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UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS FÍSICAS Y MATEMÁTICAS
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOTECNOLOGÍA
ESTUDIO DEL MECANISMO DE INTERNALIZACIÓN DE LOS PÉPTIDOS DE
PENETRACIÓN CELULAR TIRAP y TIRAPALA
EN CÉLULAS HELA.
MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO CIVIL EN
BIOTECNOLOGÍA
KAREN ALEJANDRA FLORES OLAVE
PROFESOR GUÍA:
JOSÉ CRISTIÁN SALGADO HERRERA
MIEMBROS DE LA COMISIÓN:
MARCELA ALEJANDRA HERMOSO RAMELLO.
ZIOMARA PATRICIA. GERDTZEN HAKIM.
SANTIAGO DE CHILE
SEPTIEMBRE 2010
RESUMEN DE LA MEMORIA PARA OPTAR AL TITULO DE INGENIERO CIVIL EN BIOTECNOLOGÍA POR: KAREN ALEJANDRA FLORES OLAVE. FECHA: 18/10/2010 PROF. GUIA: Sr. J. CRISTIAN SALGADO H.
“ESTUDIO DEL MECA�ISMO DE I�TER�ALIZACIÓ� DE LOS PÉPTIDOS DE
PE�ETRACIÓ� CELULAR TIRAP Y TIRAPALA
E� CÉLULAS HELA”
Los Péptidos de Penetración Celular (o CPPs) poseen la habilidad de transportar moléculas a través de la membrana plasmática, sin pérdida de su integridad. Entre las secuencias más estudiadas se encuentran TAT, Antennapedia (Antp) y oligo-argininas, cuya característica en común es la presencia de grupos de aminoácidos catiónicos. La motivación del estudio de estos péptidos, es su potencial aplicación en el diseño de nuevos fármacos capaces de actuar localmente, ingresando directamente a la célula. El interés en la inmunología innata, radica en la posibilidad de bloquear la señalización rio abajo de receptores TLR, utilizando un segmento de la secuencia de TIRAP, el cual compite por la interacción de la proteína adaptadora TIR con TLR4. Esta secuencia posee ambas características deseables: grupos de aminoácidos catiónicos y efecto biológico.
Para desarrollar futuras aplicaciones terapéuticas, es indispensable caracterizar el mecanismo de ingreso, ya que de éste depende la estabilidad y accesibilidad del potencial fármaco al blanco; es por esto que el objetivo principal de este trabajo de tesis fue caracterizar el mecanismo de internalización del péptido TIRAP en células HeLa.
Se estudiaron las diferencias y similitudes estructurales que existen entre los péptidos TAT, TIRAP, y TIRAPALA. Se obtuvieron los modelos tridimensionales de las secuencias mencionadas realizando modelación comparativa, y se calculó el potencial electrostático sobre la superficie de los péptidos. Se encontró que los tres péptidos comparten grandes similitudes estructurales (estructura α-hélice ≥ 69%), sin embargo la gran diferencia radica en el campo de potencial electrostático que generan las cadenas laterales de los residuos, sugiriendo que este es el factor clave que le otorga la habilidad de traslocación a través de la membrana plasmática. Además, al estudiar la internalización de TIRAP y TIRAPALA en células HeLa, se encuentra evidencia experimental de la fuerte asociación de TIRAP a la membrana plasmática. Estudios sobre los posibles efectos tóxicos de TIRAP y TIRAPALA, arrojaron una disminución de la sobrevida celular producto de la internalización, por lo que se determina un límite concentración de incubación igual a 40 µM.
Se concluye que la diferencia de potencial generada por las interacciones entre TIRAP y moléculas de la superficie celular, proveen la primera etapa del mecanismo de internalización, denominado transducción. La diferencia de potencial inducido sobre la superficie celular es la que finalmente provoca el ingreso de los péptidos al citoplasma. Además, es importante considerar los resultados de viabilidad obtenidos para posibles futuras aplicaciones terapéuticas en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas.
i
A mis padres Alejandro Flores y Roxana Olave, por todos estos años de amor, sacrificio, entrega
y dedicación. Por su incondicional apoyo durante mis momentos más difíciles, por el preciado
ejemplo de constancia, esfuerzo y compromiso que me inspiraron a ser la persona que hoy soy.
Por motivarme a soñar en grande, a volar con mis propias alas.
Gracias por creer en mí.
So keep the faith
Don't let nobody turn you 'round
You gotta know when it's good to go
To get your dreams up off the ground
So keep the faith, baby, yea
Because it's just a matter of time
Before your confidence will win out
Believe in yourself
No matter what it's gon' take
You can be a winner
But you got to keep the faith
Michael Jackson (Keep the Faith).
ii
AGRADECIMIENTOS
A Dios, por las maravillas de su creación que he podido observar a través de la ciencia.
A mis tutores de tesis; Dr J. Cristian Salgado, Dra Marcela Hermoso, Dra María Julieta
Venegas y Dr Gerald Zapata, por haberme guiado con gran interés y compromiso durante todo el
transcurso de este trabajo de tesis.
Al proyecto FONDECYT de iniciación 11080016 por el financiamiento de este trabajo de
tesis.
Al Laboratorio de Inmunología Innata, perteneciente a la Facultad de Medicina de la
Universidad de Chile, por haberme proporcionado los espacios y recursos necesarios para
desarrollar mi tesis.
A mis compañeros de laboratorio; Nancy, David, Patricia, Paulina, Marjorie, Loreto, Enzo
y Lucía por su permanente ayuda, especialmente al Sr. Frano Malinarich por dedicar tiempo y
paciencia en guiarme durante el desarrollo experimental.
A mis amigos Kirk y Marcos por su ayuda en la etapa de programación.
A toda mi familia, por mantener la fe en mí, especialmente a mis padres Alejandro y
Roxana, mi hermana Roxana, y mis amigos, que constantemente estuvieron animándome a
seguir.
iii
ÍNDICE DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 1
2. ANTECEDENTES GENERALES .......................................................................................... 4
2.1. Mecanismos de Ingreso de los Péptidos de Penetración Celular a las Células. ................. 5
2.2. Papel de los Proteoglicanos. ................................................................................................ 6
2.3. Alteración de la Viabilidad Celular en Función de la Concentración de Incubación. ........ 7
2.4. Zonas de Nucleación. ........................................................................................................... 8
2.5. Umbral de Transducción. ..................................................................................................... 9
2.6. Importancia de los Grupos de Aminoácidos Catiónicos en la Secuencia Primaria. ......... 10
3. OBJETIVOS........................................................................................................................... 12
4. METODOLOGÍA .................................................................................................................. 13
4.1. Modelamiento de las Estructuras Tridimensionales de TAT, TIRAP y TIRAPALA
. ............ 13
4.2. Cálculo del Campo de Potencial Electrostático sobre la Superficie de los Péptidos. ....... 14
4.3. Viabilidad de células HeLa en Función de la Concentración de Péptidos TIRAP y
TIRAPALA
........................................................................................................................................ 15
4.4. Medición de la Internalización de TIRAP y TIRAPALA
en Células HeLa Utilizando
Concentraciones Crecientes de Estreptavidina-R-Phycoerythrin. ................................................ 15
4.5. Cálculo del Porcentaje de Confluencia en Cultivos de Células HeLa. .............................. 16
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................ 18
5.1. Mejores Alineamientos Obtenidos. ..................................................................................... 18
5.2. Tablas de Información General Entregadas por VADAR en la Revisión de las Estructuras
Obtenidas con MODELLER. ......................................................................................................... 19
5.3. Análisis Estructural de los Modelos Finales Obtenidos. ................................................... 23
5.4 Características de las Estructuras Tridimensionales de los Péptidos. .............................. 25
5.5. Campo de Potencial Electrostático en la Superficie del Péptido. ...................................... 27
5.6. Determinación del Umbral de Viabilidad. ......................................................................... 30
5.7. Ensayo de Internalización de TIRAP y TIRAPALA
. ............................................................. 36
6. CONCLUSIONES ................................................................................................................. 50
7. REFERENCIAS ..................................................................................................................... 52
iv
8. ANEXOS ................................................................................................................................ 60
A. Protocolo del Ensayo de Viabilidad de Células HeLa Incubadas con Concentraciones
Crecientes de Péptidos, con Yoduro de Propidio (IP) por Citometría de Flujo. .......................... 60
B. Protocolo de Internalización de TIRAP o TIRAPALA
en Células HeLa. ................................ 61
C. Analizador de Imágenes: Código Java de las Clases Programadas. .................................... 63
D. Resumen de la simbología JOY para la Representación de Alineamientos y Análisis de
Estructuras. ................................................................................................................................... 67
E. Alineamientos Restantes Utilizados para el modelamiento de TAT. ..................................... 67
F. Alineamientos Restantes Utilizados para el modelamiento de TIRAP. ................................. 69
G. Alineamientos Restantes Utilizados para el modelamiento de TIRAPALA
. ............................. 69
H. Breve Descripción de las Estructuras Utilizadas como Plantillas. ....................................... 69
I. Histogramas de Tamaño (FSC-H) y Granularidad (SSC-H) de Células HeLa Incubadas por
16 horas con diferentes concentraciones de TIRAP y TIRAPALA
. ................................................. 73
v
ÍNDICE
Figuras
Figura 1: Modelo de absorción celular y tráfico intracelular de los péptidos de penetración
celular.. ............................................................................................................................................ 7
Figura 2: Efecto de D-R9 sobre la viabilidad celular.. .................................................................... 8
Figura 3: Internalización de péptido R9 en células HeLa. .............................................................. 8
Figura 4: Heterogeneidad de internalización de diferentes CPPs en células HeLa.. ....................... 9
Figura 5: Análisis estructura-función de la secuencia TIRAP y TAT. .......................................... 10
Figura 6: Gráfico de Ramachandran entregado por MolProbity, de la estructura final obtenida
para la secuencia TAT. .................................................................................................................. 23
Figura 7: Gráfico de Ramachandran entregado por MolProbity, de la estructura final obtenida
para la secuencia TIRAP. .............................................................................................................. 24
Figura 8: Gráfico de Ramachandran entregado por MolProbity para la secuencia TIRAPALA
. .... 24
Figura 9: Dos vistas diferentes para los modelos 3D creados de los péptidos (A, B) TAT, (C, D)
TIRAP y (E, F) TIRAPALA
. ........................................................................................................... 26
Figura 10: Mapa del potencial electrostático sobre la superficie de (A) TAT, (B) TIRAP y (C)
TIRAPALA
. ..................................................................................................................................... 28
Figura 11: Isosuperficies del campo de potencial electrostático calculado sobre la superficie de
los péptidos TAT, TIRAP y TIRAPALA
, de valores -1, 0 y +1 kT. ............................................... 29
Figura 12: (A) Caracterización de la población en el gráfico de puntos SSC-H (granularidad)
versus FSC-H (tamaño). (B) Gráfico granularidad versus intensidad de fluorescencia (medido en
el canal FL2-H) para la determinación del umbral de intensidad de fluorescencia propia de la
población (autofluorescencia). (C) Tinción basal de células HeLa con IP. .................................. 30
Figura 13: Gráficos granularidad v/s intensidad de fluorescencia para células HeLa incubadas por
16 horas con 3 concentraciones diferentes de Stauroporine: (A) 0,5 µM, (B) 1 µM, (C) 2 µM. .. 31
Figura 14: Histogramas de tamaño (FSC-H) y granularidad (SSC-H), de células HeLa incubadas
por 16 horas con diferentes concentraciones de Estaurosporina: 0 (negro) 0,5 (rojo), 1 (amarillo)
y 2 (verde) µM. .............................................................................................................................. 31
vi
Figura 15: Gráficos de puntos granularidad vs intensidad de fluorescencia obtenidos para 1 de 2
ensayos realizados en forma independiente. Células HeLa incubadas por 16 horas con (A) 10 µM,
(B) 20 µM, (C) 40 µM, (D) 60 µM, (E) 80 µM y (F) 100 µM de TIRAP. ................................... 33
Figura 16: Gráficos de puntos granularidad vs intensidad de fluorescencia obtenidos para 1 de 2
ensayos realizados en forma independiente. Células HeLa fueron incubadas por 16 horas con (A)
10 µM, (B) 20 µM, (C) 40 µM, (D) 60 µM, (E) 80 µM y (F) 100 µM de TIRAPALA
. ................. 34
Figura 17: Curvas de viabilidad en función de la concentración de (A) Estaurosporina, (B)
TIRAP y TIRAPALA
. ...................................................................................................................... 35
Figura 18: Histogramas de (A) Granularidad y (B) Tamaño de células HeLa sin estímulos
(poblaciones control), tratadas con (rojo) y sin (azul) permeabilización-fijación. ........................ 36
Figura 19: Poblaciones Control para selección de la región de análisis: R1 para blancos (A) sin
tratamiento y R0 para blancos (C) con tratamiento de permeabilización-fijación. ....................... 36
Figura 20: Control blanco sin tratamiento (ST)............................................................................. 37
Figura 21: Control blanco con tratamiento (CT) de permeabilización-fijación. ........................... 38
Figura 22: Células HeLa incubadas por 2 horas con 40 µM de TIRAP, fueron luego incubadas
por 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad con (A) 2, (B) 10, (C) 20 y (D) 100 µg/ml
de Estreptavidina-R-PE. ................................................................................................................ 39
Figura 23: Células HeLa incubadas por 2 horas con 40 µM de TIRAP, fueron permeabilizadas y
fijadas, para luego ser incubadas por 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad con (A) 2,
(B) 10, (C) 20 y (D) 100 µg/ml de Estreptavidina-R-PE. ............................................................. 39
Figura 24: Unión de la Estreptavidina-R-PE a diferentes componentes en la célula, después del
tratamiento con Permeabilización-Fijación. .................................................................................. 40
Figura 25: Células HeLa incubadas por 2 horas con 40 µM de TIRAPALA
, fueron luego incubadas
por 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad con (A) 2, (B) 10, (C) 20 y (D) 100 µg/ml
de Estreptavidina-R-PE. ................................................................................................................ 41
Figura 26: Células HeLa incubadas por 2 horas con 40 µM de TIRAPALA
, fueron permeabilizadas
y fijadas, para luego ser incubadas por 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad con (A)
2, (B) 10, (C) 20 y (D) 100 µg/ml de Estreptavidina-R-PE. ......................................................... 41
Figura 27: Gráfico IFM vs Concentración Estreptavidina-R-PE, en donde se grafica la curva de
Unión Total Medida de los valores blanco con tratamiento (CT), en conjunto con los datos de
Unión Inespecífica con los valores de los blancos no tratados (ST). ............................................ 44
vii
Figura 28: Gráficos de datos experimentales de IFM. Se presentan además las curvas de mejor
ajuste al Modelo de Unión Específica y No Específica................................................................. 45
Figura 29: Intensidad de Fluorescencia Media máxima calculada diferenciando su localización,
ya sea por péptido internalizado o péptido asociado a la membrana plasmática. ......................... 47
Figura 30: Esquema del mecanismo de internalización propuesto. .............................................. 48
Tablas
Tabla 1: Secuencia Primeria de tres de los CPPs más estudiados. .................................................. 4
Tabla 2: Secuencia primaria de los péptidos TAT, TATALA
, TIRAP y TIRAPALA
....................... 11
Tabla 3: Mejores alineamientos encontrados para la secuencia TAT representados en formato
JOY. ............................................................................................................................................... 18
Tabla 4: Mejores alineamientos encontrados para la secuencia TIRAP representados en formato
JOY. ............................................................................................................................................... 18
Tabla 5: Mejores alineamientos encontrados para la secuencia TIRAPALA
representados en
formato JOY. ................................................................................................................................. 19
Tabla 6: Análisis estructural del primer modelo tridimensional obtenido para la secuencia TIRAP,
utilizando como plantillas las estructuras descritas en la Tabla 4. ................................................ 20
Tabla 7: Análisis estructural del primer modelo tridimensional obtenido para la secuencia
TIRAPALA
, utilizando como plantillas las estructuras descritas en la Tabla 5. ............................. 20
Tabla 8: Análisis estructural del modelo tridimensional refinado obtenido para la secuencia
TIRAP. ........................................................................................................................................... 22
Tabla 9: Análisis estructural del modelo tridimensional refinado obtenido para la secuencia
TIRAPALA
. ..................................................................................................................................... 22
Tabla 10: Cambio en los ángulos de cadenas laterales realizados para el mejoramiento de la
calidad de la estructura 3D. ........................................................................................................... 23
Tabla 11: Tabla resumen del análisis de calidad de la estructura realizada por MolProbity. ....... 25
Tabla 12: Resumen de las características estructurales de los péptidos modelados, describiéndose
el número de aminoácidos que participa en cada tipo de estructura secundaria y su respectivo
porcentaje....................................................................................................................................... 27
Tabla 13: Valores de p del análisis t-Student, no paramétrico, 1 y 2 colas. .................................. 35
viii
Tabla 14: Resultados del ajuste de parámetros del modelo de Unión Específica y No Específica,
para los datos de IFM obtenidos experimentalmente. (CT) Con tratamiento y (ST) sin tratamiento
de Fijación-Permeabilización ........................................................................................................ 43
Tabla 15: Valores Promedio de los parámetros de especificidad e inespecificidad del Modelo de
Unión Específica y No Específica. ................................................................................................ 44
Tabla 16: Valores calculados para los componentes individuales que aportan fluorescencia por
unión a Estreptavidina-R-PE. ........................................................................................................ 47
Ecuaciones
Ecuación 1: Modelo de saturación usado para analizar los datos de Intensidad de Fluorescencia
Media (IFM) para los datos obtenidos tanto para los controles blanco, como para los datos de
incubación con TIRAP y TIRAPALA
............................................................................................. 42
Ecuación 2: Modelo de Medición Total de Fluorescencia. ........................................................... 46
Ecuación 3: Ecuaciones del Modelo de Medición Total de Fluorescencia simplificadas para
cuando la recta de inespecificidad esta descrita, y concentraciones de ligando muy altas (x → ∞).
....................................................................................................................................................... 46
1
1. INTRODUCCIÓN
Los Péptidos de Penetración Celular (Cell Penetrating Peptides o CPPs) pueden
internalizar y transportar moléculas a través de la membrana plasmática, tales como drogas [1],
péptidos [2], proteínas [3], PNAs (peptide nucleic acid) [4] y nanopartículas [5], las cuales por sí
solas son incapaces de atravesar la membrana celular. Los CPPs, comprenden los factores de
transcripción pertenecientes a la familia de las proteínas de homodominio, tales como
Antennapedia de Drosophila melanogaster (Antp) [6], la proteína TAT de HIV-1 [7], factores de
crecimiento de fibroblastos 1 y 2 [8], y otras moléculas capaces de generar una respuesta
biológica, tales como la secuencia del receptor tipo Toll 4 (TLR4), la proteína adaptadora TIR
(TIRAP), entre otras [9].
El principal atractivo de estos péptidos en el área de la medicina es su habilidad de mediar
la importación de moléculas biológicamente activas, cuya principal aplicación es la
internalización de nuevas generaciones de fármacos [10].
La importancia del mecanismo de internalización para este uso radica en la eficiencia de
la respuesta biológica que se desea lograr. Para un propósito terapéutico, el desafío reside en
identificar y caracterizar un resultado asociado a una molécula específica [11]. Aun así, estos
péptidos pueden inducir efectos inespecíficos que podrían enmascarar la acción biológica de las
moléculas internalizadas.
El ingreso vía endocitosis, es un mecanismo que requiere de la liberación del péptido
desde el endosoma o lisosoma al citoplasma. La acidificación del endosoma o lisosoma, puede
alterar químicamente al fármaco mermando así la respuesta biológica [12]. Por este motivo, es
deseable que los péptidos ingresen directamente al citoplasma para que el fármaco tenga más
probabilidades de alcanzar su blanco, (tales como proteínas citosólicas o ligadas a la membrana
plasmática), y obtener así la respuesta biológica deseada. El mecanismo de transducción, el cual
no ha sido completamente estudiado, se ha descrito para la internalización de la oligo-arginina R9
en varios tipos celulares a 37 ºC, el cual comprende la formación de zonas de nucleación [13]. El
mecanismo de ingreso por transducción operaría cuando se utiliza una concentración entre 1 y 10
µM de incubación con CPPs, umbral que depende del tipo celular y tamaño de la molécula a ser
transportada [14].
2
Las respuestas inflamatorias, mediadas por la activación de receptores de tipo Toll (TLRs)
son de gran interés por lo que han sido intensamente estudiados [15]. Varios péptidos de bloqueo
han sido diseñados y empleados in vitro para alterar las vías de transducción río abajo de TLR2 y
TLR4 [16-17]. Los TLRs comparten un dominio citoplasmático o TIR (dominio del receptor
TLR e Interleuquina 1, IL-1R), y su activación induce el reclutamiento de proteínas adaptadoras,
tales como MyD88 [18] y la proteína adaptadora TIR (TIRAP) [17], las cuales acoplan al
dominio TIR. Estas moléculas son un blanco potencial para intervenciones terapéuticas, y por lo
tanto se predice que un antagonista de la vía de señalización de TLR4 pueda modular respuestas
inflamatorias perjudiciales o crónicas, como la observada en la septicemia severa.
TIRAP fue identificada por Horng y cols. (2001) [17] y su papel en la señalización de
TLR4 fue investigada usando Antp como péptido de penetración celular ligado covalentemente a
un dominio dominante negativo de TIRAP. Este dominio, llamado BB loop [19], es altamente
conservada entre los dominios TIR, por lo que se especuló que este péptido podría actuar como
un inhibidor específico de la proteína adaptadora TIR, compitiendo por su interacción con TLR4
[17]. Sin embargo, publicaciones posteriores mostraron resultados contradictorios [20],
generando la duda sobre el papel de los CPPs como medio de internalización, debido a las
posibles interferencias en la interacción del péptido de bloqueo con TLR4, motivando de esta
forma la búsqueda de nuevas secuencias de aminoácidos que posean ambas características
deseables: grupos de aminoácidos catiónicos (otorgándole así la habilidad de internalización) en
conjunto con la capacidad de bloquear señalizaciones intracelulares como la de TLR4.
El péptido TIRAP, rico en grupos de aminoácidos de arginina y lisina, transloca (o
atraviesa) directamente la membrana plasmática al citoplasma, manteniendo intacta su estructura
[9]. Por esta razón se plantea la hipótesis de que péptidos con grupos de aminoácidos catiónicos
comparten el mismo mecanismo de internalización, denominado transducción, el cual está
caracterizado por las zonas de nucleación.
Un análisis más detallado del mecanismo de transducción queda aún por realizar. Se
desconoce si éste es exclusivo para R9 [21], así como las condiciones de temperatura,
concentración, tipo de CPP y tipo celular, bajo las cuales la transducción ocurre. Por esta razón,
es importante determinar la máxima concentración de incubación de modo que no afecte la
sobrevida celular, así como estudiar las características de la internalización cercanas a la
concentración límite. La caracterización de la ruta de ingreso del potencial fármaco es
3
fundamental, de manera que sea efectivamente viable y producente de una respuesta biológica de
alto rendimiento.
La internalización de TIRAP en células Hela y Raw 264.7, disminuye considerablemente
cuando los aminoácidos catiónicos son sustituidos por residuos de alanina (alifático) [9]. Sin
embargo, aun no se han determinado las características estructurales claves que le otorgan la
habilidad de internalización los CPPs. Es por esto que se hace necesario estudiar los modelos
tridimensionales de ambas secuencias TIRAP y TIRAPALA
, compararlas entre sí, y además
obtener el modelo 3D para la secuencia TAT con el fin de comparar las estructuras y su habilidad
de cruzar la membrana plasmática. También se hace necesario calcular el campo de potencial
electrostático de la superficie de la proteína para analizar el efecto de éste sobre el mecanismo de
internalización.
4
2. ANTECEDENTES GENERALES
Los Péptidos de Penetración Celular o CPPs, - también mencionados como Dominio
Homólogo a Proteína de Transducción (Protein Transduction Domain o PTDs), o Péptidos Ricos
en Arginina (Arginine Rich Peptides o R-RPs) - son secuencias de no más de 30 residuos de
aminoácidos, derivados de proteínas naturales, no-naturales o secuencias quiméricas.
Los CPPs pueden ser clasificados según: aquellos que requieren un enlace químico con la
molécula a ser transportada, o los que forman complejos estables no-covalentes con la molécula.
Los CPPs también pueden ser distinguidos desde un punto de vista estructural: (i) poli-catiónicos
o péptidos ricos en arginina (R-RPs) los cuales presentan grupos de poli-arginina en su secuencia
primaria, tales como TAT (derivado de la proteína HIV-1 TAT), Antp (derivado de la proteína
Antennapedia de Drosophila melanogaster), y las quimeras de poli-arginina; (ii) péptidos de
modelo anfipático (Model Amphipathic Peptides o MAPs) desarrollado a partir de la separación
espacial de residuos de aminoácidos cargados positivamente e hidrofóbicos [22]. En la Tabla 1 se
muestran las secuencias primarias de tres de los CPPs más estudiados.
Tabla 1: Secuencia Primeria de tres de los CPPs más estudiados. Los aminoácidos en negrita corresponden a los residuos
catiónicos.
Nombre del Péptido Secuencia Primaria
TAT GRKKRRQRRRPPQ
R9 RRRRRRRRR
Antp RQIKIWFQNRRMKWKK
El transporte de moléculas al citoplasma, mediado por CPPs, puede darse por al menos
dos mecanismos independientes: endocitosis adsortiva y la subsiguiente liberación de los
componentes desde el endosoma o lisosoma al citoplasma [23], o el rápido cruce a través de la
membrana plasmática por un mecanismo aparentemente no dependiente de energía y aún
pobremente descrito, denominado transducción [13].
En cuanto al mecanismo de internalización de los CPPs, la translocación (o
internalización) de MAPs a través de la membrana plasmática, requiere que el péptido posea una
estructura con al menos cuatro vueltas helicoidales (α-hélice) pero no depende de la carga
positiva de los residuos de aminoácidos [22], mientras que la habilidad de internalización de los
5
R-RPs depende de un número mínimo de argininas [24]. Esto sugiere que el mecanismo de
entrada de ambos tipos de CPPs no está relacionado. Si bien resulta difícil establecer un
mecanismo general de internalización para los CPPs, existe un consenso en que la habilidad de
internalización de R-RPs reside en el grupo guanidina de la arginina [25] proveyendo el primer
paso para la entrada a la célula de los componentes a través de la membrana plasmática.
La internalización de los R-RPs acoplados a moléculas de alto peso molecular está
restringida a la endocitosis [26], los R-RPs por sí solos o enlazados a moléculas de bajo peso
molecular pueden ser internalizados por diversos mecanismos. Los R-RPs ingresan directamente
a través de la membrana plasmática al citoplasma cuando se utiliza una concentración entre 1 y
10 µM o umbral de transducción, el cual varía dependiendo del tipo celular y el tamaño de la
molécula a ser internalizada [14]. Se ha reportado que péptidos funcionalmente activos ligados a
R-RPs, producen un efecto biológico luego de su internalización en cultivos celulares [27]. Es
importante mencionar entonces que la transducción mediada por R-RPs, evita el lento mecanismo
de liberación de los péptidos desde las vesículas citoplasmáticas después del ingreso por
endocitosis.
2.1. Mecanismos de Ingreso de los Péptidos de Penetración Celular a las Células.
El estudio del mecanismo de ingreso de los CPPs a la célula es esencial para el desarrollo
y optimización de estrategias apropiadas para aplicaciones terapéuticas in vivo. Aunque la
internalización celular de los CPPs ha sido reportada en una amplia variedad de tipos celulares,
su mecanismo de ingreso permanece incierto.
El mecanismo de internalización de varios CPPs sería mediado por endocitosis [11, 28-
30], sin embargo, esta observación no es concluyente principalmente por el empleo de diferentes
métodos experimentales que no son comparables entre sí. Los resultados obtenidos de estos
estudios deben evaluarse cuidadosamente, puesto que en la mayoría de los casos, los CPPs están
ligados a fluoróforos, los que podrían alterar el mecanismo natural de ingreso, o provocar una
ruta de entrada inusual que no necesariamente se refleja en la fracción biológicamente activa de
los CPPs o de la molécula internalizada.
Se han identificado varias rutas de ingreso de los CPPs (como los que se mencionan en la
sección 2.2), algunas de ellas independientes de una ruta endosómica, translocando a través de la
membrana plasmática directamente al citoplasma [13, 31-33]. Para este último mecanismo,
6
denominado transducción, se ha detectado la formación de zonas de acumulación local del CPP
R9 en la membrana plasmática de varios tipos celulares antes que la internalización ocurra, lo que
se ha denominado como zonas de nucleación. Este proceso es aparentemente un requisito para el
rápido ingreso de los péptidos a la célula [13].
2.2. Papel de los Proteoglicanos.
Los proteoglicanos juegan un papel esencial en la regulación de los microdominios de la
superficie celular, tal como la organización del citoesqueleto y la activación de enzimas, entre
otros [34-35].
Los primeros contactos entre los CPPs y la superficie celular ocurren a través de uniones
electroestáticas con los glicosaminoglicanos (GAG) y la formación de pares iónicos lipofílicos
entre grupos sulfato, fosfato y carboxilo de los constituyentes de la membrana con los dos grupos
amino de la arginina. Estas interacciones proveen el primer paso de la translocación de los CPPs
a través de la membrana plasmática [36]. Posteriormente, la red de actina se reorganiza y
pequeñas GTPasas Rho A o Rac1 se activan [13, 37], las cuales modifican la fluidez de la
membrana, promoviendo la entrada de oligo-argininas, Antp y TAT por macropinocitosis [38] o
endocitosis dependiente de clatrina [29].
En la Figura 1 se muestra un diagrama que resume los diferentes mecanismos propuestos
en la literatura (modificado de Heitz y cols. [39]).
7
Figura 1: Modelo de absorción celular y tráfico intracelular de los péptidos de penetración celular. Absorción celular de
péptidos ligados covalentemente (CPP-C) y no covalentemente (CPP-NC) a una molécula. (1) Unión de los CPPs o
complejo CPP/molécula a la matriz extracelular a través de la plataforma de proteoglicanos. (2) La agrupación de
glicosaminolicanos provoca la activación selectiva de pequeñas GTPasas y la reorganización de la red de actina. (3) Un
incremento de la fluidez de la membrana promueve la entrada celular y la liberación al citosol de los CPP-NC y CPP-C
(en altas concentraciones) a través de la fusión de la membrana o la absorción celular de CPP-C o CPP-NC a través de la
(4) endocitosis (a): dependiente de caveolina, (b): dependiente de clatrina, (c): independiente de clatrina y caveolina o (5)
macropinocitosis. Posterior a la captación de los CPP-C o CPP-NC por endocitosis, estos pueden escapar de la
degradación lisosomal y translocar al citosol y al núcleo (6), permanecer en endosomas tempranos o tardíos (7), o ser
transportados al aparato de Golgi y retículo endoplasmático (8). Modificado de Heitz y cols (2009) [39].
2.3. Alteración de la Viabilidad Celular en Función de la Concentración de Incubación.
La viabilidad celular es un parámetro que puede ser modificado durante el tratamiento con
péptidos catiónicos [21]. La incubación con R9 afecta tanto la integridad de la membrana
plasmática, determinada mediante el ensayo con azul tripán, como la actividad enzimática,
utilizando el ensayo (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5 difeniltetrazilio-bromuro (MTT), los cuales
disminuyen al aumentar la concentración de péptidos utilizada. La Figura 2 muestra el efecto de
la concentración sobre los parámetros mencionados anteriormente [21].
8
Figura 2: Efecto de D-R9 sobre la viabilidad celular. La viabilidad celular se determinó por ensayo de exclusión con azul
tripán (gris) y por medio de la actividad enzimática, utilizando de un ensayo MTT (púrpura), después de 2 horas de
incubación con diferentes concentraciones del péptido. Las barras señalan el error estándar correspondiente a dos
experimentos independientes. El número total de células contadas fueron 140 y 250 para cada experimento. Modificado de
Tunnemann y cols (2008) [21].
2.4. Zonas de Nucleación.
La rápida internalización celular a través del proceso de transducción, es dependiente de
la formación de zonas de nucleación, en los cuales los péptidos se encuentran agrupados
transientemente [13], tal como se observó en células HeLa incubadas con 20 µM de péptido R9.
En la Figura 3 se muestra la formación de zonas de nucleación (flechas blancas) y evolución
temporal del ingreso de R9 en las células HeLa.
Figura 3: Internalización de péptido R9 en células HeLa. Medio conteniendo una concentración de 20 µM de R9 ligado a
un fluoróforo, fue agregado a las células HeLa. La internalización de los péptidos fue visualizada por microscopia
confocal, en lapsos de tiempo de 30 segundos. Se muestran imágenes correspondientes al paso de 1, 5, 10 y 15 minutos,
después de la incubación. Las flechas blancas señalan la temprana formación de las zonas de nucleación. Modificado de
Duchardt y cols. (2007) [13].
9
2.5. Umbral de Transducción.
El umbral de transducción, corresponde a una concentración de péptidos a la cual ocurre
la transición entre el ingreso de los péptidos por endocitosis, y la internalización mediante zonas
de nucleación [13]. Este umbral es dependiente del tipo de célula y CPP.
Según lo reportado por Duchardt y cols. (2007), el umbral de transducción para R9 se
encuentra cercano a la concentración de 10 µM, puesto que se observan simultáneamente células
con péptido distribuido homogéneamente en el citoplasma (alta intensidad de fluorescencia) y
células con péptido confinado en vesículas (fluorescencia local, como puntos), lo que se
interpreta como dos mecanismos de translocación diferentes: transducción y endocitosis,
respectivamente [13].
Figura 4: Heterogeneidad de internalización de diferentes CPPs en células HeLa. Las células HeLa fueron incubadas por
30 minutos con concentraciones crecientes del péptido indicado. Para el análisis por microscopia de fluorescencia, las
células fueron lavadas dos veces con medio y analizadas inmediatamente. Para el análisis por citometría de flujo, las
células fueron lavadas y tratadas con tripsina/EDTA. Modificado de Duchardt y cols. (2007) [13].
10
En la Figura 4 se muestra la internalización de tres péptidos: (A) Antp, (B) R9 y (C) TAT
en las células HeLa, luego de ser incubadas por 30 minutos a 37⁰C con concentraciones
crecientes de los péptidos mencionados [13]. La heterogeneidad de la internalización de los CPPs
en las células HeLa, se presenta a altas concentraciones dependiendo del tipo de péptido. Se
puede observar células con diferentes intensidades de fluorescencia, lo que indica diferentes
cantidades de péptido de internalizado.
2.6. Importancia de los Grupos de Aminoácidos Catiónicos en la Secuencia Primaria.
La habilidad de translocación a través de la membrana plasmática de los péptidos TIRAP
y TAT en células Hela y Raw 264.7, disminuye considerablemente cuando los aminoácidos de
arginina y lisina (catiónicos) presentes en la secuencia primaria, son sustituidos por residuos de
alanina (alifático) [9]. En la Figura 5, se muestran las diferencias en la cantidad de péptido
internalizado, la cual es proporcional a la intensidad de fluorescencia media medida, para las
secuencias de TAT, TATALA
, TIRAP y TIRAPALA
.
Figura 5: Análisis estructura-función de la secuencia TIRAP y TAT. Concentraciones crecientes de los péptidos TIRAP
(barras grises), TIRAPALA (barras gris claro), TAT (barras negras) y TATALA (barras blancas) marcados con NBD, fueron
incubadas en células HeLa y RAW por 2 horas. La cuantificación de la internalización se realizo añadiendo el apagador de
fluorescencia [quencher], ditionito de sodio. Los resultados mostrados corresponden al promedio de 3 experimentos
independientes. Modificado de Low y cols. (2007) [9].
11
En la Tabla 2 se muestran las secuencias de aminoácidos de los péptidos internalizados.
Tabla 2: Secuencia primaria de los péptidos TAT, TATALA, TIRAP y TIRAPALA. Los aminoácidos resaltados en negrita
son catiónicos, mientras que los marcados con rojo corresponden a las sustituciones de alanina.
Nombre del Péptido Secuencia Primaria
TIRAP GKMADWFRQTLLKKPKKRPNSPEST
TIRAPALA
GKMADWFRQTLLAAPAAAPNSPEST
TAT GRKKRRQRRRPPQ
TATALA
GRKKAAQAAAPPQ
12
3. OBJETIVOS
General.
Caracterizar el mecanismo de internalización del péptido TIRAP en células HeLa a
37ºC.
Específicos.
1. Determinar las características estructurales y electroestáticas de los péptidos TIRAP
y TIRAPALA
por métodos bioinformáticos.
2. Estudiar la viabilidad de células HeLa incubadas con el péptido TIRAP o TIRAPALA
.
3. Caracterizar uno de los posibles mecanismos de internalización de TIRAP o
TIRAPALA
en células HeLa.
13
4. METODOLOGÍA
4.1. Modelamiento de las Estructuras Tridimensionales de TAT, TIRAP y TIRAPALA
.
Alineamientos y Selección de las Plantillas.
Se realizó una búsqueda exhaustiva de secuencias conocidas, que presenten los mejores
alineamientos con las secuencias objetivo, con el propósito de utilizarlas como plantillas para el
modelamiento. Esta búsqueda se realizó en dos bases de datos: (1) El servidor en línea FUGUE
(Versión 2.0) [40], el cual utiliza la base de datos HOMSTRAD [41] y (2) búsqueda tipo Fasta1
[42] a en la base de datos PROTEIN DATA BANK (PDB) [43-44].
Ambas bases de datos y sus respectivos motores de búsqueda, se utilizaron para encontrar
los mejores alineamientos contra las tres secuencias objetivo. Las plantillas fueron seleccionadas
según los mejores valores para los parámetros estadísticos que arrojaron las búsquedas:
ZSCORE2 y E-Value
3 para FUGUE y PDB, respectivamente.
Las secuencias primarias de TAT, TIRAP y TIRAPALA
se muestran en la Tabla 2.
Obtención de los Modelos, Validación, Refinamiento y Modelo Final.
Para la obtención de las estructuras, se utilizó el software MODELLER, el cual es usado
para el modelamiento tridimensional de proteínas por homología o comparación [45-46],
satisfaciendo las restricciones espaciales impuestas por las plantillas [47-48]. Las plantillas
utilizadas para el modelamiento comparativo de cada secuencia fueron (identificación PDB):
1 El algoritmo Blast se usa con mayor frecuencia que Fasta. A pesar de que Fasta es más lento, entrega resultados con
mayor precisión. 2 Z-score normalizado por la divergencia de la secuencia.
ZSCORE Clasificación Confianza
≥ 6,0 Seguro 99%
≥ 4,0 Probable 95%
≥ 3,5 Menor 90%
≥ 2,0 Estimación Aproximada 50%
< 2,0 Incierto < 50%
3 Corresponde al número de alineamientos diferentes con puntuación equivalente o mejor, que el puntaje de
alineamiento en bruto que puede ocurrir en la base de datos por casualidad. Este valor provee un puntaje de
confianza para Bit Score, mientras más bajo, más significativo es el Bit Score.
14
TAT: 1JFW, 1K5K, 2W18, 1TAC, 1TVS1FW5, 2VCP, 2GRG, y 1H8B.
TIRAP y TIRAPALA
: 1SRA, 2DYO, y 1H8B.
El primer modelo obtenido con el software MODELLER, se seleccionó como el mejor de
100 estructuras diferentes generadas a partir de las plantillas correspondientes a cada secuencia.
Se utilizó el índice DOPE score (menor valor) como criterio de selección.
Para comprobar la validez y calidad de las estructuras terciarias obtenidas, se utilizó el
servidor en línea VADAR [49], con el fin de detectar errores en el modelo 3D e intentar
repararlos con las herramientas de refinamiento de estructuras de MODELLER.
Se generaron 100 refinamientos diferentes a partir de cada uno, y se seleccionó el mejor
modelo (menor DOPE score), para luego realizar nuevamente la verificación de la calidad de las
estructuras obtenidas.
La adición de átomos de hidrógeno, terminadores (extremo amino y carboxilo) y
corrección de errores en ángulos de cadenas laterales, se realizó con el servidor en red
MolProbity [50]. La validación final de las estructuras, luego de los cambios anteriores, se realizó
con el servidor VADAR para TIRAP y TIRAPALA
, y con el servidor MolProbity para la
secuencia TAT.
4.2. Cálculo del Campo de Potencial Electrostático sobre la Superficie de los Péptidos.
Antes del realizar el cálculo del campo de potencial electrostático sobre la superficie
(CPES) de los péptidos, fue necesario transformar el archivo de coordenadas .pdb, al formato
.pqr. Para ello se utilizó el servidor en línea PDB2PQR [51], empleando las condiciones estándar
para proteínas: campo de fuerza tipo PARSE y pH 7.
El cálculo del CPES de cada uno de los péptidos, se hizo utilizando el software APBS
[52] (a través de la interfaz gráfica del software PyMOL [53]), el cual usa FEtk [54-55] para
resolver la ecuación de Poisson-Boltzmann mediante integración por métodos numéricos. Los
parámetros que se establecieron para estos cálculos son: temperatura 310,15 ⁰K (37°C),
concentración de iones monovalentes 0,15 M (c/u), radio iónico 2,04.
4 Valores recomendados para la resolución de la ecuación de Poisson-Boltzmann en péptidos.[56] N.A. Baker, APBS
electrostatics in PyMOL - Software, in, 2001.
15
4.3. Viabilidad de células HeLa en Función de la Concentración de Péptidos TIRAP y
TIRAPALA
.
Células HeLa fueron incubadas a 37ºC, 5% CO2, en medio Dulbecco’s modified Eagle’s
high glucose (Gibco), conteniendo 10% de suero fetal bovino (Gibco), 100 U/ml de penicilina y
100 µg/ml de estreptomicina.
La determinación de la viabilidad celular se llevó a cabo mediante la tinción con yoduro
de propidio (IP), el cual es un indicador de células en apoptosis tardía. Las células fueron
sembradas en una placa de 48 pocillos (105 células/pocillo, confluencia del 40%
5) y tratadas con
péptido disuelto en medio de cultivo en un rango de 0 a 100 µM por 16 horas a 37ºC, 5% CO2.
Una vez finalizado el tratamiento, se recolectó el medio de incubación junto con las células
cosechadas con 25 mM de EDTA. Las células fueron centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos a
4⁰C y resuspendidas en buffer FACS para ser analizadas inmediatamente en el citómetro. Se
utilizó un Citómetro de Flujo de 4 colores (BECTON DICKINSON, modelo FACSCalibur
342976, serie: E97600098; incluye FACStation MACINTOSH modelo PowerMac G5 A1047,
EMC Nº 2061).
Como control positivo de muerte, se utilizaron células HeLa incubadas con
Estaurosporina en un rango de 0 a1 µM, bajo las mismas condiciones anteriormente descritas. La
medición de la muerte celular se realizó utilizando el mismo procedimiento anterior.
El protocolo detallado de la metodología descrita, se encuentra en el Anexo A.
4.4. Medición de la Internalización de TIRAP y TIRAPALA
en Células HeLa Utilizando
Concentraciones Crecientes de Estreptavidina-R-Phycoerythrin.
Células Hela fueron incubadas en medio Dulbecco’s modified Eagle’s high glucose
(Gibco), conteniendo 10% de suero fetal bovino (Gibco), 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de
estreptomicina, a 37ºC, 5% CO2.
La cuantificación de la internalización de los péptidos unidos covalentemente a biotina, se
llevó a cabo utilizando concentraciones crecientes de Estreptavidina conjugado con el fluoróforo
R-Ficoeritrina (Estreptavidina-R-PE) (Molecular Probes). Las células fueron sembradas en placas
5 Porcentaje de confluencia calculado por análisis de imágenes mediante un software programado en Java
especialmente para este trabajo. Metodología descrita en la sección 4.5.
16
de 48 pocillos (105 células/pocillo, confluencia del 40%
6) y tratadas con péptido disuelto en
medio de cultivo 0 y 40 µM por 2 horas a 37ºC, 5% CO2. Posteriormente, se recolectó el medio
de incubación junto con las células que fueron cosechadas con EDTA 25 mM, para ser lavadas en
PBS (2000 rpm, 2 min, 4ºC) y distribuidas en una placa de 96 pocillos.
Para diferenciar la fluorescencia correspondiente a los péptidos internalizados de los
ligados a la superficie celular, las células fueron tratadas con Fixation/Permeabilization 1X (o
fijación-permeabilización) (eBioscience) por 30 minutos a 4ºC, y comparadas con las células
tratadas con PBS. Las células fueron lavadas en Permeabilization Buffer 1X (o buffer de
permeabilización) (eBioscience) o PBS según corresponda (2500 rpm, 2 min, 4ºC), para luego ser
incubadas con Estreptavidina-R-PE en un rango de 0 a 100 µg/ml (diluido en buffer de
permeabilización 1X o PBS según corresponda) durante 10 minutos a temperatura ambiente en
oscuridad.
Finalmente, las células fueron lavadas en buffer de permeabilización 1X o PBS según
corresponda (2500 rpm, 2 min, 4ºC) y resuspendidas en buffer FACS para ser analizadas por
citometría de flujo.
El protocolo detallado de la metodología anteriormente descrita, se encuentra en el Anexo
B.
4.5. Cálculo del Porcentaje de Confluencia en Cultivos de Células HeLa.
Para calcular el porcentaje de confluencia de un cultivo de células HeLa, se tomó una
fotografía digital a través de un microscopio invertido, la cual representa una muestra aleatoria
simple.
La fotografía es procesada utilizando el editor de imágenes Paint, de tal forma que quede
como un mapa de bits de 12 colores. Posteriormente, la imagen es analizada con el programa
GeneraColor, el cual cuenta el número de pixeles correspondiente a cada color y entrega una
planilla Excel con el código rgb del color y la frecuencia de aparición en la imagen.
Finalmente, se identifica el color que corresponde a las células adheridas, y se hace el
cálculo del porcentaje de aparición de dicho color de pixel sobre el total de pixeles en la imagen,
6 Porcentaje de confluencia calculado por análisis de imágenes mediante un software programado en Java, creado
especialmente para este trabajo de tesis. Metodología descrita en la sección 4.5.
17
el cual corresponde finalmente a la confluencia. Este cálculo es más certero que la comúnmente
utilizada estimación visual.
En el Anexo C se encuentran los códigos de las clases programadas, creados para este
trabajo de tesis.
Este programa fue diseñado personalmente y programado en conjunto con un Ingeniero
Civil en Computación.
18
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1. Mejores Alineamientos Obtenidos.
En las Tablas 3, 4 y 5 se muestran los alineamientos seleccionados en formato JOY [57]
para las secuencias TAT, TIRAP y TIRAPALA
, respectivamente. Estas estructuras fueron
utilizadas como plantillas para el modelamiento de las estructuras. En el Anexo D se encuentra
una tabla con la simbología JOY.
Mejores Alineamientos para TAT.
Tabla 3: Mejores alineamientos para la secuencia TAT representados en formato JOY. Solo se muestran los 2
alineamientos con menor E-Value y mayor porcentaje de similitud. Los restantes 9 alineamientos se encuentran en el
Anexo E.
Alineamiento E-Value Similitud
10 20 30 40 50
1jfw ( 1) mePvdPrLepwkHPGsqpktacttcyckkccfhcqvcfttkaLGisygrk
TAT -----------------------------------------------GRK
ββ ββ
60 70 80
1jfw ( 51) krrqrrrPpqgsqtHqvslskqptsqprGDptgpke
TAT KRRQRRRPPQ--------------------------
0,0040 100%
10 20 30 40 50
1k5k ( 1) mDpvdPnlepwNHPGSqprtPcnkcyckkccyHcqmcfitkglgiSYGrk
TAT -----------------------------------------------GRK
60 70 80
1k5k ( 51) krrqrrrppqGnqAhqDPlpeqpssqhrgdHPtgpke
TAT KRRQRRRPPQ---------------------------
αααα
0,0041 100%
Mejores Alineamientos para TIRAP.
Tabla 4: Mejores alineamientos para la secuencia TIRAP representados en formato JOY. Solo se muestra el mejor
alineamiento (mayor ZSCORE). Los restantes 2 alineamientos se encuentran en el Anexo F.
Alineamiento ZSCORE Confianza
10 20 30 40 50
1sra (136) ppÇldselteFplrMrdwLKnvLvtlyerDednnlLtekqklrVkkihen
TIRAP ------------GKMADWFRQTLLKKPKKRPNSPEST-------------
ααααααααααααααααααααααααα αααααααααααα
60 70 80 90 100
1sra (186) ekrleagdhpvelLardfeknynMYifPVHwqFgqlDqhpidgyLshtEl
TIRAP --------------------------------------------------
αααααααααα 3333ααααααααααα ββ
110 120 130 140 150
1sra (236) apLraplIpmehÇTtrFFetÇdldndkyIaLdeWAgçFgIkqkdidkdlv
TIRAP --------------------------------------------------
3333 333αααααααα ββααααααα 333 333
1sra (286) i
TIRAP -
5,39 95%
19
Mejores Alineamientos para TIRAPALA
.
Tabla 5: Mejores alineamientos para la secuencia TIRAPALA representados en formato JOY. Solo se muestra el mejor
alineamiento (mayor ZSCORE). Los restantes 2 alineamientos se encuentran en el Anexo G.
Alineamiento ZSCORE Confianza
10 20 30 40 50
1sra ( 136) ppÇldselteFplrMrdwLKnvLvtlyerDednnlLtekqklrVkkihen
TIRAPALA ------------GKMADWFRQTLLAAPAAAPNSPEST-------------
ααααααααααααααααααααααααα αααααααααααα
60 70 80 90
100
1sra ( 186) ekrleagdhpvelLardfeknynMYifPVHwqFgqlDqhpidgyLshtEl
TIRAPALA --------------------------------------------------
αααααααααα 3333ααααααααααα ββ
110 120 130 140
150
1sra ( 236) apLraplIpmehÇTtrFFetÇdldndkyIaLdeWAgçFgIkqkdidkdlv
TIRAPALA --------------------------------------------------
3333 333αααααααα ββααααααα 333 333
1sra ( 286) i
TIRAPALA -
4,93 95%
5.2. Tablas de Información General Entregadas por VADAR en la Revisión de las Estructuras
Obtenidas con MODELLER.
En las Tablas 6 y 7, se muestra el análisis de la calidad de las primeras estructuras
obtenidas con MODELLER a partir de las plantillas seleccionadas para TIRAP y TIRAPALA7
.
Estas Tablas de información general fueron entregadas por el servidor web VADAR [49].
Los resultados arrojados por los análisis fueron claves para identificar los residuos con
problemas espaciales, es decir, que no satisfacen las restricciones impuestas. Para TIRAP, se
identifican problemas en los residuos 6 y 24, mientras que para TIRAPALA
los problemas están en
los residuos 11, 20 y 25.
La columna PRBLM señala los tipos de errores que puede presentar el residuo:
A: indica posible problema con ASA (área superficial accesible) fraccional (fASA > 1.0).
V: indica posible problema con volumen fraccional (fV < 0.8 o fV > 1.2).
P: indica posible problema con ángulos Phi y Psi [58].
O: indica posible problema con ángulo Omega (omega > 170 o omega < -170).
C: indica enlace peptídico cis (-20 < omega < 20).
7 Para la secuencia de TAT no se realizó el análisis estructural con VADAR, puesto que posee menos de 15
aminoácidos.
20
TIRAP.
Tabla 6: Análisis estructural del primer modelo tridimensional obtenido para la secuencia TIRAP, utilizando como
plantillas las estructuras descritas en la Tabla 4. Los valores resaltados en rojo indican los parámetros con problemas.
RES. RES. SCND HBOND BTURN RES. FRAC. RES. FRAC. PHI PSI OMEGA PRBLM
NUM. NAME STRUC HBOND BTURN ASA ASA VOL. VOL. PHI PSI OMEGA PRBLM
---------------------------------------------------------------------------------------
1 GLY CCC C 4,5 64.5 0.71 57.6 0.91 360.0 168.5 179.7
2 LYS HHH H 5,6 182.9 0.85 157.1 1.02 -62.6 -43.7 -177.7
3 MET HHH H 6,7 145.3 0.67 142.0 0.87 -64.3 -40.1 -177.1
4 ALA HHH H 8,7 55.3 0.45 73.3 0.84 -61.4 -42.9 -179.0
5 ASP HHH H 1,9 88.1 0.56 120.7 1.06 -64.5 -34.5 -177.2
6 TRP HHH H 2,10 152.8 0.57 179.2 0.78 -60.6 -45.6 -177.6 V
7 PHE HHH H 3,11 114.9 0.51 169.0 0.86 -61.5 -46.8 -176.1
8 ARG HHH H 4,11 177.1 0.73 159.8 0.91 -60.8 -47.7 -176.3
9 GLN HHH H 5,13 80.1 0.42 118.2 0.85 -65.2 -44.0 -176.7
10 THR HHH H 6,13 27.2 0.18 98.4 0.84 -64.3 -44.2 -175.5
11 LEU HHH H 7,13 69.0 0.33 132.4 0.81 -63.3 -40.9 -177.7
11 LEU HHH H 8,16 123.1 0.59 135.7 0.83 -61.8 -39.8 -177.8
13 LYS HHH H 9,16 114.9 0.54 151.1 0.98 -62.3 -36.1 -175.0
13 LYS HHH H 10,18 119.4 0.56 138.1 0.90 -59.4 -51.9 176.4
15 PRO HHH H 11,19 77.6 0.50 113.2 0.98 -65.6 -27.7 178.4
16 LYS HHH H 11,13 142.6 0.67 142.1 0.92 -63.9 -44.2 -174.5
16 LYS HHH H 13,21 133.4 0.62 153.7 1.00 -64.8 -44.2 -172.2
18 ARG HHH H 13,21 III 185.9 0.76 159.0 0.91 -64.3 -48.8 -179.6
19 PRO HHH H 15 III 96.1 0.62 104.0 0.90 -68.1 -24.2 -176.7
20 ASN HHH H 16,16 III 93.2 0.56 98.3 0.84 -65.5 -36.6 -176.1
21 SER CCC C 16,18 III 29.2 0.22 78.8 0.87 -59.8 137.5 174.7
22 PRO CCC C 25 III 79.5 0.51 94.0 0.82 -68.5 152.7 -177.8
23 GLU CCC C III 166.9 0.88 110.7 0.83 -64.0 -39.7 -177.3
24 SER CCC C III 112.4 0.85 72.0 0.80 -61.5 -53.0 -179.7 V
25 THR CCC C 22 III 129.5 0.86 101.3 0.87 -94.9 360.0 360.0
TIRAPALA
.
Tabla 7: Análisis estructural del primer modelo tridimensional obtenido para la secuencia TIRAPALA, utilizando como
plantillas las estructuras descritas en la Tabla 5. Los valores resaltados en rojo indican los parámetros con problemas.
RES. RES. SCND HBOND BTURN RES. FRAC. RES. FRAC. PHI PSI OMEGA PRBLM
NUM. NAME STRUC HBOND BTURN ASA ASA VOL. VOL. PHI PSI OMEGA PRBLM
---------------------------------------------------------------------------------------
1 GLY CCH C 4,5 85.9 0.95 53.6 0.85 360.0 -66.1 180.0
2 LYS HHH H 5,6 181.9 0.85 138.2 0.90 -63.1 -40.9 -178.2
3 MET HHH H 6,7 126.1 0.58 153.3 0.94 -64.5 -45.8 -173.9
4 ALA HHH H 8,7 69.4 0.56 73.3 0.84 -64.5 -48.3 -176.9
5 ASP HHH H 1,9 85.3 0.54 95.5 0.84 -69.8 -29.8 178.9
6 TRP HHH H 2,10 147.5 0.55 203.2 0.88 -63.4 -37.4 -178.9
7 PHE HHH H 3,11 105.2 0.46 158.5 0.81 -60.1 -44.3 -179.6
8 ARG HHH H 4,11 149.4 0.61 154.2 0.88 -61.9 -38.1 -177.1
9 GLN HHH H 5,13 88.3 0.47 121.4 0.87 -62.0 -41.8 -179.3
10 THR HHH H 6,13 36.6 0.24 117.3 1.00 -65.9 -36.7 -179.8
11 LEU HHH H 7,8 61.8 0.30 125.1 0.77 -61.6 -45.2 -176.3 V
11 LEU HHH H 8,16 96.1 0.46 144.9 0.89 -63.3 -41.8 -175.5
13 LYS HHH H 9,16 123.3 0.58 138.7 0.90 -63.4 -37.0 -178.4
13 LYS HHH H 10,18 80.4 0.38 150.8 0.98 -60.7 -46.0 173.4
15 PRO HHH H 11,18 65.6 0.42 101.4 0.88 -62.6 -28.3 177.3
16 LYS HHH H 11,13 161.1 0.75 139.5 0.91 -64.3 -40.7 178.5
16 LYS HHH H 13,13 108.1 0.50 144.1 0.94 -62.1 -26.0 -173.9
18 ARG HHH H 13,15 140.7 0.58 171.9 0.98 -55.9 -41.2 172.8
19 PRO CCC C 16 111.0 0.72 97.5 0.85 -64.1 107.0 -176.8
20 ASN CCC C 118.9 0.72 95.0 0.81 151.5 -146.4 178.5 P
21 SER CBC C 61.2 0.46 85.0 0.94 -66.5 156.3 -178.0
22 PRO CBC C 120.6 0.78 110.9 0.96 -51.8 124.2 -177.6
23 GLU CBC C 45.5 0.24 136.0 1.02 -141.3 139.0 179.5
24 SER CCC C 63.5 0.48 85.5 0.94 48.3 55.4 -178.0
25 THR CCC C 178.5 1.18 107.6 0.92 -47.4 360.0 360.0 A
21
A partir de lo indicado en las Tablas 6 y 7, el problema más común que se presenta en las
estructuras corresponde al volumen fraccional, el cual está calculado como el volumen ocupado
por un residuo definido por su radio atómico y sus vecinos más cercanos. Cuando este valor es
menor a 0.8 (como en el caso de los residuos 6 y 24 en TIRAP, 11 en TIRAPALA
), quiere decir
que el residuo se encuentra en una región comprimida.
Luego del refinamiento con MODELLER y selección del mejor modelo obtenido
utilizando el índice Dope score (menor valor), se realizó nuevamente la verificación de la calidad
de las estructuras con VADAR. El análisis estructural posterior al refinamiento se muestra en las
Tablas 8 y 9.
Como se puede observar en las Tablas 8 y 9, el análisis arrojado indica mejoras en la
calidad de las estructuras. Los problemas detectados en TIRAP se mantuvieron a pesar de los
refinamientos realizados. Es posible que estos residuos estén forzados a permanecer en estos
valores de volumen fraccional por acción de los residuos vecinos, de tal forma que si se
modifican la estructura completa pierde calidad. Aún así, 2 de los 3 residuos con problemas
detectados en la estructura de TIRAPALA
si fueron corregidos completamente (residuos 11 y 20),
mientras que el residuo 25, sin bien permanece con problemas de área superficial accesible, su
valor se corrigió levemente disminuyendo en 0,02 grados.
22
TIRAP.
Tabla 8: Análisis estructural del modelo tridimensional refinado obtenido para la secuencia TIRAP. Los valores
resaltados en rojo indican los parámetros con problemas.
RES. RES. SCND HBOND BTURN RES. FRAC. RES. FRAC. PHI PSI OMEGA PRBLM
NUM. NAME STRUC HBOND BTURN ASA ASA VOL. VOL. PHI PSI OMEGA PRBLM
---------------------------------------------------------------------------------------
1 GLY CCC C 4,5 64.5 0.71 57.6 0.91 360.0 168.5 179.7
2 LYS HHH H 5,6 182.9 0.85 157.1 1.02 -62.6 -43.7 -177.7
3 MET HHH H 6,7 147.5 0.68 142.5 0.87 -64.3 -40.1 -177.1
4 ALA HHH H 1,8 55.3 0.45 73.3 0.84 -61.4 -42.9 -179.0
5 ASP HHH H 1,9 88.1 0.56 120.5 1.06 -64.5 -36.7 -176.6
6 TRP HHH H 2,10 167.9 0.63 180.0 0.78 -62.8 -41.9 -178.9 V
7 PHE HHH H 3,11 125.7 0.55 172.5 0.88 -60.1 -46.8 -176.1
8 ARG HHH H 4,11 177.1 0.73 159.8 0.91 -60.8 -47.7 -176.3
9 GLN HHH H 5,13 73.5 0.39 116.3 0.84 -65.2 -44.0 -176.7
10 THR HHH H 6,13 28.6 0.19 99.3 0.85 -64.3 -44.2 -175.5
11 LEU HHH H 7,13 69.0 0.33 132.4 0.81 -63.3 -40.9 -177.7
11 LEU HHH H 8,16 123.1 0.59 135.7 0.83 -61.8 -39.8 -177.8
13 LYS HHH H 9,16 114.9 0.54 151.1 0.98 -62.3 -36.1 -175.0
13 LYS HHH H 10,18 119.4 0.56 138.1 0.90 -59.4 -51.9 176.4
15 PRO HHH H 11,19 77.6 0.50 113.2 0.98 -65.6 -27.7 178.4
16 LYS HHH H 11,13 142.6 0.67 142.1 0.92 -63.9 -44.2 -174.5
16 LYS HHH H 13,21 133.4 0.62 153.7 1.00 -64.8 -44.2 -172.2
18 ARG HHH H 13,21 III 185.9 0.76 159.0 0.91 -64.3 -48.8 -179.6
19 PRO HHH H 15 III 96.1 0.62 104.0 0.90 -68.1 -24.2 -176.7
20 ASN HHH H 16,16 III 93.2 0.56 98.3 0.84 -65.5 -36.6 -176.1
21 SER CCC C 16,18 III 29.2 0.22 78.8 0.87 -59.8 137.5 174.7
22 PRO CCC C 25 III 77.6 0.50 94.5 0.82 -68.5 152.7 -177.8
23 GLU CCC C III 167.9 0.88 111.2 0.83 -64.0 -40.6 -177.7
24 SER CCC C III 113.6 0.86 72.1 0.80 -61.1 -46.0 177.1 V
25 THR CCC C 22 III 129.9 0.86 102.7 0.88 -103.4 360.0 360.0
TIRAPALA
Tabla 9: Análisis estructural del modelo tridimensional refinado obtenido para la secuencia TIRAPALA. Los valores
resaltados en rojo indican los parámetros con problemas.
RES. RES. SCND HBOND BTURN RES. FRAC. RES. FRAC. PHI PSI OMEGA PRBLM
NUM. NAME STRUC HBOND BTURN ASA ASA VOL. VOL. PHI PSI OMEGA PRBLM
---------------------------------------------------------------------------------------
1 GLY CCH C 4,5 89.4 0.98 55.6 0.88 360.0 74.2 -180.0
2 LYS HHH H 5,6 180.9 0.84 140.0 0.91 -62.6 -41.3 179.5
3 MET HHH H 6,7 136.0 0.62 148.3 0.91 -63.1 -39.8 -178.0
4 ALA HHH H 1,7 56.1 0.45 80.7 0.93 -62.3 -38.7 -177.7
5 ASP HHH H 1,9 72.2 0.46 106.6 0.94 -61.0 -39.0 180.0
6 TRP HHH H 2,10 139.7 0.52 191.7 0.83 -62.7 -38.7 -176.4
7 PHE HHH H 3,11 98.6 0.43 157.8 0.81 -60.7 -43.9 -179.3
8 ARG HHH H 5,11 172.8 0.71 150.1 0.86 -60.9 -42.0 -176.2
9 GLN HHH H 5,13 120.2 0.64 120.0 0.86 -62.0 -45.2 -178.8
10 THR HHH H 6,13 37.9 0.25 95.5 0.82 -66.0 -42.3 -175.3
11 LEU HHH H 7,13 102.3 0.49 135.5 0.83 -62.6 -40.7 -178.9
11 LEU HHH H 8,16 150.3 0.72 161.8 0.99 -63.4 -41.6 -176.7
13 ALA HHH H 16,16 54.7 0.44 87.8 1.01 -62.9 -39.4 -173.0
13 ALA HHH H 10,16 53.5 0.43 73.6 0.84 -61.0 -48.6 176.6
15 PRO HHH H 11,19 80.6 0.52 101.8 0.88 -66.3 -23.9 178.3
16 ALA HHH H 11,13 64.5 0.52 79.4 0.91 -64.8 -45.3 -175.3
16 ALA HHH H 13,20 65.7 0.53 72.9 0.84 -65.9 -43.8 -170.5
16 ALA HHH H 13,21 68.2 0.55 69.9 0.80 -62.5 -48.0 -179.6
19 PRO HHH H 15,22 III 88.8 0.57 107.6 0.93 -69.3 -18.3 -178.0
20 ASN CHH H 23,16 III 91.1 0.55 94.4 0.81 -67.0 -28.3 -177.7
21 SER CHH H 16,24 III 88.9 0.67 72.6 0.80 -61.9 -36.8 -174.3
22 PRO CHH H 19 III 106.6 0.69 95.2 0.83 -65.4 -18.7 -178.0
23 GLU CHH H 20,21 95.6 0.50 119.3 0.90 -63.8 -37.6 -176.0
24 SER CCC C 21 105.8 0.80 75.1 0.83 66.8 25.9 178.6
25 THR CCC C 175.4 1.16 112.0 0.96 -114.7 360.0 360.0 A
23
Luego de la adición de átomos de hidrógeno y terminadores (extremo amino y
carboxilo), se corrigieron errores en ángulos de cadenas laterales, los cuales fueron detectados a
través del servidor en red MolProbity. Los cambios que se realizaron se muestran en la Tabla 10.
Tabla 10: Cambio en los ángulos de cadenas laterales realizados para el mejoramiento de la calidad de la estructura 3D.
Péptido # Residuo ID Residuo Origen Flip Flip-Origen
TAT 13 GLN -1,90 -0,54000 1,36000
TIRAP 20 ASN -3,70 -2,00000 1,70000
TIRAPALA
09 GLN -0,19 -0,00041 0,18959
20 ASN 0,19 -0,25000 -0,44000
5.3. Análisis Estructural de los Modelos Finales Obtenidos.
La validación final de las estructuras obtenidas luego de los cambios anteriores, se realizó
con MolProbity. En las Figuras 6, 7 y 8 se muestran los gráficos de Ramachandran para las
secuencias de TAT, TIRAP y TIRAPALA
, respectivamente.
Gráficos de Ramachandran de las Estructuras Finales.
TAT.
Figura 6: Gráfico de Ramachandran de la estructura final de la secuencia TAT. Las regiones delimitadas por una línea
celeste corresponden las zonas óptimas, aquellas delimitadas con una línea azul son zonas permitidas, las regiones sin
delimitación corresponden a zonas no permitidas. Gráfico obtenido con MolProbity.
24
TIRAP.
Figura 7: Gráfico de Ramachandran de la estructura final de la secuencia TIRAP. Las regiones delimitadas por una línea
celeste corresponden las zonas óptimas, aquellas delimitadas con una línea azul son zonas permitidas, las regiones sin
delimitación corresponden a zonas no permitidas. Gráfico obtenido con MolProbity.
TIRAPALA
.
Figura 8: Gráfico de Ramachandran de la estructura final de la secuencia TIRAPALA. Las regiones delimitadas por una
línea celeste corresponden las zonas óptimas, aquellas delimitadas con una línea azul son zonas permitidas, las regiones sin
delimitación corresponden a zonas no permitidas. Gráfico obtenido con MolProbity.
25
La Tabla 11 muestra el resumen del análisis de calidad para las estructuras finales de
TAT, TIRAP y TIRAPALA
.
Si bien, el porcentaje de rotámetros pobres excede la meta impuesta (la cual está
configurada por el servidor utilizado), se considera aceptable puesto que sólo un residuo de cada
modelo presenta este problema.
Tabla 11: Tabla resumen del análisis de calidad de la estructura realizada con MolProbity. Se comparan los resultados de
las secuencias TAT, TIRAP y TIRAPALA.
Parámetro TAT TIRAP TIRAPALA
Meta
Rotámetros Pobres 8.33% (01/12) 4.35% (01/13) 5.56% (01/18) < 1.0%
Ramachandran outliers 0.00% (00/11) 0.00% (00/23) 0.00% (00/23) < 0.2%
Ramachandran favorecidos 100% (11/11) 100% (23/23) 100% (23/23) > 98.0%
Desviaciones Cβ > 0.25 Å 0 0 1 0
Residuos con malos enlaces 0.00% 0.00% 0.00% 0.0%
Residuos con malos ángulos 0.00% 0.00% 0.00% < 0.1%
5.4 Características de las Estructuras Tridimensionales de los Péptidos.
Se puede observar de la Figura 9, que al reemplazar lisina (LYS, K) y arginina (ARG, R)
por alanina (ALA, A) en el péptido TIRAP para formar TIRAPALA
(Figura 9C y 9E), la estructura
secundaria varía aumentado levemente el porcentaje de α-hélice en la estructura de TIRAPALA
con respecto a la estructura de TIRAP.
26
(A) TAT: Vista simple más cadenas laterales (B) TAT: Vista de la superficie
(C) TIRAP: Vista simple más cadenas laterales (D) TIRAP: Vista de la superficie
(E) TIRAPALA
: Vista simple más cadenas
laterales (F) TIRAP
ALA: Vista de la superficie
Figura 9: Dos vistas diferentes para los modelos 3D creados de los péptidos (A, B) TAT, (C, D) TIRAP y (E, F) TIRAPALA.
Los puntos rosados corresponden a los átomos de las cadenas laterales pertenecientes a los aminoácidos de interés. En la
vista simple más cadenas laterales, el color azul indica el extremo amino, y el color rojo el extremo carboxilo. En la vista
de superficie, los colores representan: verde = C, blanco = H, rojo = O, azul = N. Imágenes generadas con PyMol [53].
Este cambio no es atribuible a las plantillas utilizadas, puesto que se usaron las mismas
para ambas secuencias, más bien podría explicarse dado el menor tamaño del residuo de alanina
(89,09 g/mol) en comparación al de lisina (146,19 g/mol) y arginina (174,2 g/mol). Es posible
que el residuo de arginina esté interactuando con las cadenas laterales de los residuos vecinos
(interacción estérica), interfiriendo de esta forma con la formación de vueltas helicoidales en la
última sección de la estructura. Así, al reemplazarse con un aminoácido de cadena lateral más
pequeña, esta interacción disminuye permitiendo la estructura α-hélice en los residuos cercanos al
extremo carboxilo.
27
Las estructuras obtenidas presentan grandes similitudes estructurales (Tabla 12),
predominando fuertemente la estructura secundaria tipo α-hélice, siendo su composición mayor al
69% en los tres modelos obtenidos.
Tabla 12: Resumen de las características estructurales de los péptidos modelados. Se describe el número de aminoácidos
que participa en cada tipo de estructura secundaria y su respectivo porcentaje.
Observado
Parámetro TAT TIRAP TIRAPALA
# α-Hélice 09 (69%) 19 (76%) 22 (88%)
# Hoja-β 00 (00%) 00 (00%) 00 (00%)
# Coil 04 (31%) 06 (24%) 03 (12%)
Con respecto a las plantillas utilizadas para el modelamiento de las estructuras, se puede
notar en el caso de la secuencia TAT, que a pesar de que las dos estructuras con mejor
alineamiento según PDB (1K5K y 1JFW) presentan efectivamente 100% de similitud, las
estructuras secundarias de las plantillas (ver Anexo H) son muy diferentes al modelo final
obtenido, siendo 1K5K y 1JFW principalmente tipo coil versus la predominancia de α-hélice en
TAT. Esto da una idea que, para la obtención de un modelo aceptable, no sólo es necesario la
utilización de buenas plantillas, sino que también del refinamiento posterior y las condiciones de
borde que se le den al modelo. En el caso particular de TAT, las condiciones de borde fueron
entregadas por las plantillas con secuencias más cortas.
A pesar de la buena evaluación de las estructuras obtenidas (#Outliers 0, en Tabla 11)
mostrados en las los gráficos de Ramachandran de las Figuras 6, 7 y 8, aún existen problemas en
los modelos obtenidos. Estos defectos se deben principalmente a superposiciones estéricas entre
algunos átomos de cadenas laterales vecinas, mostrados por los índices entregados por VADAR
(Tablas 8 y 9) y MolProbity (Tabla 11), los cuales deben ser corregidos en el futuro utilizando,
por ejemplo, técnicas de refinación basadas en simulaciones de dinámica molecular.
5.5. Campo de Potencial Electrostático en la Superficie del Péptido.
Los cálculos obtenidos fueron determinados en condiciones estándar, es decir, a pH 7,
temperatura 37⁰C y 0,15 M de iones monovalentes. Estos parámetros son muy similares a las
condiciones experimentales (pH 7,3 y salinidad fisiológica), por lo que las variaciones deberían
ser despreciables. Así, los resultados obtenidos se asumen válidos para los análisis posteriores.
28
Los modelos indican que las sustituciones en la secuencia primaria de TIRAP, no provoca
un cambio importante en la estructura secundaria, sin embargo, el potencial electrostático varía
fuertemente. Esto sugiere que el campo electrostático puede ser una de las características
importantes que le otorga a los CPPs la permeabilidad a la membrana plasmática, y por lo tanto,
jugar un papel importante en el mecanismo de internalización de los péptidos.
(A) TAT
(B) TIRAP
(C) TIRAPALA
Figura 10: Mapa del potencial electrostático en la superficie de (A) TAT, (B) TIRAP y (C) TIRAPALA. Las regiones azules
corresponden al sector del campo que tiene valor +1, las blancas con valor neutro y las de color rojo con valor -1. Los
puntos rosados corresponden a los átomos de las cadenas laterales pertenecientes a los aminoácidos de interés. Imágenes
generadas con PyMol [53].
Como se puede observar en la Figura 10, el CPES positivo predomina considerablemente
por sobre negativo, tanto para TAT como para TIRAP. La estructura de TIRAPALA
presenta un
mapa superficial mas homogéneamente distribuido.
29
En la Figura 11 se comparan las isosuperficies de módulo 0 y 1 para las 3 estructuras. En
TIRAP al igual que en TAT, la isosuperficie electrostática positiva es la que domina el campo
superficial, con un área claramente mayor al de la isosuperficie negativa.
En el caso de la secuencia de TIRAPALA
, el reemplazo de los aminoácidos catiónicos por
alaninas genera disminución de área de la isosuperficie electrostática positiva, balanceando en
cierto modo el campo sobre la superficie. Es más, en TIRAPALA
, la isosuperficie electrostática
neutra, muestra que se podría definir un dipolo sobre la superficie del péptido.
Isosuperficie -1 kT Isosuperficie 0 kT Isosuperficie +1 kT
TAT
TIRAP
TIRAPALA
Figura 11: Isosuperficies del campo de potencial electrostático calculado sobre la superficie de los péptidos TAT, TIRAP y
TIRAPALA, de valores -1, 0 y +1 kT. Los puntos rosados corresponden a los átomos de las cadenas laterales pertenecientes
a los aminoácidos de interés. Imágenes generadas con PyMol [53].
Debido a lo anteriormente expuesto, se plantea que las diferencias en el grado de
internalización de TIRAP y TIRAPALA
reportados por Low y cols. (Figura 5) [9], se deben a la
interacción del campo electrostático entre la superficie de éstos y las moléculas de la membrana
celular, y no a la conformación de la estructura secundaria de los péptidos. Esta observación se
discutirá con los resultados presentados más adelante.
30
5.6. Determinación del Umbral de Viabilidad.
Control Blanco: Células HeLa sin estímulo.
En la Figura 12 se pueden ver los gráficos de puntos (o Dot Plots) representativos (n = 3),
obtenidos mediante citometría de flujo de células HeLa. Cada punto representa un evento (una
célula), y la diferencia de colores determina la densidad de, siendo las zonas azules las de mayor
densidad, seguido por las zonas de color verde, amarillo y rojo. El parámetro SSC-H (Side
Scatter) caracteriza la granularidad de las células, mientras que FSC-H (Forward Scatter)
caracteriza el tamaño celular. El canal FL2-H detecta la emisión de yoduro de propidio o IP (562-
588 nm), el cual se intercala en el ADN otorgándole fluorescencia a las células en apoptosis
tardía, por lo que esta tinción se utiliza como indicador de muerte celular. El umbral de
autofluorescencia de las células se fijó de tal modo que cerca del 99,5% de las células control
queden por debajo de éste. El número señalado en la esquina inferior derecha, indica el
porcentaje de células que sobrepasan el umbral de autofluorescencia, es decir, que han sido
marcadas o teñidas con el fluoróforo.
Figura 12: (A) Caracterización de la población de células HeLa en el gráfico de puntos SSC-H (granularidad) versus FSC-
H (tamaño). (B) Gráfico de granularidad versus intensidad de fluorescencia (medido en el canal FL2-H) para la
determinación del umbral de intensidad de fluorescencia propia de la población (autofluorescencia). (C) Tinción basal de
células HeLa con yoduro de propidio. La línea vertical indica el umbral de autofluorescencia. El porcentaje en el
cuadrante derecho, indica el número de células que incorporan el fluoróforo (IP). Los colores indican la densidad de
puntos, siendo las zonas azules las de mayor densidad, seguido por las zonas de color verde, amarillo y rojo.
En la Figura 12C muestra que existe muerte celular no despreciable asociada a la técnica
de cosechado de células adherentes con EDTA, puesto que cerca del 10% de las células
sobrepasan el umbral de autofluorescencia, es decir, se encuentran en apoptosis tardía. Es por
esto que fue necesario realizar varios ensayos (3 en total) para lograr caracterizar la muerte basal,
31
con el fin de identificar posteriormente la muerte inducida por la incubación con los diferentes
estímulos.
Control de Muerte: Células HeLa estimuladas con concentraciones crecientes de
Estaurosporina.
En la Figura 13 se puede apreciar un aumento en la intensidad de fluorescencia de IP en
las células incubadas con el inductor de apoptosis Estaurosporina. También se observa un cambio
en las características de la población, tales como el aumento de la heterogeneidad y disminución
del tamaño y granularidad (Figura 14). Para las tres concentraciones de Estaurosporina
empleadas, se observa una segunda población de células con alta intensidad de fluorescencia, las
cuales se asocian al proceso de apoptosis tardía [59].
Figura 13: Gráficos granularidad v/s intensidad de fluorescencia para células HeLa incubadas por 16 horas
Estaurosporina: (A) 0,5 µM, (B) 1 µM, (C) 2 µM. Gráficos de puntos representativos de 4 ensayos realizados en forma
independiente.
Figura 14: Histogramas de tamaño (FSC-H) y granularidad (SSC-H), de células HeLa incubadas por 16 horas con
Estaurosporina: 0 (negro) 0,5 (rojo), 1 (amarillo) y 2 (verde) µM.
32
Estimulación con TIRAP: Porcentaje de células marcadas con IP.
Para los ensayos de viabilidad de células HeLa estimuladas con TIRAP por 16 horas
(Figura 15), se puede apreciar claramente una población con aumento de la fluorescencia de IP
medido por citometría de flujo. A partir de 40 µM, se muestra un abrupto aumento de la
fluorescencia (de 13,7% a 31,5% de células muertas o IP+), tendencia que se mantiene para las
concentraciones mayores o iguales a 40 µM, con un promedio de muerte celular cercano al 29%.
Lo anterior, sugiere que el aumento de la concentración de TIRAP, induce la muerte de células
HeLa.
Con respecto a las características morfológicas de las poblaciones celulares, no se
observan cambios notorios ni en la granularidad, ni en el tamaño celular con respecto a las células
control (Anexo I). Se descarta que el IP se una inespecíficamente a la membrana, puesto que los
controles blancos no presentan tal incremento abrupto en la fluorescencia. Así también se
descarta que el IP se esté uniendo inespecíficamente al péptido asociado a la membrana puesto
que el ión propidio es un catión impermeable, el cual sería repelido por la superficie catiónica de
TIRAP. No queda claro cuál es el o los tipos de muerte inducidos por TIRAP ni su mecanismo.
Hasta la fecha no se cuenta con un modelo claro del mecanismo de inducción de muerte
producido por diferentes CPPs, sin embargo su determinación no es objetivo de ésta tesis.
33
Figura 15: Gráficos de puntos granularidad vs intensidad de fluorescencia representativo (n = 2). Células HeLa fueron
incubadas con TIRAP (A) 10 µM, (B) 20 µM, (C) 40 µM, (D) 60 µM, (E) 80 µM y (F) 100 µM, durante 16 horas.
Estimulación con TIRAPALA
: Porcentaje de células marcadas con IP
La viabilidad de células HeLa incubadas con TIRAPALA
por 16 horas no se ve
mayormente afectada. Se observa claramente en la Figura 16 que no hay aumento de la
fluorescencia, con respecto al control (Figura 12C) producto de la incubación con el péptido.
Las diferencias en los datos obtenidos se atribuyen principalmente a eventos aleatorios
producidos por el error asociado a la técnica de extracción y medición. Un análisis estadístico8 de
los datos obtenidos, señalan que no existen diferencias significativas (p > 0,05) entre los datos
obtenidos de la incubación con TIRAPALA
y los controles. Esto demuestra que no hay inducción
de muerte producto de la incubación con TIRAPALA
, sugiriendo además que éste péptido no
ingresa a la célula. Este último comentario discutirá más adelante.
8 Análisis t-Student, no paramétrico, 1 y 2 colas.
34
Figura 16: Gráficos de puntos de granularidad vs intensidad de fluorescencia representativo (n = 2). Células HeLa fueron
incubadas con TIRAPALA (A) 10 µM, (B) 20 µM, (C) 40 µM, (D) 60 µM, (E) 80 µM y (F) 100 µM de, por 16 horas.
Curvas de Porcentaje de Viabilidad en Función de la Concentración de Incubación.
Para poder entender todos los datos reportados anteriormente, se construyeron curvas de
porcentaje de viabilidad en función de la concentración de incubación de Estaurosporina, TIRAP
y TIRAPALA
. En la Figura 17 se muestran dos gráficos de los datos obtenidos. Los puntos
graficados corresponden al promedio de los datos obtenidos para (A) 4 y (B) 2 experimentos
independientes, y las barras muestran el error estándar.
Los datos obtenidos de los ensayos de viabilidad en células HeLa incubadas con
concentraciones crecientes de péptidos, muestran que TIRAP efectivamente induce muerte
celular, reduciendo la viabilidad en un 23,5%9 con respecto a la condición basal, mientras que la
incubación con Estaurosporina redujo la viabilidad en un 12,71%10
con respecto al control.
9 Cálculo realizado comparando los datos de viabilidad para 40, 60, 80 y 100 µM de TIRAP con las muestras control.
10 Cálculo realizado comparando los datos de viabilidad para 1,0 y 2,0 µM de Estaurosporina con las muestras
control.
35
(A) HeLa (16 Hrs)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.570
75
80
85
90
95
n = 4
Estaurosporina
Concentración [M]
% V
iab
ilid
ad
(B) HeLa (16 Hrs)
0 50 100 15050
60
70
80
90
100
n = 2
TIRAPALA
TIRAP
* * * *
Concentración [uM]
% V
iab
ilid
ad
Figura 17: Curvas de viabilidad celular en función de la concentración de (A) Estaurosporina, (B) TIRAP y TIRAPALA.
Los puntos graficados son los valores promedio de (A) 4, y (B) 2 experimentos independientes. Células HeLa fueron
estimuladas por 16 horas, para luego medir viabilidad por tinción con IP por citometría de flujo. Las barras representan
el error estándar. (B) Los asteriscos muestran los datos que presentan diferencias significativas con respecto a los
controles blanco.
En la Figura 17B, los datos marcados con asterisco son aquellos que mostraron
diferencias significativas con respecto a los controles blanco, según un análisis t-Student no
paramétrico de 1 y 2 colas. En la Tabla 13 se muestran los valores de p (p ≤ 0,05 para que sea
significativo).
Tabla 13: Valores de p del análisis t-Student, no paramétrico, 1 y 2 colas. Se muestran solo los valores con p ≤ 0,05; así
como el porcentaje de viabilidad promedio de dos experimentos independientes, correspondiente a cada dosis de
incubación.
Concentración TIRAP T(1 cola, no paramétrico) T(2 colas, no paramétrico) % Viabilidad
40 µM 0,0008 0,0016 68,00 %
60 µM 0,0133 0,0266 66,30 %
80 µM 0,0086 0,0172 69,85 %
100 µM 0,0056 0,0112 64,95 %
En base a los datos encontrados, se tiene que el promedio de viabilidad basal es de
87,91%, por lo que el límite de viabilidad impuesto es de 77,91% (cercano al 80%). Para
concentraciones mayores o iguales a 40 µM este límite es superado (la viabilidad disminuye más
de un 10% con respecto a la viabilidad basal). Es importante tener este resultado en consideración
para posibles futuras aplicaciones terapéuticas, por lo que no se recomienda usar concentraciones
mayores a 40 µM debido al daño celular que se puede generar.
36
5.7. Ensayo de Internalización de TIRAP y TIRAPALA
.
Controles Blanco: Células HeLa sin (ST) y con tratamiento (CT) de Permeabilización-Fijación.
Poblaciones Control.
En la Figura 19, se muestra la selección de la población, excluyendo de esta forma restos
celulares que puedan interferir en la fluorescencia. Debido a que la morfología de las células
cambia levemente con el tratamiento de permeabilización-fijación (Figura 18), en los gráficos de
granularidad (SSC-H) versus tamaño (FSC-H) se seleccionaron las regiones para cada población,
R1 para las células control sin tratamiento de fijación-permeabilización (Figura 19A), y R0 para
la población control con tratamiento de fijación-permeabilización (Figura 19C).
Figura 18: Histogramas de (A) Granularidad y (B) Tamaño de células HeLa sin estímulos (poblaciones control), tratadas
con (rojo) y sin (azul) permeabilización-fijación. Se observa un ligero aumento del tamaño y disminución de la
granularidad de la población, cuando las células son tratadas con Permeabilización-Fijación.
Luego, los datos de la Figura 19A y 19C se grafican en granularidad versus fluorescencia
(FL2-H) para determinar el umbral de autofluorescencia correspondiente a cada tratamiento
empleado (Figuras 19B y 19D respectivamente).
Figura 19: Poblaciones Control para selección de la región de análisis: R1 para blancos (A) sin tratamiento y R0 para
blancos (C) con tratamiento de permeabilización-fijación. Así mismo se definió el umbral de autofluorescencia para las
regiones seleccionadas para las células (B) sin tratamiento y (D) con tratamiento.
37
Blancos Sin Tratamiento.
Los resultados presentados en la Figura 20, corresponden a células HeLa control
incubadas por 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad, con concentraciones crecientes
de Estreptavidina-R-PE. Se puede observar que existe un leve incremento en la fluorescencia de
las células a medida que aumenta la concentración de incubación con Estreptavidina-R-PE. Como
se muestra en la Figura 20, el porcentaje de células marcadas con el fluoróforo aumenta desde
1,5% a 4,41% cuando la concentración de incubación aumenta 50 veces.
Se ha reportado que Estreptavidina posee el triplete Arg-Tyr-Asp (RYD) que
aparentemente imita al triplete Arg-Gly-Asp (RGD), secuencia de unión a fibronectina, un
componente de la matriz extracelular que específicamente promueve la adhesión celular [60].
Esta secuencia de reconocimiento universal se une a integrinas y otras moléculas relacionadas
con la superficie celular [61-62], por lo que problemas asociados a ruido en la medición de los
datos puede atribuírsele a este triplete. Es por esto, que la caracterización y cuantificación de la
inespecificidad de Estreptavidina, por componentes de la matriz extracelular, fue muy importante
para los análisis posteriores de los datos de Intensidad de Fluorescencia Media (IFM) obtenidos
para los ensayos de internalización de TIRAP y TIRAPALA
, en donde esta interacción se modela
como inespecificidad proporcional a la concentración de incubación.
Figura 20: Control blanco sin tratamiento (ST). Células HeLa fueron incubadas por 10 minutos a temperatura ambiente
en oscuridad, con (A) 2, (B) 10, (C) 20 y (D) 100 µg/ml de Estreptavidina-R-PE.
Blancos Con Tratamiento.
Las imágenes mostradas en la Figura 21, muestran un desplazamiento completo de la
población, aumentando su florescencia en la medida que aumenta la concentración de
Estreptavidina-R-Pe. Esto se debe a que la Estreptavidina se une específicamente tanto a la
biotina endógena, como a los componentes biotinilados de las células HeLa.
38
Figura 21: Control blanco con tratamiento (CT) de permeabilización-fijación. Células HeLa fueron incubadas por 10
minutos a temperatura ambiente en oscuridad con (A) 2, (B) 10, (C) 20 y (D) 100 µg/ml de Estreptavidina-R-PE.
Lo anterior concuerda con lo reportado por Rodriguez Melendez (2000), en donde se
indica que en humanos, la biotina está involucrada en importantes rutas metabólicas tales como
glucogénesis, síntesis de ácidos grasos, y catabolismo de aminoácidos, actuando como un grupo
prostético para la piruvato carboxilasa, propionil-CoA carboxilasa, beta-metilcrotinil-CoA
carboxilasa y acetil-CoA carboxilasa [63]. Además, se ha reportado que conjugados de
Estreptavidina y anticuerpos Anti-biotina se unen a la mitocondria de algunos tipos celulares
[64]. Es por esto, que la cuantificación de la biotina endógena en células HeLa, por medio de la
Intensidad de Fluorescencia Media (IFM) obtenida de los datos experimentales, fue fundamental
para analizar los datos de internalización de TIRAP y TIRAPALA
.
Internalización de TIRAP: Sin Tratamiento.
Luego de que células HeLa fuesen incubadas por 2 horas con 40 µM de TIRAP, el
resultado de la incubación con diferentes concentraciones de Estreptavidina-R-PE para la
detección de péptido asociado a la membrana plasmática, se muestra en la Figura 22.
Nuevamente se aprecia un notable incremento en la fluorescencia como consecuencia del
aumento de la concentración de incubación con Estreptavidina-R-PE. Gracias a que las células no
fueron tratadas con permeabilización-fijación, la fluorescencia medida se interpreta como la
unión inespecífica de Estreptavidina a componentes de la matriz extracelular, más la unión
específica de Estreptavidina a biotina ligada covalentemente a TIRAP.
Cabe destacar que la población no se desplaza completamente, consecuente con lo
presentado para células sin incubación con péptido (Figura 20), por lo que la interpretación de los
datos es válida.
39
Figura 22: Células HeLa incubadas por 2 horas con 40 µM de TIRAP, fueron luego incubadas por 10 minutos a
temperatura ambiente en oscuridad con (A) 2, (B) 10, (C) 20 y (D) 100 µg/ml de Estreptavidina-R-PE.
Internalización de TIRAP: Con Tratamiento.
Los resultados de las mediciones de fluorescencia obtenidos para células HeLa incubadas
por 2 horas con 40 µM de TIRAP (Figura 23), muestran un desplazamiento completo de la
población a medida que aumenta la concentración de incubación con Estreptavidina-R-PE, con
respecto al respectivo control (Figura 19D), producto de la detección de la internalización de
TIRAP.
Figura 23: Células HeLa incubadas por 2 horas con 40 µM de TIRAP, fueron permeabilizadas y fijadas, para luego ser
incubadas por 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad con (A) 2, (B) 10, (C) 20 y (D) 100 µg/ml de
Estreptavidina-R-PE.
En los gráficos de la Figura 23, especialmente en la Figura 23D, se observa un conjunto
de eventos de intensidad de fluorescencia heterogénea, abarcando un amplio rango fluorescencia
(entre 101 y 10
4 u.a.). Esto concuerda con la heterogeneidad en la internalización de los péptidos
catiónicos Antp, TAT y R9 ligados a un fluoróforo, observado a través de microscopía confocal
[13].
Los datos de fluorescencia medidos por citometría de flujo, son interpretados como la
suma de la unión específica de Estreptavidina a biotina endógena, la unión específica a biotina
40
ligada covalentemente a TIRAP internalizado, la unión inespecífica a componentes
extracelulares, y la unión específica a TIRAP biotinilado en la superficie de la membrana (Figura
24).
Figura 24: Unión de la Estreptavidina-R-PE a diferentes componentes en la célula, después del tratamiento con
Permeabilización-Fijación. La Intensidad de fluorescencia medida (estrella roja) corresponde a la unión de Estreptavidina
a (A) componentes biotinilados y biotina endógena, (B) TIRAP biotinilado internalizado, (C) componentes de la matriz
extracelular y (D) TIRAP asociado a componentes de la membrana plasmática.
Internalización de TIRAPALA
: Sin Tratamiento.
Al observar los datos de porcentaje de células con fluorescencia superior al umbral
(Figura 25), estos presentan solo un leve aumento en la fluorescencia en comparación con los
datos de los controles blanco (Figura 20). El dato para células HeLa incubadas con 40 µM de
TIRAPALA
y luego teñidas con 100 µg/ml de Estreptavidina-R-PE (Figura 25D) es casi 1,4
puntos porcentuales superior al correspondiente control (Figura 20D).
41
Figura 25: Células HeLa incubadas por 2 horas con 40 µM de TIRAPALA, fueron luego incubadas por 10 minutos a
temperatura ambiente en oscuridad con (A) 2, (B) 10, (C) 20 y (D) 100 µg/ml de Estreptavidina-R-PE.
Este resultado sugiere que existe baja asociación de TIRAPALA
a la membrana plasmática,
en comparación a los datos obtenidos para TIRAP (Figura 22), en donde el porcentaje de células
fluorescentes alcanza el 18,6%, para la misma concentración de Estreptavidina-R-PE.
Internalización de TIRAPALA
: Con Tratamiento.
En la Figura 26 se encuentras los gráficos de puntos obtenidos de las mediciones por
citometría de flujo de células HeLa incubadas por 2 horas con 40 µM de TIRAPALA
, y luego
tratadas con fijación-permeabilización.
Para todas las concentraciones de Estreptavidina-R-PE empleadas, no se observan
mayores diferencias en la población de células, con respecto a los controles blancos con el mismo
tratamiento (Figura 21). No fue posible realizar un análisis estadístico, de tipo ANOVA, para
determinar si existen o no diferencias significativas entre los dos grupos de datos, ya que por falta
de tiempo no se pudieron hacer repeticiones. Como se verá más adelante, se discutirá una
interpretación para estos datos.
Figura 26: Células HeLa incubadas por 2 horas con 40 µM de TIRAPALA, fueron permeabilizadas y fijadas, para luego ser
incubadas por 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad con (A) 2, (B) 10, (C) 20 y (D) 100 µg/ml de
Estreptavidina-R-PE.
42
Análisis de Datos de Intensidad de Fluorescencia Media (IFM): Modelo de Unión Específica y
No Específica.
Para poder analizar los datos de IFM obtenidos anteriormente, tanto para los controles
blanco como para las muestras de células HeLa incubadas con 40 µM de TIRAP y TIRAPALA
, se
utilizó el Modelo de Unión Específica y No Específica (o MUENE) [65] descrito en la Ecuación
1, la cual es matemáticamente equivalente a la ecuación de Michaelis-Menten para la velocidad
de una reacción catalizada por una enzima [66]. Esta ecuación ha sido adaptada para interpretar
los datos de intensidad de fluorescencia. Se utiliza la hipótesis de que la IFM medida por
citometría de flujo, es directamente proporcional a la cantidad de Estreptavidina unida.
Se asume que los datos obtenidos, son el resultado de la unión específica e inespecífica de
la Estreptavidina a la biotina y componentes de la matriz extracelular, respectivamente.
En las ecuaciones, y representa IFM medida en unidades arbitrarias [u.a.] como función
de la concentración de incubación con Estreptavidina-R-PE x en unidades de [µg/ml]. Kd
representa la concentración de ligando a la cual se alcanza la mitad de la fluorescencia máxima
βmax, este valor representa la afinidad de Estreptavidina por su ligando específico biotina.
Cuando la concentración de incubación es muy alta (x → ∞), la IFM llega al límite βmax. Los
valores de Background y NS se interpretan como la fluorescencia basal (autofluorescencia de las
células) y constante de inespecificidad de unión respectivamente.
Ecuación 1: Modelo de saturación usado para analizar los datos de Intensidad de Fluorescencia Media (IFM) para los
datos obtenidos tanto para los controles blanco, como para los datos de incubación con TIRAP y TIRAPALA
Se procedió a realizar el ajuste de parámetros a la curva del Modelo de Unión Específica y
No Específica (MUENE) para todos los datos obtenidos experimentalmente. Los cálculos fueron
realizados utilizando el software GraphPad Prism [67], el cual obtiene los valores de los
parámetros asociados con la mejor curva de ajuste por regresión no lineal, utilizando el método
de mínimos cuadrados [68-71].
43
En la Tabla 14 se muestran los valores de los parámetros del MUENE ajustados por
regresión no lineal, para los datos de IFM obtenidos experimentalmente. Se presentan los valores
de los parámetros que mejor se ajustan al modelo, error estándar asociado a cada parámetro,
intervalo de confianza del 95% y los parámetros de la indican la calidad del ajuste. La última
sección de la tabla indica que los parámetros de unión total y no específica son compartidos, es
decir, ambos grupos de datos se ajustan al modelo.
Tabla 14: Resultados del ajuste de parámetros del modelo de Unión Específica y No Específica, para los datos de IFM
obtenidos experimentalmente. (CT) Con tratamiento y (ST) sin tratamiento de Fijación-Permeabilización
Unión Total: Específica y No Específica
Unión No
Específica
Blanco (CT) TIRAP (CT) TIRAP
ALA (CT) TIRAP (ST) TIRAP
ALA (ST) Blanco (ST)
Valores de Mejor Ajuste
βmax 35,940 221,600 29,980 60,440 1,070 (no usado)
Kd 29,870 28,280 34,070 21,390 29,390 (no usado)
NS 0,031 0,048 0,029 0,031 0,028 0,033
Background 5,312 3,301 5,350 4,752 5,365 4,816
Error Estándar
βmax 4,363 17,210 3,919 7,739 1,613 (no usado)
Kd 8,423 5,158 10,070 6,834 103,200 (no usado)
NS 0,016 0,067 0,014 0,035 0,006 0,028
Background 0,660 2,699 0,541 1,424 0,247 1,114
Intervalo de Confianza 95%
βmax 25,260 a
46,610
179,500 a
263,700 20,390 a 39,570
41,500 a
79,370 -2,877 a 5,018 (no usado)
Kd 9,264 a
50,480
15,650 a
40,900 9,417 a 58,720
4,667 a
38,110
-223,200 a
282,000 (no usado)
NS -0,010 a
0,071
-0,117 a
0,212 -0,004 a 0,063
-0,055 a
0,117 0,013 a 0,043 -0,117 a 0,212
Background 3,697 a
6,928
-3,304 a
9,907 4,025 a 6,674 1,268 a 8,236 4,761 a 5,968 -3,304 a 9,907
Calidad del Ajuste
Grados de Libertad 6 6 6 6 6 6
R² 0,981 0,991 0,981 0,972 0,880 0,844
Suma de Cuadrados 12,050 194,700 8,012 55,200 1,225 0,965
Restricciones
NS compartido compartido compartido compartido compartido compartido
Background compartido compartido compartido compartido compartido compartido
Puntos Analizados 5 5 5 5 5 5
Se puede comprobar que los valores de Kd encontrados, el cual representa la especificidad
de unión de la Estreptavidina a la biotina, se encuentran dentro del mismo rango para los 5
cálculos realizados. Así también, los valores de NS y Background comparten el mismo rango
44
entre las diferentes mediciones, indicando concordancia entre los datos medidos. En la Tabla 15
se muestran los valores promedio, desviación estándar y error estándar para los parámetros de Kd,
NS y Background.
Tabla 15: Valores Promedio de los parámetros de especificidad e inespecificidad del Modelo de Unión Específica y No
Específica.
Parámetro Promedio Desviación Estándar Error Estándar
Kd 28,600 4,105 0,906
NS 0,033 0,007 0,038
Background 4,816 0,791 0,398
Los datos anteriormente expuestos, corresponden a solo un experimento realizado. Por
falta de tiempo y recursos no fue posible repetir el ensayo, sin embargo se encuentra
concordancia experimental con los datos reportados en la literatura para ensayos de
internalización en células HeLa incubadas con 40 µM de TIRAP y TIRAPALA
, en donde la
cantidad de fluorescencia asociada a la internalización de TIRAP supera casi 3 veces la
presentada por TIRAPALA
[9], por lo que se espera encontrar la misma tendencia al realizar
futuros experimentos independientes.
En las Figuras 27 y 28 se grafican los datos experimentales de IFM, de unión total y unión
no específica. Adicionalmente, se grafican las curvas de mejor ajuste al modelo.
Unión Total Blancos (+ Inesp)
0 50 100 1500
10
20
30
40Blanco (CT)
Blanco (ST)
Concentración Streptavidine-R-PE [g/ml]
IFM
Figura 27: Gráfico IFM vs Concentración Estreptavidina-R-PE, en donde se grafica la curva de Unión Total Medida de
los valores blanco con tratamiento (CT), en conjunto con los datos de Unión Inespecífica con los valores de los blancos no
tratados (ST).
45
En la Figura 27 se presentan los datos experimentales de IFM para los blancos con
tratamiento de fijación-permeabilización (CT) (o datos de unión total), en conjunto con los datos
experimentales de IFM para los blancos sin tratamiento (ST) (o datos de unión inespecífica).
Utilizando los datos anteriormente mencionados, se pudo cuantificar (en fluorescencia) la biotina
endógena de las células HeLa, con el objetivo de analizar de forma independiente la fluorescencia
correspondiente a péptido internalizado y no internalizado.
(A) Unión Total TIRAP (CT) (+ Inesp)
0 50 100 1500
50
100
150
200TIRAP (CT)
Blanco (ST)
Concentración Streptavidine-R-PE [ g/ml]
IFM
(B) Unión Total TIRAPALA
(CT) (+ Inesp)
0 50 100 1500
10
20
30
40TIRAPALA (CT)Blanco (ST)
Concentración Streptavidine-R-PE [g/ml]
IFM
(C) Unión Total TIRAP (ST) (+ Inesp)
0 50 100 1500
20
40
60
80TIRAP (ST)
Blanco (ST)
Concentración Streptavidine-R-PE [ g/ml]
IFM
(D) Unión Total TIRAPALA
(+ Inesp)
0 50 100 1500
2
4
6
8
10TIRAPALA (ST)Blanco (ST)
Concentración Streptavidine-R-PE [ g/ml]
IFM
Figura 28: Gráficos de datos experimentales de IFM. Se presentan además las curvas de mejor ajuste al Modelo de Unión
Específica y No Específica. IFM de células HeLa incubadas por 2 horas con 40 µM de (A, C) TIRAP, (B, D) TIRAPALA.
Los péptidos biotinilados fueron detectados con Estreptavidina-R-PE y posteriormente medición por citometría de flujo.
Se diferencian células con tratamiento (CT) y sin tratamiento (ST) de fijación-permeabilización.
En la Figura 28, se muestran las curvas del modelo de MUENE que mejor se ajustan a los
datos de IFM medidos en células HeLa incubadas con 40 µM de TIRAP (azul) y TIRAPALA
(verde), además de los datos medidos del control blanco sin péptidos (negro), el cual no fue
tratado con fijación-permeabilización (Blanco (ST)), de tal modo que se interpreta como la unión
46
inespecífica de Estreptavidina a componentes de la matriz extracelular. Las muestras con
tratamiento (CT) presentan mayor intensidad media de fluorescencia que aquellas que no fueron
tratadas (ST), indicando no solo la efectividad de la técnica de fijación-permeabilización, sino
que también el aumento de la fluorescencia producto de la internalización de los péptidos.
Se propone entonces que los datos de IFM medidos experimentalmente se pueden
expresar como la suma de IFM aportada por diferentes componentes (Ecuación 2), en donde cada
uno de estos aportes individuales es una función de Unión Específica descrita por la Ecuación
1A, más la Unión Inespecífica (Ecuación 1B) la cual es representada por las mediciones del
control blanco sin tratamiento (Ecuación 2A).
Ecuación 2: Modelo de Medición Total de Fluorescencia. Se describen las ecuaciones para cada situación de incubación
(blanco/pept.) y post-tratamiento (CT/ST). IFM corresponde a Intensidad de Fluorescencia Medida detectada.
Una vez calculados los valores parámetros de la unión inespecífica (Background y NS), se
pueden suprimir, para trabajar solo con los valores de βmax (o IFMmax) cuando x → ∞. La
simplificación de la Ecuación 2 con los supuestos anteriores se presenta en la Ecuación 3.
Ecuación 3: Ecuaciones del Modelo de Medición Total de Fluorescencia simplificadas para cuando la recta de
inespecificidad esta descrita, y concentraciones de ligando muy altas (x → ∞).
Con los valores calculados mostrados en la Tabla 14, y las ecuaciones desplegadas en
Ecuación 3, se obtienen los resultados mostrados en la Tabla 16. Para el valor de IFMmax
correspondiente a TIRAPALA
internalizado, se obtiene un valor negativo dado que los valores
IFM para cada concentración de Estreptavidina-R-PE en las muestras con tratamiento (Figura
47
28B) son levemente menores que los obtenidos para los valores de IFM en las muestras blanco
con tratamiento (Figura 27). Estas diferencias son atribuibles principalmente al error asociado a
la técnica utilizada y no a diferencias significativas. El este resultado se interpreta como que no
existe internalización de TIRAPALA
, por lo que se le asigna el valor 0.
Tabla 16: Valores calculados para los componentes individuales que aportan fluorescencia por unión a Estreptavidina-R-
PE. Los valores de la tabla fueron obtenidos usando los resultados de los cálculos mostrados en el Gráfico 7, en conjunto
con la Ecuación 3.
Componente [u.a.]
35,94
60,44
125,22
1,07
-7,03
0
En la Figura 29, se comparan las fluorescencias máximas asociadas a cada componente
descrito en la Ecuación 3 utilizando los valores de la Tabla 9. Se puede apreciar que TIRAP
internaliza fuertemente en células HeLa al cabo de 2 horas de incubación, en contraste con
TIRAPALA
que sencillamente no fue capaz de atravesar la membrana plasmática. Adicionalmente,
la diferencia encontrada en la fluorescencia asociada a péptido ligado a la membrana plasmática
entre TIRAP y TIRAPALA
es notable, siendo la de TIRAP casi 60 veces superior a la encontrada
en TIRAPALA
y caso la mitad con respecto a la fluorescencia de TIRAP internalizado.
HeLa (40 µM, 2 Hrs)
Internalizado Ligado a Membrana0.1
1
10
100
1000TIRAP
TIRAPALA
Localización
IFM
max
Figura 29: Intensidad de Fluorescencia Media máxima calculada diferenciando su localización, ya sea por péptido
internalizado o péptido asociado a la membrana plasmática. Los datos se presentan es escala logarítmica.
48
Se evidencia por primera vez experimentalmente, una fuerte asociación de TIRAP a la
membrana plasmática, lo que sugiere un mecanismo dependiente de la diferencia de potencial
inducida en la superficie de la membrana celular, la cual sería dependiente de la concentración [9,
13] y campo de potencial electrostático de la superficie del péptido, en donde existe interacción
con moléculas de la membrana celular, tales como las cabezas de los fosfolípidos de la membrana
plasmática y proteoglicanos [23, 36], concordante con la literatura publicada para otros CPPs. Es
posible relacionar este resultado con la formación de zonas de nucleación, característica principal
del mecanismo de transducción en estudio.
En la Figura 30 se muestra un diagrama del mecanismo de internalización propuesto. Las
fuertes interacciones del péptido de penetración celular TIRAP, con proteoglicanos y moléculas
de la superficie de la membrana plasmática a altas concentraciones, produce una acumulación
local de TIRAP, induciendo una diferencia de potencial en la superficie de la membrana. La
reorganización de la red de actina del citoesqueleto conduce finalmente a un cambio en la fluidez
de la membrana, para dar lugar a la internalización del péptido TIRAP. Debido a que TIRAPALA
interactúa en menor medida con moléculas de la superficie (producto del bajo potencial
electrostático positivo), no se genera una diferencia de potencial sobre la membrana, impidiendo
de esta forma la internalización del péptido.
Figura 30: Esquema del mecanismo de internalización propuesto. (A) Las interacciones de TIRAP con proteoglicanos y
moléculas de la membrana plasmática a altas concentraciones, produce una acumulación local de TIRAP, generando una
diferencia de potencial en la superficie de la membrana, seguido de la reorganización de la red de actina del citoesqueleto,
conduciendo finalmente a un cambio en la fluidez de la membrana y posterior internalización de TIRAP. (B) Debido a que
TIRAPALA interactúa en menor manera con moléculas de la superficie (producto de su bajo potencial electrostático
positivo), no es capaz de generan una diferencia de potencial sobre la membrana, impidiendo de esta forma la
internalización del péptido.
49
En base a los resultados obtenidos en este trabajo, se propone que para que la
internalización se produzca, es indispensable la inducción de la diferencia de potencial producto
del campo de potencial electrostático de los CPPs, puesto que esta fuerte asociación a la
membrana sería la primera etapa de la internalización.
50
6. CONCLUSIONES
El objetivo fundamental de este trabajo de investigación, fue determinar las características
estructurales de los de péptidos de penetración celular (o CPPs) que son requisito para la
internalización de éstos en la célula, y usar ésta información para desarrollar las bases de un
modelo que explique uno de los mecanismos de ingreso a la célula utilizado por los CPPs
estudiados.
La importancia de los grupos de aminoácidos catiónicos en la secuencia del péptido ya
había sido reportada, por lo que se estudió el efecto de estos aminoácidos sobre la estructura
terciaria del péptido. Por medio de técnicas de modelación molecular (modelamiento por
comparación en adición a sucesivos procesos de refinamiento y validación), se obtuvieron los
modelos tridimensionales de los péptidos TAT, TIRAP y TIRAPALA
. Se observan similitudes
tridimensionales importantes entre los modelos, predominando fuertemente la estructura terciaria
tipo α-hélice con un porcentaje superior al 69% en las tres estructuras. Esta característica le da
una forma alargada y cónica a los péptidos, permitiendo que los residuos catiónicos estén
expuestos al solvente y por ende puedan interactuar con las moléculas de la superficie de la
membrana celular. Cuando los residuos de arginina y lisina del péptido TIRAP son reemplazados
por alanina para formar TIRAPALA
, la conformación espacial varía aumentando levemente el
porcentaje de α-hélice en el modelo. Aunque la sustitución de los residuos no afecta mayormente
la estructura central del péptido, la taza de internalización es reducida notablemente [9]. Esto
sugiere que la conformación α-hélice no es requisito suficiente para lograr la internalización de
los péptidos, sino que es más importante la carga superficial, siendo ésta una de las características
esenciales que le otorgan la habilidad de internalización.
En la estructura de TIRAP, se observan dos subgrupos de residuos de arginina y lisina que
están orientados en diferentes direcciones; los residuos 2, 13 y 16 se encuentran en oposición a
los residuos 14 y 18, el residuo de arginina en la posición 17 se encuentra en una dirección
intermedia a las anteriores. Esta característica sugiere que no todos los residuos catiónicos
interactúan simultáneamente con las moléculas de la superficie celular, por lo que sólo un
subgrupo de ellos participa directamente en la primera etapa del mecanismo de internalización
(interacción con las moléculas de la superficie). Además, la orientación de los residuos está
51
determinada por el número de aminoácidos consecutivos no catiónicos entre cada residuo de
arginina y/o lisina, lo que sugiere que el espaciamiento entre los residuos catiónicos puede influir
en la eficiencia de la internalización.
La diferencia más importante entre los péptidos estudiados, se detecta al calcular el campo
de potencial electrostático sobre la superficie. En TAT y TIRAP, el campo positivo presenta un
área superficial mucho mayor que el negativo cuando se comparan las isosuperficies de módulo
1; sin embargo, el campo electrostático se balancea al sustituir arginina y lisina por alanina,
estableciéndose un dipolo sobre la superficie de TIRAPALA
. Este resultado lleva a concluir que la
habilidad de internalización de los péptidos catiónicos depende, entre otras variables, de la
diferencia de potencial inducida por los péptidos sobre la superficie de la célula. Esta observación
se comprueba experimentalmente en los ensayos de internalización realizados en células HeLa.
Se encuentra evidencia experimental de la importancia del campo electrostático sobre la
superficie del péptido, para lograr una fuerte asociación a la membrana plasmática. Esto sugiere
un mecanismo dependiente de la diferencia de potencial inducida en la superficie de la
membrana, en el cual la concentración de péptido en el medio y el campo de potencial
electrostático sobre la superficie del péptido juegan un papel importante. Esta asociación sería
una etapa importante en el mecanismo de transducción. Además, la fuerte interacción de los
péptidos con moléculas de la membrana plasmática (tales como cabezas de fosfolípidos y
proteoglicanos), podría ser el resultado de la azarosa formación de zonas de nucleación sobre la
superficie celular, el cual es requisito para el rápido ingreso de los péptidos por medio del
mecanismo de transducción.
Estudios toxicológicos en células incubadas con diferentes concentraciones de quimeras
de arginina, indican que altas concentraciones provocan muerte celular no deseada producto de la
internalización. Con el fin de determinar los efectos tóxicos de TIRAP, se realizó un estudio de la
viabilidad de células HeLa como función de la concentración de incubación, el cual varió en el
rango 0 – 100 µM. Se detectó una clara inducción de muerte producto de la internalización de los
péptidos. Para concentraciones mayores a 40 µM, la viabilidad de células HeLa disminuyó más
de un 10% en comparación a la sobrevida basal de referencia, por lo que en futuras aplicaciones
terapéuticas, debe trabajarse a concentraciones menores o iguales a este límite.
52
7. REFERENCIAS
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60
8. ANEXOS
A. Protocolo del Ensayo de Viabilidad de Células HeLa Incubadas con Concentraciones
Crecientes de Péptidos, con Yoduro de Propidio (IP) por Citometría de Flujo.
Materiales.
1. Solución EDTA-PBS 25 mM.
2. Stock de Yoduro de Propidio (IP).
3. Solución Buffer FACS.
4. Tubos Falcon.
5. Tubos para citometría.
Métodos.
1. En una placa de 48 pocillos se siembran 17 pocillos con 100.000 células cada uno y se
afora hasta 1 ml de medio de cultivo. Se deja reposar 4 horas a 37⁰C para que se adhieran
las células al fondo de la placa.
2. Se extrae el medio de cultivo y se lava 1 vez con PBS para retirar las células muertes o no
adheridas.
3. Se agrega medio de cultivo fresco que contenga las siguientes condiciones:
#1
Blanco 1 ml de medio
#2
Control IP 1 ml de medio
#3
Staurosp. 0,5 µM 500 µl de 1 µM + 500
µl de medio
#4
Staurosp. 1 µM 1 µl de 1 mM + 999 µl
de medio
#5
Staurosp. 2 µM 2 µl de 1 mM + 998 µl
de medio
#6
TIRAP 10 µM
25 µl de 1 mM + 225 µl de medio
#7
TIRAP 20 µM
20 µl de 1 mM + 230 µl de medio
#8
TIRAP 40 µM
15 µl de 1 mM + 235 µl de medio
#9
TIRAP 60 µM
10 µl de 1 mM + 240 µl de medio
#10
TIRAP 80 µM
5 µl de 1 mM + 245 µl de medio
#11
TIRAP 100 µM
2,5 µl de 1 mM + 247,5 µl de medio
#12
TIRAPALA 10 µM
25 µl de 1 mM + 225
µl de medio
#13
TIRAPALA 20 µM
20 µl de 1 mM + 230
µl de medio
#14
TIRAPALA 40 µM
15 µl de 1 mM + 235
µl de medio
#15
TIRAPALA 60 µM
10 µl de 1 mM + 240
µl de medio
#16
TIRAPALA 80 µM
5 µl de 1 mM + 245 µl
de medio
#17
TIRAPALA 100 µM
2,5 µl de 1 mM +
247,5 µl de medio
4. Se deja incubando por 16 horas a 37⁰C, 5% CO2.
5. Se extrae el medio celular de las placas y se guarda en tubos falcon rotulados, en hielo.
6. Se agregan 250 µl de EDTA-PBS a cada pocillo.
7. Se incuba en la estufa de la sala de cultivo a 37 ⁰C por 5 min.
61
8. Se sueltan las células adheridas restantes con un suave pipeteo. Se ponen las células ya
sueltas en los tubos falcon correspondiente a su medio de cultivo, previamente rotulados.
9. Centrifugar a 1200 rpm por 5 min a 4⁰C.
10. Se elimina el sobrenadante y solo se deja el pellet.
11. Se resuspende el pellet en 200 µl de Buffer FACS 1%.
12. Se mantienen las muestras en hielo hasta que se realice la tinción con IP.
13. Se agrega 1 µl de IP a cada muestra, se homogeniza suavemente y traspasan las células a
tubos de citometría. Se mantienen los tubos en hielo.
14. Se miden las muestras en el citómetro.
Nota: Se pasaron primero las muestras sin IP y luego las muestra con IP, ya que el citómetro
puede contaminarse, alterando así las mediciones de las muestras siguientes sin IP.
B. Protocolo de Internalización de TIRAP o TIRAPALA
en Células HeLa.
Métodos.
1. En una placa de 48 pocillos, se sembraron 13 pocillos con 100.000 células por pocillo en
una placa de 48 pocillos. Se dejaron a 37⁰C, 5% CO2 por 2 horas para que se completara
la adherencia de las células.
2. Se retiró el medio de cultivo y se lavó con PBS.
3. Posteriormente 5 pocillos se dejaron con 100 µl de medio de cultivo (sin tratamiento), 4
pocillos con 100 µl de medio conteniendo 40 µM de TIRAP y 4 pocillos con 100 µl de
medio conteniendo 40 µM de TIRAPALA
.
4. Se dejó incubando por 2 horas a 37⁰C, 5% CO2.
5. Se retira el medio de cultivo y se guarda en tubos eppendorff previamente rotulados.
6. Se agregan 500 µl de EDTA 25 mM para cosechar las células. Se deja a la estufa por 5-10
min.
7. Se sueltan las células con un suave pipeteo y se colocan en los tubos rotulados
correspondiente a su medio de cultivo previamente retirado.
8. Se centrifugan las muestras a 1200 rpm por 5 min, 4⁰C.
9. Se resuspenden las células en 100 µl de PBS y se distribuyen en una placa de 96 pocillos
según el siguiente diagrama. Los 5 pocillos sin tratamientos se distribuyen en volúmenes
iguales para las 10 muestras de autofluorescencia y blancos, los 4 pocillos con TIRAP se
62
distribuyen en las 8 muestras de TIRAP y los 4 pocillos con TIRAPALA
se distribuyen en
los 8 muestras de TIRAPALA
.
Autofluorescencia Sin Permeabilizar/Fijar
Con Permeabilizar/Fijar
Dilución Streptavidina-R-PE
1/10 1/50 1/100 1/500
0 µM Blancos
Sin Permeabilizar/Fijar
Con Permeabilizar/Fijar
1/10 1/50 1/100 1/500
TIRAP Sin Permeabilizar/Fijar
40 µM Con Permeabilizar/Fijar
1/10 1/50 1/100 1/500
TIRAPALA
Sin Permeabilizar/Fijar
40 µM Con Permeabilizar/Fijar
10. Se centrifuga la placa a 2000 rpm 2 min, 4⁰C y se elimina el sobrenadante.
11. Permeabilización y fijación de células agregando 50 µl/pocillo de solución
Fixation/Permeabilization 1X (o PBS para las muestras sin permeabilización). Se incuba
por 30 min a 4⁰C.
12. Centrifugación 2500 rpm, 2 min, 4⁰C.
13. 1 lavado en 150 µl de PermBuffer/PBS según corresponda.
14. Incubación con 10 µl de Streptavidin-R-Pe, diluciones 0, 1/10, 1/50, 1/100, 1/500 (en
PermBuffer o PBS según corresponda) por 10 min a 20⁰C en oscuridad (temperatura
ambiente).
Dilución 0 1/10 1/50 1/100 1/500
Formula = 50 µl
PermBuffer/PBS
05 µl stock
45 µl
PermBuffer/PBS = 50 µl
10 µl 1/10
40 µl
PermBuffer/PBS = 50 µl
20 µl 1/50
20 µl
PermBuffer/PBS = 40 µl
10 µl 1/100
40 µl
PermBuffer/PBS = 50 µl
Concentración 0 µg/ml 100 µg/ml 20 µg/ml 10 µg/ml 2 µg/ml
Vol. Disponible 50 µl 40 µl 30 µl 30 µl 50 µl
15. Centrifugación 2500 rpm 2 min 4⁰C.
16. 1 Lavado en 150 µl de PermBuffer/PBS según corresponda (2500 rpm 2 min 4⁰C).
63
17. Resuspensión en 100 µl de buffer FACS.
18. Se marcan los tubos de citometría y se agregan 100 µl de buffer FACS a cada uno, se
traspasan las muestras a los tubos correspondientes y se analizan por citometría.
C. Analizador de Imágenes: Código Java de las Clases Programadas.
Clase ColorCount
import java.awt.*;
import java.awt.image.BufferedImage;
import java.io.*;
import javax.imageio.ImageIO;
public class ColorCount {
public static void main(String[] args) throws IOException {
String path = args[0];
BufferedImage image = ImageIO.read(new File(path));
int redCount = 0, greenCount = 0, blueCount = 0;
int red = Color.red.getRGB();
int green = Color.green.getRGB();
int blue = Color.blue.getBlue();
System.out.printf("red = %d green = %d blue = %d%n",red,
green,blue);
int w = image.getWidth();
int h = image.getHeight();
Histo histograma = new Histo();
int cont = 0;
for(int y = 0;y < h;y++) {
for(int x = 0;x < w;x++) {
System.out.println(cont);
int pixel = image.getRGB(x,y);
HistoElem e = new HistoElem(pixel,1);
histograma.add(e);
cont++;
}
}
histograma.display();
64
}
}
Clase GeneraColor.
import java.awt.*;
import java.awt.image.BufferedImage;
import java.io.*;
import javax.imageio.ImageIO;
import java.lang.*;
public class GeneraColor {
public static void main(String[] arg) {
int numEntero = Integer.parseInt(arg[0]);
try {
BufferedImage bi = getMyImage(numEntero);
File outputfile = new File(arg[0]+".png");
ImageIO.write(bi,"png",outputfile);
}
catch(IOException e){
}
}
public static BufferedImage getMyImage(int rgba) {
BufferedImage image = new BufferedImage (100,100,
BufferedImage.TYPE_INT_ARGB);
int w = image.getWidth();
int h = image.getHeight();
int cont=0;
for(int y = 0;y < h;y++) {
for(int x = 0;x < w;x++) {
System.out.print(".");
image.setRGB(x,y,rgba);
cont++;
}
65
}
System.out.println("done");
return image;
}
}
Clase Histo.
import java.util.*;
import java.io.*;
public class Histo {
Vector <HistoElem> vect = new Vector <HistoElem>();
public void SortByColor() {
}
public void add(HistoElem he) {
if (colorWasAlreadyAdded(he)) {
}
else {
vect.addElement(he);
}
}
public void display() {
try {
FileWriter outFile = new FileWriter
("outCCFile.xls");
PrintWriter out = new PrintWriter(outFile);
for(int i = 0;i < vect.size();i++) {
HistoElem aux = (HistoElem)vect.elementAt(i);
out.println(aux.getRecord());
}
out.close();
}
catch (IOException e) {
66
}
}
public boolean colorWasAlreadyAdded(HistoElem he) {
boolean retorno = false;
for(int i = 0;i < vect.size();i++) {
HistoElem aux = (HistoElem)vect.elementAt(i);
if(aux.getColor() == he.getColor()) {
retorno = true;
HistoElem reemplazo = new HistoElem
(aux.getColor(),aux.getFrec()+1);
vect.remove(i);
vect.add(i,reemplazo);
break;
}
}
return retorno;
}
}
Clase HistoElem.
public class HistoElem {
public int color;
public int frec;
public HistoElem(int c, int f) {
color = c;
frec = f;
}
public int getColor() {
return color;
}
public int getFrec() {
return frec;
}
67
public void frecPlus() {
frec ++;
}
public void display() {
System.out.printf("%d | %d %n",this.color,this.frec);
}
public String getRecord () {
String retorno = this.color+";"+this.frec;
return retorno;
}
}
D. Resumen de la simbología JOY para la Representación de Alineamientos y Análisis de
Estructuras.
Característica Símbolo Ejemplo
inaccesible al solvente MAYÚSCULA X
accesible al solvente minúscula x
Φ positivo itálica x
péptido-cis breve x
puente de hidrógeno a otra cadena lateral tilde x
puente de hidrógeno a amino cadena principal ennegrecido x
puente de hidrógeno a carboxilo cadena principal subrayado x
enlace disulfuro cedilla ç
α-hélice rojo x
hoja-β azul x
helice-310 granate x
E. Alineamientos Restantes Utilizados para el modelamiento de TAT.
Alineamiento ZSCORE Confianza
10 20 30 40 50
2w18 ( 854) nLqlvseLknpsgscSvDVsAmfwekepCIITACedvVSLwkaldawqWe
TAT --------------------------------------------------
βββββββ βββββββββ ββββββββ βββββββ ββ
60 70 80 90 100
2w18 ( 908) klytWhFaevpVlqIVpVpdVynLVCVALGnleireIrALfcekqvllks
TAT --------------------------------------------------
ββββββ ββββ βββββ βββββββ ββββββ
110 120 130 140 150
2w18 ( 964) gnIkaVlGLtkrrLVSSsgtlsdQqVeVmtFaedGggkenqfLmpPeetI
TAT ----------------------------------GRKKRRQRRRPPQ---
βββββββββ ββββββ βββββββ βββββββ β
160 170 180 190 200
2w18 (1014) ltFaeVqgmqeALLGTTimnnIVIWnLktGqllkkMhIddasvChkAYse
TAT --------------------------------------------------
βββββββ ββββββ ββββββ ββββββ ββββββββ
3,11 50%
68
210 220 230 240 250
2w18 (1067) mglLfIVLSpVFqlIvInpkttlSvgvmlYcLppgqagrfleGdVkdhcA
TAT --------------------------------------------------
βββββββ βββββββ ββββββββ βββββββ ββ
260 270 280 290 300
2w18 (1129) AAILtsgtIAIWdLllgqCtallppvqhWsFVkWSgTdshLLAGQkdGnI
TAT --------------------------------------------------
ββββ βββββ βββββ ββββ βββββ β
2w18 (1181) fVYhys
TAT ------
βββββ
10 20 30 40 50
1tac ( 1 ) ldpvdPniepWnhpGsqPktasnrahakksayhsQvaFItkglGisygrk
TAT -----------------------------------------------GRK
60 70 80
1tac ( 51 ) krRqrrrpsqgGqTHqdPIpkqpssQprgdpTgpke
TAT KRRQRRRPPQ--------------------------
333
2,67 50%
10 20 30 40 50
1tvs ( 1) ledrripgtaeenlqkssggvpgqntggqearpnyhçqlçflrslgidyl
TAT --------------------------------------------------
αααα αααααα ααα
60 70
1tvs ( 51) daslrkknkqrlkaiqqgrqpqyll
TAT ---------GRKKRRQRRRPPQ---
ααα αααααααααα
2,51 50%
10 20
1fw5 ( 1) gstlytesrkllrswhlpsv
TAT -------GRKKRRQRRRPPQ
αααααααααααααα
2,48 50%
10
2vcp ( 433) grdalldqirqgiqlksva
TAT GRKKRRQRRRPPQ------
ααααααααα
2,23 50%
10 20 30 40 50
2grg ( 1) mkssipiteVlprAvGsLtFdenynlldtsgvAkvIekspIaeiIrkSna
TAT --------------------------------------------------
ββααααααα βββββ ββββββ333 αααααααααα
60 70 80 90
2grg ( 51) eLgrlGysVyedaqyiGhAFkkaghfiVyFTpknknregvvppvgitn
TAT -------------------------------GRKKRRQRRRPPQ----
α βββββββ βββββββ βββββββ
2,23 50%
10 20
1h8b ( 7) gkkaeavatvvaavdqarvrepr
TAT ----------GRKKRRQRRRPPQ
ααααααααααααααααα
2,18 50%
10 20 30 40 50
1lki ( 9) natçairhpçhgnlmnqIknqLaqLngsAnaLfisYytaQgepFpnnvek
TAT --------------------------------------------------
ββ333 ααααααααααααααααααααααααααα 333ααα
60 70 80 90 100
1lki ( 59 ) lÇapnmtdFpsFhgngtektkLveLyrMVaYLsasLtnitrdQkvlnpta
TAT ------------------------------------GRKKRRQRRRPPQ-
α ααααααααααααααααααααααααααααα
110 120 130 140 150
1lki ( 109 ) vsLqvkLnaTIdvMrgLlsnVlÇrLÇnkyrvghVdvppvpdhsdkeafqr
TAT --------------------------------------------------
ααααααααααααααααααααααααααα ββ αααα
160 170
1lki ( 159 ) kklGÇqlLGTYkqvIsvVvqaf
TAT ----------------------
ααααααααααααααααααα
2,14 50%
10 20 30
1ery ( 1 ) deçanAaaqçSitlÇnlyÇgplieiÇeltVmqnçeppf
TAT -------------------------GRKKRRQRRRPPQ
ααααααα ααααααα 333ααααααααααα
2,03 50%
69
F. Alineamientos Restantes Utilizados para el modelamiento de TIRAP.
Alineamiento ZSCORE Confianza
10 20 30
2dyo ( 22) dsmddllirrltdrndkeahlnelfqdnsgaiggni
TIRAP GKMADWFRQTLLKKPKKRPNSPEST-----------
αααααααααααααααααα 333
4,78 95%
10 20
1h8b ( 7) gkkaeavatvvaavdqarvrepr
TIRAP GKMADWFRQTLLKKPKKRPNSPEST
Ααααααααααααααααα
4,03 95%
G. Alineamientos Restantes Utilizados para el modelamiento de TIRAPALA
.
Alineamiento ZSCORE Confianza
10 20 30
2dyo ( 22) dsmddllirrltdrndkeahlnelfqdnsgaiggni
TIRAPALA GKMADWFRQTLLAAPAAAPNSPEST-----------
αααααααααααααααααα 333
4,70 95%
10 20
1h8b ( 7) gkkaeavatvvaavdqarvrepr
TIRAPALA GKMADWFRQTLLAAPAAAPNSPEST
Ααααααααααααααααα
3,89 90%
H. Breve Descripción de las Estructuras Utilizadas como Plantillas.
TIRAP y TIRAPALA
.
PDB ID: 1SRA
Hohenester, E.; Maurer, P.; Hohenadl, C.; Timpl, R.; Jansonius,
J.N.; Engel, J.
Structure of a novel extracelular Ca2+
-binding module in BM-40.
Nature Structure Biology 3: 67-73 (1996).
PDB ID: 2DYO
Matsushita, M.; Suzuki, N.N.; Obara, K.; Fujioka, Y.; Ohsumi, Y.;
Inagaki, F.
Structure of Atg5.Atg16, a complex essential for autophagy.
J. Biol. Chem. 282: 6763-6772 (2007).
70
PDB ID: 1H8B
Atkinson, R.A.; Joseph, C.; Kelly, G.; Muskett, F.W.; Frenkiel,
T.A.; Nietlispach, D.; Pastore, A.
Ca2+
-independent binding of an EF-hand domain to a novel motif in
the alpha-actinin-titin complex.
Nature Structure Biology 8: 853 (2001).
TAT.
PDB ID: 1JFW
Péloponèse, J.M. Jr.; Grégoire, C.; Opi, S.; Esquieu, D.; Sturgis,
J.; Lebrun, E.; Meurs, E.; Collette, Y.;Olive, D.; Aubertin, A.M.;
Witvrow, M.; Pannecouque, C.; De Clercq, E.; Bailly, C.;
Lebreton, J.; Loret, E.P.
1H-13C nuclear magnetic resonance assignment and structural
characterization of HIV-1 Tat protein.
C. R. Academic Science III 323: 883-894 (2000).
PDB ID: 1K5K
Grégoire, C.; Péloponèse, J.M. Jr.; Esquieu, D.; Opi,
S.; Campbell, G.; Solomiac, M.; Lebrun, E.; Lebreton, J.; Loret,
E.P.
Homonuclear (1) H-NMR assignment and structural
characterization of human immunodeficiency virus type 1 Tat
Mal protein.
Biopolymers 62: 324-335 (2001).
PDB ID: 2W18
Oliver, A.W.; Swift, S.; Lord C.J.; Ashworth, A.; Pearl, L.H.
Structural basis for recruitment of BRCA2 by PALB2.
Embo Rep. 10: 990-996 (2009).
71
PDB ID: 1TAC
Boehm, M.; Sticht, H.; Seidel, G.; Roesch, P.
HIV-1 TAT CYS-, NMR, 10 Structures.
To be Published.
PDB ID: 1TVS
Sticht, H.; Willbold, D.; Ejchart, A.; Rosin-Arbesfeld, R.; Yaniv,
A.; Gazit, A.; Rösch, P.
Trifluoroethanol stabilizes a heliz-turn-heliz motif in equine
infectious-anemia-virus transactivator protein.
European Journal of Biochemistry 225: 855-861 (1994).
PDB ID: 1FW5
Lampio, A.; Kilpeläinem, I.; Pesonen, S.; Karhi, K.; Auvinen, P.;
Somerharju, P.; Kääriäinen, L.
Membrane binding mechanism of an RNA virus-capping enzyme.
Journal of Biological Chemistry 275: 37853-37859 (2001).
PDB ID: 2VCP
Faucher, J.F.; Didry, D.; Carlier, M.F.
Crystal structure of N-Wasp Wh2 domain in complex with
skeletal actin.
To be Published.
72
PDB ID: 2GRG
Wu, B.; Yee, A.; Ramelot, T.; Lemak, A.; Semesi, A.; Kennedy,
M.; Edward, A.; Arrowsmith, C.H.
Solution NMR Structure of Protein YNR034W-A from
Saccharomyces cerevisiae. Northeast Structural Genomics
Consortium Target YT727; Ontario Center for Structural
Proteomics Target yst6499.
To be Published.
PDB ID: 1H8B
Atkinson, R.A.; Joseph, C.; Kelly, G.; Muskett, F.W.; Frenkiel,
T.A.; Nietlispach, D.; Pastore, A.
Ca2+
-independent binding of an EF-hand domain to a novel motif
in the alpha-actinin-titin complex.
Nature Structure Biology 8: 853 (2001).
PDB ID: 1LKI
Robinson, R.C.; Grey, L.M.; Staunton, D.; Vankelecom, H.;
Vernallis, A.B.; Moreau, J.F.; Stuart, D.I.; Heath, J.K.; Jones,
E.Y.
The crystal structure and biological function of leukemia
inhibitory factor: implications for receptor binding.
Cell (Cambridge, Mass.) 77: 1101-1106 (1994).
PDB ID: 1ERY
Luginbühl, P.; Wu, J.; Zerbe, O.; Ortenzi, C.; Luporini, P.;
Wüthrich, K.
The NMR solution structure of the pheromone Er-11 from the
ciliated protozoan Euplotes raikovi.
Protein Science 5: 1512-1522 (1996).
73
I. Histogramas de Tamaño (FSC-H) y Granularidad (SSC-H) de Células HeLa Incubadas
por 16 horas con diferentes concentraciones de TIRAP y TIRAPALA
.
TIRAP.
TIRAPALA
.