas enterocitos (Kusamori, et al., 2018).
La constante renovación del epitelio intestinal promueve la presencia de enterocitos jóvenes
los mismos que tienen una semivida muy corta pero que permiten optimizar la absorción al
interactuar con micelas formadas durante el proceso digestivo y que poseen características
específicas según el tipo de compuestos que engloban sean estos lípidos, proteínas, glúsidos,
iones, etc., (Sheikh y Plevy, 2014, pág. 38).
2.7.2 Mecanismos de absorción
La membrana plasmática de todas las células y puntualmente de los enterocitos, se
encuentran constituidas por una bicapa formada por fosfolípidos, lípidos y proteínas, es decir,
moléculas anfipáticas con una parte hidrófila orientada hacia el exterior de la membrana y la
otra hidrófoba en dirección del interior de la molécula (Figura 14) (Krapf, 2018). De esta
manera cuando el organismo prosigue el transporte de compuestos de un extremo al otro de la
membrana, se enfrentan a dos medios polares separados por uno no polar, lo que representa
termodinámicamente una barrera de energía que puede oponerse a este paso, con estos
antecedentes se plantean en varios estudios una serie de mecanismos utilizados en este caso
puntual por fármacos para atravesar estas barreras acorde a propiedades específicas de carácter
imprescindible (Devadasu, et al, 2018).
23
Figura 14. Estructura de la membrana plasmática.
Fuente: Hirano, et al, (2017)
2.7.2.1 Difusión pasiva
La difusión pasiva es el principal mecanismo que rige el transporte de los fármacos a través
de las membranas biológicas y es fundamental para completar los procesos de absorción,
distribución y reabsorción en especial en el túbulo renal durante la excreción (Backes W. L.,
2015). Facilita la estabilidad de otros mecanismos (filtración, endocitosis e incluso el transporte
activo), y durante el estudio de varios mecanismos de acción se observa que esta ruta no es
específica para el transporte de fármacos sino que participa también en la transferencia de
muchos compuestos endógenos (Borbás, et al., 2016).
Un punto crítico es la diferencia de concentración tanto fuera como dentro de la membrana
siendo característico que la dirección del transporte vaya desde las áreas de concentraciones
mayores hacia parte de interna de la membrana donde la concentración es menor, de esta
manera este flujo en el transporte de las moléculas busca constantemente mantener un
equilibrio a los dos lados de la membrana (Lock, Carlson, y Carrier, 2018). Sin embargo, la
velocidad de transporte en los fármacos varía de acuerdo con cuatro factores: (a) superficie de
la membrana, (b) concentración de fármaco en el sitio de acción, (c) la liposolubilidad y (d) las
características de ionización (Scott, Ghosh, y Maurer, 2017).
24
Dentro de esta vía de transporte se pueden señalar dos rutas principales que utilizan los
fármacos para atravesar las barreras biológicas:
Ruta transcelular
Es la principal vía de transporte de moléculas a través de las membranas intestinales que
distribuye las partículas entre la bicapa lipídica y el fluido intestinal (Figura 15). Esta es la
ruta de elección por compuestos lipofílicos y de menor tamaño molecular, características a las
que sumamos el grado de ionización ya que todo esto en conjunto puede modificar este
transporte (Smith, et al., 2014; Tari, et al., 2017).
Figura 15. Ruta transcelular.
Fuente: Ozeki, et al., (2015)
Ruta paracelular
Este mecanismo se caracteriza por la apertura de poros que se encuentran en los espacios
existentes entre las células, favoreciendo el paso de moléculas que sean altamente hidrosolubles
y de peso molecular bajo (Figura 16) (DiMarco, et al., 2017).
25
Figura 16. Ruta paracelular.
Fuente: Smith, et al., (2014)
2.7.2.2 Transporte activo
Se produce de forma unidireccional en contra del gradiente electroquímico y de
concentración, en donde el paso del soluto no puede generarse por difusión por lo que necesita
una fuente de energía para su traslado al interior de la membrana celular, en sí, desde un
compartimiento por lo general de concentraciones bajas; para esto precisa de la formación de
un complejo sustrato-transportador que posee uniones específicas y reversibles (Fajardo y
Guevara, 2018).
Existen diferentes formas de clasificar a este tipo de mecanismos se puede mencionar
entonces el transporte dependiente de adenosina trifosfato (ATP) que se produce de forma
directa por medio de la hidrolisis del mismo o utilizando cotransportadores por medio de un
intercambio iónico a favor del gradiente de concentración. Otra clasificación se da en función
de la concentración de fármaco, destacando las proteínas resistentes a múltiples fármacos
(MRP, por sus siglas en inglés) y glicoproteínas-P (P-gp, por sus siglas en inglés), ambas son
responsables de la disminución o acumulación del principio activo en la membrana por
diferentes mecanismos que pueden ser por la expulsión o captación del mismo (Mihajlica,
Betsholtz y Hammarlund-Udenaes, 2018).
26
2.7.2.3 Proteínas Transportadoras
Son proteínas encargadas de trasladar moléculas entre las zonas citosólicas y basales de la
membrana, están presentes en mayor proporción en el intestino delgado y se acoplan a
estructuras específicas como es el caso de nutrientes (vitaminas, aminoácidos), azúcares y
ácidos biliares a los cuales se une una amplia gama de xenobióticos con los que forman
complejos al reconocer la molécula o moléculas que van a trasladar, provocando un cambio
conformacional que permita el trasiego a través de la membrana (Mir, 2018).
Algunos transportadores pueden utilizar el gradiente de concentración involucrándose en un
transporte conocido como uniporte (transporte primario). Por otro lado, si dos complejos viajan
en el mismo sentido se denomina simporte (Figura 17) y si existe el cruzamiento de los
transportadores en diferentes direcciones lleva el nombre de antiporte (Figura 18)
(Andrianifahanana, et al., 2016). De esta manera pueden condicionar la absorción o secreción
de sustratos (Yeagle, 2016, pág. 345).
Figura 17. Transporte simporte.
Fuente: Lobet, et al., (2018)
27
Figura 18. Tranporte antiporte
Fuente: Lobet, et al., (2018)
2.8 Estudios del proceso de absorción de fármacos
2.8.1 Modelo ex-vivo: Saco intestinal invertido
El uso de tejidos animales aislados se utiliza ampliamente para estudiar la permeabilidad y
absorción intestinal en especial de fármacos que se conoce por sus propiedades físico químicas
pueden tener inconvenientes en estos aspectos. El garantizar en estos modelos los parámetros
fisiológicos adecuados permiten la evaluación y cuantificación del paso de compuestos a través
de la zona intestinal de donde los resultados obtenidos permiten a la par establecer una
correlación con ensayos in vivo desglosando un análisis real de las concentraciones absorbidas
a raíz del comportamiento de los fármacos en órganos o tejidos específicos (Alqahtani,
Mohamed y Kaddoumi, 2013; Pierre, et al., 2017).
El modelo del saco intestinal invertido (Figura 19) desde inicio de su aplicación hasta la
fecha presenta una serie de modificaciones propuestas por algunos investigadores con el fin de
obtener una mejor viabilidad del tejido y mantener en condiciones óptimas el epitelio de la
mucosa intestinal y preservar de esta forma la vida de los enterocitos durante el ensayo (Luo,
et al., 2013; Oshima y Miwa, 2016). Por tanto al igual que otros modelos exterioriza una serie
de ventajas y desventajas que exigen el perfeccionamiento de la técnica para aprovechar mejor
28
el corto tiempo de vida útil que tienen las células implicadas en estos ensayos procurando
resultados confiables (Billat, et al., 2016).
Figura 19. Modelo del saco intestinal invertido.
Fuente: Luo, et al., (2013).
Estudios de relevancia reportan el uso del modelo de saco intestinal invertido especialmente
investigaciones relacionadas con la interacción de fármacos y mecanismos de transporte con el
objetivo de comprender el comportamiento del fármaco frente a las características fisiológicas
del intestino considerando implícitamente la interacción entre enzimas y glicoproteína P
presentes en el mismo (Wanga, et al., 2014).
En los excipientes utilizados como transporte en la formulación de fármacos también se ha
realizado investigaciones utilizando el modelo de saco intestinal invertido, los surfactantes o
tensoactivos interaccionan con los fármacos mejorando el transporte de Glicoproteína P y sus
características farmacocinéticas, esta aplicación es fundamental para la absorción de los
fármacos (Perrone, et al., 2013).
El modelo de saco intestinal invertido se compara en algunas ocasiones con el modelo de
saco intestinal no invertido para complementar estudios de permeabilidad de fármacos y para
comparar la capacidad de absorción observada en cada modelo; existen varios reportes que
29
concluyen que la permeabilidad de algunos fármacos cuyas moléculas fueron transportadas por
la glicoproteína P revelaron resultados en proporciones más elevados al emplear el modelo
invertido (Freag, Elnaggar, y Abdallah, 2013).
Las limitaciones del modelo van a depender inicialmente de la especie animal con la cual se
trabaje en el estudio, su edad, sexo, peso y variabilidad genética por mencionar algunos de los
factores que influyen en la fisiología y morfología del tejido base para el ensayo al igual que
en el proceso metabólico (Boudry, et al., 2010; Christiansen, et al., 2016; Villiger, Stillhart,
Parrott, y Kuentz, 2016; Liu, 2017).
Los aspectos externos por considerar durante la fase experimental son la temperatura, el pH
y las condiciones del medio (Moore, Whal, y Schneider, 2018). Es importante resaltar que el
pH es fundamental en el modelo debido a que está relacionado directamente con la absorción
y el transporte de fármacos en el intestino (Mazák y Noszál, 2014; Hunt, et al., 2015).
Durante el experimento uno de los factores que afecta significativamente el resultado es la
temperatura, ya que es primordial mantener los valores fisiológicos de temperatura por dos
aspectos primordiales garantizar la viabilidad de los enterocitos y sus funciones fisiológicas
normales sin afectar el transporte activo o pasivo del fármaco a lo largo de la superficie de
absorción (Rebmann, Grabski, Sanchez, y Britt, 2016; Mondal, et al., 2017)
30
CAPÍTULO III
MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Diseño de investigación
La presente investigación es de carácter experimental cuantitativo y comparativo debido a
que se cuantificó y comparó las concentraciones obtenidas de diferentes concentraciones en
cada una de las muestras a evaluar.
3.2 Obtención de datos
Se trata de un estudio experimental que se realizará en el Bioterio de la Facultad de Ciencias
Químicas, mediante la extrapolación de datos. Además se podrá evaluar la absorción intestinal
del GMZ en un modelo in vitro que comparte similitud con el ser humano.
3.3 Métodos
3.3.1 Preparación de los Cristales Líquidos
Los CL se prepararon a partir de la construcción de un diagrama de fases elaborado por
Baque y Reyes (2017), de donde se eligió un punto de la región de CL compuesto por Tween
80 (70%), ácido oleico (10%) y agua (20%). Estos componentes se mezclaron con agitación
constante y suave hasta obtener una fase transparente, después de esto se procedió a incorporar
el fármaco. Posterior a esto se procedió a almacenar los CL por un período de 24 horas para la
estabilización del sistema. La Tabla I muestra la composición de los CL con y sin
gemfibrozilo.
31
Tabla I. Composición de los Cristales Líquidos con y sin gemfibrozilo.
Muestra Agua TW80 AO GMZ70
CL 20% 70% 10% -
CL-GMZ70 20% 70% 10% 70mg
3.3.2 Microscopía de luz polarizada
El análisis de los CL se realizó con un fotomicroscopio (Microscopio Leica DMLP®)
acoplado a una cámara y polarizadores cruzados. Para el reconocimiento de los sistemas se
aplicó el software Leica IM 1000®. Los sistemas fueron caracterizados según la presencia de
cruces de malta y estrías para CL y campo oscuro para ME.
3.3.3 Evaluación ex – vivo de la absorción intestinal del gemfibrozilo por el método del
saco intestinal invertido
El estudio se realizó en 8 cobayos machos, procedentes de la Plataforma de Bioterio del
Instituto Nacional de Salud Pública e Investigación - Dr. Leopoldo Izquieta Pérez (INSPI) los
cuales presentaron pesos que oscilaban entre los 400 a 450 g. Posterior al traslado de los
animales hacia el Bioterio de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Guayaquil
se sometieron a un período de adaptación de 5 días bajo condiciones controlados de
temperatura (21±0°C), humedad relativa (40±0%) y ciclos de luz/oscuridad de 12 horas,
además de alimento y agua ad libitum. Antes de proceder a la experimentación, los cobayos se
mantuvieron en un periodo de ayuno de 8 horas.
Para el desarrollo experimental se pesaron los animales y a partir de estos datos se estableció
la dosis adecuada de anestésico y se administró por vía intraperitoneal la mezcla de
ketamina/diazepam en dosis de 100mg y 5 mg respectivamente. El efecto se verificó con la
ausencia de reflejos en las extremidades posteriores y luego se procedió a realizar una incisión
en la parte baja del abdomen para la remoción de aproximadamente 6cm de intestino grueso y
32
delgado. Cuidadosamente se invirtió la porción extraída del intestino por medio de un capilar
y después se prosiguió a cerrar uno de los extremos con hilo de sutura para posteriormente con
la ayuda de una piseta llenar el intestino con solución buffer TC 199 cerrarando el otro extremo
del intestino con hilo de sutura.
El intestino se llevó a un medio de incubación en un matraz Erlenmeyer (100mL) cerrado
con tapones plásticos permitiendo el flujo de entrada de O2 (5%) y salida de CO2 (95%), este
sistema fue preparado acoplando una manguera plástica a un motor de aire (Air Pump SC-
7500). La incubación continuó por un período de 90 minutos a una temperatura de 37°C
controlada con termómetro de alcohol, cuando transcurrió el tiempo establecido se procedió a
retirar los sacos del medio, se filtró el contenido interno almacenándolo de forma adecuada
para finalmente cuantificar las concentraciones absorbidas por espectrofotrometría ultravioleta
a 276 nm. Para cada medio de incubación se añadió gemfibrozilo, tween 80/gemfibrozilo, ácido
oleico/gemfibrozilo y las ME.
Durante todo el procedimiento experimental se siguieron protocolos estándares de bioética
en base a los principios éticos de reducción, reemplazo y refinamiento con el fin de garantizar
el bienestar de la especie empleada.
Los resultados fueron calculados según la ecuación de la recta:
y= 0,6896x-0,0106
La validación del método se realizó por Cantos y Muñoz (2018, datos no publicados).
3.3.4 Análisis estadístico
Para el tratamiento de los datos se empleó el programa IBM SPSS versión 22 (IBM SPSS®
software). Se expresó las concentraciones con los valores de las medias ± desviación estándar
33
(DE). Para comparar las medias de los datos se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de
clasificación simple seguido de la prueba de Turkey de comparaciones múltiples. Valores
probabilísticos *p<0,05 fueron considerados estadísticamente significativos.
34
CAPÍTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Preparación de los cristales líquidos
Los CL son sistemas caracterizados por su transparencia y estabilidad termodinámica y
pueden ser almacenados por largos períodos de tiempo sin que ocurra la separación de fases
(Vicentini, Casagrande, Verri, Georgetti, Bentley y Fonseca, 2008). La Figura 20 muestra el
CL durante el tiempo de almacenamiento.
Figura 20. Cristales Líquidos durante el tiempo de almacenamiento.
Fuente: Autores.
4.2 Microscopía de luz polarizada
La caracterización de los CL y ME se observa en función de la polarización y la orientación
ordenada de los mismos, en este contexto la representación gráfica en forma de cruces de malta
o estrías pueden ser un indicativo de la fase lamelar o hexagonal respectivamente mientras que
35
la presencia de un campo oscuro puede indicar cristales líquidos de fase cúbica o
microemulsiones (Chong, et al., 2004; Froelich, et al., 2017). La Figura 21 muestra los
resultados de la microscopia de luz polarizada de los CL sin GMZ.
Figura 21. Microscopía de luz polarizada de los sistemas sin gemfibrozilo.
Fuente: Autores.
En la Figura 21 es posible observar CL de fase lamelar y hexagonal, estas estructuras
también se describieron en otros trabajos de investigación como el de Vicentini et al., (2008)
quienes desarrollaron y caracterizaron CL que contienen quercetina, planteando que la
visualización de cruces de malta y estrías es característica de los CL de fases lamelar y
hexagonal según su observación en el análisis de microscopia de luz polarizada. Estos
resultados se respaldaron por Omray, (2013) que puntualiza la relación de la presencia de
estrías con los CL de fase hexagonal y las cruces de malta con los de fase lamelar. Lo antes
expuesto, respalda la definición de cristales líquidos sugerida en los resultados debido a la
36
presencia de cruces de malta (A y B) y estrías (C), lo que indica la formación de CL de fase
lamelar y hexagonal respectivamente.
Figura 22. Microscopía de luz polarizada de los sistemas con gemfibrozilo.
Fuente: Autores.
El campo oscuro que se formó por la adición de GMZ se observa en la Figura 22, lo cual
puede ser indicativo de CL de fase cúbica o ME, ya que ambos revelan esta característica en
los análisis de microscopía de luz polarizada. Los CL de fase cúbica tienden a formar sistemas
de elevada viscosidad, mientras que las ME forman sistemas de mayor fluidez. Un aspecto a
tener en cuenta en que los CL sin fármaco presentaron una viscosidad considerable (dato no
exhibido) y la incorporación del GMZ disminuyó la viscosidad del sistema, por esta razón se
sugiere que la lipofilicidad del fármaco promueve una transición de fases formado un sistema
u otro.
37
En su estudio, Vicentine, et al., (2008) reportaron no solo la obtención de CL de fase lamelar
y hexagonal sino que también observaron que al adicionar quercetina se formó un campo
oscuro sugiriendo la presencia de CL de fase cúbica. Sin embargo, otros autores manifiestan
que los sistemas formados fueron ME debido al campo oscuro (Froelich et al., 2017). En este
sentido, no es posible definir los sistemas formados únicamente con el uso de microscopía de
luz polarizada ya que para esto se requieren técnicas de caracterización más detallada como
por ejemplo la Dispersión de Rayos X a Bajos Ángulos (SAXS, por sus siglas en inglés).
4.3 Evaluación ex – vivo de la absorción intestinal del gemfibrozilo por el método del
saco intestinal invertido
Durante el procedimiento experimental se observó cómo los cristales líquidos favorecen a
la absorción del gemfibrozilo en el intestino delgado, según Cuevas y Alonso, 2016, este
fármaco trae consigo efectos secundarios que pueden ser perjudiciales en el ser humano como
problemas digestivos, erupciones cutáneas, elevación de enzimas hepáticas, mialgias y litiasis
biliar, por otro lado se han realizado estudios donde se han demostrado que los CL en unión
con fármacos presentan una mejor absorción cuando estos se incorporan a su estructura
favoreciendo la disminución de dichos efectos secundarios (Primorac y Đekić, 2017).
38
Figura 23. Efecto de los cristales líquidos y excipientes en la absorción del gemfibrozilo,
en el intestino delgado y colon. Las barras representan la media de las concentraciones
absorbidas durante 90 minutos con un p-valor<0,05 (*) estableciendo diferencias
estadísticamente significativas.
En la Figura 23 es posible observar un aumento significativo en la absorción del GMZ70
incorporado en los cristales líquidos (CL-GMZ70) tanto en las porciones correspondientes al
intestino delgado (ID) como en el colon. Adicional a esto, al comparar los excipientes, se
observa que el TW80 mejoró la absorción del GMZ70 en el ID en mayor proporción que el AO
aunque los dos viabilizan la permeabilidad del GMZ70 en relación con las concentraciones del
fármaco libre absorbido, resultado que puede ser debido a la solubilidad del GMZ70 en los dos
excipientes. Estudios realizados por Patel, et al., (2013) al evaluar la solubilidad del GMZ en
diferentes tensoactivos para la posterior preparación de ME, mostraron que fue posible disolver
aproximadamente 60% del fármaco en el TW80 lo que ratifica la solubilidad del GMZ en este
tensoactivo.
(ME) (ME)
39
Un comportamiento diferente al que se analizó en el ID se observa en el colon,
particularmente, el GMZ70 atraviesa mejor las membranas de esta región en su forma libre que
al estar disuelto en AO y se muestra además, que las concentraciones de GMZ70 libre y
mezclado con el TW80 son aproximadas por lo que, los excipientes, en este caso no presentan
diferencias estadísticamente significativas. Los resultados presentados indican que los cristales
líquidos favorecen la absorción intestinal del gemfibrozilo.
Tabla II. Promedio de las concentraciones expresado en mg/mL.
MUESTRAS ABSORBCIÓN INTESTINAL (mg/mL) + DE
INTESTINO DELGADO COLON
CL-GMZ70 (ME) 7,5889 ± 3,0637* 7,0403 ± 2,6186*
TWEEN 80 6,7237 ± 2,2080 5,4210 ± 1,4962
ÁCIDO OLEICO 4,0555 ± 1,3856 3,1980 ± 0,9847
GMZ 70 mg 3,1468 ± 1,0639 4,2880 ± 0,5520
Los datos se expresan como la media ± desviación estándar (DE) (n=8) con un p-valor <0.05
estableciendo diferencias significativas (*) en la absorción del ID y colon.
Se observa en la Tabla II el promedio de las concentraciones y la desviación estándar. En
el caso de los CL-GMZ70 la concentración absorbida es mayor en ID y colon mientras que
para el Tween 80 los valores obtenidos se muestran menores en relación a los CL-GMZ70;
comportamiento similar se observa en los datos de concentraciones observados para el ácido
oleico, aunque este valor en el colon es menor que el correspondiente al fármaco libre. No
obstante en el ID se muestra que las concentraciones de fármaco libre absorbidas son
considerablemente menores a las que se mostraron en los CL-GMZ70. Estos resultados se
encuentran en los Anexos 1, 2, 3 y 4.
40
CONCLUSIONES
Se evaluó la absorción intestinal del gemfibrozilo incorporado a cristales líquidos
obteniendo diferencias estadísticamente significativas en relación al fármaco libre tanto
en el intestino delgado como en el colon.
Los cristales líquidos presentaron propiedades transportadoras favorables demostrando
un aumento significativo en la absorción del gemfibrozilo para las dos porciones
intestinales estudiadas (intestino delgado y colon).
En el intestino delgado fue posible observar que los excipientes aumentaron la
absorción del gemfibrozilo. El Tween 80 incrementó la absorción del fármaco en
comparación con el ácido oleico, sin embargo la concentración absorbida por medio de
estos dos excipientes es mayor a la absorción del fármaco libre aunque no se
evidenciaron diferencias significativas.
Se observó una mayor absorción de gemfibrozilo en el colon al estar disuelto en Tween
80 y una menor absorción del fármaco en el ácido oleico.
41
RECOMENDACIONES
Teniendo en cuenta la importancia del experimento y los resultados que se han obtenido se
presenta indicaciones que se deben tener en cuenta para estudios posteriores, a continuación
presentamos algunas recomendaciones:
Efectuar estudios predictivos de cultivos celulares de carcinoma humano de colon
(CaCo-2) para evaluar el comportamiento de los sistemas coloidales en función de la
biodisponibilidad.
Realizar estudios del perfil farmacocinético in vivo del gemfibrozilo incorporado a
cristales líquidos con la finalidad de confirmar el cambio de concentración en
comparación con el uso tradicional del fármaco.
42
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GLOSARIO
Agente reductor: Un agente reductor se encarga de ceder electrones a un agente oxidante
pasando a un estado superior de oxidación.
Citocromo P450 3A4: Enzima importante que se encuentra en el intestino y es responsable
de la oxidación en regiones selectivas de los fármacos administrados en un 60%.
Fases inmiscibles: Las fases inmiscibles están formadas por dos líquidos que no se pueden
mezclar entre sí o se mezclan parcialmente, uno de los líquidos se la conoce como dispersa y
la otra como fase dispersa y la otra como fase continúa.
Glicoproteína P: Proteínas que se encargan del transporte de fármacos u otras moléculas
en el epitelio intestinal.
Hipolipemiantes: Son fármacos que se encargan de mejorar y modificar distintas porciones
lipídicas con diferentes mecanismos de acción para evitar problemas cardiovasculares.
Mesofases: Denominación que reciben los cristales líquidos por presentar características
intermedias a la de los sólidos cristalinos.
Micela: Las micelas se forman cuando los surfactantes son solubilizados en un disolvente
polar, la temperatura actúa sobre la parte hidrofílica del compuesto facilitando la formación de
las micelas que pueden presentar una forma geométrica esférica.
60
Moléculas anfipáticas: Moléculas que se encargan de minimizar la tensión interfásica de
biosurfactantes para poder obtener un aumento en la solubilidad del agua y disponibilidad de
material de origen orgánico que pueden ser producidos por microorganismos.
Sistemas Winsor: Los sistemas Winsor se pueden clasificar en cuatro grupos que se
encargan de describir sistemas multifásicos para las microemulsiones dependiendo de su
composición, temperatura y humedad.
61
ANEXOS
Anexo 1. Absorbancias y concentraciones obtenidas para la muestra de Microemulsión
Microemulsión
INTESTINO DELGADO COLON
INTERNO INTERNO
ABB Conc. mg/mL ABB Conc. mg/mL
0,1087 8,6499 0,0731 6,0687
0,0489 4,3140 0,1274 10,0058
0,0888 7,2070 0,059 5,0464
PROMEDIO 6,7237 7,0403
DS 2,2079 2,6185
Anexo 2. Absorbancias y concentraciones obtenidas para la muestra de Ácido Oleico
ACIDO OLEICO
INTESTINO DELGADO COLON
INTERNO INTERNO
ABB Conc. mg/mL ABB Conc. mg/mL
0,066 5,5539 0,018 2,0737
0,0417 3,7921 0,0392 3,6108
0,0283 2,8205 0,0433 3,9081
PROMEDIO 4,0555 3,1975
DS 1,3856 0,9846
62
Anexo 3. Absorbancias y Concentraciones obtenidas para la muestra de Gemfibrozilo a una
concentración de 70 mg/ml
Gemfibrozilo 70 mg
INTESTINO DELGADO COLON
INTERNO INTERNO
ABB Conc. mg/mL ABB Conc. mg/mL
0,029 2,8712 0,0506 4,4374
0,0204 2,2477 0,0549 4,7491
0,049 4,3213 0,0401 3,6760
PROMEDIO 3,1468 4,2875
DS 1,0639 0,5520
Anexo 4. Absorbancias y concentraciones obtenidas para la muestra de Tween 80
TWEEN 80
INTESTINO DELGADO COLON
INTERNO INTERNO
ABB Conc. mg/mL ABB Conc. mg/mL
0,1143 9,0560 0,0814 6,6705
0,1224 9,6433 0,0698 5,8295
0,0455 4,0676 0,0413 3,7631
PROMEDIO 7,5889 5,4210
DS 3,0637 1,4962