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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
MODALIDAD: INVESTIGACIÓN
TEMA:
PREVALENCIA DEL POLIMORFISMO RS9939609 DEL GEN FTO
CON LOS NIVELES DE MARCADORES DE INFLAMACIÓN EN
NIÑOS Y NIÑAS ESCOLARES CON SOBREPESO Y
OBESIDAD DE LA CIUDAD DE GUAYAQUIL,
2014 – 2015.
TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO
PREVIO PARA OPTAR POR EL GRADO DE QUÍMICO Y
FARMACÉUTICO
AUTOR:
KELVIN VICENTE BASURTO PINTO
TUTOR:
BLGO. GUSTAVO SAUL ESCOBAR VALDIVIESO, M.Sc.
GUAYAQUIL – ECUADOR
2015
IV
ÍNDICE GENERAL
Pág.
Resumen Ejecutivo VIII
Abstract IX
Introducción 1
Problema 3
Planteamiento del problema 3
Enunciado / Contextualización 3
Formulación del problema 4
Justificación 5
Objetivo general 6
Objetivos específicos 6
Hipótesis 7
Variables 7
Variables independientes 7
Variables dependientes 7
Variables, conceptualización e indicadores. 8
CAPITULO I 9
1. Marco teórico 9
1.1. Antecedentes 9
1.2. Estado del Arte 10
1.3. Fundamentos teóricos 11
1.3.1. Sobrepeso y Obesidad 11
1.3.2. Epidemiologia 11
1.3.3. Medición de la grasa corporal 12
1.3.4. Factores de riesgo 14
1.3.5. Enfermedades asociadas a la obesidad 19
1.3.6. Síndrome metabólico en la infancia 23
1.3.7. Inflamación y Obesidad 25
1.3.8. Marcadores de Inflamación 26
1.3.9. Diversidad del genoma 28
1.3.10. Polimorfismos 31
1.3.11. Análisis de genes 35
1.3.12. Detección del polimorfismo de secuencia de DNA 35
1.3.13. Genética y Obesidad 38
1.3.14. El gen FTO y la obesidad 41
1.3.15. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 43
1.4. Glosario 49
CAPITULO II 53
2. Metodología de la investigación 53
2.1. Métodos científicos empleados en la investigación 53
2.2. Metodología 54
2.3. Tipo de investigación 55
2.4. Diseño experimental de la investigación 55
2.5. Población y muestra 55
2.5.1. Criterios de Investigación 56
2.6. Materiales y equipos 57
2.6.1. Materiales 57
2.6.2. Reactivos 57
2.6.3. Equipos 58
2.7. Procedimiento 59
CAPITULO III 62
3. Recolección de datos, análisis e interpretación de resultados 62
3.1. Análisis de resultados 63
DISCUSIÓN 72
CONCLUSIONES 73
RECOMENDACIONES 74
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 75
ANEXOS 85
V
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Pág.
Gráfico I. Prevalencia de Sobrepeso y Obesidad en la población. 63
Gráfico II. Prevalencia de los Marcadores de Inflamación en la
población. 64
Gráfico III. Prevalencia de Marcadores de Inflamación en Obesidad y
Sobrepeso. 65
Gráfico IV. Prevalencia de los Marcadores de Inflamación según
el sexo. 67
Gráfico V. Prevalencia del polimorfismo rs9939609 del gen FTO en la
población. 68
Gráfico VI. Prevalencia del polimorfismo rs9939609 del gen FTO en
niños con Sobrepeso y Obesidad. 69
Gráfico VII. Prevalencia del polimorfismo rs9939609 del gen FTO
según el sexo. 70
VI
ÍNDICE DE TABLAS
Pág.
Tabla I. Prevalencia de Sobrepeso y Obesidad en la población. 63
Tabla II. Prevalencia de los Marcadores de Inflamación en la población. 64
Tabla III. Prevalencia de los Marcadores de Inflamación en Obesidad y
Sobrepeso. 65
Tabla IV. Prevalencia de los Marcadores de Inflamación según el sexo. 67
Tabla V. Prevalencia del polimorfismo rs9939609 del gen FTO en la
población. 68
Tabla VI. Prevalencia del polimorfismo rs9939609 del gen FTO en
niños con Sobrepeso y Obesidad. 69
Tabla VII. Prevalencia del polimorfismo rs9939609 del gen FTO
según el sexo. 70
Tabla VIII. Asociación del polimorfismo rs9939609 y marcadores de
inflamación. 71
VII
ÍNDICE DE CUADROS
Pág.
Cuadro I. Master Mix – Alelo Silvestre 60
Cuadro II. Master Mix – Alelo Mutado 60
RESUMEN EJECUTIVO VIII
Introducción: Varios polimorfismos del gen relacionados con la masa grasa y
la obesidad (FTO) han sido fuertemente asociados con la obesidad infantil y
marcadores de inflamación. Objetivo: Establecer la asociación entre el
polimorfismo rs9939609 del gen FTO y los niveles elevados de marcadores de
inflamación en niños y niñas escolares con obesidad y sobrepeso. Materiales y
métodos: Estudio descriptivo con un enfoque cuantitativo y de cohorte
transversal, la población de estudio fue de 175 niños y niñas de edad escolar
con una muestra de 49 pacientes con diagnóstico clínico de obesidad y
sobrepeso. En todos los pacientes se identificó la presencia del polimorfismo del
gen FTO utilizando la técnica de PCR convencional y se determinó la
concentración de los marcadores de inflamación mediante reacción colorimétrica
(proteína C reactiva, leptina, fibrinógeno e interleuquina-6). Resultados: En la
población estudiada, el 83.67% eran obesos y el 16.33% con sobrepeso. De los
41 pacientes con obesidad, 68.29% presentaron el genotipo TT (silvestre),
26.82% el genotipo AT (premutado) y 4.87% el genotipo AA (mutado). Los
niveles de leptina se encontraron elevados en los niños y niñas con sobrepeso
en un 100% así como un 85.37% en niños y niñas con obesidad. Conclusiones:
Los niveles elevados de leptina tuvieron una asociación con el sobrepeso y
obesidad. El polimorfismo rs9939609 del gen FTO estuvo presente en la
población estudiada y predominó en el sexo femenino. En el presente estudio no
se encontró una asociación significativa entre el polimorfismo y los marcadores
de inflamación.
Palabras claves: Sobrepeso, Obesidad, Polimorfismo rs9939609,
Marcadores de inflamación, Leptina.
ABSTRACT IX
Introduction: Several polymorphisms associated with fat mass and obesity
(FTO) have been strongly associated with childhood obesity and inflammatory
markers. Objective: To establish the association between the FTO rs9939609
polymorphism of the gene and elevated levels of inflammatory markers in school
children with obesity and that are overweight. Materials and Methods: A
descriptive study with a quantitative approach and transversal cohort, the study
population was 175 children of school age with a sample of 49 patients with
clinical diagnosis of obesity and overweight. All patients were identified to have
the presence FTO gene polymorphism using conventional PCR technique and
the concentration of inflammatory markers was determined by colorimetric
reaction (C-reactive protein, leptin, fibrinogen and interleukin-6). Results: In the
studied population, the 83.67% were obese and 16.33% overweight. Of the 41
patients with obesity, 68.29% had the genotype TT (wild), 26.82% AT genotype
(pre-mutated) and 4.87% AA genotype (mutated). Leptin levels were elevated in
overweight children by 100% and 85.37% in children with obesity. Conclusions:
Elevated levels of leptin had an association with being overweight and with
obesity. The FTO rs9939609 gene polymorphism was present in the study
population and had predominance in females. In the present study a significant
association between the polymorphism and inflammatory markers was not found.
Keywords: Overweight, Obesity, Rs9939609 polymorphism, inflammatory
markers, Leptin.
1
INTRODUCCIÓN
La obesidad es la acumulación excesiva de tejido adiposo, consecuencia del
desequilibrio energético (Tejero, 2008), siendo las primeras causas, los cambios
en los hábitos de vida, el consumo de alimentos energéticamente densos y
raciones alimenticias de mayor porción, junto con la disminución del ejercicio
físico; sin embargo, investigaciones reportan una relación entre el factor genético
y la enfermedad (Gil-Hernández, Aguilera-García & Gil-Campos, 2007).
La obesidad actualmente es un problema de salud pública debido al aumento
alarmante de su prevalencia, además conlleva importantes riesgos de
enfermedades en la edad adulta, aunque muchas de ellas no se observan en la
edad pediátrica (Gil-Hernández, 2010).
En el genoma humano existen secuencias que son altamente polimórficas
que están vinculadas con la expresión de genes. Diferentes estudios en genética
(Frayling et al., 2007; Dina et al., 2007; Fischer et al., 2009; Fang et al., 2010; De
Luis et al., 2012; Sitek et al, 2014) han puesto de manifiesto la presencia de
estos polimorfismos en la patología de la masa corporal y la obesidad que está
asociado con el gen de la masa grasa y la obesidad (FTO), se estima que
aproximadamente existen mil millones de personas portadoras homocigotas (AA)
para el alelo mutado a nivel mundial en las diferentes etnias. A pesar que este
gen ha sido estudiado, aún se desconoce la función biológica en el control del
balance energético (Cheung & Yeo, 2011).
Sin embargo se han venido presentado resultados contradictorios, debido a
que en algunos estudios se ha demostrado dicha asociación, pero en otros, no
se ha podido obtener los mismos resultados.
2
Por otro parte, la visión actual de tejido adiposo es la de un órgano secretor
activo, que envía señales que modulan el apetito, sensibilidad a la insulina, gasto
energético, inflamación y la inmunidad. Estas acciones son realizadas por
proteínas producidas principalmente por los adipocitos (De Luis et al., 2012).
Son muy pocos los estudios que han analizado la relación del polimorfismo
rs9939609 del gen FTO con los niveles de los marcadores de inflamación; y los
datos que se han obtenido son contradictorios al evaluar los niveles de ciertos
marcadores. Hasta la fecha no se ha analizado esta relación en niños / niñas con
sobrepeso y obesidad (De Luis et al., 2012).
Nuestro objetivo fue establecer la asociación entre el polimorfismo rs9939609
del gen FTO y los marcadores de inflamación en niños y niñas escolares con
Obesidad y Sobrepeso.
3
PROBLEMA
Planteamiento del problema
Enunciado / Contextualización
La Organización Mundial de la Salud (OMS) (2015), indica que en todo el
mundo se ha duplicado la cifra de personas obesas, habiendo en el 2013 más de
42 millones de niños menores de cinco años con sobrepeso y que si estas
tendencias siguen, el número aumentará a 70 millones para el 2025.
El gran problema de la obesidad en los infantes, es que les causa daños
psicológicos permanentes como inseguridad, baja autoestima, provocados por
un rechazo de la sociedad, además esta enfermedad se asocia a una amplia
gama de complicaciones de salud graves y a un creciente riesgo de contraer
enfermedades prematuramente, como: diabetes mellitus y cardiopatías (OMS,
2015); según el Instituto Nacional de Estadísticas y Censos en el 2013, son las
principales causas de mortalidad en Ecuador.
La obesidad es una entidad clínica que influyen muchos factores, entre ellos,
el factor genético, que a su vez podría estar influenciada por factores
ambientales, sociales, culturales y económicos, entre otros (García-García et al.,
2008).
La variante genética rs9939609 del gen FTO ha sido relacionada con un
mayor riesgo de obesidad y diabetes mellitus tipo 2 (De Luis et al., 2012), por
esta razón, hoy en día es posible demostrar la predisposición de una persona a
padecer obesidad mediante análisis genéticos. Debido a la falta de estudios
sobre este gen en nuestro país, esta propuesta se hace necesaria para
proporcionar información sobre una asociación genética entre el polimorfismo
rs9939609 del gen FTO con el sobrepeso y la obesidad, esto sería de mucha
ayuda para la posible prevención de la obesidad desde edades tempranas.
4
Formulación del problema
¿Existe una asociación entre el polimorfismo rs9939609 del gen FTO y los
niveles elevados de los marcadores de inflamación con el sobrepeso y la
obesidad en los niños y niñas que asisten a la unidad San José del Buen Pastor,
periodo 2014-2015?
5
Justificación
Según la Encuesta Nacional de Salud y Nutrición (ENSANUT) 2011 - 2013,
en Ecuador, la prevalencia de sobrepeso y obesidad en la edad preescolar es de
8.5% y se triplica al pasar a la edad escolar. La población mestiza, blanca u otra,
excluyendo la indígena, son las más afectada por sobrepeso / obesidad (30.7%).
Cuando la información se divide por quintil económico, la prevalencia del
sobrepeso / obesidad es mayor en los escolares del quintil más rico con un
41.4%, mientras que los escolares del quintil más pobre representan un 21.3%.
El sobrepeso y la obesidad son prevenibles, siendo el entorno, un factor
fundamental, pues condiciona las decisiones de los padres y los niños, y pueden
hacer que la opción más sencilla para prevenir la obesidad, sean los alimentos
más saludables y la actividad física regular (OMS, 2015).
Con el presente estudio se quería establecer la asociación entre la variante
genética con la obesidad y sobrepeso, esta información es muy importante para
la prevención de esta enfermedad en nuestro medio, ya que se está
multiplicando en cifras alarmantes según lo publicado por la OMS, debido a que
se podría lograr saber a edades tempranas, si un infante está predispuesto a
desarrollar obesidad, por poseer el alelo mutado relacionado con el gen FTO en
el genoma.
De esta manera, se lograría tomar medidas de precaución desde muy
temprana edad, para evitar que esta enfermedad se desarrolle en un futuro.
6
Objetivo general
Establecer la asociación entre el polimorfismo rs9939609 del gen FTO y los
marcadores de inflamación en niños y niñas escolares con Obesidad y
Sobrepeso de la ciudad de Guayaquil, periodo 2014 – 2015.
Objetivos específicos
1. Analizar la asociación de los niveles de marcadores de inflamación: PCR,
Fibrinógeno, IL-6 y Leptina con la obesidad y sobrepeso.
2. Determinar la presencia del polimorfismo rs9939609 del gen FTO.
3. Determinar la prevalencia de la variante genética rs9939609 del gen FTO
y los marcadores de inflamación.
7
Hipótesis
La presencia del polimorfismo rs9939609 del gen FTO y los altos niveles de
concentración de los marcadores de inflamación están asociados con el
sobrepeso y la obesidad en los niños y niñas que asisten a la unidad San José
del Buen Pastor, en el periodo 2014 – 2015.
Variables
Variables independientes
Marcadores de Inflamación
Polimorfismo rs9939609 del gen FTO
Variables dependientes
Obesidad
Sobrepeso
8
Variables, conceptualización e indicadores.
Variable Conceptualización Indicador / Unidades
Dependiente
Sobrepeso
Acumulación anormal o
excesiva de tejido adiposo
Índice de masa corporal (IMC).
IMC ≥ 25
Dependiente
Obesidad
Acumulación anormal o
excesiva de tejido
adiposo.
Índice de masa corporal (IMC).
IMC ≥ 30
Independiente
Marcadores de inflamación
Marcadores puntualizados
que se alteran en una
enfermedad: PCR,
Fibrinógeno, IL-6, y
Leptina.
PCR: ≥ 5,0 mg/L
Fibrinógeno: ≥ 471 mg/dl
IL-6: ≥ 7,0 pg/ml
Leptina:
Hombres: ≥ 5,6 ng/ml
Mujeres: ≥ 11,10 ng/ml
Independiente
Polimorfismo rs9939609
Variación de un solo
nucleótido en la
secuencia, cuya mutación
corresponde al reemplazo
de una timina (T) por una
adenina (A) en la posición
Chr16:53820527.
Presencia:
Banda
fluorescente
Homocigoto:
Banda solo en
el carril SS o
SM.
Heterocigoto:
Banda en
ambos
carriles.
9
CAPITULO I
1. MARCO TEÓRICO
1.1. Antecedentes
Frayling et al. (2007), realizaron una búsqueda en todo el genoma de los 2
tipos de genes susceptibles a la diabetes, e identificaron una variante común en
el gen FTO que predispone a la diabetes a través de un efecto sobre el índice de
masa corporal. Esta asociación fue observada desde la edad de 7 años hacia
adelante y reflejó un aumento específico de la masa grasa.
Dina et al. (2007), identificaron un conjunto de polimorfismos de nucleótido
simple en el primer intrón del gen FTO que está fuertemente asociado con la
aparición temprana de la obesidad severa en adultos y niños de ascendencia
europea.
Fischer et al. (2009) indican que la pérdida del gen FTO en ratones produce
una reducción significativa en el tejido adiposo y la masa corporal magra, como
consecuencia de un aumento del gasto de energía.
Un estudio realizado en China, comprobó la asociación de las variantes
genéticas del gen FTO con la obesidad, mediante la genotipificación de la
variante rs9939609 en 670 niños de 8 – 11 años que habitan en Beijing (Fang et
al., 2010).
Se han reportado diversos polimorfismos en el gen FTO, señalando que por lo
menos 20 de estos están asociados con algún aspecto de la obesidad, aunque
también con la susceptibilidad a la diabetes tipo 2 y con el síndrome metabólico
(Piña-Calva, Álvarez-González, Madrigal-Bujaidar, & Espinosa, 2011).
10
Estudios realizados por Mangge y colaboradores, (2011) determinaron que el
polimorfismo rs9939609 del gen FTO está asociado a la masa grasa y la
obesidad temprana en adultos y niños, donde el alelo mutado homocigoto AA fue
significativamente mayor en los adolescentes obesos. Liu, Mou, & Cai (2013), en
un meta-análisis determinaron una asociación significativa entre el polimorfismo
rs9939609 del gen FTO y el riesgo de sobrepeso y obesidad entre niños y
adolescentes.
Sin embargo, estas asociaciones han sido polémicas con respecto a los
sujetos asiáticos, donde valores de Índice de masa corporal no difirieron
significativamente entre los genotipos en la población China y Japonés. Por tal
motivo se realizó un estudio buscando la asociación de las variantes del gen
FTO en japoneses, concluyendo que la variante rs9939609 no estuvo
significativamente asociada con la obesidad en la población estudiada (Hotta et
al., 2008).
Ohashi et al. (2007), analizaron la frecuencia de la variante rs9939609 en seis
poblaciones de Oceanía y su asociación con el IMC, logrando comprobar que
dichas poblaciones no muestran ninguna asociación significativa entre el
polimorfismo y el IMC. Otro estudio en Shanghai y Beijing examinó la asociación
entre la variante rs9939609 y la obesidad, donde tampoco se encontró una
asociación significativa (Li et al., 2008).
1.2. Estado del Arte
De Luis et al. (2012), analizaron la relación entre el polimorfismo rs9939609
del gen FTO con el peso corporal, factores de riesgo cardiovascular y niveles de
adipocitoquinas en pacientes con obesidad mórbida, obteniendo como resultado
la asociación del polimorfismo con la masa grasa y niveles circulantes de leptina
y proteína C reactiva.
11
Polimorfismos de nucleótido único (SNP) que se agrupan en el primer intrón
del gen FTO se asocian a los rasgos de obesidad; esta asociación se ha
confirmado a través de los grupos de edad y poblaciones de diversas
ascendencias. El efecto de los polimorfismos en las poblaciones de ascendencia
africana y asiática es similar o algo menor que en las poblaciones de
ascendencia europea. Sin embargo, el alelo mutado en FTO que incrementa el
índice de masa corporal es menos frecuente en poblaciones con ascendencia no
europea (Loos, R. & Yeo, G., 2014).
Estos polimorfismos no influyen en los niveles de actividad física; a pesar que,
en los individuos físicamente activos, el efecto sobre la obesidad es atenuada en
aproximadamente un 30% (Loos et al., 2014).
1.3. Fundamentos teóricos
1.3.1. Sobrepeso y Obesidad
El sobrepeso y la obesidad se caracterizan por una acumulación anormal o
excesiva de tejido adiposo (OMS, 2015).
1.3.2. Epidemiologia
1.3.2.1. Prevalencia mundial de la obesidad
La obesidad puede ser considerada actualmente una epidemia universal.
Naciones Europeas como España, Finlandia, Grecia y Holanda; además Canadá
y muy especialmente Estados Unidos han sido testigos de un incremento en la
prevalencia de la obesidad durante las pasadas décadas (Sabán-Ruiz, 2009).
12
La Organización Mundial de la Salud (2015), indica que desde 1980, la
obesidad se ha incrementado de forma alarmante en todo el mundo. Las últimas
cifras indican que en el 2014, más de 1900 millones de adultos tenían
sobrepeso, de los cuales, más de 600 millones de estos eran obesos. La
mayoría de la población vive en países donde el sobrepeso y la obesidad se
cobran más vidas de personas que la insuficiencia ponderal.
1.3.2.2. Prevalencia en Ecuador
Según la Encuesta Nacional de Salud y Nutrición 2011 - 2013, en Ecuador, la
prevalencia de sobrepeso y obesidad en la población adulta (mayores de 19 a
menores de 60) es 62.8%, siendo mayor en las mujeres con un 65.5% que en los
hombres con un 60%, y el mayor índice se presenta en la cuarta y quinta década
de vida, con prevalencias superiores al 73%.
La prevalencia aumenta con el nivel económico; así los adultos del quintil más
rico tienen la mayor prevalencia de sobrepeso y obesidad frente a los del quintil
más pobre (66.4% vs 54.1%). Los resultados indican que 18 de 24 provincias
más Quito y Guayaquil tienen prevalencias de exceso de peso en adultos por
encima del 60%, es decir, en el 70% del territorio nacional aproximadamente 6
de cada 10 padecen de sobrepeso u obesidad (ENSANUT, 2013).
Además, cabe indicar que la prevalencia de sobrepeso y obesidad de la
población escolar (de 5 a 11 años) es de 29.9%. Esta cifra es preocupante,
sobre todo si se toma en cuenta que la prevalencia en la edad preescolar es de
8.5% y se triplica al pasar a la edad escolar (ENSANUT, 2013).
1.3.3. Medición de la grasa corporal
La composición corporal es medida con el propósito de determinar el
porcentaje de masa grasa corporal y el de masa grasa o masa libre de grasa.
(Sabán-Ruiz, 2009).
13
1.3.3.1. Técnicas directas
Densitometría
Se basa en que podemos deducir la composición de una mezcla de dos
componentes de diferentes densidades, si conocemos la densidad de cada
componente. Por tal motivo se puede deducir la composición de grasa del
cuerpo si conocemos la densidad de la grasa, de la masa libre de grasa y del
cuerpo (Sabán-Ruiz, 2009).
Medición del agua corporal
En el organismo, el agua puede ser determinada por el principio de dilución,
estimándose al conocer la cantidad de un soluto administrado inicialmente y la
concentración final en algunas de las muestras corporales tomadas después de
un tiempo determinado (Sabán-Ruiz, 2009).
Potasio corporal total
El potasio es un elemento limitado al compartimiento libre de grasa. El potasio
40 (K40) es un isotopo que emite una radiación gamma 1.46 MeV, con esta
característica se puede determinar la masa libre de grasa a partir del contenido
de potasio corporal total (Sabán-Ruiz, 2009).
Impedancia bioeléctrica
Se basa en el hecho de que una corriente de alta frecuencia y bajo voltaje se
conduce de forma diferente por la grasa, la cual actúa como un aislante. De las
técnicas directas, esta técnica es la más utilizada en la práctica clínica (Sabán-
Ruiz, 2009).
14
1.3.3.2. Técnicas indirectas
Antropometría
La antropometría es considerada como la ciencia que estudia las medidas del
cuerpo humano, es el método menos costoso y más ampliamente usado para la
medición de la composición corporal. Entre las medidas antropométricas
consideradas más útiles constan el peso, estatura, pliegues cutáneos,
circunferencias del tronco y de los miembros y el espesor sagital del tronco
(Sabán-Ruiz, 2009).
1.3.4. Factores de riesgo
Según Meléndez (2008), para abordar la etiología multifactorial de la
obesidad, algunos autores han propuesto aplicar el marco del modelo ecológico,
los elementos de este modelo se agrupan alrededor de la triada epidemiológica:
Huésped, Vector y Ambiente. De esta manera se puede identificar el papel que
juegan las influencias biológicas, de comportamiento y ambientales en la
manifestación de la obesidad.
1.3.4.1. Huésped
Factores genéticos
Para el autor la genética desempeña una función muy importante en la
determinación del metabolismo basal de una persona, además de utilizar
eficazmente la energía. Es así que, si a dos personas de talla idéntica y con igual
dieta caloría se les hace realizar el mismo ejercicio, ganaran o perderán peso
según su base genética. En diversos estudios se ha determinado que la dotación
genética representa hasta un 40-60% de la capacidad de una persona para
convertirse en obesa (Gil-Hernández, 2010).
15
Se han descrito más de 100 genes candidatos, que codifican proteínas que
pueden tener algún tipo de relación con la sensación de saciedad, la distribución
de la adiposidad y el peso corporal o la termogénesis. También se han estudiado
genes candidatos posicionales relacionados con el desarrollo de síndromes
mendelianos que asocian obesidad y otras manifestaciones (Gil-Hernández,
2010).
La predisposición genética aporta una mayor susceptibilidad individual a la
ganancia de peso, aunque siempre se requiere un entorno ambiental favorable
para que esta se produzca (Gil-Hernández, 2010).
Factores biológicos
Peso al nacimiento y rebote de adiposidad
La masa grasa es el componente más variable de la composición corporal, al
nacimiento constituye del 10 al 15% del peso corporal, y a los 6 meses de edad
se incrementa a 30% y va disminuyendo gradualmente durante la infancia
temprana. Entre los 5 y 8 años de edad ocurre un rebote de adiposidad y,
después en las mujeres de 9 a 20 años, la masa grasa vuelve a incrementarse
de 20 a 26%, mientras que en los hombres después de los 13 años la masa
magra incrementa y la masa grasa disminuye de 13 a 17% (Meléndez, 2008).
Según Meléndez (2008), los niños con peso alto al nacimiento parecen tener
un incremento en el riesgo de sobrepeso posterior, esto sugiere que el ambiente
intrauterino afecta el número de adipocitos y centro cerebrales que se encargan
de regular el apetito, a través de la exposición a hiperinsulinemia.
16
Se ha demostrado que la desnutrición dentro del útero o durante los primeros
años de vida se asocia con riesgo de sobrepeso, y en especial con la
distribución de grasa visceral en la adultez, debido a que la deficiencia de
energía en estas etapas programa al individuo hacia un metabolismo ahorrador
(Meléndez, 2008).
Lactancia materna
La alimentación al seno materno traduce patrones de vida sanos y se asocia
negativamente al riesgo de padecer obesidad en un claro patrón dosis-
respuesta. En un estudio que se llevó a cabo en Alemania, la prevalencia de
obesidad fue de 3.8% para los niños que recibieron dos meses de lactancia
materna, 2.3% para los que recibieron de tres a cinco meses, 1.7% para los de
seis a doce meses y 0.8% para los que recibieron más de doce meses
(Meléndez, 2008).
El efecto protector de la lactancia materna es dosis y tiempo dependiente, que
se atribuye a un menor contenido proteico de la leche humana, menos ingestión
calórica y, por lo tanto, menor incremento ponderal, en comparación con los
niños alimentados en forma indiscriminada con fórmulas lácteas comerciales,
que favorecen la sobrealimentación (Meléndez, 2008).
Factores conductuales
Para Meléndez (2008), los comportamientos y actitudes que tiene cada
individuo no pueden desligarse de la influencia familiar y de la sociedad en la
que vive. Los hábitos alimentarios del niño obeso se caracterizan por comidas
nocturnas; alimentos alta densidad energética; ayunos prolongados; con
frecuencia no desayunan; comen sin hambre, posiblemente por depresión,
angustia, fatiga o aburrimiento.
17
1.3.4.2. Vectores
Inactividad física
Los cambios en el medio ambiente han conducido a que se necesite realizar
menos actividad física, esto conlleva a un menor gasto calórico, lo cual favorece
la obesidad, además de promover estilos de vida sedentarios. Actualmente la
gente gasta seis veces más tiempo en ver televisión que en hacer ejercicio
(Meléndez, 2008).
Dieta
Los principales aspectos relacionados con la elección de los alimentos son:
sabor, percepción del valor del alimento, comodidad y valor nutritivo. La
importancia que las personas dan a cada uno varía según el nivel
socioeconómico; en el nivel más bajo suele dársele mayor peso a la percepción
del precio del alimento, en cambio aquellos con mayores posibilidades
económicas le dan más importancia al valor nutritivo (Meléndez, 2008).
A pesar de que las personas tengan algún conocimiento sobre nutrición
saludable, cuando se consideran todos los aspectos, la selección de alimentos
favorece a los que tienen mejor sabor y menor precio, aunque sean menos
nutritivos (Meléndez, 2008).
18
1.3.4.3. Ambiente
Factores socioculturales
Obesidad en los padres
El sobrepeso en los padres es uno de los factores de riesgo más importante
para el desarrollo de obesidad en los niños. El efecto que ejercen los padres en
la aparición de obesidad infantil es solo parcialmente debido a componentes
genéticos, como se comprueba mediante estudios con niños adoptados. El estilo
de vida, los hábitos de alimentación y de actividad física de la familia, así como
las preferencias de alimentos también influyen, ya que los padres funcionan
como un modelo a seguir (Meléndez, 2008).
Las madres obesas tienden a proporcionar porciones de alimentos mayores
de las que se necesita, provocando que los niños no sean capaces de regular la
ingestión de energía entre una comida y otra. Los niños con padres que
muestran pérdida del control de la ingesta dietaría (desinhibición) muestran
mayor adiposidad, dado que el acceso a los alimentos para ellos es, por lo
general, libre (Meléndez, 2008).
Factores físicos
Publicidad
Existe una baja oferta, un alto precio y escasa publicidad para alimentos
saludables. Este tipo de estrategia logra que los niños pidan que se les compre
un producto en particular. La publicidad de alimentos grasos se incluye en lo que
implica un ambiente obesogénico, ya que dificulta que los niños hagan
elecciones saludables en cuestión de alimentos (Meléndez, 2008).
19
Ambiente familiar y escolar
Para Meléndez (2008), la influencia del hogar es fundamental para establecer
hábitos alimenticios y de actividad física para los niños, dado que para combatir
la obesidad, una de las áreas modificables es el tipo de alimento disponible y la
actividad física.
En las etapas preescolar y escolar se forman los hábitos alimentarios que
predominarán durante toda la vida, los cuales pueden ser atribuidos a factores
familiares, como la selección de tipo y cantidad de alimento; heredados y
ambientales, como interacciones entre padres e hijos incluyendo información de
cuando iniciar y terminar de comer (Meléndez, 2008).
Factores económicos
Los precios y el ingreso familiar afectan la elección de alimentos, los hábitos
para su consumo y la calidad de la dieta (Meléndez, 2008).
1.3.5. Enfermedades asociadas a la obesidad
1.3.5.1. Ortopédicas
Es frecuente observarlas en el niño como pie plano, genu valgum, epidisiolisis
femoral y escoliosis son las más observadas, siendo menos frecuentes la
enfermedad de Blount y la espondilolistesis (Gil-Hernández, 2010).
20
1.3.5.2. Metabólicas
En edades prepuberales se observan normalmente alteraciones en la
tolerancia a la glucosa o en la resistencia a la insulina, y en la adolescencia,
diabetes mellitus tipo 2. El niño cuando es obeso presenta dislipidemias, el
desarrollo de síndrome metabólico y gota en adultos (Gil-Hernández, 2010).
1.3.5.3. Respiratorias
Son frecuentes la disnea de esfuerzo ante el ejercicio, el asma y el síndrome
de apnea obstructiva del sueño, que obliga en ocasiones a realizar una
adenoamigdalectomia (Gil-Hernández, 2010).
1.3.5.4. Psíquicas
Los niños obesos pueden presentar baja autoestima, ansiedad y depresión,
que favorecen el aislamiento social. Este estado psicológico predispone al
fracaso escolar, al sedentarismo y a trastornos de la conducta alimentaria,
agravando la obesidad (Gil-Hernández, 2010).
1.3.5.5. Cardiovasculares
El sobrepeso aumenta en 8,5 veces el riesgo de padecer hipertensión arterial
y enfermedad cardiovascular en la edad adulta, y los valores de presión arterial
de los niños con sobrepeso suelen ser superiores a los del grupo control (Gil-
Hernández, 2010).
21
1.3.5.6. Gastrointestinales
Se han descrito dolor abdominal, reflujo gastroesofágico, estreñimiento,
enfermedad hepática grasa no alcohólica, litiasis biliar (sobre todo en niñas, que
pierden rápidamente peso tras un régimen alimentario restrictivo) y desarrollo
tardío de cáncer intestinal (Gil-Hernández, 2010).
1.3.5.7. Endocrinas
Son frecuentes el pseudohipogenitalismo en los varones (pene inmerso en la
grasa peripubica), adipomastia, ginecomastia y pubertad adelantada. En mujeres
adolescentes se suele desarrollar un síndrome de ovario poliquistico y
disfunciones menstruales, como consecuencia del hiperandrogenismo. En la
edad adulta algunas pueden presentar infertilidad (Gil-Hernández, 2010).
1.3.5.8. Dermatológicas
La acantosis pigmentaria se relaciona con resistencia a la insulina hasta en
un 55% de niños obesos de raza negra y en un 8% de niños de raza blanca. Es
frecuente estrías violáceas, adipomastia, acné e hirsutismo, siendo considerados
factores de riesgo de resistencia a la insulina (Gil-Hernández, 2010).
1.3.5.9. Neurológicas
Pueden presentarse, entre otras morbilidades neurológicas, seudotumor
cerebral; hipertensión intracraneal benigna y trastornos del sueño (Gil-
Hernández, 2010).
22
1.3.5.10. Nefrológicas
Se pueden presentar enuresis nocturna, proteinuria y glomerulosclerosis focal
y segmentaria, que puede progresar a insuficiencia renal crónica o revertir con la
pérdida de peso (Gil-Hernández, 2010).
1.3.5.11. Neoplasias
Pueden afectar a diferentes órganos en adultos, y su mecanismo patogénico
es desconocido por el momento (Gil-Hernández, 2010).
1.3.5.12. Infecciones
Se producen alteraciones del sistema inmunitario, incrementándose el riesgo
de infecciones (Gil-Hernández, 2010).
1.3.5.13. Caries dental
Se relaciona significativamente con el IMC elevado en la infancia (Gil-
Hernández, 2010).
1.3.5.14. Envejecimiento prematuro.
Está relacionado con una menor esperanza de vida. El incremento moderado
del IMC y sobre todo del perímetro de la cintura, como medidor indirecto de la
adiposidad visceral, se asocian a un riesgo elevado de muerte por enfermedad
cardiovascular (Gil-Hernández, 2010).
23
Según Gil-Hernández (2010) la relación existente entre la obesidad y el
síndrome metabólico merece especial atención, debido a que favorece el
desarrollo de enfermedades cardiovasculares, postulándose que el nexo de
unión entre ambas alteraciones es la resistencia a la insulina y un estado
inflamatorio crónico de bajo grado, subyacente en la obesidad.
1.3.6. Síndrome metabólico en la infancia
1.3.6.1. Concepto y clasificación
El síndrome metabólico o síndrome X, es definido por la American Heart
Association como, un conjunto de factores de riesgo interrelacionados de origen
metabólico que parecen promover directamente el desarrollo de enfermedad
cardiovascular. Entre los factores destacan la obesidad, hipertensión arterial,
hiperglucemia, dislipidemia, estados protromboticos y proinflamatorios. Debido a
la obesidad central, estas alteraciones metabólicas comienzan en la infancia
pudiendo manifestarse en la adolescencia o en adultos jóvenes (Gil-Hernández,
2010).
Según Gil-Hernández (2010), el síndrome metabólico está integrado por un
grupo de factores predictivos del desarrollo de la enfermedad cardiovascular y
diabetes mellitus tipo 2 como son: elevación de los triglicéridos, bajos niveles de
HDL-C, aumento de la presión sanguínea, niveles de glucosa en ayunas
elevados, y obesidad abdominal.
El aumento del tejido adiposo abdominal se asocia con resistencia a insulina,
y tiene un efecto inflamatorio aterogenico, caracterizado por niveles altos de
proteína C reactiva (PCR) y otros marcadores inflamatorios. Los niveles altos de
estos marcadores se correlacionan con un aumento de la incidencia de la
diabetes mellitus tipo 2 y enfermedad cardiovascular (Gil-Hernández, 2010).
24
Se considera que la obesidad central es una condición importante para el
diagnóstico de síndrome metabólico, considerando como criterio diagnostico
principal el perímetro de la cintura y no el IMC. No obstante, el síndrome
metabólico también se observa en el 1% de niños no obesos (Gil-Hernández,
2010).
Existen otras alteraciones que merecen ser tomadas en cuenta en el
síndrome metabólico y son la resistencia a la insulina, marcadores inflamatorios
como la PCR, trombogénicos, fibrinoliticos y de disfunción plaquetaria, que
pueden incrementar el riesgo cardiovascular (Gil-Hernández, 2010).
El concepto de riesgo cardiometabolico respalda la idea de que el exceso de
grasa visceral provoca una desregulación en la liberación de adipocitoquinas,
conduciendo a un estado inflamatorio crónico de bajo grado, y este a un estado
de resistencia a la insulina. Por este motivo, se debe considerar un tratamiento
de los factores de riesgo cardiovascular en conjunto, en un acto único (Gil-
Hernández, 2010).
1.3.6.2. Etiología del síndrome metabólico
Según Gil-Hernández (2010), se creía que la causa subyacente de las
alteraciones metabólicas propias del síndrome metabólico y la obesidad era el
ambiente, luego la OMS cambio el concepto de causa subyacente hacia la
resistencia a la insulina; actualmente esta hipótesis está siendo desplazada por
la del proceso inflamatorio crónico subyacente a la obesidad, que sería el
responsable principal de favorecer el síndrome metabólico en pacientes obesos.
También proponen que la resistencia a la insulina e inflamación crónica, sean
considerados el nexo de unión entre la obesidad, el síndrome metabólico y la
enfermedad cardiovascular.
25
1.3.7. Inflamación y Obesidad
Se ha demostrado que existe una inflamación sistémica leve en la obesidad.
Los adipocitos producen citocinas inflamatorias como son el factor de necrosis
tumoral alfa (TNF−α), la interleucina 6 (IL−6), inhibidor del activador del
plasminógeno (PAI-1) y moduladores inflamatorios potentes como leptina y
adiponectina y la proteína C reactiva (PCR) (Blancas-Flores et al., 2010;
Domínguez-García, Huitrón-Bravo, & Mendoza-López, 2012).
Además se ha encontrado que el tejido adiposo está infiltrado por células del
sistema inmunitario, que también son fuente de citocinas inflamatorias
(Domínguez-García et al., 2012).
Existen evidencias que relacionan el tejido adiposo y la inflamación, como es
en el caso de que hay una asociación positiva entre la concentración de TNF−α
y la proteína C reactiva (PCR), con el aumento del tejido adiposo; al aumentar el
TNF−α se estimula la producción de IL-6, que estimula la producción de
proteínas de fase aguda en el hígado entre las que se encuentra la PCR y el
fibrinógeno (Domínguez-García et al., 2012; González-Bardanca, 2012).
La relación entre obesidad e inflamación se confirma con el hecho de que la
pérdida de peso tras dieta y ejercicio, va asociada a una reducción de los niveles
circulantes de IL-6, PCR, PAI-1, TNF-α entre otros, independientemente de la
edad, el sexo y el índice de masa corporal (Blancas-Flores et al., 2010;
González-Bardanca, 2012).
Es posible predecir la obesidad mediante de los niveles aumentados de los
marcadores de inflamación y además por las células estromales del tejido
adiposo, que también producen y secretan TNF−α e IL−6. Otra evidencia entre la
relación inflamación/obesidad es una respuesta a la hipoxia en áreas de
depósitos de grasa; ya que a medida en que la masa grasa se incrementa, la red
26
vascular es insuficiente para mantener la normoxia y se estimula la angiogénesis
(Domínguez-García et al., 2012).
1.3.8. Marcadores de Inflamación
1.3.8.1. Adipocinas
Las adipocinas son sustancias secretadas por el tejido adiposo, que
participan en la regulación del consumo de energía, en el metabolismo de los
lípidos y proteínas, el equilibrio glucosa/insulina, el estrés oxidativo, la
aterosclerosis, la inflamación y la integridad cardiovascular (Domínguez-García
et al., 2012).
El grupo de inflamación incluye: las citocinas clásicas (TNF−α, IL−6, IL−8), los
factores de crecimiento (TGF−β), las proteínas del sistema alterno del
complemento (adipsina, proteína estimulante de la acilación), las proteínas
involucradas en la homeostasis vascular (PAI−1, factor tisular), aquellas
involucradas en la regulación de la presión sanguínea (angiotensinógeno), el
metabolismo lipídico (proteína enlazante del retinol), la homeostasis de la
glucosa (adiponectina, leptina y resistina), así como en las respuestas de estrés
y de fase aguda (haptoglobina y metalotioneina) (Domínguez-García et al.,
2012).
1.3.8.2. Leptina
Es una hormona proteica de 163 aminoácidos y de 16 kDa de peso molecular
y es codificada en el gen Ob localizado en el brazo largo del cromosoma 6. Ésta
se produce tanto en los adipocitos como en el hipotálamo, el ovario y la placenta
y es un regulador a largo plazo del apetito y el metabolismo, por lo que tiene un
efecto antiobesidad a través de su acción bloqueadora del neuropéptido “Y” con
la consecuente disminución del apetito y pérdida de peso (Domínguez-García et
al., 2012).
27
Los niveles de leptina son regulados por tres mecanismos: la ingesta de
comida, el sistema endócrino y el sistema inmune innato. Aproximadamente el
50% de la leptina está unida a proteínas en personas delgadas, mientras que en
personas obesas la mayoría se encuentra en su forma libre. A mayor
concentración de leptina, mayor es el grosor de la capa de grasa subcutánea
(Domínguez-García et al., 2012).
El papel más importante de la leptina es inhibir el apetito, regulando el
balance de energía al mandar información al cerebro acerca de la acumulación y
agotamiento de los depósitos grasos (Domínguez-García et al., 2012).
1.3.8.3. Interleuquina 6 (IL−6)
La IL-6 es una citocina secretada por adipocitos y macrófagos, candidata para
la transportación de información desde los adipocitos al hipotálamo en la
regulación del balance energético. La grasa proporciona aproximadamente el
30% de la IL-6 circulante en humanos. La producción de IL-6 por el tejido
adiposo incrementa con una mayor adiposidad, por lo tanto las concentraciones
circulantes de IL-6 están altamente relacionadas con el porcentaje de grasa
corporal, ya que la grasa subcutánea produce más IL-6 que la grasa visceral
(Acosta-García, 2012; Domínguez-García et al., 2012).
La IL-6 tiene un papel principal en la estimulación de la producción de leptina,
rige la producción de la PCR, contribuye de gran manera al desorden sistémico
inflamatorio crónico, media el incremento del fibrinógeno plasmático, y contribuye
al riesgo en la formación de coágulos (Domínguez-García et al., 2012).
28
1.3.8.4. Proteína C reactiva (PCR)
La proteína C reactiva es una proteína de fase aguda, producida
principalmente por el hígado y participa de forma muy importante en la
inmunidad innata. El nivel de PCR se asocia al índice de masa corporal (IMC) y
con la presencia de diabetes (Acevedo et al., 2007; Domínguez-García et al.,
2012).
Asimismo, se ha observado la disminución de ésta cuando se presenta una
reducción de peso. Un estudio encontró que el gen encargado de codificar la
PCR está expresado en el tejido adiposo, mostrando una aparente correlación
inversa entre los niveles de mRNA de la PCR y de la adiponectina. Eso aumenta
la posibilidad de que el tejido adiposo contribuya directamente al aumento de los
niveles circulantes de la PCR (Domínguez-García et al., 2012).
Benozzi, S., Perruzza, F., Pennacchiotti, G. (2012), observaron que la
circunferencia de la cintura se asoció de forma significativa con el incremento de
PCR, y que dicha asociación en individuos con síndrome metabólico fue
independiente del efecto de otras variables como edad y sexo, dejando así
evidencia de que la obesidad central es el principal contribuyente para el
incremento de los niveles plasmáticos de PCR.
1.3.9. Diversidad del genoma
El DNA genómico nuclear es una entidad muy variable, no solo entre
especies diferentes, sino también entre individuos de una misma especie. Esta
diversidad es responsable de fenómenos biológicos como la evolución de las
especies y, dentro de cada especie, de la presencia de características
diferenciales en cada individuo, únicas e irrepetibles (Herráez, 2012).
29
La diversidad o variabilidad genética se debe a variaciones en la secuencia
del genoma; por tanto, en un sentido amplio el concepto de diversidad se hace
sinónimo de polimorfismo genético de secuencia o de DNA. El polimorfismo
afecta a regiones codificantes del genoma y a las no codificantes, en ambos
casos puede consistir en la variación de un solo par de bases del DNA o, menos
frecuente, de millones de pares de bases. El primer caso se conoce como
polimorfismo de un solo nucleótido o SNP. Cualquier variación puede tener lugar
en células germinales o reproductoras, con lo que se transmite a la
descendencia (polimorfismo hereditario), o bien en células somáticas, no
reproductoras, en cuyo caso no se trasmite (polimorfismo no hereditario)
(Herráez, 2012).
Un gen está representado como una sección de cromosoma, que equivale a
un segmento de DNA con una secuencia determinada. Un gen se presenta en
doble dosis, uno de origen paterno y otro materno, a estas copias se les llama
alelos. Estas diferentes formas alélicas de un mismo gen existen porque la
secuencia del DNA está sometida a cambios, en ocasiones a causa de
mutaciones que originan formas alternas de un gen, a veces con funciones
diferentes al alelo original o silvestre (Salazar-Montes, Sandoval-Rodríguez, &
Armendáriz-Borunda, 2013).
La posición física donde se ubica un gen en el genoma se denomina locus.
Cuando un individuo tiene diferentes formas alélicas en el locus se dice que es
heterocigoto, debido a que la secuencia de cada alelo puede generar variantes
de la misma proteína. En cambio, cuando un individuo presenta la misma forma
alélica en el locus seria identificado como homocigoto, por lo tanto el resultado
de la expresión génica será un mismo producto proteico, bien sea a partir del
alelo silvestre o del modificado (Salazar-Montes et al., 2013).
30
El grado de polimorfismo de una población es tanto mayor cuantos más
individuos contenga, viene determinado por el número de alelos distintos
existentes para un locus concreto y se refleja en el grado de heterocigotos, o
proporción de individuos heterocigotos en el total de la población (Herráez, 2012)
Figura 1. Grado de polimorfismo de la población.
(Herráez, 2012).
Lógicamente, la causa de la existencia de un polimorfismo es la mutación del
DNA. La distinción entre el uso de los términos mutación y polimorfismo no es
claro, pero en general, el primero se asocia con situaciones excepcionales, en
especial si son patológicas, mientras que se habla de polimorfismo cuando la
presencia de la variación genética es común en la población, por lo tanto estable
y nada o poco perjudicial. Como consecuencia el polimorfismo puede ser
heredado, mientras que la mutación puede o no serlo (Herráez, 2012).
en una población para
cada locus considerado
mayor proporción de
individuos heterocigóticos
mayor grado de
polimorfismo
mayor numero de
alelos
31
1.3.10. Polimorfismos
Son muchas las secuencias variables en los organismos, los análisis de
genética poblacional han permitido detectar dos o más alelos por cada una, y
cuantos más alelos diferentes hay es más polimórfico (Salazar-Montes et al.,
2013).
Salazar-Montes et al. (2013) consideran que hay un polimorfismo genético
cuando existen múltiples alelos de un gen en una población definida, es decir,
cuando la secuencia de bases nitrogenada de la molécula de DNA de un locus
en particular es variable entre los individuos de una población.
Según Herráez (2012) la definición de polimorfismo es la “existencia
simultánea en una población de genomas con distintos alelos para un locus
determinado” (p. 406). En genética, el concepto básico de polimorfismo indica
que cuando un alelo en un locus en la población presenta una frecuencia de más
de 1% se considera polimórfico. Este porcentaje indica que la presencia de estas
variantes es común y no se da por azar (Salazar-Montes et al., 2013).
1.3.10.1. Tipos de polimorfismos
Se pueden diferenciar dos tipos de polimorfismos: los que implican cambios
en un solo nucleótido y en los que intervienen deleciones o inserciones de pocos
o muchos pares de bases (Salazar-Montes et al., 2013).
De acuerdo con esta clasificación, los marcadores polimórficos más utilizados
para un estudio de perfil genético son:
Polimorfismo de un solo nucleótido o nucleótido único (single nucleotide
polymorphism, SNP).
32
Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (restriction
fragments length polymorphism, RFLP)
Numero variable de repeticiones continuas o en tándem (variable
numbers of tándem repeats, VNTR).
Repeticiones cortas y continuas (short tándem repeats, STR).
Polimorfismos del cromosoma Y
Marcadores mitocondriales
Insertion-delection (InDel).
Polimorfismo de un solo nucleótido o nucleótido único
Como su nombre lo indica, los SNP son variaciones en un solo nucleótido o
par de bases en una secuencia dada.
Figura 2. Polimorfismo SNP. Representado por el cambio de una base por otra
(Salazar-Montes et al., 2013).
Estos polimorfismos pueden estar representados por la deleción, inserción o
sustitución de una base nitrogenada en la secuencia normal. Este tipo de
33
polimorfismo es muy frecuente y se ha descrito que es posible encontrar un SNP
en el DNA humano cada 1000 a 3000 pb, en secuencias codificantes de
proteínas. Las ventajas de los SNP como biomarcadores, son su extensa
distribución a través de todo el genoma, su frecuencia y su estabilidad (Salazar-
Montes et al., 2013).
1.3.10.2. Diversidad genética dentro de una especie
Polimorfismo fisiológico o normal, de interés en estudios familiares, en
identificación de individuos, expresión de proteínas, etc (Herráez, 2012).
Polimorfismo patológico, de interés en el diagnostico presintomático y
prenatal de enfermedades genéticas, detección de individuos portadores,
determinación de compatibilidad para trasplantes, etc. Además puede
definir el riesgo para padecer enfermedades (Herráez, 2012).
1.3.10.3. Consecuencias funcionales del polimorfismo
El polimorfismo puede tener distinta transcendencia desde el punto de vista
funcional dependiendo si afecta a regiones no codificantes, reguladoras o
codificantes del genoma y también del modo como afecte al mensaje genético de
estas últimas (Herráez, 2012).
a) Polimorfismo en regiones codificantes
De la parte codificante del genoma humano se cree que unas tres cuartas
partes son monomorfos, genes únicos compartidos sin variación por todos los
individuos. La cuarta parte restante, son polimorfos, donde sus variaciones, en
muchos casos mínimas, determinan el polimorfismo génico. Se pueden distinguir
dos situaciones de acuerdo con el efecto sobre el fenotipo (Herráez, 2012).
34
Sin efecto fenotípico
Aun estando la variación localizada en una secuencia codificante, puede no
tener consecuencias sobre el fenotipo, por dos motivos: que no se altere la
secuencia proteica codificada o que la variación ocurra en una región de la
proteína que no sea esencial para su función (Herráez, 2012).
Con alteración del fenotipo
La variación en la secuencia del gen modifica la secuencia de la proteína de
tal manera que afecta su funcionalidad; aunque esta modificación puede ser
beneficiosa, como base de la evolución, lo más frecuente es encontrar un
polimorfismo perjudicial o patológico (Herráez, 2012).
b) Polimorfismo en regiones génicas no codificantes
Existen regiones del DNA que forman parte del gen, pero no codifican su
producto génico. Este es el caso de las regiones reguladoras (promotores), los
intrones y las regiones 5´UTR y 3´UTR, que aunque se conservan en el mRNA,
no se traducen. Aunque el polimorfismo no afectara a la secuencia de la
proteína, puede afectar a su expresión. Las variaciones en secuencias
promotoras probablemente perturben la expresión del gen, por lo tanto, el
polimorfismo en regiones génicas no codificantes puede manifestarse o no en un
efecto fenotípico (Herráez, 2012).
35
c) Polimorfismo en regiones no génicas
La mayoría de las mutaciones del genoma ocurren en regiones del DNA que
no codifican ningún producto, debido a su mayor abundancia en el genoma
humano y de otras eucariotas, por lo tanto, los cambios de bases en este DNA
no tienen ningún efecto fenotípico, no se altera la secuencia, la estructura o la
función proteica (Herráez, 2012).
1.3.11. Análisis de genes
Son muchos los aspectos que interesan en el estudio del DNA génico, como
desde obtener información sobre un gen o especialmente para su aplicación al
estudio de enfermedades con fines diagnósticos y terapéuticos. Entre los
aspectos estudiados es importante citar la localización de genes en los
cromosomas, la identificación de sus funciones, la búsqueda y detección de
genes anómalos responsables de enfermedades conocidas o nuevas, la
identificación de mutaciones responsables de anomalías, las pruebas genéticas
en el diagnóstico clínico de enfermedades monogénicas y multifactoriales, etc
(Herráez, 2012).
1.3.12. Detección del polimorfismo de secuencia de DNA
Para detectar las variaciones en la secuencia del genoma de distintos
individuos se acude a estrategias diversas, como la secuenciación del DNA, pero
por su laboriosidad se acude a otras técnicas, basadas en la hibridación de
Southern o en la PCR (Herráez, 2012).
36
1.3.12.1. Polimorfismo de un solo nucleótido
a) RFLP: detección de polimorfismo en la longitud de los fragmentos de
restricción
Se basa en la detección de las variaciones en la secuencia del DNA
(codificante o no codificante) que tienen como consecuencia un cambio en una
diana de restricción. Casi siempre la variación afecta a un solo nucleótido, por lo
tanto, los fragmentos que se obtienen son diferentes, dependiendo de qué alelo
esté presente (Herráez, 2012).
Cada muestra de DNA generará múltiples fragmentos, de diferentes
longitudes en función de los sitios de restricción que estén presentes. Debido a
que muchos de ellos no corresponden a la región que se pretende estudiar,
habitualmente se utiliza una sonda que hibrida en una posición cercana al sitio
polimórfico y se analizan los fragmentos por el método de Southern (Herráez,
2012).
Para poder utilizar el método con cantidades pequeñas de muestra, es normal
realizar antes una amplificación por PCR; para esto se debe disponer de un par
de cebadores específicos para secuencias que cerquen la región polimórfica. En
tal caso, puede ser innecesario el uso de la hibridación, pues la cantidad de DNA
es suficiente para detectarlo en el gel con un método de tinción, y se podrá
observar la diferencia en el patrón de fragmentación (Herráez, 2012).
b) Otras formas de detectar polimorfismo SNP
Se han desarrollado infinidad de técnicas para el genotipado de polimorfismos
SNP. Un método para detectar polimorfismos es la secuenciación del DNA
genómico, pero este es muy costoso para usarse como método de rutina, por
ello sólo se lo utiliza para la caracterización inicial del polimorfismo. Una vez
37
conocido el nucleótido variable y la secuencia en la que está inmerso, se acude
a otras técnicas para averiguar cuál es la variante presente en una muestra
(Herráez, 2012).
Otros métodos se basan en técnicas de hibridación o de PCR, donde se trata
de diseñar oligonucleótidos complementarios a cada uno de los alelos, los
cuales pueden emplearse como sondas de hibridación o como cebadores de
PCR (Herráez, 2012).
Hibridación específica de alelo
La detección directa de la hibridación requiere, el uso de condiciones de
elevado rigor, de modo que el oligonucleótido no se empareje con la muestra si
no hay complementariedad de bases perfecta en el punto polimórfico (Herráez,
2012).
Figura 3. Hibridación
(Herráez, 2012).
38
1.3.13. Genética y Obesidad
El aumento considerable de la prevalencia global de la obesidad es reflejo de
cambios de tipo socioeconómico, culturales o ambientales que estimulan la
sobrealimentación y reducen la actividad física (Gil-Hernández, 2010), sin
embargo, la obesidad no puede ser contemplada únicamente como un problema
endocrino o de comportamiento, ya que si sometemos a un grupo de individuos
al mismo régimen de ingesta de energía y ejercicio físico, aparecerán diferencias
individuales en cuanto a la ganancia o pérdida de masa corporal (Moreno,
Monereo, & Álvarez, 2006) esto plantea la posibilidad de que el grado en que un
individuo desarrolle o no la obesidad pudiera depender de su composición
genética (Gil-Hernández, 2010).
De una forma sencilla, se puede ver la obesidad como un desequilibrio entre
la energía ingerida y la energía gastada, siendo los factores genéticos que
afectan a estos dos componentes, pero también se encuentran modulados por
factores de comportamiento y una marcada influencia del ambiente. En general,
el genotipo determina unos límites dentro de los cuales se va a encontrar la
masa corporal de un individuo, siendo los factores no genéticos los que
determinan en qué punto exacto se localizaran los parámetros de masa y
composición corporal. La conjunción de estos factores hace que la obesidad
aparezca de forma variable en las distintas poblaciones y en cada persona
(Moreno et al, 2006).
Se estima que un 30% de los pacientes obesos tienen padres con peso
normal, pero el riesgo aumenta en un 40% si uno de los padres es obeso y en un
80% si ambos lo son, es decir que existe una genética heredada del 40%
aproximadamente (Martínez-Romero, 2006).
La adiposidad como un rasgo fenotípico está definida por la genética de los
individuos y aunque es ampliamente aceptado que los factores ambientales
juegan un papel muy relevante en su desarrollo, en los últimos años se ha
obtenido suficiente información para sustentar que la genética contribuye de
forma significativa al acúmulo normal y anormal de tejido adiposo. Esta influencia
39
aditiva en el desarrollo de la obesidad podría alcanzar un efecto de 50 % o aún
mayor en el caso de ciertos rasgos ligados al acúmulo excesivo de tejido adiposo
(Peralta-Romero, Gómez-Zamudio, Estrada-Velasco, Karam-Araujo, & Cruz-
López, 2014).
La genética de la obesidad se puede presentar en tres formas: la monogénica
(mendeliana), la sindromática y la común; de estas, las dos primeras ocurren con
una prevalencia < 0.01 %. La forma monogénica es aquella en la que el fenotipo
de obesidad se deriva de cambios mutagénicos en un solo gen, como el
reportado para el gen de leptina y su receptor, la carboxipeptidasa E, la proteína
orexigénica agouti, el receptor de melanocortina 4, la pro-hormona convertasa 1
y la pro-opiomelanocortina (Peralta-Romero et al., 2014).
En cuanto a los desórdenes sindromáticos, al menos 20 de ellos son
causados por anormalidades cromosómicas tanto autosómicas como ligadas al
cromosoma X, muchos de ellos asociados a retardo mental; como ejemplos se
tienen el síndrome de Prader-Willi, el síndrome de pseudo-hipoparatiroidismo
tipo 1 y el síndrome de Bardet-Biedl. La obesidad genética común agrupa todos
aquellos casos en los que existe un problema multifactorial, es decir, una
interacción entre el medio ambiente, genes susceptibles o candidatos y otros
factores (Peralta-Romero et al., 2014).
La influencia genética de la obesidad parece actuar a través de genes
susceptibles, aunque tales genes incrementan el riesgo de desarrollar una
determinada característica, estos no son esenciales para su expresión o,
suficientes por si mismos para explicar el desarrollo de una enfermedad. La idea
de los genes susceptibles está apoyada tras los resultados de estudios
realizados en gemelos, los cuales fueron expuestos a diferentes periodos de
balance energético, observando que las diferencias en la frecuencia de ganancia
de peso, la proporción del peso ganado y el lugar de deposición grasa mostro
una mayor similitud en una pareja de gemelos que entre diferentes parejas de
gemelos; esto sugiere que las diferencias en la susceptibilidad genética dentro
40
de una población determinan aquellos que son más probables a volverse obesos
en unas circunstancias medioambientales adecuadas (Sabán-Ruiz, 2009).
Si tenemos en cuenta que un gen candidato, es quien dirige la síntesis de una
cadena polipeptídica especifica asociada con una enfermedad particular, los
genes candidatos para la obesidad pueden ser elegidos por sus posibles efectos
sobre los factores relacionados con la obesidad (Sabán-Ruiz, 2009).
Cuanto mayor sea el número de genes anómalos o susceptibles que presente
el paciente, su patología será más grave y más precoz; por lo tanto, los
familiares en primer grado de un paciente obeso están situados más cerca del
umbral de susceptibilidad, constituyendo una población de riesgo, ya que
cualquier cambio medioambiental que en otros individuos no causaría efecto, en
ellos produce una alteración tal que ocasiona la patología (Moreno et al, 2006).
La mejor evidencia para la influencia genética en el desarrollo de la obesidad
viene de los estudios realizados en los países nórdicos, donde gemelos suizos
fueron criados con familias que los adoptaron en Dinamarca; el IMC de los niños
adoptados estaba más íntimamente relacionado con el de sus padres biológicos
que con el de sus padres adoptivos (Sabán-Ruiz, 2009).
Hasta cierto punto, las conclusiones basadas en los estudios genéticos y
epidemiológicos están limitadas a las regiones donde se llevaron a cabo, y por lo
tanto es posible que el relativo papel de los factores ambientales se exagere en
poblaciones donde la obesidad es especialmente prevalente (Sabán-Ruiz, 2009).
Entre los genes implicados se encuentran los que codifican péptidos con
función de señal de hambre y saciedad, aquellos implicados en el crecimiento y
la diferenciación de los adipocitos, genes metabólicos y genes implicados en el
control del gasto energético (Gil-Hernández, 2010).
41
Uno de los genes asociados con diferentes rasgos de la obesidad es el gen
asociado a la masa grasa (FTO). Este gen primero fue asociado en el desarrollo
de diabetes mellitus 2 (Peralta-Romero, 2014). Su asociación con el desarrollo
de obesidad se ha confirmado en diversos estudios con gran número de
individuos de poblaciones diferentes. Además de su asociación con el IMC y el
riesgo de obesidad y sobrepeso, se han descrito asociaciones con otros rasgos
relacionados, como el peso corporal, los niveles de leptina, la masa grasa y el
perímetro de cintura (Gil-Hernández, 2010).
Muchos estudios en diferentes poblaciones han replicado estos hallazgos
asociados al fenotipo de obesidad. Mediante meta-análisis se ha corroborado
que el gen FTO tiene el mayor impacto identificado sobre el índice de masa
corporal (IMC), aunque con poca cuantía entre las poblaciones. Esto significa
que la presencia de un alelo contribuye a aumentar el peso corporal entre 0.8 y
2.1 kg. Otros genes o regiones identificadas con efectos significativos, pero
menores que el gen FTO sobre el IMC incluyen a la región cercana al gen
MC4R, el gen TMEM18, el KCNMA1 y el loci del gen BDNF (Peralta-Romero et
al., 2014).
1.3.14. El gen FTO y la obesidad
Un estudio de asociación del genoma completo (GWA) en pacientes con DT2
del Reino Unido identificó a principios del 2007 al gen FTO como un
determinante principal de adiposidad y mostró diferencias del IMC entre casos y
controles. Froguel et al., al utilizar un enfoque diferente para el escaneo de todo
el genoma, publicaron que los SNP en el primer intrón de este gen contribuyen
fuertemente en el desarrollo de la obesidad severa. Este descubrimiento fue
confirmado por dos estudios de GWA para rasgos relacionados con la obesidad
en población cerdeña y alemana (Peralta-Romero et al., 2014).
El gen FTO se localiza en el cromosoma 16 (16q12.2) y se ha determinado
que codifica la producción de una proteína nuclear con actividad de demetilasa
de ácidos nucleicos. Su acción se ha relacionado con diversos procesos
bioquímicos y fisiológicos, entre los que destacan la reparación de DNA, la
42
homeostasis de la temperatura y la regulación del almacenamiento de lípidos y
del tejido adiposo, también se ha determinado que la proteína se localiza
principalmente en el hipotálamo y en el páncreas (Piña-Calva et al., 2011).
Este gen presenta varios polimorfismos de tipo SNP (syngle nucleotide
polimorphism) en su primer intrón, en este tipo de polimorfismos se cambia un
solo nucleótido de su secuencia cuya mutación corresponde al reemplazo de
una timina por una adenina en la posición Chr16:53820527 (Loos & Bouchard,
2008).
El polimorfismo del gen FTO relacionado con la obesidad aún no ha sido
denominado pero se conoce que el alelo de riesgo es un grupo de 10
nucleótidos en el primer intrón (rs9939609). Una copia de este alelo variante (A)
la presentan el 45% de los caucasianos o euripidos y el 14% de orientales. Los
adultos portadores de uno de estos alelos (heterocigotos AT) tienen un promedio
de 1.2 kg más que los sujetos no portadores (TT) (37% de la población). Dos
copias del alelo (homocigotos AA) están presentes en el 16% de los europeos
estudiados. Los adultos con estas dos copias tienen un promedio de 3 kg más
que los sujetos sin el alelo, en estos últimos sujetos la ganancia de peso
empieza en la infancia (a los 7 años), habiéndose llevado a cabo estudios en RN
que muestran un peso normal (Sabán-Ruiz, 2009).
En términos de riesgo, se consideran que los sujetos con una copia del alelo
tienen un incremento del riesgo de tener sobrepeso (≥25 kg/m2) del 38%, cifra
que es del 67% para los sujetos con dos copias del alelo. Se desconoce el
mecanismo de la ganancia de peso pero se sabe que el gen está ampliamente
distribuido en el hipotálamo y que la ganancia de peso se debe al incremento de
masa grasa. De forma sorprendente hay un gen próximo al FTO, el KIAA1005,
que se transcribe de forma inversa al FTO y del que tampoco conocemos su
función pero que tienen que estar necesariamente relacionados. Es ultimo gen
no parece estar afectado estructuralmente en el polimorfismo del FTO
relacionado con la obesidad pero se desconoce si puede estarlo funcionalmente
(Sabán-Ruiz, 2009).
43
1.3.15. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método para la
amplificación de un segmento específico de DNA (Stephenson, 2012). Esta
técnica se basa en una replicación exponencial in vitro de una molécula de DNA
genómico o DNA complementario, mediante ciclos repetitivos, que constan de
tres temperaturas. En cada ciclo las moléculas se duplican hasta que los
reactivos se agotan (Salazar-Montes et al., 2013).
Una PCR típica contiene DNA o ARN molde, una polimerasa de DNA con
estabilidad térmica, los 4 deoxinucleósidos trifosfato (dNTP), magnesio,
cebadores o primers y un tampón (Stephenson, 2012).
1.3.13.1. Principio del método
La PCR es una metodología resultante de la aplicación práctica de tres
conceptos:
1) Desnaturalización, donde el ácido nucleico molde pasa a ser de una sola
cadena mediante la exposición a una temperatura elevada (Stephenson,
2012).
2) Hibridación, la temperatura de la reacción baja y los dos primers se unen a
las cadenas opuestas del molde desnaturalizado, de manera que sus
extremos 3´ quedan dirigidos uno hacia el otro (Stephenson, 2012).
3) Extensión, una polimerasa con estabilidad térmica añade dNTPs a los
extremos 3´ de los cebadores hibridados, de manera que se produce la
replicación de la cadena de DNA (Stephenson, 2012).
44
1.3.13.2. Esquema de la PCR
1) Inicio de la desnaturalización.
2) Ciclos de amplificación.
Temperatura de desnaturalización.
Temperatura de alineamiento.
Temperatura de extensión.
3) Amplificación final.
4) Almacenamiento temporal.
Estos pasos se llevan a cabo en un equipo que produce cambios automáticos
de temperaturas, denominado Termociclador (Salazar-Montes et al., 2013).
1) Inicio de la desnaturalización
Es necesaria una temperatura de 95 °C para la desnaturalización de la doble
cadena de DNA, en el caso del DNA genómico, o en el DNAc, el rompimiento de
estructuras secundarias. Esta temperatura se mantiene de 5 a 10 minutos al
inicio de la PCR (Salazar-Montes et al., 2013).
2) Ciclos de amplificación
Estos ciclos de temperatura se repiten continuamente por 25 a 35 ocasiones y
cada temperatura cumple con una función específica (Salazar-Montes et al.,
2013).
45
Desnaturalización
Se realiza a 95 °C y tiene como objetivo desnaturalizar la doble cadena de
DNA y/o destruir las estructuras secundarias del DNA, lo que permite el acceso
de los primers a la cadena molde en sus secuencias complementarias (Salazar-
Montes et al., 2013).
Alineación
La temperatura se encuentra entre 55 y 60 °C, en donde la mayoría de los
primers hibridan; formando los puentes de hidrógeno con la cadena molde, así,
dejando el extremo 3’ OH disponible y listo para la adición de los nucleótidos
(Salazar-Montes et al., 2013).
Extensión
Se produce a la temperatura óptima para el funcionamiento de la DNA
polimerasa empleada. En el caso de la Taq polimerasa, la más utilizada es de
72°C (Salazar-Montes et al., 2013).
3) Amplificación final
Una vez terminados los ciclos designados para la PCR, la temperatura de
extensión se mantiene por unos minutos, lo que permite que la polimerasa
termine la extensión de los productos a los cuales se encuentra unida (Salazar-
Montes et al., 2013).
46
4) Almacenamiento temporal
Se mantiene a 4 °C por tiempo indefinido, esto permite conservar los
productos de PCR hasta que se retiren los tubos de reacción del equipo
(Salazar-Montes et al., 2013).
Figura 3. Esquema convencional de un PCR.
(Salazar-Montes et al., 2013).
1.3.13.3. Molde y Amplificación
Uno de los motivos por los cuales se utiliza la técnica de PCR de forma tan
amplia es el hecho de que se requiere sólo un poco de molde de DNA inicial
para la amplificación (Stephenson, 2012).
47
1.3.13.4. Amplificación exponencial
Durante la PCR, el producto de un ciclo sirve como molde para el siguiente
ciclo, esta característica le proporciona la capacidad de amplificar una única
molécula en millones de copias (Stephenson, 2012).
La PCR es un proceso que tiene lugar de forma exponencial, debido a que la
amplificación del molde progresa a razón de 2n, donde n es igual al número de
ciclos. Los productos de PCR se denominan amplicones y el segmento
amplificado de DNA se llama diana (Stephenson, 2012).
1.3.13.5. Eficiencia
La fórmula 2n utilizada para calcular la amplificación por PCR puede usarse
para describir cualquier sistema de sucesos de duplicación. Esta relación
describe a la PCR si la reacción es eficiente al 100%. Ninguna reacción
desarrollada en un tubo de análisis tendrá una eficiencia al 100%. Para
representar la realidad, la relación debe ser modificada, teniendo en cuenta la
eficiencia real de la reacción (Stephenson, 2012):
Y = (1 + E)n
donde Y: grado de amplificación, n: número de ciclos y E: eficiencia media de
amplificación en cada ciclo.
La pérdida de eficiencia puede ocurrir por diferentes motivos, incluyendo la
perdida de actividad de la enzima DNA polimerasa, la depleción de reactivos y la
desnaturalización incompleta del molde (Stephenson, 2012).
48
1.3.13.6. Sensibilidad
La PCR es una técnica que puede obtener una sensibilidad y una
especificidad de 100%, sin embargo, en la práctica es difícil obtener estos
resultados, ya que múltiples factores influyen de manera transcendental en el
desarrollo de una PCR, como la selección de un sistema adecuado de detección
del producto amplificado, el correcto diseño de los primers, la calidad de la
muestra, el control de los inhibidores de la reacción, la contaminación ambiental,
la contaminación con otros productos de PCR, las condiciones de reacción, la
concentración de reactivos, el termociclador empleado, etc. La calidad de la PCR
estará influenciada por el control y el manejo correcto de cada uno de estos
factores (Salazar-Montes et al., 2013).
49
1.4. Glosario
Adenoamigdalectomia: Intervención que se realiza para extirpar las amígdalas
y las vegetaciones adenoideas.
Adipocito: Células que forman el tejido adiposo.
Alelo: Cada una de las formas alternativas que puede tener un mismo gen que
se diferencian en su secuencia y que se puede manifestar en modificaciones
concretas de la función de ese gen.
Aminoácidos: Compuestos orgánicos que se combinan para formar proteínas.
Antropometría: Sub-rama de la antropología biológica o física que estudia las
medidas del cuerpo del hombre.
Cromosoma: Cada una de las estructuras altamente organizadas, formadas por
DNA y proteínas, que contiene la mayor parte de la información genética de un
individuo.
Dislipidemia: Alteración de las concentraciones de lípidos y lipoproteínas en la
sangre.
Epidemiologia: Disciplina que estudia la distribución, la frecuencia, los factores
determinantes, las predicciones y el control de los factores relacionados con la
salud y con las distintas enfermedades existentes en poblaciones humanas
definidas.
50
Etnia: Conjunto de personas que comparten rasgos culturales, idioma, religión,
celebración de ciertas festividades, vestimenta, nexos históricos, tipo de
alimentación, y, muchas veces, un territorio.
Fibrinógeno: Proteína soluble del plasma sanguíneo precursor de la fibrina, es
responsable de la formación de los coágulos de sangre.
Gen: Unidad de información en un locus de Ácido desoxirribonucleico (DNA) que
codifica un producto funcional, o Ácido ribonucleico (ARN) o proteínas y es la
unidad de herencia molecular.
Genoma: Conjunto de genes contenidos en los cromosomas.
Genotipificación: Proceso de determinación del genotipo o contenido
genómico, en forma de DNA, específico de un organismo biológico, mediante un
procedimiento de laboratorio.
Homocigoto: Un organismo es homocigótico respecto a un gen cuando los dos
alelos codifican la misma información para un carácter.
Interleucina 6: Es una citocina con actividad antiinflamatoria y pro inflamatoria.
Intrón: Fragmento de DNA que está presente en un gen pero que no codifica
ningún fragmento de la proteína.
Lactancia: Primer período de la vida de los mamíferos, en el cual se alimentan
solo de leche.
Leptina: Hormona producida en su mayoría por los adipocitos aunque también
se expresa en el hipotálamo, el ovario y la placenta.
51
Litiasis biliar: Formación de cálculos en las vías biliares, sobre todo en la
vesícula biliar.
Nucleótido: Molécula orgánica formadas por la unión covalente de un
monosacárido de cinco carbonos (pentosa), una base nitrogenada y un grupo
fosfato.
Países nórdicos: Región geográfica y cultural que comprende cinco Estados de
Europa septentrional: Dinamarca, Finlandia, Islandia, Noruega y Suecia.
Polimorfismo genético o variante genética: Variación en la secuencia de un
lugar determinado del DNA entre los individuos de una población.
Predisposición genética: Carga genética que influye en el fenotipo de un
organismo individual, o de una especie o población.
Prevalencia: Proporción de individuos de un grupo o una población que
presentan una característica o evento determinado en un momento o en un
período determinado.
Proteína C reactiva: Proteína plasmática circulante, que aumenta sus niveles en
respuesta a la inflamación.
Proteinuria: Presencia de proteína en la orina en cantidad superior a 150 mg en
la orina de 24 horas.
Secuencia: Sucesión de letras representando la estructura primaria de una
molécula real o hipotética de DNA o banda, con la capacidad de transportar
información.
52
Pseudohipogenitalismo: Cuando la grasa supra púbica oculta la base del pene,
disminuyendo su tamaño real.
Termogénesis: Capacidad de generar calor en el organismo debido a las
reacciones metabólicas.
53
CAPITULO II
2. METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN
2.1. Métodos científicos empleados en la investigación
El presente estudio es de nivel descriptivo con un enfoque cuantitativo y de
cohorte transversal, donde se determinó la presencia del polimorfismo
rs9939609 del gen FTO y marcadores de inflamación en niños y niñas escolares
con Sobrepeso y Obesidad.
54
2.2. Metodología
55
2.3. Tipo de investigación
El presente estudio de investigación se basó en un diseño no experimental de
cohorte transversal, debido a que no se manipularon las variables.
2.4. Diseño experimental de la investigación
No experimental
2.5. Población y muestra
El universo estuvo constituido de niños y niñas de edad escolar (5-11 años)
que acudían a consulta externa de nutrición del Hospital de niños “León Becerra”
de la Escuela San José del Buen Pastor de la ciudad de Guayaquil.
La población de estudio fue de 175 niños y niñas de edad escolar (5 a 11
años) con una muestra de 49 niños y niñas que tuvieron diagnóstico clínico de
Sobrepeso y Obesidad (aumento del componente graso) por bioimpedancia
eléctrica.
56
2.5.1. Criterios de Investigación
2.5.1.1. Criterio de Inclusión
Se definieron las siguientes características en los niños y niñas que asistieron a
la unidad educativa “San José del Buen Pastor” en la Ciudad de Guayaquil,
periodo 2014-2015.
1. Niños y niñas de 5 y 11 años de edad.
2. Tener un índice de masa corporal ≥ 25.
3. No haber sido parte de un programa o tratamiento de control nutricional
en el último año.
2.5.1.2. Criterio de Exclusión
1. Niños que presenten enfermedades como: Síndrome de Down, Diabetes
Mellitus tipo I o tipo II.
2. Niños con grado de desnutrición.
57
2.6. Materiales y equipos
2.6.1. Materiales
Tubos Eppendorf de 1.5 ml y 0.6 ml.
Tubos de plástico de 15 ml
Puntas de plástico para pipetas automáticas
PureLink Genomic DNA Mini Kit - Invitrogen
Matraz de 50 ml
Probetas de 1000 y 500 ml
Soporte para gel
2.6.2. Reactivos
Agarosa Ultra Pura
Buffer TAE (Tris Ácido Acético) 1 X
Agua libre de nucleasa
GoTaq 2x – PCR Master Mix
SYBR Safe
BlueJuice 2 X
Etanol 100%
100 bp DNA Ladder (Marcador de peso molecular)
58
2.6.3. Equipos
Equipos utilizados para los procesos de extracción del material genético y
amplificación.
EQUIPO CASA
COMERCIAL MODELO FUNCION
Termociclador en tiempo real
BIO-RAD T100 Amplificación del material
genético
Baño María seco Labnet
Extracción de DNA/ARN
Centrifuga 12 pocillos EPPENDORF 5410 Separar elementos según
su sedimentación
Congelador -45ºC NUAIRE UN
LÍNEA 65016
Conservación del material biológico y reactivos
Cámara de electroforesis
(agarosa)
Life Techonologies
10245
Separar fragmentos de DNA de productos
amplificados mediante la PCR
Micropipetas EPPENDORF 10, 200 y 1000 µl
Empleado para absorber y transferir pequeños
volúmenes de líquidos
Fuente de poder V.W.R
SCIENTIFIC UER 105 Regulador de voltaje
Campana química LABCONCO 64132 Extractor de vapores
químicos
Sistema de purificación de agua
MILLIPORE Direct-Q Purificador de agua tipo 2-
3
Vortex BARNSTEAD/
THERMOLYNE M 37615
Homogeneizador de soluciones
Cámara de Flujo laminar con LUZ UV
NUAIRE 76648 Preparación de master mix
para PCR Área estéril
Foto-Documentador BIO-RAD
Visualización del amplicon en el gel
59
2.7. Procedimiento
Para la presente investigación se procedió a encuestar a los padres de familia
de los niños y niñas que asistieron a la Unidad Educativa “San José del Buen
Pastor” en la Ciudad de Guayaquil, durante el periodo lectivo 2014-2015, luego
se procedió a la firma del consentimiento informado (Anexo 1), previo a la
valoración nutricional y toma de muestra.
Se pesaron los niños y niñas que cumplieron con los criterios de inclusión en
la balanza INBODY-230 donde se obtuvieron datos como: composición total del
cuerpo, peso, masa muscular, masa grasa, masa grasa libre, agua total del
cuerpo e índice de masa corporal, con esos datos posteriormente se procedió a
tomar una muestra representativa de sangre periférica para poder realizar los
análisis de los marcadores inflamatorios: PCR, IL-6, Leptina y Fibrinógeno, y el
análisis molecular, los datos obtenidos fueron ingresado a una base de datos
(Anexo 2) donde se analizaron los niveles de los marcadores de inflamación con
el grado de obesidad.
El diagnóstico molecular se realizó con la descongelación de las muestras
almacenadas a -45ºC, luego se procedió a elaborar una base de datos de todas
las muestras crioconservadas con sus respectivo códigos ya establecidos para
cada muestra, el proceso de extracción del material genético se realizó con el kit
de extracción PureLink Genomic DNA Mini Kit a partir de sangre periférica
(Anexo 3). Una vez que se obtuvo el material genético, se procedió a la
amplificación del polimorfismo rs9939609 del gen FTO mediante PCR
convencional (Anexo 4), para ello se tomó como referencia los primers utilizados
por Oltehua, (2012): (1) primer sentido normal
5´TTGCGACTGCTGTGAATTTT3´, (2) primer sentido mutado
5´TTGCGACTGCTGTGAATTTA3´ y (3) primer antisentido
5’ATGGCTTCAGGGTACCAG3´; que fueron validados por el programa BLAST,
una vez comprobadas las secuencias, los primers fueron diseñados mediante la
casa comercial INVITROGEN; la amplificación se llevó a cabo bajo condiciones
adecuadas de reacción utilizando el kit de Promega Gotaq.
60
Cuadro I. Master Mix – Alelo Silvestre
Componentes Volumen (x1) Concentración
GoTaq 2x 10.0 μL 1x
Primer 1 - 3 1.0 μL 1x
Agua libre de nucleasas
6.0 μL --------------------
Total 17 μL --------------------
DNA genómico 3.0 μL --------------------
Volumen Final 20.0 μL --------------------
Nota: Calcular siempre una reacción más de lo necesario para compensar los errores de pipeteo.
Cuadro II. Master Mix – Alelo Mutado
Componentes Volumen (x1) Concentración
GoTaq 2x 10.0 μL 1x
Primer 2 - 3 1.0 μL 1x
Agua libre de nucleasas
6.0 μL --------------------
Total 17 μL --------------------
DNA genómico 3.0 μL --------------------
Volumen Final 20.0 μL --------------------
Nota: Calcular siempre una reacción más de lo necesario para compensar los
errores de pipeteo.
61
El proceso de amplificación se realizó utilizando las siguientes temperaturas,
pre desnaturalización a 95°C, por 7 min; desnaturalización a 94°C por 1 min,
hibridación a 54°C por 1min y extensión a 72°C por 1 min, por 25 ciclos, y
extensión final a 72°C por 10 min. Posterior a esto el producto amplificado fue
sometido al proceso de electroforesis (Anexo 5) durante 30 minutos, utilizándose
un gel de agarosa al 2%, SYBR Safe como revelador y BlueJuice 2x, y TAE 1x,
los productos amplificados y sometidos al proceso de electroforesis fueron
analizados mediante el fotodocumentador BIO-RAD (Anexo 6), los resultados
fueron ingresados a la base de datos principal para su posterior análisis
estadístico.
62
CAPITULO III
3. RECOLECCIÓN DE DATOS, ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE
RESULTADOS
Técnicas de recolección de la información
Las técnicas empleadas para el desarrollo del presente trabajo de
investigación fueron información obtenida mediante una encuesta para la
construcción de una base de datos.
Técnica primaria
Como fuente primaria utilizada en el presente estudio fue la observación y el
análisis de la base de datos de los niños y niñas escolares que asistieron a la
Unidad Educativa “José del Buen Pastor” de la ciudad de Guayaquil, la
información obtenida fue sintetizada y analizada.
Técnica secundaria
Como fuente secundaria utilizada fue la revisión bibliográfica de los trabajos
de investigación publicados en revistas indexadas en la web, sobre la Obesidad
Infantil.
63
3.1. Análisis de resultados
Tabla I. Prevalencia de Sobrepeso y Obesidad en la población.
n=49
SOBREPESO 8 (16.33%)
OBESIDAD 41 (83.67%)
Gráfico I. Prevalencia de Sobrepeso y Obesidad en la población.
(Basurto, 2015.)
En el gráfico I, con respecto a la prevalencia de sobrepeso y obesidad
podemos observar que en la población estudiada, el 16.33% tienen sobrepeso,
mientras que el 83.67% tienen obesidad.
16.33 %
83.67 %
SOBREPESO OBESIDAD
64
Tabla II. Prevalencia de los Marcadores de Inflamación en la población.
Marcadores de Inflamación Valores Elevados Valores Normales
n= 49
PCR 3 (6.12%) 46 (93.88%)
Fibrinógeno 4 (8.16%) 45 (91.84%)
IL-6 3 (61.2%) 46 (93.88%)
Leptina 43 (87.76%) 6 (12.24%)
Gráfico II. Prevalencia de los Marcadores de Inflamación en la población.
(Basurto, 2015)
En relación con el gráfico II, se realizó una comparación de los niveles de
marcadores de inflamación, mostrando que el 6.12% de la población muestra
tanto los valores normales de proteína C reactiva como de IL-6 elevados, el
93.88% muestra valores normales; el 8.16% de los niños, los valores de
fibrinógeno estaban elevados y el 91.84% estaban normales, en cambio los
niveles elevados de Leptina tuvieron una mayor prevalencia, debido a que se
presentaron en un 87.76% y el 12.24% restante, los valores estaban entre
normales y disminuidos.
6.12% 8.16% 6.12%
87.76%
93.88% 91.84% 93.88%
12.24%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
PCR Fibrinógeno IL-6 Leptina
Marcadores de Inflamación en la Población
Valores Elevados Valores Normales
65
Tabla III. Prevalencia de los Marcadores de Inflamación en Obesidad y
Sobrepeso.
Parámetros Sobrepeso n=8 Obesidad n=41
PCR ≥ 5,0 mg/L 0 (0%) 3 (7.32%)
Fibrinógeno ≥ 471 mg/dl 0 (0%) 4 (9.76%)
IL-6 ≥ 7,0 pg/ml 2 (25%) 1 (2.44%)
Leptina (Elevado) 8 (100%) 35 (85.37%)
Gráfico III. Prevalencia de Marcadores de Inflamación en Obesidad y
Sobrepeso.
(Basurto, 2015)
25%
100%
7.3
2%
9.7
6%
2.4
4%
85.3
7%
P C R ≥ 5 , 0 MG / L F I B R I N Ó G E N O ≥ 4 7 1 MG / D L
I L - 6 ≥ 7 , 0 P G / ML L E P T I N A ( E L E V A D O )
Marcadores de Inf lamación en Obesidad y Sobrepeso
Sobrepeso n=8 Obesidad n=41
66
En el gráfico III, se muestra la prevalencia de los marcadores de inflamación
tanto en sobrepeso como en obesidad y se observa que de los 8 niños con
sobrepeso, ninguno presento valores elevados de proteína C reactiva ni de
Fibrinógeno, sin embargo el 25% presentó valores elevados de IL-6 y en el
100% de los niños, los valores de Leptina se encontraron elevados, por otro
lado, de los 41 niños con obesidad, el 7.32% presentó valores de proteína C
reactiva elevada, el 9.76% tenían valores de fibrinógeno por encima de los
valores referenciales, el 2.44% presentó valores de IL-6 elevados y un 85.37%
valores altos de Leptina. En ambas patologías la Leptina se encontró elevada en
porcentajes significativos. Además los valores elevados de PCR y fibrinógeno
predominaron en niños con obesidad, al contrario de la IL-6, donde los valores
elevados predominaron en niños con sobrepeso.
67
Tabla IV. Prevalencia de los Marcadores de Inflamación según el sexo.
Parámetros Femenino n=28 Masculino n=21
PCR ≥ 5,0 mg/L 3 (10.71%) 0 (0%)
Fibrinógeno ≥ 471 mg/dl 2 (7.14%) 2 (9.52%)
IL-6 ≥ 7,0 pg/ml 1 (3.57%) 2 (9.52%)
Leptina (Elevado) 23 (82.14%) 20 (95.23%)
Gráfico IV. Prevalencia de los Marcadores de Inflamación según el sexo.
(Basurto, 2015)
El gráfico IV muestra la prevalencia de los marcadores de inflamación de
acuerdo al sexo. Se observa que en el sexo femenino, los niveles elevados de
proteína C reactiva se presentaron en un 10.71%, de fibrinógeno en un 7.14%,
de IL-6 en un 3.57% y de leptina en un 82%, en cambio en el sexo masculino, no
se presentaron niveles elevados de proteína C reactiva, pero sí de fibrinógeno e
IL-6 en un 9.52% y de leptina en un 95.23%.
10.71%7.14% 9.52%
3.57%9.52%
82%
95.23%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Femenino (n=28) Masculino (n=21)
Marcadores de Inflamación por Sexo
PCR ≥ 5,0 mg/L Fibrinógeno ≥ 471 mg/dL
IL-6 ≥ 7,0 pg/ml Leptina (Elevado)
68
Tabla V. Prevalencia del polimorfismo rs9939609 del gen FTO en la población.
rs9939609 n = 49 %
Silvestre (TT) Homocigoto 35 71.43%
Heterocigoto (TA) 12 24.49%
Mutado (AA) Homocigoto 2 4.08%
Gráfico V. Prevalencia del polimorfismo rs9939609 del gen FTO en la población.
(Basurto, 2015)
El gráfico V muestra la prevalencia del polimorfismo rs9939609 del gen FTO
en la población estudiada. Además se observa que el 71.43% son homocigotos
para el alelo silvestre, el 24.49% son heterocigotos y el 4.08% son homocigotos
para el alelo mutado.
71.43%
24.49%
4.08%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Silvestre (TT) Heterocigoto (TA) Mutado (AA)
Polimorfismo rs9939609 en la Población
69
Tabla VI. Prevalencia del polimorfismo rs9939609 del gen FTO en niños con
Sobrepeso y Obesidad.
Sobrepeso y Obesidad
n=49
rs9939609 Silvestre (TT), Homocigoto
rs9939609 Premutado (TA),
Heterocigoto
rs9939609 Mutado (AA), Homocigoto
Sobrepeso n=8 7 (87.5%) 1 (12.5%) 0 (0%)
Obesidad n=41 28 (68.29%) 11 (26.82%) 2 (4.87%)
Gráfico VI. Prevalencia del polimorfismo rs9939609 del gen FTO en niños con
Sobrepeso y Obesidad.
(Basurto, 2015)
En relación a la prevalencia del polimorfismo rs9939609 del gen FTO en niños
con sobrepeso y obesidad, en el gráfico VI se observa que de los 8 niños con
sobrepeso, el 87.50% poseen alelos homocigotos silvestres (TT), ninguno
presentó alelos homocigotos mutados (AA), sin embargo el 12.50% presentaron
alelos heterocigotos (TA). De 41 niños que padecen obesidad, el 68.29%
presentaron alelos homocigotos silvestres (TT), el 26.82% alelos heterocigotos
(TA) y el 4.87% alelos homocigotos mutados (AA).
87.5
0%
68.2
9%
12.5
0% 2
6.8
2%
4.8
7%
SOBREPESO N=8 OBESIDAD N=41
Pol imorf ismo rs9939609 en Obesidad y Sobrepeso
Silvestre (TT) Premutado (TA) Mutado (AA)
70
Tabla VII. Prevalencia del polimorfismo rs9939609 del gen FTO según el sexo.
Sexo rs9939609
Silvestre (TT), Homocigoto
rs9939609 Premutado (TA),
Heterocigoto
rs9939609 Mutado (AA), Homocigoto
Masculino (n=21) 16 (76.19%) 5 (23.81%) 0 (0%)
Femenino (n=28) 19 (67.86%) 7 (25%) 2 (7.14%)
Gráfico VII. Prevalencia del polimorfismo rs9939609 del gen FTO según el sexo.
(Basurto, 2015)
El gráfico VII muestra la prevalencia del polimorfismo rs9939609 del gen FTO
de acuerdo al sexo. Se observa que en el sexo masculino, estuvieron presente
en un 76.19% los alelos homocigotos silvestres (TT), no se presentó los alelos
homocigotos mutados (AA), y en un 23.81% estuvieron los alelos heterocigotos
(TA), en cambio en el sexo femenino, los alelos homocigotos silvestres (TT) se
presentaron en un 67.86%, los heterocigotos (TA) en un 25% y los homocigotos
mutados (AA) en un 7.14%.
76.19%
23.81%
67.86%
25%
7.14%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Silvestre (TT) Permutado (TA) Mutado (AA)
Polimorfismo por Sexo
Masculino (n=21) Femenino (n=28)
71
Tabla VIII. Asociación del polimorfismo rs9939609 y marcadores de inflamación.
MARCADORES Silvestre (TT), Homocigoto
Premutado (TA),
Heterocigoto
Mutado (AA), Homocigoto
PCR ≥ 5,0 mg/L (n=3) 1 (33.33%) 2 (66.67%) 0 (0%)
Fibrinógeno ≥ 471 mg/dl (n=4) 3 (75%) 1 (25%) 0 (0%)
IL-6 ≥ 7,0 pg/ml (n=3) 3 (100%) 0 (0%) 0 (0%)
Leptina (n=43) 29 (67.4%) 12 (27.9%) 2 (4.6%)
En la tabla VIII, se muestra una comparación entre el polimorfismo
rs9939609 del gen FTO y los marcadores de inflamación, donde se puede
observar que de los valores elevados de proteína C reactiva, el 66.67% se
presentó en los pacientes heterocigotos (TA) y el 33.33% en los homocigotos
silvestres (TT). Los valores elevados de fibrinógeno predominaron en los
pacientes homocigotos silvestres con un 75% y los 25% restantes se
presentaron en los heterocigotos. El 100% de los valores elevados de IL-6 se
presentaron en los pacientes homocigotos silvestres. Finalmente, de los valores
elevados de Leptina, el 67.4% se presentaron en pacientes homocigotos
silvestres, el 28% en heterocigotos y el 4.6% en los homocigotos mutados.
72
DISCUSIÓN
La asociación entre la leptina y la obesidad ha sido ampliamente
documentada (Villaseñor, 2002; Martínez, 2010; Zimmermann et al., 2011; Olza
et al., 2013) y los resultados obtenidos confirman esta asociación en un grupo de
niños con sobrepeso y obesidad en edad escolar. No se encontró asociación
entre los niveles elevados de proteína C reactiva y fibrinógeno con la obesidad, a
pesar que algunos trabajos han logrado demostrar esta relación. Por ejemplo,
Barbella et al. (2012), encontraron que los valores elevados de fibrinógeno,
presentaron una correlación significativa con el porcentaje de grasa corporal. En
otros estudios encontraron que la PCR se asocia en forma directa y significativa
al grado de adiposidad, especialmente con el IMC (Acevedo et al., 2007; Balas-
Nakash et al., 2013). Además, no se encontró asociación entre los niveles
elevados de IL-6 y la obesidad, estos resultados concuerdan con los obtenidos
en otros estudios (Wärnberg et al, 2006; Galcheva et al., 2011; Balas-Nakash et
al., 2013).
Con respecto a la relación entre el polimorfismo rs9939609 del gen FTO y la
obesidad, no se encontró asociación entre dichas variables. Estos resultados
concuerdan con el estudio realizado por Espinoza, (2015) en la población
ecuatoriana. En referencia a los marcadores de inflamación, tampoco se
encontró asociación entre la leptina, IL-6 y PCR, con el polimorfismo rs9939609.
Algunos estudios corroboran estos resultados (Fang et al., 2010; Mangge et al.,
2011). Kring et al. (2008), no detectaron asociación entre el polimorfismo
rs9939609 y los niveles de fibrinógeno, en este trabajo se obtuvieron los mismos
resultados, sin embargo, en otro estudio, se comprobó la asociación del
fibrinógeno con el polimorfismo del mismo gen, el rs9939973 (Karns et al., 2011).
Este estudio tuvo limitaciones que deben ser discutidas, como, el pequeño
tamaño de la muestra y el análisis estadístico limitado, a pesar de esto se pudo
detectar una asociación entre la leptina y la obesidad, sin embargo, no fue
suficiente para detectar la asociación entre el polimorfismo rs9939609 con la
obesidad y los marcadores de inflamación. En caso de que exista dicha
asociación, se necesitaría más investigación.
73
CONCLUSIONES
En referencia a los marcadores de inflamación, en esta población de 49 niños,
podemos observar que no se encontró asociación entre la proteína C reactiva,
IL-6 y Fibrinógeno con el sobrepeso y la obesidad, por otro lado la investigación
muestra que existe una fuerte asociación entre la leptina, el sobrepeso y la
obesidad, debido a que los valores de leptina se presentaron elevados en el
100% de los pacientes con sobrepeso y en el 85.37% de los pacientes con
obesidad.
En la población también se observó que la leptina no se presentó elevada en
la totalidad de los pacientes con obesidad pero si en aquellos que padecen
sobrepeso, esto pudo haber ocurrido debido a que según Álvarez-Castro et al.
(2011), los niveles circulantes de leptina descienden con la restricción calórica y
con la pérdida de peso.
En cuanto al polimorfismo rs9939609 del gen FTO, se demostró que si está
presente en la población de niños con sobrepeso y obesidad. También se
observó que los alelos heterocigotos (TA) y homocigotos mutados (AA) se
encontraron en un mayor porcentaje en la población obesa, con un 26.82% y
4.87% respectivamente, además se observó que el genotipo mutante predominó
en el sexo femenino.
De acuerdo al análisis de los resultados podemos indicar que no se encontró
una asociación significativa entre el polimorfismo rs9939609 con la leptina,
proteína C reactiva, IL-6 y fibrinógeno.
74
RECOMENDACIONES
Se recomienda realizar investigaciones similares con una mayor muestra,
incluyendo niños con normopeso, de esta manera se podría confirmar la
asociación del polimorfismo y la obesidad en nuestra población, así se
evidenciaría de que la presencia del polimorfismo puede predisponer a padecer
obesidad infantil, conociendo el nivel de significancia en la población de estudio
y la frecuencia alélica.
Se recomienda también estudiar los otros polimorfismos del gen FTO que
están involucrados directamente con la obesidad.
También sería importante realizar estudios de los hábitos alimenticios de cada
paciente, con esto se podría notar diferencias significativas entre el normopeso,
sobrepeso y obesidad en relación con la alimentación.
75
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85
ANEXOS
Anexo 1. Consentimiento Informado
Protocolo de la investigación: “Medición de marcadores de inflamación en niños
obesos escolares del Hospital León Becerra”
Evaluador: Registro interno:
Datos personales
Nombre: Edad:
Sexo: Fecha de nacimiento:
Nacionalidad: Raza:
Persona Responsable:
Vinculo:
Dirección:
Lugar de procedencia:
Lugar de residencia:
APP: APF:
Registro Antropométrico
Peso (en kg): Talla (en cm):
Circunferencia media de brazo
Circunferencia de cintura
Pliegue tricipital: Pliegue subescapular:
Análisis del balance de la Composición corporal (bioimpedancia)
Peso: Bajo normal alto
Masa muscular: Bajo normal alto
Masa grasa: Bajo normal alto
86
Análisis del balance de la masa muscular por miembros
Brazos balanceado Ligeramente desbalanceado
Extremadamente desbalanceado
Piernas balanceado Ligeramente desbalanceado
Extremadamente desbalanceado
Brazos y piernas
balanceado Ligeramente desbalanceado
Extremadamente desbalanceado
Percentil peso para la edad:
Percentil talla para la edad:
Cuál es el peso ideal?
Para mi masa muscular ideal
Ganar o perder
Peso ideal es:
Para mi masa grasa ideal
Ganar o perder
Para mi peso ideal Ganar o perder
Evaluación de mi cuerpo:
IMC normal Score de crecimiento % grasa normal
Grado de obesidad
normal
Metabolismo basal
normal
Cuestionario de patrón de alimentación
1. Numero de comidas que hace al día y cuáles?
2. Suele repetir?
3. Se salta las comidas principales frecuentemente?
4. Pica entre horas?
5. Se levanta por las noches a comer?
PCR
Fibrinógeno
IL-6
87
Yo, Sr/ Sra _________________________________________, manifiesto que
he sido informado y estoy conforme con la investigación y el procedimiento que
se me ha propuesto efectuar a mí hijo (a). He comprendido la información, he
podido preguntar y aclarar todas mis dudas. Por eso he tomado consciente y
libremente la decisión de autorizarla. También sé que puedo retirar mi
consentimiento cuando lo estime oportuno.
__SI__NO Autorizo que se realicen el análisis de composición corporal como
método diagnóstico para valorar antropométricamente a mi hijo.
__SI__NO Autorizo la toma de muestras y utilización de muestras biológicas
para investigaciones futuras relacionada a la obesidad infantil.
__SI__NO Autorizo la utilización de imágenes con fines docentes o de difusión
del método científico.
Firma # de cédula:
88
Anexo 2. Base de datos
89
Anexo 3. Protocolo de Extracción de DNA.
Preparación del Lisado
1) Colocar los materiales que se utilizaran en la cabina de flujo laminar y
dejarlos bajo rayos UV por 10 minutos.
2) Limpiar con alcohol al 70% el área de trabajo.
3) Rotular los tubos con el número de muestra correspondiente.
4) En un tubo estéril de microcentrifuga colocar 200 µL de la muestra de
células sanguíneas.
5) Añadir 20 µL de Proteinase K
6) Añadir 20 µL de RNasa A, mezclar mediante vortex e incubar a
temperatura ambiente por 2 minutos.
7) Añadir 200 µL de PureLink Genomic Lysis / Binding Buffer y mezclar
mediante vortex.
8) Incubar a 55 °C por 10 minutos para promover la digestión de proteínas
(a los 5 minutos proceder a agitar ligeramente los tubos para que la
digestión sea uniforme).
9) Centrifugar con un Spin para bajar las gotas que estuvieran en la tapa del
tubo.
10) Añadir 200 µL de etanol al 100% al lisado, mezclar bien mediante vortex
por 5 segundos hasta obtener una mezcla homogénea.
11) Proceder inmediatamente a la purificación del DNA.
Purificación del DNA
12) Rotular las columnas de separación con el respectivo número de
muestra.
13) Extraer el lisado y añadirlo a una columna colocada en un tubo
recolector.
14) Centrifugar a 12000 rpm por 1 minuto a temperatura ambiente.
15) Descartar el tubo de recolección y colocar la columna a un nuevo tubo de
recolección.
16) Proceder al lavado del DNA.
90
Lavado del DNA
17) Añadir 500 µL de Wash Buffer 1 a la columna y centrifugar a 12000 rpm
por 1 minuto.
18) Descartar el tubo de recolección y colocar la columna en un nuevo tubo
de recolección.
19) Añadir 500 µL de Wash Buffer 2 a la columna y centrifugar a máxima
velocidad (14500 rpm) por 3 minutos; luego descartar el tubo de
recolección.
20) Colocar la columna en un nuevo tubo de recolección y centrifugar a
máxima velocidad por 1 minuto.
21) Proceder a la elución del DNA.
Elución del DNA
22) Rotular nuevos tubos de microcentrifuga estériles.
23) Colocar la columna en un tubo eppendorf de 1.5 ml y añadir 100 µL de
PureLink Genomic Elution Buffer.
24) Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto y centrifugar 14500 rpm por
1 minuto.
25) Finalmente, el tubo contiene DNA genómico purificado y debe ser
almacenado a -20 °C
91
Anexo 4. Protocolo de Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
1) Limpiar con alcohol la cabina de flujo laminar y colocar los materiales
necesarios.
2) Encender la luz UV por 10 minutos.
3) Colocar sobre hielo los reactivos y los tubos de PCR.
4) Preparar el Master Mix, en un tubo de 1.5 ml, agregar 10 µl de GoTaq 2x, 1
µl de la mezcla de iniciadores para el alelo silvestre, y 6 µl de agua libre de
nucleasas y mezclar.
5) En otro tubo de 1.5 ml, agregar 10 µl de GoTaq 2x, 1 µl de la mezcla de
iniciadores para el alelo mutado, y 6 µl de agua libre de nucleasas y
mezclar.
6) Añadir 17 µl del correspondiente master mix a cada tubo.
7) Añadir 3 µl de DNA y mezclar.
8) Colocar los tubos en el termociclador y programar los ciclos adecuados para
el gen que se quiere amplificar.
92
Anexo 5. Protocolo de Electroforesis
Preparación del gel de agarosa
1) En un matraz de 100 ml, vertir 50 ml del tampón de electroforesis TAE 1x.
2) Pesar 1 g. de agarosa, agregar al matraz y agitar.
3) Calentar hasta ebullición, para conseguir la completa disolución de la
agarosa.
4) Dejar enfriar la solución hasta que alcance unos 50ºC aproximadamente.
5) Armar el soporte donde se verterá el gel de agarosa y colocar los peines que
servirán para formar los pocillos en el gel.
6) Una vez que la solución de agarosa ha alcanzado los 50ºC, añadir 9 µL de
SYBR Safe DNA gel stain y mezclar bien.
7) Verter la solución de agarosa en el soporte y dejar solidificar durante 15
minutos protegido de la luz.
Preparación de las muestras
1) Añadir 5 µl de BlueJuice 2x y mezclar.
Electroforesis
1) Colocar el gel en la cubeta de electroforesis, teniendo en cuenta que los
pocillos deben de estar cerca del cátodo (polo negativo, color negro).
2) Añadir TAE 1X, de forma que cubra por completo el gel de agarosa.
3) Colocar 5 µl de marcador de peso molecular en el pocillo correspondiente.
4) Colocar 13 µl de cada muestra en el pocillo correspondiente.
5) Tapar la cubeta de electroforesis y conectar los electrodos a la fuente de
alimentación. Comprobar que este bien conectada.
6) Programar la fuente a unos 100 voltios y comenzar a correr la electroforesis
durante 30 minutos.
93
Anexo 6. Electroforesis en gel de agarosa.
Figura 4. Gel de agarosa al 2%, el carril 1 muestra el marcador de peso
molecular; carril 2, muestra alelo silvestre y carril 3, alelo mutado de la muestra
22; carril 5, alelo silvestre y carril 6, alelo mutado de la muestra 23; carril 7, alelo
silvestre y carril 8, alelo mutado de la muestra 24; carril 10, marcador de peso
molecular; carril 11, alelo silvestre y carril 12, alelo mutado de la muestra 25;
carril 13, alelo silvestre y carril 14, alelo mutado de la muestra 26; carril 15, alelo
silvestre y carril 16, alelo mutado de la muestra 27.